JPH10503382A - ライム病関連ボレリアに対する核酸増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はボレリア核酸の検出に有用なハイブリダイゼーションアッセイプローブ、増幅プライマー、核酸組成物および方法を開示する。ライム病関連ボレリアを選択的に検出し、およびボレリア ヘルムシーからこれらのボ レリアを区別するハイブリダイゼーションアッセイプローブおよび増幅プライマーが開示される。ボレリア ヘ ルムシーを選択的に検出し、およびライム病関連ボレリ アを検出しない別のハイブリダイゼーションプローブもまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 ライム病関連ボレリアに対する核酸増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブ発明の分野 本明細書に記載および特許請求される発明は、ライム病に関連するボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ）生物体に対する増幅オリゴヌクレオチドおよび核酸プローブ の設計および使用に関し、それらは例えば、組織試料および体液からの、および 培養物からの試験試料中の生物体の検出を可能にする。背景技術 ライム病は北アメリカ、欧州および温帯気候を持つ世界の他の地域において、 しばしば診断されるヒト疾患であり、最も流行しているダニ媒介疾患である。Ａ ．Ｇ．Ｂａｒｂｏｕｒ ＆ Ｄ．Ｆｉｓｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１６１０ −１６（１９９３）；Ｊ．Ｆ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒｅｖ．Ｉｎｓｅｃｔ Ｄｉ ｓ ．１１：５１４５１−５９（１９８９）；Ａ．Ｃ．Ｓｔｅｅｒｅ，Ｎ．Ｅｎｇ ｌ．Ｊ．Ｍｅｄ ．，３３１：５８６−９６（１９８９）を参照されたい。ライム 病またはライムボレリア病はボレリアスピロヘータにより引き起こされる多段階 感染である。ボレリア生物体は感染したマダニ属のダニによりヒトおよび動物へ 伝搬される。白尾シカおよび白足マウス（ペロミスカス ロイコパス）が各々自 然における成虫ダニおよび幼虫型の一次保有体である。 ヒトおよび動物におけるライムボレリア病の感染は感染の段階に依存して多く の異なった臨床症状発現を起こす。ヒトの初期感染は通常、遊走性紅斑と称され る特徴的な皮膚発疹を伴うインフルエンザ様の病気である。遊走性紅斑は遠心的 に広がり、通常環状の形をしている。遊走性紅斑は通常、ダニに咬まれた後１− ５週間以内に現れ、数週間または数カ月後に自然に消散する。Ｈ．Ｗ．Ｐｆｉｓ ｔｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ ３４３：１０１３（１９９４）を参照されたい。 ボレリア感染後数週間から数カ月以内に、感染は脳、神経、眼、関節および心 臓を含む種々の器官に広がるであろう。この感染の広がりは疾患のII期が進行状 態にあることを示している。ライムボレリア病の神経学的特色には髄膜神経根神 経炎（バンワース症候群）、髄膜炎、顔面神経の脳神経炎、神経叢神経炎、多発 性単神経炎、および希に、脳炎、脊椎炎、心血管炎、ＣＳＦリンパ球多サイトー シスが含まれる。 ライム心臓炎は重度の病態であり、一般に種々の程度の過渡的な房室ブロック 、周期障害心筋心臓炎および心不全を特徴とする。ライム心臓病の共通の徴候に は動悸、胸部不快感、息切れ、運動時のめまい感およびアダムス−ストークス発 作が含まれる。 筋骨格系のライムボレリア感染は筋痛炎症性ではない関節炎、関節炎、筋炎、 およびリンパ節症のような徴候を起こす。眼へのボレリア感染は結膜炎、虹彩毛 様体炎、脈絡膜炎、瞳孔浮腫を伴う視神経障害、汎眼球炎のような徴候を起こす 。他の器官への感染では肝腫、肝炎、咳および精巣膨潤が起きるであろう。 感染して数カ月から数年後、慢性的な器官障害が起こり、ライムボレリア病が III期に入ったことを示している。この段階の徴候には慢性関節炎、単関節関節 炎、少数関節関節炎、慢性萎縮性先端皮膚炎、脳炎、筋炎、角膜炎、慢性多発性 神経炎および拡張型心筋症が挙げられる。 ライムボレリア病を起こすことが知られているボレリアスピロヘータは最初はボレリア ブルグドルフェリ （Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）と 称されていたが、現在は三つの主なゲノム種に分類されている。Ｒ．Ｔ．Ｍａｒ ｃｏｎｉ ＆ Ｃ．Ｆ．Ｇｕｒｏｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３ ０：２８３０−３４（１９９２）を参照されたい。一つの群は種呼称Ｂ．ブルグ ドルフェリ を保持しており、第二の群はボレリア ガルニー（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｇａｒｎｉｉ ）と名付けられており、第三の群は種の名前が未だ帰属されてい ず、ＶＳ４６１と称されている。 別のボレリア種、Ｂ．ヘルムシー（ｈｅｒｍｓｉｉ）はＢ．ブルグドルフェリ と非常に近縁であるが異なったヒト疾患（回帰熱）に関連している。Ｂ．ヘルム シー はＤＮＡハイブリダイゼーションによりＢ．パルヘリ（ｐａｒｈｅｒｉ）お よびＢ．トゥリカテ（ｔｕｒｉｃａｔａｅ）と同一の種に属していると特性付け られているが、各々は特定の節足動物ベクターに特異的である（Ｂａｒｂｅｒｉ ＆ Ｈａｙｅｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５０：３９１−４００ ， １９８６）。二つの他のボレリア種Ｂ．アンセリナ（ａｎｓｅｒｉｎａ）およびＢ．コリアセエ （ｃｏｒｉａｃｅａｅ）はＢ．ブルグドルフェリと非常に近縁で あるが、ヒトに対して感染性ではない。 ボレリア生物体は他のスピロヘータのように波打った形および鞭毛を持ってい る。Ａ．Ｇ．Ｂａｒｂｏｕｒ ＆ Ｓ．Ｆ．Ｈａｙｅｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ ．，５０：３８１−４００（１９８６）。これらの生物体はまた、染色体 および環状というよりむしろ線状のいくつかの染色体外要素も持っている。Ａ． Ｇ．Ｂａｒｂｏｕｒ ＆ Ｃ．Ｆ．Ｇａｒｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３７：４０ ９（１９８７）。いくつかの表面露出リポ蛋白質、ＯｓｐＡおよびＯｓｐＢが同 定されており、血清学的実験室試験において抗原マーカーとして使用された。 体液からのボレリア生物体の培養は困難であり、培養によるライムボレリア病 の微生物学的診断を不十分なものにしている。Ｂ．ブルグドルフェリを検出する ための血清学的試験が開発されており、酵素結合免疫吸着アッセイ[ＥＬＩＳＡ] 、間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）およびウェスタンブロッティングが挙げられ ている。Ｍ．Ｇ．Ｇｏｌｉｇｈｔｌｙ，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．， ９９：１６８−７４（１９９３）を参照されたい。しかしながら、これらの血清 学的試験では標準化が難しく、偽りの陽性および偽りの陰性結果を与えるのでそ の有効性は制限されている。Ｂａｒｂｏｕｒ，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ． ，１１０：５０４（１９８９）を参照されたい。 感染初期（Ｉ期）またはII期の患者では抗体が検出可能なレベルには達してい ず、トレポネマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）またはライム病と関連しない他のボレリ アとの交差反応が起こるであろう。抗生物質による処置はライムボレリア病患者 における検出可能な抗体の発生を妨げまたは遅延させるであろう。これらの欠陥 は、ライムボレリア病の診断および処置における血清学的試験の有用性および信 頼性を制限する。 感染作因の認識のためのプローブとして特異的ヌクレオチド配列を持つオリゴ ヌクレオチドの使用は問題のある免疫学的検出アッセイの代替物になってきてい る。ボレリアのゲノムおよびプラスミドＤＮＡ配列の両方の少なくとも一部が得 られている。Ｓｃｈｗａｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２７：１ ７３４（１９８９）；Ｓｃｈｗａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ５３９：４１９（１９８８）を参照されたい。Ｂ．ブルグドルフェリの直線状プ ラスミドから誘導された核酸ハイブリダイゼーションプローブが製造され、多数 のボレリア種からのＢ．ブルグドルフェリの同定に使用された。しかしながら、 これらのプローブはそのヌクレオチド配列が時間が経つと不安定になり、または 病原性ボレリア単離物には存在しないかもしれないプラスミドから誘導されてい るので生来的に制限されている。特異的ボレリア遺伝子を標的とする他の核酸ハ イブリダイゼーションプローブもまた、標的とされた遺伝子の進化的安定性の程 度に依存して生来的に制限されている。例えば、Ｍａｌｌｏｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ．，２８：１０８９（１９９０）；Ｌｅｂａｃｈら、Ｊ． Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ．，２９：７３１−７３７；およびＧｏｏｄｍａ ｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５９：２６９−２７８（１９９１）を参照 されたい。 無作為にクローン化したＢ．ブルグドルフェリＤＮＡ配列が核酸プライマーを 構築するのに使用され、これらのプライマーがＢ．ブルグドルフェリの標的ＤＮ Ａ配列の増幅に使用された。Ｒｏｓａら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ.Ｄｉｓ.，１６０： １０１８（１９８９）を参照されたい。しかしながら、Ｂ．ブルグドルフェリ単 離物の全ては検出されず、ライム病を起こす全てのＢ．ブルグドルフェリを検出 するためには不十分な核酸プライマーであった。 ＦｕｋｕｎａｇａおよびＳｏｈｎａｋａ、Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ｒｅｓ.Ｃｏｍｍ. ，１８３：９５２−５７（１９９２）；およびＰｏｓｔｉｃら、Ｒｅｓ．Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌ ．，１４１：４６５−４７５（１９９０）によりＢ．ブルグドルフ ェリ のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子の地図が作製され、クローン化され た。Ｂ．ブルグドルフェリは染色体当たり２３Ｓ ＲＮＡ遺伝子の二つのコピー および１６Ｓ ｒＲＮＡをコードしているたった一つのコピーのみを含んでいる ようである点において通常と異なっている。（Ｆｕｋｕｎａｇａら、Ｊ．Ｇｅｎ ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.，１３８:８７１−８７７，１９９２）。ボレリア１６Ｓ ＲＮＡの配列が培養Ｂ．ブルグドルフェリ生物体を検出できたハイブリダイゼ ーションプローブの設計に使用された。Ｍａｒｃｏｎｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉ ｃｒ ｏｂｉｏｌ ．，３０：６２８−３２（１９９２）を参照されたい。生物体を培養 せずに臨床試料中のＢ．ブルグドルフェリを検出することに対するこのプローブ の有用性は証明されていない。 これらの制限を克服するため、ボレリア１６Ｓ ｒＤＮＡを増幅するための広 範囲の特異性を持つプライマー対を用いたリボソームＲＮＡ配列の核酸増幅が記 載されている。Ｍａｌｌｏｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８： １０８９−９３（１９９０）を参照されたい。しかしながら、使用された核酸プ ライマーはＳ．オーレウス（ａｕｒｅｕｓ）およびＰ．アエルギノサ（ａｅｒｕ ｇｉｎｏｓａ ）をもまた増幅し、従ってボレリア ブルグドルフェリに特異的で はなかった。 １６Ｓ ｒＲＮＡ配列由来の四つの組のプライマーが三つの異なったボレリア ゲノム群のＤＮＡを増幅するのに使用された。Ｒ．Ｔ．ＭａｒｃｏｎｉおよびＣ ．Ｆ．Ｂａｒｏｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３０：２８３０−３ ４（１９９２）を参照されたい。ボレリア１６Ｓ ｒＲＮＡの８１９−８４２お よび１１５３−１１７３位由来のたただ一つのプライマーの組のみが試験された 種々の培養ライム病単離物中に存在するすべてのボレリア生物体を検出した。他 のプライマーの組はライム病ボレリアの三つすべてを認識しなかったかまたはラ イム病に関係しないボレリアをも認識した。その他のプライマーの組は臨床単離 物から培養された種々のボレリア生物体のすべてを増幅しなかった。１６Ｓ ｒ ＲＮＡ配列および１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ４領域が変化したボレリア ブル グドルフェリ のサブタイプの増幅はＡｄａｍら、Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．，５ ９：２５７９−８５、により記載されている。ＰＣＲプライマーがＢ．ブルグド ルフェリ の２３Ｓ ｒＲＮＡの特異的領域を増幅するためおよびボレリアの他の 種からそれを区別するために使用された。Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏ ．，３０：３０８２（１９９２）を参照されたい。 ボレリア１６Ｓ ｒＲＮＡ配列に相補的な他のプローブがＷｅｉｓｂｕｒｇ、 ＥＰＯ公開番号ＥＰＯ ０４２１ ７２５Ａ号、出願番号第９０３１０７６６． ２号、により記載されている。ＷｈｉｔｅおよびＤｏｄｇｅ、ＰＣＴ ＵＳ９１ ／０１５７４号、はＢ．ブルグドルフェリおよびＢ．ヘルムシーの１６Ｓ ｒＲ ＮＡ遺伝子由来のプライマーおよびプローブを開示している。 ライム病の血清学的検出および同定において現在は制限があるため、ライム病 に関連するボレリアのすべての地理的単離物を検出するための感度のよい方法に 対する要望が存在する。発明の要約 本発明はボレリアのｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）またはｒＤＮＡ（リボソー ムＤＮＡ）ヌクレオチド配列の特定の領域に相補的であるように設計された新規 かつ有用な増幅オリゴヌクレオチド、ヘルパーオリゴヌクレオチドおよびオリゴ ヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブ、またはボレリアｒＲＮ ＡまたはｒＤＮＡヌクレオチド配列またはその相補体の特定の部分に実質的に対 応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを開示し、特許請求している。これら の増幅オリゴヌクレオチド、ヘルパーオリゴヌクレオチドおよびハイブリダイゼ ーションアッセイプローブは病原性ボレリアの１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡ由 来であるので、これらのｒＲＮＡ遺伝子から発現されたＲＮＡのレベルがより高 くなり、核酸配列の変化の速度が遅く、および生物体間でのｒＲＮＡ配列の側方 伝達がなくなるためより優れた検出アッセイが得られる。 増幅オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションア ッセイプローブはストリンジェントハイブリダイゼーションアッセイ条件下、標 的ボレリア１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡおよび／またはｒＤＮＡ遺伝子配列に ハイブリダイズすることにより機能する。好適な態様において、本明細書に記載 したプローブおよび増幅オリゴヌクレオチドはボレリア ブルグドルフェリ、ボ レリア ガルニー およびＶＳ４６１群のボレリアを含むライム病関連ボレリアを 、血液または組織のような臨床試料中に観察される他の微生物および他のボレリ ア 種から区別できる。従って、本増幅オリゴヌクレオチドおよびハイブリダイゼ ーションアッセイプローブはライム病関連ボレリアを特異的に検出および／また は定量するためのアッセイに使用されるであろう。好適な態様において、本明細 書に記載したハイブリダイゼーションアッセイプローブはストリンジェントハイ ブリダイゼーション条件下、ライム病関連ボレリアからの核酸に選択的にハイブ リ ダイズすることができ、ボレリア ヘルムシーからの核酸にはハイブリダイズし ない。本発明のいくつかの態様において、ハイブリダイゼーションアッセイプロ ーブは標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションの同定を助けるため、ア クリジニウムエステルまたは放射性同位元素のようなレポーター基を含むオリゴ ヌクレオチドから成っている。本発明のいくつかの態様において、増幅オリゴヌ クレオチドは随意にＲＮＡポリメラーゼにより認識されるか、またはＲＮＡポリ メラーゼによる開始または伸長を促進する核酸配列を持っているものである。 本発明はライム病関連ボレリアおよびボレリア ヘルムシーからの核酸の存在 を検出するのに有用なハイブリダイゼーションアッセイプローブを特色とする。 好適には、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは以下のヌクレオチド配列 から選択される： および 本発明はライム病関連ボレリアからの核酸の存在を検出するのに有用なハイブ リダイゼーションアッセイプローブを特色とする。これらのハイブリダイゼーシ ョンアッセイプローブは、好適には以下のヌクレオチド配列から選択される： および 本発明はまたボレリア ヘルムシー核酸を検出するのに有用なハイブリダイゼ ーションアッセイプローブも特色とする。好適には、これらのハイブリダイゼー ションアッセイプローブは以下のヌクレオチド配列の一つから選択されるヌクレ オチド配列を持っている： および 本発明の別の態様は本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブと一緒 にヘルパーオリゴヌクレオチド（プローブ）を含むプローブ混合物である。好適 には、ヘルパーオリゴヌクレオチドは標的核酸へのアッセイプローブの特異的ハ イブリダイゼーションを容易にするために使用される；ヘルパーオリゴヌクレオ チドは本明細書において援用され、本発明と共通の所有権を享有するＨｏｇａｎ およびＭｉｌｌｉｍａｎの米国特許第５，０３０，５５７号に記載されている。 本発明においてヘルパープローブとして使用されるオリゴヌクレオチドには以下 の配列が含まれる： および 本発明の別の態様はライム病関連ボレリアを検出するための組成物であり、そ れは本発明のオリゴヌクレオチドとライム病関連ボレリアからのヌクレオチドポ リマーの特定の領域との間で形成された核酸ハイブリッドである。一般的に、ヌ クレオチドポリマーは本発明のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体に実質 的に対応する核酸配列を含んでおり、ボレリアのリボソームＲＮＡをコードして いるｒＲＮＡまたはｒＤＮＡから誘導される。これらの組成物に存在するオリゴ ヌクレオチドは増幅オリゴヌクレオチド、ヘルパーオリゴヌクレオチド、ハイブ リダイゼーションアッセイプローブ、またはそれらの混合物であろう。従って、 本発明の組成物は一つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチド、一つまたはそ れ以上のヘルパーオリゴヌクレオチドおよび一つまたはそれ以上のハイブリダイ ゼーションアッセイプローブを含んでいるであろう。 その標的配列へハイブリダイズしたプローブを含んでいる本発明の組成物は核 酸配列の存在を検出するために有用である。その標的核酸配列へハイブリダイズ したヘルパーオリゴヌクレオチドを含んでいる本発明の組成物はハイブリダイゼ ーションに利用可能な標的核酸配列の特定の部分を作るために有用である。その 標的配列へハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライマーを含んでいる本発 明の組成物はプライマーの３’末端にポリメラーゼのための開始部位を作り出す ために有用である。 本発明はライム病に関連したボレリアの存在を検出するための方法もまた企図 しており、核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブがボレリア ブルグド ルフェリ 標的核酸配列へハイブリダイズできるがボレリア ヘルムシーからの核 酸配列とはハイブリダイズしないストリンジェントハイブリダイゼーションアッ セイ条件下、試験試料を核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触さ せる。本発明はまたこれらの方法で使用されるオリゴヌクレオチドおよびその均 等物も企図しており、それらは標的配列へのプローブのハイブリダイゼーション の同定の助けとなるレポーター分子を随意に含んでいる。本発明は血液、血液由 来試料、組織、組織由来試料、他の体液および身体試料のようなヒトからの試験 試料におけるボレリア核酸の存在を検出するのに有用である。 核酸が少なくとも一つの本発明の増幅オリゴヌクレオチドを用いて増幅される 、ライム病関連ボレリアの存在を検出するための方法も本発明はまた企図してい る。好適な態様において、そのような増幅後に検出工程が続いており、そこでは 本発明のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いて 増幅された核酸が検出される。本発明の方法はまた、ＲＮＡプロモーターのため のヌクレオチド配列を含む増幅オリゴヌクレオチドの使用も企図している。 別の態様において、本発明は増幅アッセイにおける、ボレリア ブルグドルフ ェリ を含むライム病関連スピロヘータの検出に有用な増幅オリゴヌクレオチドを 特色としている。そのようなオリゴマーは好適には以下の配列の一つに実質的に 対応している： および ここで、オリゴマーは修飾されていなくてもよいし、またはＲＮＡポリメラーゼ により認識される５’末端への特異的核酸配列（Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６ ＲＮ Ａポリメラーゼのためのプロモーター配列が挙げられるが、これらに制限される わけではない）、および／またはＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ転写の開始ま たは伸長を促進する配列の付加のような修飾を含んでいてもよい。プロモーター 配列の一つの例としては、 配列ＩＤ番号:４３、5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3'が挙げられる。有用な プロモーター配列の別の例には、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎ ｇ ＳｙｓｔｅｍｓからのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ^RベクターまたはＰｒｏｍｅ ｇａ Ｂｉｏｔｅｃ．からのｐＧＥＭ^TMベクターを含む種々の市販品として入手 可能なベクターが含まれる。 本発明の別の態様において、増幅オリゴヌクレオチドは以下の配列に実質的に 対応する配列を介して結合するかまたは配列の伸長を起こす： および 本発明の別の態様は、増幅オリゴヌクレオチド、ヘルパーオリゴヌクレオチド およびハイブリダイゼーションアッセイプローブを含む一つまたはそれ以上の本 発明のオリゴヌクレオチドを含むキットを含んでいる。好適な態様において、本 発明のキットは少なくとも一つの増幅オリゴヌクレオチド、および他の微生物お よび他のボレリア種からライム病関連ボレリアを区別できる一つのハイブリダイ ゼーションアッセイプローブを含んでいる。 特定の核酸配列を検出するための核酸ハイブリダイゼーションの使用の基礎的 な記述は、Ｋｏｈｎｅ（１９８９年７月２５日に公開された米国特許第４，８５ １，３３０号）およびＨｏｇａｎら（”非ウイルス生物体の検出および／または 定量のための核酸プローブ”と題された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８７／０ ３００９）により与えられている（両方の参照文献とも本明細書において援用さ れる）。Ｈｏｇａｎらは（上記文献）試料（例えば、痰、尿、血液および組織切 片、食品、土壌および水）中の非ウイルス生物体または非ウイルス生物体の群の 存在を決定するための方法を記載している。発明の詳細な説明 Ａ．定義 以下の用語は特別に異なった意味を持つように指示しない限り、本明細書にお いては指示された意味を持っている。 ”標的核酸”とは標的ヌクレオチド配列を持っている核酸を意味している。 ”オリゴヌクレオチド”とはお互いに共有結合で結合された二つ以上のヌクレ オチドサブユニットから作製された一本鎖ヌクレオチドポリマーを意味している 。好適には、１０から１００の間のヌクレオチドユニットが存在し、より好適に は１２から５０の間のヌクレオチドサブユニットがお互いに結合されている。ヌ クレオチドサブユニットの糖部分はリボースでも、デオキシリボースでも、また はＯ−メチルリボースのようなそれらの修飾誘導体でもよい。オリゴヌクレオチ ドのヌクレオチドサブユニットはホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結 合、メチルホスホネート結合またはオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーショ ンを妨害しない他の希なまたは天然に存在しない結合により結合されているであ ろう。さらに、オリゴヌクレオチドは普通には存在しないヌクレオチドまたは非 ヌクレオチド残基を持っていてもよい。本明細書で定義されるように、オリゴヌ クレオチドは核酸であるが（好適にはＤＮＡ）、ＲＮＡまたは共有結合で結合さ れたリボ−およびデオキシリボヌクレオチドの組み合わせでもよい。決められた 配列のオリゴヌクレオチドプローブおよび増幅オリゴヌクレオチドは、化学的ま たは生化学的合成および例えば、細菌またはレトロウイルスベクターのような組 換え核酸分子からのインビトロまたはインビボ発現によるような当業者には既知 の技術により製造される。本開示により意図されるように、オリゴヌクレオチド は野生型染色体ＤＮＡまたはそのインビボ転写生成物からは成っていない。プロ ーブの一つの使用はハイブリダイゼーションアッセイプローブとしてであり；プ ローブは病気にかかった、感染したまたは病原性の細胞においての遺伝子転写ま たは翻訳を阻止または阻害するためのインビボまたはインビトロ治療増幅オリゴ マーまたはアンチセンス剤としても使用されるであろう。 ”標的核酸配列”、”標的ヌクレオチド配列”または”標的配列”とは一本鎖 核酸分子の全部または一部のヌクレオチド配列およびそれらに相補的なデオキシ リボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列からなる特異的デオキシリボヌク レオチドまたはリボヌクレオチド配列を意味している。 核酸ハイブリダイゼーションとは、完全にまたは一部が相補的であるヌクレオ チド配列を持つ二つの核酸鎖が前もって決定された反応条件下でお互いに一緒に なって特異的水素結合を持つ安定な二本鎖ハイブリッドを形成する過程である。 どちらの核酸鎖もデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）かまたはリボ核酸（ＲＮＡ）で あり；従ってハイブリダイゼーションによりＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、ＤＮ Ａ：ＤＮＡハイブリッドまたはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドが生成する。 本明細書で使用する場合の用語”ハイブリダイゼーション”とは二つの相補的 または部分的に相補的な一本鎖核酸が逆平行配位で一緒になって二本鎖領域を持 つ安定な構造を形成する能力を指している。この二本鎖構造（しばしばハイブリ ッドと呼ばれる）の構成鎖は水素結合によりお互いに保たれている。これらの水 素結合は一本鎖核酸上に塩基アデニンおよびチミンまたはウラシル（ＡおよびＴ またはＵ）またはシトシンおよびグアニン（ＣおよびＧ）を含むヌクレオチド間 で最も普通に形成されるが、これらの”規範的”対の構成要素ではない塩基間で も塩基対形成は形成できる。非規範的塩基対形成は本分野ではよく知られている 。例えば、Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ （Ａｄａｍｓら、編、１９９２）を参照されたい。 ”ストリンジェント”ハイブリダイゼーションアッセイ条件とは、特異的ハイ ブリダイゼーションアッセイプローブが他の微生物（例えば、ボレリア ヘルム シー） またはヒトに由来する試験試料中に存在する他の核酸の中で標的核酸（好 適にはライム病関連ボレリアのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ）とハイブリダイズでき る条件を意味している。これらの条件は、ＧＣ含量およびプローブの長さ、ハイ ブリダイゼーション温度、ハイブリダイゼーション試薬または溶液の組成、およ び考えられたハイブリダイゼーション特異性の程度を含む因子に依存して変化す るであろうことが理解されるであろう。特異的ストリンジェント条件は以下の開 示で提供される。 ”プローブ”とは検出されるべきと考えられた核酸配列にストリンジェントハ イブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするようにその配列と部分的また は完全に相補的である配列を持つ一本鎖オリゴヌクレオチドを意味している。用 語”プローブ”では天然に存在する核酸は除かれる。精製されたオリゴヌクレオ チドプローブは化学合成および組換え核酸分子（例えば、レトロウイルスベクタ ー）からのインビトロおよびインビボ発現のような本分野で知られている技術に より製造される。好適には、プローブは１０から１００ヌクレオチドの長さであ る。プローブは、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダ イゼーションに実質的に影響を与えない限り、標的配列に相補的でない領域を持 っていてもよい。もしそのような領域が存在するならば、それらはＲＮＡ転写の ための５’プロモーター配列および／または結合部位、制限エンドヌクレアーゼ 認識部位を含むか、またはプローブまたは標的核酸上に、またはその両方に触媒 活性部位またはヘアピン構造のような所望の二次または三次構造を与えるであろ う配列を含んでいるであろう。プローブが標的配列へハイブリダイズしたことを 検出または確認するために使用できる放射性同位元素、蛍光または化学発光残基 のようなレポーター基残基、酵素または他のリガンドで修飾されているであろう 。 本開示において使用される特異的配列の群”より選択される配列から本質的に 成る核酸配列を持つプローブ（またはオリゴヌクレオチド）”という句は、その プローブが（基本的はおよび新規で特徴的なものとして）ストリンジェントハイ ブリダイゼーション条件下、掲げた核酸配列の群の一つの配列の正確な相補体を 持つ核酸へ安定にハイブリダイズできることを意味している。正確な相補体には 対応するＤＮＡまたはＲＮＡ配列が含まれる。 句”核酸配列に実質的に対応している”とは引き合いに出された核酸は十分に 核酸配列と類似しており、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、同 一の標的核酸配列とハイブリダイズするであろうという点で引き合いに出された 核酸は核酸配列と類似のハイブリダイゼーション特性を持っている。 本発明の実質的に対応するプローブおよびプライマーは引き合いに出された配 列と変わっていてもよいが、依然として同一の標的核酸配列にハイブリダイズす ることを当業者は理解するであろう。当業者はまた、この変異はプローブまたは プライマー中の同一でない塩基の数、または標的核酸配列の対応する塩基へハイ ブリダイズしないプローブの不適正塩基の数として表現できることも理解するで あろう。本発明のプローブまたはプライマーは、もしこれらのパーセントが１０ ０％から８０％であるか、または１０ヌクレオチド標的配列中の不適正が０塩基 から１０ヌクレオチド標的配列中の不適正が２塩基であるならば実質的に対応し ている。 好適な態様において、このパーセントは１００％から８５％である。より好適 な態様において、このパーセントは９０％から１００％であり；別の好適な態様 において、このパーセントは９５％から１００％である。当業者は受容不可能な レベルの非特異的ハイブリダイゼーションを起こすことなく、特異的標的配列へ のハイブリダイゼーションを可能にする相補性の種々のパーセントで必要とされ るであろうハイブリダイゼーション条件の種々の変更を理解するであろう。 ”核酸ハイブリッド”または”ハイブリッド”とは二本鎖、水素結合領域（好 適には１０から１００ヌクレオチドの間の長さで、最も好適には約１２から５０ ヌクレオチドの間の長さで）を含む核酸構造を意味しており、ここで各々の鎖は 相手と相補的であり、およびこの領域は化学発光または蛍光光検出、オートラジ オグラフィーまたはゲル電気泳動を含む（これらに制限されるわけではない）方 法により検出されるようにストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で十 分に安定である。そのようなハイブリッドはＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡま たはＤＮＡ：ＤＮＡデュープレックス分子から成っている。 ”相補的”とは二つの一本鎖核酸の類似の領域または同一の一本鎖核酸の異な った領域のヌクレオチド配列がストリンジェントハイブリダイゼーション条件下 、一本鎖が一緒になって安定な二本鎖水素結合領域にハイブリダイズすることを 可能にするヌクレオチド塩基組成を持っていることを意味している。一つの一本 鎖領域のヌクレオチドの隣接する配列が他の一本鎖領域のヌクレオチドの類似の 配列と一連の”規範的”水素結合塩基対（ＡはＵまたはＴと対合し、ＣがＧと対 合するような）を形成できるとき、ヌクレオチド配列は”完全に”相補的である 。 ”保存的に修飾された変異体”とは別の核酸の核酸領域と相補的であるヌクレ オチド配列を持っている核酸またはオリゴヌクレオチドを意味しており、そのよ うな領域は順番に参照核酸と完全に相補的である。そのような保存的に修飾され た変異体はストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、ボレリアヌクレオ チド配列を持つ標的核酸領域と安定にハイブリダイズできる。 ”増幅オリゴヌクレオチド”とは標的核酸配列とハイブリダイズでき、および 核酸合成のためのプライマーまたは核酸合成開始のためのプロモーター鋳型（例 えば、相補鎖合成のための、それにより機能性プロモーター配列が形成される） またはその両方として働くことができるオリゴヌクレオチドを意味している。も し増幅オリゴヌクレオチドがＲＮＡ合成を開始させるように設計されているとし たら、オリゴヌクレオチドは標的配列とは相補的ではないが、ＲＮＡポリメラー ゼ（Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼのような）により認識される ヌクレオチド配列を含んでいるであろう。増幅ヌクレオチドはプライマー伸長を 阻害するまたはその量を少なくするように修飾された３’末端を持っていてもよ いし、持っていなくてもよい。本明細書で定義されたように、増幅ヌクレオチド は好適には１０から１００ヌクレオチドの間の長さであろう；最も好適であるの は約１２から５０ヌクレオチドの間の長さであろう。本発明の増幅オリゴヌクレ オチドは化学的に合成されるかまたはベクターから誘導されるが、そのようなオ リゴヌクレオチドは天然に存在する核酸ではない。 ”核酸増幅”または”標的増幅”とは少なくとも一つの標的核酸配列を持つ核 酸分子の数を増加させることを意味している。 ”アンチセンス”または”負のセンス”とは参照核酸配列と相補的な核酸配列 を持っていることを意味している。 ”センス”、”同一センス”または”正のセンス”とは参照核酸配列と類似の 核酸配列を持っていることを意味している。 ”ヘルパーオリゴヌクレオチド”とは標識プローブと異なった場所で標的核酸 とハイブリダイズするように設計された核酸プローブを意味しており、それによ り標識プローブのハイブリダイゼーション速度を増加させ、または標的：標識プ ローブハイブリッドの融解温度（Ｔ_m）を高め、またはその両方を行う。 ”ライム病関連ボレリア”とはライム病を起こすボレリア種であり、亞種ボレ リア ブルグドルフェリ 、ボレリア ガルニーおよびボレリアＶＳ４６１が含ま れる。典型的には、ライム病関連ボレリアはライム病に罹患した哺乳類から単離 できる。 ”系統発生的に密接に関係した”とは生物体が進化的意味においてお互いに密 接に関係しており、従ってより遠い関係の生物体より形態学における著しい類似 性およびより高い全核酸配列相同性を持っているであろう。系統発生樹上で隣り および隣の次の位置を占める生物体は密接に関係している。系統発生樹上で隣り および隣の次よりさらに離れた位置を占める生物体は、もしそれらが著しい全核 酸配列相同性を持っているならば密接に関係しているであろう。 Ｂ．ハイブリダイゼーション条件およびプローブ／プライマー設計 ハイブリダイゼーション反応条件（ハイブリダイゼーションの温度およびハイ ブリダイゼーション溶液中の塩濃度が最も重要）は本発明の増幅オリゴヌクレオ チドまたはハイブリダイゼーションプローブが標的ボレリアヌクレオチド配列を 持つ核酸と優先的にハイブリダイズ可能にし、試験試料中に存在していると疑わ れる他の選ばれていない核酸とはハイブリダイズしないように選択できる。塩濃 度が減少および／または温度が上昇（ストリンジェンシーの増加と呼ばれる）す ると、二本鎖ハイブリッド分子において対合したヌクレオチド塩基間の水素結合 が破壊されるので核酸ハイブリダイゼーションの程度が減少する；この過程は” 融解”と呼ばれている。 一般的に言って、最も安定なハイブリッドは最も多くの隣接する完全に一致し た（即ち、水素結合された）ヌクレオチド塩基対を持つものである。従って、そ のようなハイブリッドは通常ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシー を増加させた場合最も遅く融解することが期待されるであろう。しかしながら、 一つまたはそれ以上の不適正な（”非規範的”）または不完全な塩基対（核酸の ヌクレオチド配列のその位置でより弱い塩基対合を生じるかまたは塩基対合が存 在しない結果を生む）を含む二本鎖核酸領域は、それでも試験試料中に存在する 他の選ばれていない核酸と交差反応することなくハイブリダイゼーションアッセ イで検出されるべき核酸ハイブリッドを与える比較的高いストリンジェンシー条 件下で十分に安定である。 これ故、標的核酸のヌクレオチド配列および系統発生的に別個のものに属する が一方密接に関係した非標的核酸のヌクレオチド配列間の類似性の程度、および 特定の増幅オリゴヌクレオチドまたはハイブリダイゼーションプローブのヌクレ オチド配列および他の標的および非標的核酸のヌクレオチド配列間の相補性の程 度に依存して、一つまたはそれ以上の不適正は標的核酸へハイブリダイズし、非 標的核酸へハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドの能力を必ずしもくじくわ けではないであろう。 本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブはプローブ：標的ハイブリ ッドの融解温度（Ｔ_m、与えられた反応混合物中の潜在的二本鎖分子の半分が一本 鎖の変性された状態にある温度として定義される）およびプローブと試験試料中 に存在すると予想される系統発生的に最も密接に関係した生物体のｒＲＮＡまた はｒＤＮＡ（検出されるべきとは求められていない）のＴ_m間の相違が最大にな るように選択、抜粋および／または設計された。非標識増幅オリゴヌクレオチド およびヘルパーオリゴヌクレオチドは本発明で有用な標識ハイブリダイゼーショ ンアッセイプローブのように非常に高程度の特異性を持つ必要はないので、それ らは他の核酸を制して一つまたはそれ以上の標的核酸へ優先的にハイブリダイズ するための同様の方法で設計された。 原核生物のヌクレオチド配列は５Ｓ、１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡをコード しているｒＲＮＡ遺伝子を含んでいる。レプトスピラ、レプトネマ、セルピュラ 、スピロヘータおよびトレポネマ１６Ｓ核酸配列のリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒ ＲＮＡ）のボレリア核酸配列もまた比較のために使用された。ボレリア核酸配列 情報は実験室での研究および発表された論文（ＭａｒｃｏｎｉおよびＧａｒｏｎ 、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３８：５３３−５３６（１９９２）；Ｐ ａｓｔｅｒら、Ｊ.Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ.１７３:８１８１−６１０９（１９９１ ）；ＭａｒｃｏｎｉおよびＧａｒｏｎ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：２４ １−２４４（１９９２）；Ｍａｒｃｏｎｉ ＆ Ｇａｒｏｎ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌ ．３０：２８３０−３４（１９９２）；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ．１７４：３７７６−７４（１９９２））から得られた 。 プローブおよび増幅オリゴヌクレオチドとして使用されるべき核酸配列の同定 を容易にするため、生物体の異なった種からのヌクレオチド配列を最初に整列さ せて相同性を最大限に活用した。ｒＲＮＡ分子内では、全体にわたる構造および 機能間に緊密な関係が存在する。このことは一次配列の進化的変化に制限を賦課 し、そのため二次構造が維持されている。例えば、もしヘリックスの一つの側で 塩基が変化していると、相補性を保存するために他の側に補償する変化がなされ ている（このことは共変異と呼ばれている）。このことは保存された一次配列に および保存された二次構造要素に基づいて整列されるべき二つの非常に異なった 配列を可能にする。ハイブリダイゼーションプローブのための可能性のある標的 配列は整列させた配列の相同性の変異に注目して同定された。 変異領域の各々での配列進化はほとんど分岐的である。分岐のため、ライム病 関連ボレリアのより遠い系統発生的関係種は系統学的により近い関係種よりも変 異領域により大きな変異性を示す。ライム病関連ボレリアおよび同一の試料中に 観察されるであろう他のボレリア種の間に、好適な標的部位を同定および有用な プローブを設計するための十分な変異が観察された。 ライム病に関連するボレリア種と、文献で発表されているまたは実験室で決定 されたｒＲＮＡ配列の比較分析による他のボレリア種との間で変化している配列 が同定された。本明細書で開示されている目的のために使用されるまたは適用さ れるであろうコンピューターおよびコンピュータープログラムは市販品として入 手可能である。本プローブを設計するため、標的生物体および同一の試料中に観 察されるであろう最も近い系統発生的関係種間に十分な変異が観察された。 推定の独特で可能性のある標的ヌクレオチド配列を単に同定するだけでは、そ の配列を含むボレリアｒＲＮＡまたはｒＤＮＡへハイブリダイズする機能的な種 特異的ハイブリダイゼーションアッセイプローブが製作できることを保証しては いない。種々の他の因子が種特異的プローブのための標的部位としての核酸座の 適性を決定するであろう。本明細書に記載したようなハイブリダイゼーション反 応の程度および特異性は多くの因子により影響されるため、一つまたはそれ以上 のこれらの因子の操作が特定のオリゴヌクレオチド（その標的に完全に相補的で あるにしろまたはないにしろ）の正確な感受性および特異性を決定するであろう 。種々のアッセイ条件の重要性および影響はＨｏｇａｎら（本出願と同一の譲受 人および本明細書において援用される）およびＨｏｇａｎおよびＨａｍｍｏｎｄ 、米国特許第５，２１６，１４３号（国際特許番号ＰＣＴ／ＵＳ８７／０３００ ９号に譲渡されている）、Ｋｏｈｎｅ、米国特許第４，８５１，３３０号により 記載されているように当業者には知られている。 例としては：可能な標的ヌクレオチド配列の（および従って二本鎖プローブ： 標的ハイブリッドの）ＧＣ含量がより高いと一般的に安定性および従ってハイブ リッドのＴ_mが上昇する。一つまたはそれ以上の”選ばれなかった”生物体と同 一である配列内のヌクレオチドの数もまた安定性、従って、ボレリアｒＲＮＡと 完全に相補的であるプローブと選ばれなかった生物体（類）のｒＲＮＡヌクレオ チド配列を持っている核酸の間の部分的に不適正なハイブリッドのＴ_m'に影響す る。 ハイブリダイゼーションの望まれる温度およびハイブリダイゼーション溶液組 成（濃度、界面活性剤および他の溶質のような）もまた二本鎖ハイブリッドの安 定性に大きな影響を与える。イオン強度およびプローブが標的にハイブリダイズ されるであろう温度のような条件は、群−または種−特異的プローブの構築に考 えに入れなければならない。ハイブリッド核酸の熱安定性は一般に反応混合物の イオン強度の増加とともに増加する。一方、ホルムアミド、尿素、ジメチルスル ホキシドおよびアルコールのような水素結合を破壊する化学試薬はハイブリッド の熱安定性を非常に減少させることができる。 標的に対するプローブの特異性を最大限に活用するため、本発明の目的プロー ブは高いストリンジェンシーの条件下で標的とハイブリダイズするように設計さ れた。そのような条件下では程度の高い相補性を持つ核酸一本鎖のみがお互いに ハイブリダイズするであろう；そのような程度の高い相補性を持たない核酸一本 鎖はハイブリッドを形成しないであろう。従って、アッセイ条件のストリンジェ ンシーはハイブリッドを形成するために二つの核酸鎖間に存在しなければならな い相補性の量を決定する。ストリンジェンシーは、プローブと標的核酸の間で形 成されるハイブリッドおよびプローブと存在する任意の非標的核酸の間で形成さ れる可能性のあるハイブリッドの安定性の相違を最大限に活用するように選択さ れる。 適切な特異性は、非標的生物体の配列に対する完全な相補性を持つプローブの 長さを最少にすることにより、非標的配列に対する相同性のＧおよびＣが豊富な 領域を避けることにより、および可能な限り非標的配列に対する多くの不安定化 不適正を含むようにプローブを構築することにより達成される。プローブ配列が 生物体の特定の型のみを検出するのに有効かどうかは、プローブ：標的ハイブリ ッド対潜在的プローブ：非標的ハイブリッド間の熱安定性の相違に大きく依存し ている。プローブの設計において、これらのハイブリッド間のＴ_m値の相違は可 能な限り大きくしなければならない（好適には約５℃またはそれ以上）。Ｔ_mの 操作はプローブ長およびプローブ組成（ＧＣ含量に対するＡＴ含量）を変化させ ることにより達成できる。 一般に、約１０−５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドプローブに対する 至適ハイブリダイゼーション温度は、与えられたデュープレックスに対する融解 温度の約５℃下である。至適温度以下の温度でのインキュベーションは不適正塩 基配列のハイブリダイズを可能にし、従って特異性を減少できる。プローブをよ り長くすると（塩基対間の水素結合が多くなる）、一般にＴ_mが高くなる。また 、ＧおよびＣのパーセントを多くすると、Ｇ−Ｃ塩基対は追加の水素結合を示し てＡ−Ｔ塩基対よりも熱安定性が大きくなるのでＴ_mは高くなる。 Ｔ_mを決定するための好適な方法では、”均一保護アッセイ”と題したＡｒｎ ｏｌｄら（上記文献）によるハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）を 用いてハイブリダイゼーションが測定される。Ｔ_mは以下の方法によりＨＰＡを 用いて測定できる。プローブ：標的ハイブリッドはコハク酸リチウム緩衝化溶液 （０．１Ｍコハク酸リチウム緩衝液、ｐＨ５．０、２ｍＭエチレンジアミン四酢 酸（ＥＤＴＡ）、２ｍＭエチレン グリコール−ビス（β−アミノ−エチルエー テル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、１０％（ｗ／ｖ）ラウリル硫 酸リチウム）中、過剰量の標的を用いて形成させる。ハイブリッドの一部は次に クエン酸リチウム緩衝化溶液で希釈し、予期されるＴ_m（典型的には５５℃）よ り下の温度から始め、２−５℃づつ高くした種々の温度で５分間インキュベート する。この溶液は続いて温和なアルカリ性ホウ酸緩衝液（０．１５Ｍ四ホウ酸ナ トリウム、ｐＨ７．６、５％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ^R Ｘ−１００）で希釈し てより低い温度（例えば、５０℃）で１０分間インキュベートする。これらの条 件下、一本鎖プローブに結合されているアクリジニウムエステルは加水分解され るが、一方ハイブリダイズされたプローブに結合されているアクリジニウムエス テルは加水分解から比較的保護されている。従って、残存するアクリジニウムエ ステルはハイブリッドの量に比例し、過酸化水素続いてのアルカリの添加により アクリジニウ ムエステルから発生される化学発光により測定できる。化学発光はルミノメータ ー（例えば、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ ＬＥＡＤＥＲ^RＩまたはＬＥＡＤＥＲ^R５０） により測定できる。得られたデータは温度に対して最大信号（通常最も低い温度 ）のパーセントとしてプロットする。Ｔ_mは残存する最大信号の５０％を示す温 度として定義される。上記の方法に加え、当業者にはよく知られている同位元素 法（例えば、Ｈｏｇａｎら、上記文献）によってもＴ_mが決定されるであろう。 与えられたハイブリッドのＴ_mは使用されたハイブリダイゼーション溶液に依 存して変化することに注意しなければならない。塩濃度、界面活性剤および他の 溶質のような因子は熱変性の間のハイブリッド安定性に影響を及ぼすことができ る（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉ s，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１１章（第ニ版、１９８９））。プ ローブの標的へのハイブリダイズに使用されるであろうイオン強度およびインキ ュベーション温度のような条件はプローブの構築の際に考えに入れなければなら ない。一方、ホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキスドおよびアルコールのよ うな水素結合を破壊する化学試薬はハイブリッドの熱安定性を大きく減少させる ことができる。 プローブがその標的に特異的であることを確かにするため、高いストリンジェ ンシーの条件下でのみハイブリダイズするプローブを持つことが望まれる。高ス トリンジェンシー条件下では高度に相補的である核酸ハイブリッドのみが形成さ れる；十分な程度の相補性のないハイブリッドは形成されないであろう。従って 、アッセイ条件のストリンジェンシーがハイブリッドを形成するための二つの核 酸鎖間に必要とされる相補性の量を決定する。ストリンジェンシーは標的および 他の核酸配列で形成されるハイブリッド間の安定性の相違を最大にするように選 ばれる。 適切な特異性は、非標的核酸に対して完全な相補性の長さを最少にすることに より、非標的配列に対する相同性のＧおよびＣが豊富な領域を避けることにより 、および可能な限り非標的配列に対する多くの不安定化不適正を含むようにする ことにより達成される。プローブ配列が生物体の特定の型のみを検出するのに有 効かどうかは、プローブ：標的ハイブリッドおよびプローブ：非標的ハイブリッ ド 間の熱安定性の相違に大きく依存している。プローブの設計において、これらの Ｔ_m値間の相違は可能な限り大きくしなければならない（好適には約５℃または それ以上）。 標的核酸配列の長さ、および、従ってプローブ配列の長さもまた重要である。 ある場合には、特定の領域、例えば、位置および長さが変化している変異領域か らのいくつかの配列が存在し、それらから所望のハイブリダイゼーション特性を 持つプローブが得られる。別の場合には、あるプローブが単一の塩基が異なって いるヌクレオチド配列を持つプローブよりも著しく良好であろう。核酸はハイブ リダイズするために完全に相同的ではなくてもよく、完全に相同的な塩基配列の 最も長い広がりが一般的にハイブリッド安定性を決定し、塩基対の組成もまたそ れに対して役割を果たしている。標的核酸配列の長さ、および、従ってプローブ 配列の長さもまた重要である。ある場合には、特定の”変異”領域（位置および 長さが変化している）からのいくつかの配列が存在し、それらは所望のハイブリ ダイゼーション特性を持つプローブの設計に使用される。 本発明においてプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは種々の長さで ある。好適なプローブは１０から１００ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチ ドである。 ハイブリダイゼーションの阻害となる強い内部構造を形成するｒＲＮＡ領域は 、少なくともヘルパープローブが使用されないアッセイではより好ましくない標 的領域である。同様に、強い自己相補性を生じるプローブ設計も避けるべきであ る。前に説明したように、ハイブリダイゼーションとは相補的核酸の二つの一本 鎖が会合して水素結合で結合された二本鎖ハイブリッドを形成することである。 従って、二つの鎖の一つが完全にまたは部分的に分子内または分子間ハイブリッ ドに含まれているとしたら、新しい分子間プローブ：標的ハイブリッドの形成に 関与しにくいであろう。リボソームＲＮＡ分子は水素結合により非常に安定な分 子内ヘリックスおよび二次構造を形成することが知られている。標的化された配 列の実質的な部分がプローブとのハイブリダイゼーションまで一本鎖状態で残っ ているようにハイブリダイゼーションアッセイを設計することにより、プローブ および標的間のハイブリダイゼーションの速度および程度が著しく増加するであ ろう。 このことの一つの方法は、標的ヌクレオチド配列として分子内水素結合に含まれ ていない配列を選ぶことにより達成されるであろう。もしくはまたはさらに、標 的部位をハイブリダイゼーションのためにハイブリダイゼーションアッセイプロ ーブにより近づき易くするようにできるヘルパーオリゴヌクレオチドとのプロー ブ混合物としてハイブリダイゼーションアッセイプローブが使用される。 ＤＮＡ標的は自然にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の生成物のようにニ本 鎖の形で存在する。これらのニ本鎖標的は自然にはプローブとのハイブリダイゼ ーションには阻害的であり、ハイブリダイゼーションに先立って変性を必要とす る。適した変性およびハイブリダイゼーション条件は本分野では既知である（例 えば、Ｅ．Ｍ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３（１９ ７５））。 その標的核酸へ完全に一致したオリゴヌクレオチドのために融解温度の推定値 を提供するであろう多くの式が利用可能である。そのような式の一つ、Ｔ_m＝８ １．５＋１６．６（ｌｏｇ₁₀［Ｎａ⁺）＋０．４１（分画Ｇ＋Ｃ）−（６００／ Ｎ）（式中、Ｎ＝ヌクレオチドの数でのオリゴヌクレオチドの長さ）は１４から ６０または７０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドに対して良好な推定値 を提供する。そのような計算から、続いての経験的確認またはＴ_mの”微細な調 整”が本分野ではよく知られているスクリーニング技術を用いて行われる。ハイ ブリダイゼーションおよびオリゴヌクレオチドプローブに関するさらなる情報は 、例えば、本明細書において援用されるＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓ ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８９）を 参照されたい（１１章）。この参照文献は特に本分野でよく知られており、ハイ ブリッドのＴ_mに対する不適正の影響の推定値も提供している。従って、二つま たはそれ以上の生物体のリボソームＲＮＡ（またはｒＤＮＡ）の与えられた既知 のヌクレオチド配列から、これらの生物体をお互いに区別するであろうオリゴヌ クレオチドが設計される。 Ｃ．核酸増幅 好適には、本発明の増輻オリゴヌクレオチドはオリゴデオキシヌクレオチドで あり、核酸ポリメラーゼによる伸長生成物合成のための基質として使用するのに 十分な長さである。至適プライマー長は反応温度、構造およびプライマーの塩基 組成およびいかにプライマーが使用されるべきかなどのいくつかの因子を考えに 入れなければならない。例えば、至適特異性のためにはオリゴヌクレオチドプラ イマーは一般的には標的核酸配列の複雑さに依存して少なくとも約１２のヌクレ オチドを含んでいなければならない。もしそのような特異性が必須ではないなら 、より短いプライマーが使用されるであろう；そのような場合、鋳型核酸との安 定なハイブリッド複合体を形成させるためにより冷たい温度で反応を実施するこ とが望ましいであろう。 所望の特性を持つ増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブのための有用なガイ ドラインが本明細書に記載されている。我々の最良の様式設計部位は、単一核酸 分子の約１５塩基より大きく約３５０塩基以内の、およびより好適には１５０保 存ヌクレオチド以内のライム病関連ボレリア核酸の二つおよび好適には三つの保 存領域を含んでいる。 プライマーまたはプロモータープライマーの組で観察される増幅の程度は、そ の相補的配列へハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの能力および酵素的に伸 長またはコピーされるそれらの能力を含むいくつかの因子に依存している。異な った長さおよび塩基組成のオリゴヌクレオチドが使用できるが、本発明で好適な オリゴヌクレオチドは１８−４０塩基の標的結合領域を持ち、約６５℃の標的と の予想Ｔ_mを持っている。 Ｔ_mのようなプローブのハイブリダイゼーションに影響するパラメーター、相 補性および標的配列の二次構造もまたプライマーハイブリダイゼーションおよび その結果としての性能に影響する。非特異的伸長（プライマー−ダイマーまたは 補標的のコピー）の程度もまた増幅効率に影響し、従ってプライマーは低自己− または交差−相補性を持つように選択される（特に配列の３’末端で）。長いホ モポリマー領域および高ＧＣ含量は見せかけのプライマー伸長を減少させるため に避けられる。設計のこの局面を助けるためにコンピュータープログラムが利用 可能である。 本発明の増幅オリゴヌクレオチドに関連して使用される核酸ポリメラーゼは化 学的、物理的または生物学的作用剤を意味し、それは鋳型依存的様式で核酸ポリ マーまたは鎖内へリボ−またはデオキシリボヌクレオチドまたはその両方を取り 込む。核酸ポリメラーゼの例としては、ＤＮＡ−指向ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮ Ａ−指向ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ−指向ＲＮＡポリメラーゼが含まれる 。ＤＮＡポリメラーゼは鋳型依存的様式でおよび５’から３’方向への核酸合成 を引起こす。ニ本鎖核酸中の二つの鎖は逆平行配向のため、この方向は鋳型の３ ’領域から鋳型の５’領域である。ＤＮＡ−指向ＤＮＡポリメラーゼの例には大 腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、テルムス アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕ ａｔｉｃｕs ）（Ｔａｑ）からの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよびバシルス ステアロテルモフィルス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ ｌｕｓ ）（Ｂｓｔ）からのＤＮＡポリメラーゼＩのラージフラグメントが含まれ る。ＲＮＡ−指向ＤＮＡポリメラーゼの例にはモロニーマウス白血球ウイルス（ ＭＭＬＶ）逆転写酵素またはトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素のよ うな種々のレトロウイルス逆転写酵素が含まれる。 ほとんどの核酸増幅反応の間に、核酸ポリメラーゼは鋳型として標的核酸を用 いてプライマーの３’末端にヌクレオチド残基を付加するので、標的核酸領域に 部分的にまたは完全に相補的である核酸配列を持つ第二の核酸鎖を合成する。多 くの核酸増幅反応において、生じたニ本鎖構造を含む二つの鎖は、増幅反応の進 行を可能にするために化学的または物理的手段により分離されなければならない 。もしくは、新しく合成された鋳型鎖は、鎖置換または本来の標的鎖の一部また は全部を消化する核酸分解性酵素の使用により第二のプライマーまたはプロモー ター−プライマーによるハイブリダイゼーションに利用可能なようにされるであ ろう。このように、本過程を多くのサイクル繰り返され、標的ヌクレオチド配列 を持つ核酸分子の数が多量に増加する。 第一または第二の増幅オリゴヌクレオチドまたはその両方がプロモーター−プ ライマーであろう。そのようなプロモーター−プライマーは通常標的核酸分子ま たはプライマー伸長生成物のヌクレオチド配列と相補的ではないヌクレオチド配 列を含んでいる。これらの非相補的配列は増幅オリゴヌクレオチドの相補的配列 の５’に位置しており、核酸ポリメラーゼの作用によりニ本鎖が作製された場合 、ＲＮＡ合成開始のための座を提供するであろう。このように提供されたプロモ ーターは標的核酸配列の複数のＲＮＡコピーのインビトロ転写を可能にするであ ろう。本明細書のプライマーに言及する場合、言及の文脈において明白に他のも のを示していない限り、そのような言及はプロモーター−プライマーのプライマ ー的見地を含んでいるつもりである。 いくつかの増幅系において（例えば、Ｄａｔｔａｇｕｐｔａら、上記文献、の 増幅法）、増幅オリゴヌクレオチドは鎖置換を助ける５’非相補的ヌクレオチド を含んでいるであろう。さらに、５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ核酸ポリメ ラーゼと関連して使用された場合、増幅オリゴヌクレオチドは酵素的消化を防止 するためにそれらの５’末端が修飾されているであろう。もしくは、核酸ポリメ ラーゼは５’エキソヌクレアーゼを除去するように修飾（そのようなヌクレアー ゼを持たない活性なポリメラーゼ断片を発生するプロテアーゼでの処理によるよ うな）されているであろう。そのような場合、オリゴヌクレオチドはその５’末 端が修飾される必要はない。 １．オリゴヌクレオチドの製造 オリゴヌクレオチドはお互いに共有結合で連結されたヌクレオチドサブユニッ トから作られている。ヌクレオチドサブユニットの糖基はリボース、デオキシリ ボースまたはＯ−メチルリボースのようなそれらの修飾された誘導体である。ヌ クレオチドサブユニットはホスホジエステル結合、修飾結合またはオリゴヌクレ オチドのハイブリダイゼーションを阻害しない非ヌクレオチド残基のような結合 で連結されている。修飾結合には標準ホスホジエステル結合がホスホロチオエー ト結合またはメチルホスホネート結合のような異なった結合で置き換えられてい る結合が含まれる。前記のように、ハイブリダイゼーションアッセイプローブと して使用された場合、オリゴヌクレオチドは好適には、標的配列へのプローブの ハイブリダイゼーションの同定を助けるためアクリジニウムエステルまたは放射 性同位元素のようなレポーター基を含んでいる。 本発明のすべての増幅オリゴヌクレオチドは本分野では既知の方法により容易 に製造できる。好適には、プライマーは固相法を用いて合成された。例えば、Ｃ ａｒｒｕｔｈｅｒｓらはホスホジエステル結合によりヌクレオチドを連結するた めに標準ホスホロアミダイト固相化学の使用を記載している。シアノエチルホス ホロアミダイト前駆体を用いる自動化固相化学合成がＢａｒｏｎｅら、Ｎｕｃｌ ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ，１２：４０５（１９８４）、により記 載されている。（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１４３巻、２ ８７ページ（１９８７））。同様に、Ｂｈａｔｔはホスホロチオエート結合を含 むオリゴヌクレオチド合成のための方法を記載している。（本発明と共通の所有 権を享有する”有機リン化合物の硫化のための方法および試薬”と題した米国特 許出願第０７／３１９，５７０号）。また、Ｋｌｅｍら（”オリゴマー合成の改 良法”と題したＰＣＴ ＷＯ９２／０７８６４）は、メチルホスホネート結合を 含む異なった結合を持つオリゴヌクレオチドの合成を記載している。後の三つの 参照文献は本発明において援用される。さらに、オリゴヌクレオチドの有機合成 のための方法は当業者には既知であり，Ｓａｍｂｒｏｏｋらにより記載されてい る（上記文献、前に本明細書において援用されている）。 特定のオリゴヌクレオチドの合成および精製に続いて、いくつかの異なった方 法が大きさおよび純度の点でのプローブまたはプライマーの受容可能性を決定す るために利用される。適した方法にはポリアクリルアミドゲル電気泳動または高 速液体クロマトグラフィーが含まれる。これらの方法は両方とも当業者にはよく 知られている。 本発明のすべてのオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションアッセイプ ローブ、増幅オリゴヌクレオチドまたはヘルパーオリゴヌクレオチドにせよ、そ れらの性能を高めるためまたは増幅精製物の特性決定を容易にするために化学基 で修飾される。例えば、オリゴヌクレオチドをある種のポリメラーゼの核酸分解 活性耐性にするホスホロチオエートまたはメチルホスホネート基を持つオリゴヌ クレオチドのような主鎖修飾オリゴヌクレオチドは増幅または他の反応でのその ような酵素の使用を可能にする。修飾の別の例にはハイブリダイゼーションまた はプライマーの伸長を妨害しない、核酸鎖中のヌクレオチド間に取り込まれたヌ クレオチドリンカー（例えば、Ａｒｎｏｌｄら、”ヌクレオチドプローブのため の非ヌクレオチド結合剤”欧州特許出願第８８３０８７６６−０号）の使用が含 まれる。増幅オリゴヌクレオチドはまた所望の修飾および天然のヌクレオチドの 混合物も含んでいる。 増幅オリゴヌクレオチドの３’末端はまた、”核酸配列増幅”と題された米国 特許出願第０７／９２５，４０５号（本発明と共通の所有権を享有し、本明細書 において援用される）にＭａＤｏｎｏｕｇｈにより記載されているようにＤＮＡ 合成の開始を防止するために保護されている。異なった３’保護増幅オリゴヌク レオチドはここに記載されているように核酸増幅の効率を増加させる。 前記のように、オリゴヌクレオチドの５’末端はいくつかの核酸ポリメラーゼ に存在する５’−エキソヌクレアーゼ活性に耐性となるように修飾されている。 そのような修飾は、前に本明細書において援用された”ヌクレオチドプローブの ための非ヌクレオチド結合剤”と題してＡｒｎｏｌｄらにより記載されているよ うな技術を用いてプライマーの末端５’ヌクレオチドへ非ヌクレオチド基を付加 させることにより実施できる。 一度合成されたら、選択されたオリゴヌクレオチドプローブはいくつかの既知 の方法により標識される（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記文献）。有用な 標識には放射性同位元素ならびに非放射活性レポート基が含まれる。同位元素標 識には³Ｈ、³⁵Ｓ、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ、⁵⁷Ｃｏおよび¹⁴Ｃが含まれる。同位元素標識は 、ニックトランスレーション、末端標識、第二鎖合成、逆転写の使用および化学 的方法のような本分野では既知の技術によりオリゴヌクレオチド内へ導入できる 。放射性標識プローブを使用した場合、ハイブリダイゼーションはオートラジオ グラフィー、シンチレーション計数またはガンマ計数により検出できる。選択さ れる検出法は標識に使用された特定の放射性同位元素に依存するであろう。 非同位元素物質もまた標識に使用でき、核酸配列の内部にまたは核酸配列の末 端に導入される。修飾ヌクレオチドは酵素的にまたは化学的に取り込まれる。プ ローブの化学修飾は、例えば、Ａｒｎｏｌｄら（”ヌクレオチドプローブのため の非ヌクレオチド結合剤”と題したＥＰＯ出願番号第８８３０８７６６−０号、 公開番号第３１３２１９号、本明細書において援用される）により記載されたよ うな非ヌクレオチドリンカー基の使用により、プローブ合成の間または後で実行 される。非同位元素標識には蛍光分子、化学発光分子、酵素、補因子、酵素基質 、ハプテンまたはその他のリガンドが含まれる。 好適には、プローブはアクリジニウムエステルで標識される。アクリジニウム エステル標識はＡｒｎｏｌｄら（”アクリジニウムエステル標識およびヌクレオ チドプローブの精製”と題して１９９３年２月９日に公開された米国特許第５， １８５，４３９号、本明細書において援用される）により記載されたように実施 される。 ２．ボレリアｒＲＮＡおよびｒＤＮＡの増幅 本発明の増幅オリゴヌクレオチドは特定のボレリア１６Ｓまたは２３Ｓ ｒＲ ＮＡヌクレオチド配列またはそれらのｒＤＮＡ対応物に方向付けられている。こ れらの増幅オリゴヌクレオチドは、核酸増幅アッセイにおいてボレリアの存在を 検出するためのハイブリダイゼーションアッセイプローブとして使用された少な くとも一つの標的ヌクレオチド配列内に隣接または含まれている。本明細書にお いて記載され特許請求された増幅オリゴヌクレオチドは二つの組の増幅オリゴヌ クレオチドを含んでいる。増幅オリゴヌクレオチドの組の構成物は以下のヌクレ オチド配列の一つを持つかまたは実質的に対応している核酸とハイブリダイズで きる： および 好適な態様において、これらの増幅オリゴヌクレオチドは以下の配列を持つか または実質的に対応している： および これらのオリゴヌクレオチドはまた、その５’末端にＲＮＡポリメラーゼを結合 でき、鋳型として標的核酸を用いるＲＮＡ転写を指図するプロモーター配列を含 む追加の非相補的塩基も持っている。 ボレリアの１６Ｓ ｒＲＮＡへ方向付けられた好適な増幅プライマーは以下の 配列を持つかまたは実質的に対応している： および これらの１６Ｓ ｒＲＮＡ増幅オリゴヌクレオチドは特定のボレリア１６Ｓ ｒＲＮＡ核酸配列、ｒＤＮＡ対応物に方向付けることができ、部分的または完全 にこれらの配列と重複している。 好適であるのはヌクレオチド配列： に実質的に対応するヌクレオチド配列を持つ１６Ｓ増幅オリゴヌクレオチドであ る。 最も好適であるのはヌクレオチド配列： （式中、１９の最も３’のヌクレオチドが示された通り厳密であるである）に実 質的に対応するヌクレオチド配列を持つ１６Ｓ増幅オリゴヌクレオチドである。 ボレリアの２３６Ｓ ｒＲＮＡへ方向付けられた好適な増幅プライマーは以下 の配列を持つかまたは実質的に対応している： および これらの２３Ｓ ｒＲＮＡ増幅オリゴヌクレオチドは特定のボレリア２３Ｓ ｒＲＮＡ核酸配列、ｒＤＮＡ対応物に方向付けることができ、部分的または完全 にこれらの配列と重複している。 本発明のすべての増幅オリゴヌクレオチドはこれらの配列への修飾または付加 を含まない配列を持っている。増幅オリゴヌクレオチドはまた、またはもしくは 、保護された３’および／または５’末端またはＲＮＡポリメラーゼにより認識 される特異的ヌクレオチド配列（例えば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６ ＲＮＡポリ メラーゼのためのプロモーター配列）の付加、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ 転写の開始または延長を促進する配列の付加、または分子内塩基対合を提供し、 二次または三次核酸構造の形成を助長する配列の付加を含む（これらに制限され るわけではない）付加のような修飾を持っていてもよい。 ポリメラーゼ連鎖反応またはＫａｃｉａｎおよびＦＵｌｔｚ、上記文献，Ｄａ ｔｔａｇｕｐｔａら、上記文献、およびＳｎｉｎｓｋｙら、米国特許第５，０７ ９，３５１号（どちらも本明細書において援用され、最初の二つは本発明と共通 の所有権を享有している）により記載されたようなＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ ポリメラーゼおよびＲＮＡｓｅ Ｈまたはその均等物を用いる増幅反応のような 核酸増幅反応で増幅オリゴヌクレオチドが使用される。 増幅された標的配列の検出に広範囲の方法が利用できる。例えば、ヌクレオチ ド基質またはプライマーは新たに合成されるＤＮＡ内へ取り込まれる検出可能な 標識を含むことができる。生じた標識増幅生成物は次に、未使用の標識ヌクレオ チドまたはプライマーから分離され、標識は分離された生成物分画で検出される 。 有用な検出可能標識として働くことができる物質は本分野ではよく知られてお り、放射性同位元素、蛍光化合物、化学発光化合物、発色団、ならびにビオチン およびハプテンのようなリガンド（こられは直接的には検出可能ではないが、例 えば、各々アビジンおよび抗体のようなそれらの特異的結合相手の標識形との反 応により容易に検出できる）が含まれる。 増幅生成物を検出する別の方法は、検出可能なように標識した核酸プローブと ハイブリダイゼーションさせ、生じたハイブリッドを通常の様式で測定する方法 である。特に、生成物は標的配列へ化学発光アクリジニウムエステル標識核酸プ ローブをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしていないプローブ上に存在する アクリジニウムエステルを選択的に加水分解し、ルミノメーターで残存するアク リジニウムエステルから発生する化学発光を測定することによりアッセイできる 。（例えば、Ａｒｎｏｌｄら、上記文献、ＰＣＴ出願番号ＵＳ８８／０２７４６ 、およびＮｅｌｓｏｎら、”Ｎｏｎ−Ｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉ ｅｇｏ（Ｋｒｉｃｋａ編、１９９２年）、両方の参照文献ともに本明細書におい て援用される、を参照されたい。） Ｄ．ボレリアｒＲＮＡおよびｒＤＮＡに対するオリゴヌクレオチドハイブリダイ ゼーションアッセイプローブ 本明細書において開示および請求されているオリゴヌクレオチドハイブリダイ ゼーションアッセイプローブは系統発生学的に密接に関連した細菌種の核酸を制 して、ライム病関連ボレリアｒＲＮＡまたはｒＤＮＡヌクレオチド配列を含む標 的核酸へ優先的にハイブリダイズできる。これらのハイブリダイゼーションプロ ーブは、ライム病関連ボレリアおよび該系統発生学的に密接に関連した種のヌク レオチド配列の比較に基づいて設計され、選択されおよび／または決められた。 好適な態様において、これらのプローブはボレリア ヘルムシーの核酸を制して ライム病関連ボレリアの核酸に選択的にハイブリダイズする。 本発明はライム病関連ボレリアまたはボレリア ヘルムシーを含むボレリア種 の核酸に選択的にハイブリダイズするが密接に関連した微生物の核酸とはハイブ リダイズしないオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを企図して おり、以下の核酸配列を持つまたは実質的に対応する核酸配列が含まれる： および ライム病関連ボレリアの核酸に選択的にハイブリダイズする本発明のハイブリ ダイゼーションアッセイプローブは以下の核酸配列を持つまたは実質的に対応す る： および 現在の所、ライム病関連ボレリアの１６Ｓ ｒＲＮＡに方向付けられたこれら のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブの好適な態様は 以下のヌクレオチド配列を持つまたは実質的に対応する： および ライム病関連ボレリアの２３Ｓ ｒＲＮＡに方向付けられたこれらのオリゴヌ クレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブの好適な態様は以下のヌク レオチド配列を持つまたは実質的に対応する： および 本発明の多くのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブ は他の系統発生学的に密接に関連した細菌種の核酸を制して、ボレリア ヘルム シー ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡヌクレオチド配列を含む標的核酸へ好適にハイブリ ダイズする。好適な態様において、これらのハイブリダイゼーションアッセイプ ローブは他のボレリア核酸からボレリア ヘルムシー核酸を区別できる。 ボレリア ヘルムシーに由来する核酸に選択的にハイブリダイズする本発明の ハイブリダイゼーションプローブは以下のヌクレオチド配列を持つまたは実質的 に対応する： および ボレリア ヘルムシーの１６Ｓ ｒＲＮＡに方向付けられたこれらのオリゴヌ クレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブの好適な態様は以下のヌク レオチド配列を持つまたは実質的に対応する： および ボレリア ヘルムシーの２３Ｓ ｒＲＮＡに方向付けられたこれらのオリゴヌ クレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブの好適な態様は以下のヌク レオチド配列を持つまたは実質的に対応する： および 本発明のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブは、標 的配列へプローブがハイブリダイズしたことを検出または確認するために使用で きる放射性同位元素、蛍光性または化学発光性残基、酵素またはその他のリガン ドのようなレポーター基残基で好適に標識される。標識として化学発光性アクリ ジニウムエステルの使用が最も好ましい。本出願と共通の所有権を享有し、本明 細書において援用されるＡｒｎｏｌｄらによる米国特許第５，１８５，４３９号 を参照されたい。アッセイプローブは、相補性領域中での水素結合形成により二 つの鎖のアニーリングを可能にするために適したハイブリダイゼーション条件下 、標的配列を持っている核酸を含むと疑われる試料と混合する。プローブは標的ボレリア ヌクレオチド配列を持っている核酸との結合を容易にするため、一つま たはそれ以上の非標識ヘルパーオリゴヌクレオチドとも結合されているであろう 。プローブは試料中に存在する標的核酸へハイブリダイズする；生じたハイブリ ッドデュープレックスは分離され、ヒドロキシアパタイト吸着および放射活性モ ニタリングのような本分野ではよく知られている種々の技術により検出される。 本出願と共通の所有権を享有し、本明細書において援用されるＡｒｎｏｌｄらに よる米国特許第５，２８３，１７４号に開示されているような、ハイブリダイズ していないプローブ上に存在する標識を選択的に分解し、続いて残存するハイブ リ ダイズしたプローブに付随する標識の量を測定することを含む技術もこれらの技 術の中に含まれている。この後者の技術が現在のところ好ましい。 Ｅ．ボレリアの検出に使用されるヘルパーオリゴヌクレオチド 特異的ヘルパーオリゴヌクレオチドが標的核酸へのハイブリダイゼーションア ッセイプローブのハイブリダイゼーションを容易にするために使用された。ヘル パーオリゴヌクレオチドは、本出願と共通の所有権を享有し、本明細書において 援用される”核酸ハイブリダイゼーションを促進するための手段および方法”と 題されたＨｏｇａｎおよびＭｉｌｌｉｍａｎによる米国特許第５，０３０，５５ ７号に開示されている。 ヘルパープローブはハイブリダイゼーションアッセイプローブにより標的化さ れた領域近くに位置する核酸配列へハイブリダイズするように選択される。ヘル パープローブのハイブリダイゼーションは標的核酸の二次および三次構造を変化 させ、標的核酸へのプローブのハイブリダイゼーションを容易にする。 ボレリア核酸の特異的検出を容易にするための特異的ヘルパーオリゴヌクレオ チドはこれらのヌクレオチド配列の一つを持っているかまたは実質的に対応して いる： および 別の態様において、ボレリア核酸の特異的検出を容易にするための特異的ヘル パーオリゴヌクレオチドは以下のヌクレオチド配列の一つを持っているかまたは 実質的に対応している： および 好適な態様において、ヘルパーオリゴヌクレオチドと一緒にプローブ混合物で 使用されるライム病関連ボレリアの１６Ｓリボソーム核酸に方向付けられたハイ ブリダイゼーションアッセイプローブは以下のヌクレオチド配列を持っているか または実質的に対応している： および 最も好適な態様において、実質的に に対応するライム病関連ボレリア１６Ｓリボソーム核酸に方向付けられたハイブ リダイゼーションプローブは以下のヌクレオチド配列： および を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオチドと一緒にプローブ混 合物で使用される。 最も好適な態様において、実質的に に対応するライム病関連ボレリア１６Ｓリボソーム核酸に方向付けられたハイブ リダイゼーションプローブは以下のヌクレオチド配列： および を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオチドと一緒にプローブ混 合物で使用される。 好適な態様において、ヘルパーオリゴヌクレオチドと一緒にプローブ混合物で 使用されるライム病関連ボレリアの２３Ｓ核酸に方向付けられたハイブリダイゼ ーションアッセイプローブは以下のヌクレオチド配列を持っているかまたは実質 的に対応している： および 最も好適な態様において、実質的に に対応するライム病関連ボレリア２３Ｓリボソーム核酸に方向付けられたハイブ リダイゼーションプローブは以下のヌクレオチド配列： および を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオチドと一緒にプローブ混 合物で使用される。 好適な態様において、実質的に配列ＩＤ番号１０または配列ＩＤ番号３３に対 応するボレリア ヘルムシー１６Ｓリボソーム核酸に方向付けられたハイブリダ イゼーションプローブは以下のヌクレオチド配列： および を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオチドと一緒にプローブ混 合物で使用される。 好適な態様において、実質的に に対応するボレリア ヘルムシー１６Ｓリボソーム核酸に方向付けられたハイブ リダイゼーションプローブは以下のヌクレオチド配列： および を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオチドと一緒にプローブ混 合物で使用される。 好適な態様において、ボレリア ヘルムシー２３Ｓリボソーム核酸に方向付け られたハイブリダイゼーションプローブは以下のヌクレオチド配列： および を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオチドと一緒にプローブ混 合物で使用される。 好適な態様において、実質的に に対応するボレリア ヘルムシー２３Ｓリボソーム核酸に方向付けられたハイブ リダイゼーションプローブは以下のヌクレオチド配列： および を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオチドと一緒にプローブ混 合物で使用される。 ヘルバーオリゴヌクレオチドは一般的にはストリンジェントハイブリダイゼー ション条件下で使用されるが、特異性においては種特異的である必要はない；す なわち、ヘルパーオリゴヌクレオチドのための標的ヌクレオチド配列は種ボレリ ア に独特である必要はない。 Ｆ．核酸組成物 別の関連する態様において、本発明はハイブリダイゼーションアッセイプロー ブおよびそれに対して実質的に相補的である核酸配列間の核酸ハイブリッド（プ ローブ：標的）を含む組成物を特色としている。プローブおよび標的間で形成さ れたハイブリッドの一つの使用は標的配列の存在を検出することである。例えば 、ハイブリッドに存在するアクリジニウムエステル（”ＡＥ”）はアルカリ溶液 での加水分解に抵抗するが、一方一本鎖核酸に存在するＡＥはアルカリ溶液で加 水分解される（Ａｒｎｏｌｄら、”同質保護アッセイ”と題されたＥＰＯ出願番 号第８８３０８７６７．８号、公開番号第３０９２３０号、および米国特許番号 第５，２３８，１７４号、本明細書において援用される）。従って、非結合ＡＥ −標識プローブの加水分解後、核酸ハイブリッドに付随する残存アクリジニウム エステルの化学発光を測定することにより標的核酸の存在が検出できる。 本発明はまた増幅オリゴヌクレオチドおよびそれに対して実質的に相補的な核 酸配列間の核酸ハイブリッド（プライマー：標的）を含む組成物も企図している 。プライマーおよび標的間で形成された核酸ハイブリッドの一つの使用は増幅オ リゴヌクレオチドの３’末端にポリメラーゼのための開始部位を提供することで あ る。例えば、ハイブリッドは逆転写酵素、ＴａｑポリメラーゼのようなＤＮＡポ リメラーゼおよびＴ７ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼおよびＴ３ポリメラー ゼなどのようなＤＮＡポリメラーゼのための開始部位を形成するであろう。 本発明はまた、ヘルパーオリゴヌクレオチドおよびそれに対して実質的に相補 的である核酸配列間の核酸ハイブリッド（ヘルパーオリゴヌクレオチド：標的） を含む組成物を特色とする。ヘルパーオリゴヌクレオチドおよび標的間のハイブ リッドの一つの使用は特別の核酸配列をハイブリダイゼーションに利用できるこ とにすることである。例えば、ヘルパーオリゴヌクレオチドおよびその標的間の ハイブリッドは核酸配列をハイブリダイゼーションプローブとのハイブリダイゼ ーションに利用可能な標的配列へハイブリダイズできるようにするであろう。ヘ ルパーオリゴヌクレオチド使用の完全な記述はＨｏｇａｎおよびＭｉｌｌｉｍａ ｎによる米国特許第５，０３０，５５７号に提供されている。 本発明の組成物にはボレリア核酸および下記の核酸配列の少なくとも一つに実 質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成された核酸ハイブリ ッドを含むボレリア核酸を検出するための組成物が含まれる： および 本発明の好適な組成物にはボレリア核酸および下記の核酸配列の少なくとも一 つに実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成された核酸ハ イブリッドを含むライム病関連ボレリアを検出するための組成物が含まれる： および 本発明の好適な組成物にはボレリア核酸および下記の核酸配列の少なくとも一 つに実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成された核酸ハ イブリッドを含むライム病関連ボレリアを検出するための組成物が含まれる： および 本発明はまた、ボレリア核酸および に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成され、および、 また以下の核酸配列： および の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドも持つ 核酸ハイブリッドを含むライム病関連ボレリアを検出するための組成物も企図し ている。 本発明はまた、ボレリア核酸および に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成され、および、 また以下の核酸配列： および の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドも持つ 核酸ハイブリッドを含むライム病関連ボレリアを検出するための組成物も企図し ている。 本発明の好適な組成物にはボレリア ヘルムシー核酸および下記の核酸配列の 少なくとも一つに実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成 された核酸ハイブリッドを含むボレリア ヘルムシーを検出するための組成物が 含まれる： および 本発明のより好適な組成物にはボレリア ヘルムシー核酸および下記の核酸配 列の少なくとも一つに実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で 形成された核酸ハイブリッドを含むボレリア ヘルムシーを検出するための組成 物が含まれる： および 本発明はまた、ボレリア ヘルムシー核酸および に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成され、および、 以下の核酸配列： および の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドも持つ 核酸ハイブリッドを含むボレリア ヘルムシーを検出するための組成物も企図し ている。 本発明はまた、ボレリア ヘルムシー核酸および に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成され、および、 また以下の核酸配列： および の少なくとも一つと実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチドも持つ 核酸ハイブリッドを含むボレリア ヘルムシーを検出するための組成物も企図し ている。 本発明はまた本発明のプローブおよび下記の核酸配列の少なくとも一つに実質 的に対応する核酸配列を持つ少なくとも一つのヘルパーオリゴヌクレオチドを含 む核酸ハイブリッドを企図している： および 本発明はまた、ボレリア核酸および および に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成され、および、 また以下の核酸配列： および の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドも持ち 、および随意に以下の配列： および の一つに実質的に対応する配列を持つ一つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド を含む核酸ハイブリッドからなるライム病関連ボレリアを検出するための組成物 も企図している。 本発明はまた、ボレリア核酸および および に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成され、および、 また以下の核酸配列： および の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドも持ち 、および随意に以下の配列： および の一つに実質的に対応する配列を持つ一つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド を含む核酸ハイブリッドからなるライム病関連ボレリアを検出するための組成物 も企図している。 本発明はまた、ボレリア ヘルムシー核酸および および に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成され、および、 また以下の核酸配列： および の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドも持ち 、および随意に以下の配列： および の一つに実質的に対応する配列を持つ一つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド を含む核酸ハイブリッドからなるボレリア ヘルムシーを検出するための組成物 も企図している。 本発明はまた、ボレリア ヘルムシー核酸および および に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成され、および、 また以下の核酸配列： および の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドも持ち 、および随意に以下の配列： および の一つに実質的に対応する配列を持つ一つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド を含む核酸ハイブリッドからなるボレリア ヘルムシーを検出するための組成物 も企図している。 好適な態様において、本発明はまた本発明のプローブおよび下記の核酸配列の 少なくとも一つに実質的に対応する核酸配列を持つ少なくとも一つのヘルパーオ リゴヌクレオチドを含む核酸ハイブリッドを企図している： 本発明はまた、ボレリア核酸および または （ここで１９の最も３’のヌクレオチドは示されたように厳密である）に実質的 に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成された核酸ハイブリッド を含むライム病関連ボレリアを検出するための組成物も企図している。 Ｇ．アッセイ法 本発明は試料内のボレリア核酸の存在をアッセイするための種々の方法を企図 している。使用される厳密なアッセイ条件、プローブまたはプライマーは、使用 される特定のアッセイ型および試料源に依存して変化するであろうことが当業者 には理解されるであろう。 一般に、本発明はストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、試験試料 をストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でボレリア標的核酸とハイブ リダイズできるが、密接に関連した微生物からの核酸とはハイブリダイズできな い核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させることによりボレリ ア 微生物の存在を検出する方法を企図しており、該標的核酸は： および から成る群より選択される配列に実質的に対応する核酸配列を持っている。 ライム病関連ボレリアの存在を検出するための好適な方法は、ストリンジェン トハイブリダイゼーション条件下、試験試料をストリンジェントハイブリダイゼ ーション条件下でライム病関連ボレリア標的核酸とハイブリダイズできるが、ボ レリア ヘルムシー のような密接に関連した細菌の核酸配列とはハイブリダイズ できない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させる工程を含み 、 該標的核酸配列は： および から成るより選択される配列に実質的に対応する。 ライム病関連ボレリアの存在を検出するためのより好適な方法は、ストリンジ ェントハイブリダイゼーション条件下、試験試料をストリンジェントハイブリダ イゼーション条件下でライム病関連ボレリア標的核酸とハイブリダイズできるが 、ボレリア ヘルムシーのような密接に関連した細菌の核酸配列とはハイブリダ イズできない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させる工程を 含み、該標的核酸配列は： および から成るより選択される配列に実質的に対応する。 本発明はまた、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、試験試料を ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でボレリア１６Ｓリボソーム核 酸配列とハイブリダイズできるが、密接に関連した微生物からの核酸配列とはハ イブリダイズできない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させ ることによりボレリア微生物の存在を検出する方法を企図しており、該標的核酸 配列は： および から成る群より選択される配列に実質的に対応している。 一般に、本発明はストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、試験試料 をストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でボレリア２３Ｓリボソーム 核酸とハイブリダイズできるが、密接に関連した微生物からの核酸配列とはハイ ブリダイズできない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させる ことによりボレリア微生物の存在を検出する方法を企図しており、該標的核酸配 列は： および から成る群より選択される配列に実質的に対応している。 本発明はストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、試験試料をストリ ンジェントハイブリダイゼーション条件下でボレリア１６Ｓリボソーム核酸配列 とハイブリダイズできるが、ボレリア ブルグドルフェリおよび他のライム病関 連ボレリアのような密接に関連した微生物からの核酸とはハイブリダイズできな い核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させることによりボレリ ア ヘルムシー 微生物の存在を検出する方法を企図しており、該標的核酸配列は ： および から成る群より選択される配列に実質的に対応するヌクレオチド配列を持ってい る。 本発明はストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、試験試料をストリ ンジェントハイブリダイゼーション条件下でボレリア２３Ｓリボソーム核酸配列 とハイブリダイズできるが、ボレリア ブルグドルフェリおよび他のライム病関 連ボレリアのような密接に関連した微生物からの核酸配列とはハイブリダイズで きない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させることによりボ レリア ヘルムシー 微生物の存在を検出する方法を企図しており、該標的核酸配 列は： および から成る群より選択される配列に実質的に対応する。 本発明はまた、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、試験試料を ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でライム病関連ボレリア１６Ｓ リボソーム核酸配列とハイブリダイズできるが、密接に関連した微生物からの核 酸配列とはハイブリダイズできない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプロー ブと接触させることによりライム病関連ボレリア微生物の存在を検出する方法を 企図しており、該標的核酸配列は： および から成る群より選択される配列に実質的に対応している。 最も好適であるのはストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、試験試 料をストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でライム病関連ボレリア１ ６Ｓリボソーム核酸配列とハイブリダイズできるが、密接に関連した微生物から の核酸配列とはハイブリダイズできない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプ ローブと接触させることによりライム病関連ボレリア微生物の存在を検出する方 法であり、該標的核酸配列は： から成る群より選択される配列に実質的に対応している。 本発明はストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、試験試料をストリ ンジェントハイブリダイゼーション条件下でライム病関連ボレリア２３Ｓリボソ ーム核酸配列とハイブリダイズできるが、密接に関連した微生物からの核酸配列 とはハイブリダイズできない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接 触させることによりライム病関連ボレリア微生物の存在を検出する方法を企図し ており、該標的核酸配列は： および から成る群より選択される配列に実質的に対応している。 最も好適であるのはストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、試験試 料をストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でライム病関連ボレリア２ ３Ｓリボソーム核酸配列とハイブリダイズできるが、密接に関連した微生物から の核酸配列とはハイブリダイズできない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプ ローブと接触させることによりライム病関連ボレリア微生物の存在を検出する方 法であり、該標的核酸配列はヌクレオチド配列： に実質的に対応している。 本発明はまた、最初にボレリア核酸の一部を増幅し、次に随意に本発明のハイ ブリダイゼーションアッセイプローブを用いて本発明のプライマーにより増幅さ れた特異的ボレリア核酸をアッセイすることによるボレリア微生物の検出法も企 図している。増幅された核酸はゲル電気泳動を含む多くの方法で検出できる。 好適な態様において、本発明は最初に以下の配列： および の一つまたはそれ以上へ結合するまたは延長を起こすであろう少なくとも一つの 増幅オリゴヌクレオチドで該核酸を増幅するボレリア核酸の検出法を企図してお り、ここで該増幅オリゴヌクレオチドは随意にＲＮＡポリメラーゼにより認識さ れるまたはＲＮＡポリメラーゼによる延長の開始を促進する核酸配列を持ってい る。 この最初の方法工程に続いて、増幅工程で産生された増幅核酸をストリンジェ ントハイブリダイゼーション条件下、ボレリア核酸に特異的にハイブリダイズで きるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブで検出する。 本発明の方法で使用される増幅オリゴヌクレオチドは随意にＲＮＡポリメラー ゼにより認識される主たはＲＮＡポリメラーゼによる延長の開始を促進する核酸 配列を持っている。 Ｈ．診断システム 本発明はまたキットの形での診断システムも企図している。本発明の診断シス テムには、少なくとも１回のアッセイに十分な量の増幅プライマーおよび／また は本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブを包装素材内に包含するキ ットを含まれる。典型的には、キットにはまた包装されたプライマーおよび／ま たはプローブを使用するための説明書も含まれているであろう。 診断システムのさまざまな構成要素は種々の形で提供される。例えば、必要と される酵素、ヌクレオチド三リン酸、プライマーおよびプローブは凍結乾燥され た試薬として提供される。これらの凍結乾燥された試薬は再構成された場合、各 々の成分の適正な比を持ちアッセイに即座に使用できる完全な混合物を形成させ るために凍結乾燥に先立って混合されているであろう。さらに、本発明の診断シ ステムはキットの凍結乾燥試薬再構築のための再構築試薬を含んでいるであろう 。好適なキットにおいて、酵素、ヌクレオチド三リン酸および酵素に必要とされ る補助因子は単独の凍結乾燥試薬として提供され、再構築された場合に本方法で 使用する適切な試薬を形成する。これらの好適なキットにおいて、凍結乾燥プラ イマー試薬もまた提供される。別の好適なキットにおいては凍結乾燥プローブ試 薬が提供される。 典型的な包装素材には本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブまた は増幅プライマーを固定した範囲内に保つことができるガラス、プラスチック、 紙、およびホイルのような固体マトリックスが含まれるであろう。従って、例え ば、包装素材から作製された包装とは企図されたプライマーまたはハイブリダイ ゼーションアッセイプローブのマイクログラムからミリグラム量を包含させるた めのガラスバイアルであろうし、または本発明のプローブおよび／またはプライ マーが作動可能なように付着されている（すなわち、本発明の検出法に関与でき るように結合されている）マイクロタイタープレートであろう。 使用説明書は典型的には種々の試薬および／または試薬の濃度を記載している 明確な表現、および少なくとも一つのアッセイ法パラメーター（例えば、試料量 当たりの試薬の相対量であろう）を含んでいる。さらに、メンテナンス、時間、 温度および緩衝液条件のような明細書も含まれているであろう。 本発明は本発明の組成物のオリゴヌクレオチドを含む診断システムまたはキッ トを企図している。本発明はまた、本発明の方法を実施するのに必要なオリゴヌ クレオチドを含む診断システムまたはキットを企図している。 本発明は： および から成る群より選択される核酸配列に実質的に対応している核酸を持つ少なくと も一つのオリゴヌクレオチドを含む診断システムまたはキットを企図している。 本発明は： 該オリゴヌクレオチドが または である場合： 該オリゴヌクレオチドが または である場合： または、該オリゴヌクレオチドが である楊合： から成る群より選択される配列に実質的に対応する核酸配列を持つ少なくとも一 つのヘルパープローブを随意に持つ診断システムまたはキットを企図している。 本発明は、随意にＲＮＡポリメラーゼにより認識される、またはＲＮＡポリメ ラーゼによる開始または延長を促進する５’配列を持つ： および から成る群より選択される核酸配列に実質的に対応している核酸を持つ少なくと も一つのオリゴヌクレオチドを含む診断システムまたはキットを企図している。 本発明は： 該二つのオリゴヌクレオチドが： および から選択される場合は： および または、該オリゴヌクレオチドが および から選択される場合は： および から選択される核酸配列に実質的に対応する核酸配列を持つ少なくとも一つのオ リゴヌクレオチドを随意に持つ診断システムまたはキットを企図している。 本発明は以下の配列： および または に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを含む診断システムまた はキットを企図している。 本発明は以下の配列： および または に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを含む診断システムまた はキットを企図している。 本発明は以下の配列： および または に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを含む診断システムまた はキットを企図している。 本発明は以下の配列： または に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを含む診断システムまた はキットを企図している。 本発明は以下の配列： または に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを含む診断システムまた はキットを企図している。実施例 ： 本発明の異なった特色および態様を例示するために以下に実施例が提供される 。これらの実施例は開示された発明を制限することを意図しているものではない 。 ボレリア ブルグドルフェリを含むライム病関連ボレリアに対して特異的なプ ローブは報告および決定されている１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡ配列から同定 された。系統発生的に近い近縁種Ｂ．ヘルムシー、Ｂ．トゥリカテ、Ｂ．アンセ リナ およびＢ．コリアセエからの核酸配列は変異領域を同定するためにＢ．ブル グドルフェリ の核酸配列との比較に使用された。 以下のハイブリダイゼーションアッセイプローブ配列は以下の実施例に特徴が 示されている：配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２および配列ＩＤ番号：２１ はＢ．ブルグドルフェリに方向付けられており、および配列ＩＤ番号：１０およ び２２はＢ．ヘルムシーに方向付けられている。 プローブはＡｒｎｏｌｄら（上記文献、”ヌクレオチドプローブのための非ヌ クレオチド結合剤”）により記載されているように非ヌクレオチドリンカーで合 成され、次にＡｒｎｏｌｄら（上記文献、米国特許第５，１８５，４３９号）に より記載されているように化学発光性アクリジニウムエステルで標識された。ラ イム病関連ボレリアに対する反応性および特異性はＡｒｎｏｌｄら（上記文献、 ”均質保護アッセイ”）およびＡｒｎｏｌｄら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３５：１ ５８８（１９８９）、本明細書において援用される）により記載されているよう な均質アッセイフォーマットを用いて示された。結果はルミノメーターにより検 出された光子計測の相対的光ユニット（ＲＬＵ）として与えられた。プローブは 細胞溶解物の核酸または標的増幅反応の生成物とハイブリダイズされた。以下の 実 施例はボレリア ブルグドルフェリを含むライム病関連ボレリアを標的とするハ イブリダイゼーションアッセイプローブおよび増幅オリゴヌクレオチド、および ハイブリダイゼーションおよび増幅／ハイブリダイゼーションアッセイにおける それらの使用を記載している。 実施例１． １６Ｓ ｒＲＮＡを標的とするプローブを用いたライム病関連ボレ リアの検出 この実施例はＢ．ブルグドルフェリからのライム病関連ボレリア核酸を直接検 出するために（しかしＢ．ヘルムシーは検出しない）ライム病関連ボレリア１６ Ｓ ｒＲＮＡを標的としたプローブの能力を例示している。プローブ溶液は配列 、配列ＩＤ番号：１で合成されたアクリジニウムエステル標識プローブおよび配 列ＩＤ番号：３および配列ＩＤ番号：５を持つ対応する非標識ヘルパーオリゴヌ クレオチドを含んでいる。配列ＩＤ番号：１からなるプローブの標的配列はライ ム病関連ボレリア群を示す株で同一になるように選択され、従ってこのプローブ はライム病に関連する三つすべての亜種または種（ＶＳ４６１、Ｂ．ブルグドル フェリ センス ストリクチュ およびＢ．ガリニー）を検出することが期待され る。 Ｂ．ブルグドルフェリ、Ｂ．ヘルムシーおよび大腸菌１６Ｓの領域を整列させ たものが以下に示されており、点は配列における類似点を示している： 以下の実験において、細胞溶解物から放出された核酸が直接アッセイされた。 溶解物を調製するための方法の例はＭｕｒｐｈｙら（ＥＰＯ公開番号第２８８６ １８号、本明細書において援用される）により提供されている。各々の細胞の５ ０μｌおよび１００ｍＭコハク酸リチウム ｐＨ５、２％（ｗ／ｖ）ラウリル硫 酸リチウム、１．２Ｍ塩化リチウム、２０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ Ａ）、およびエチレングリコールビス（ベータ−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ ，Ｎ’，Ｎ’四酢酸（ＥＧＴＡ）を含む５０μｌのプローブ溶液を混合し、６０ ℃で２０分インキュベートし、続いて０．３ｍｌの０．１５Ｍ四ホウ酸ナトリウ ムｐＨ８．５、１％トリトンＸ−１００を加え、６０℃で１５分間インキュベー トした。反応液を冷却し、０．１％過酸化水素を含む１ｍＭ硝酸の自動注入、続 いての１Ｍ水酸化ナトリウム溶液の注入後、ハイブリダイズしたアクリジニウム エステル標識プローブからの残存する化学発光をルミノメーターで測定した。結 果は相対的光ユニットまたはＲＬＵで与えられた。配列ＩＤ番号：５８−６３を 含むヘルパーオリゴヌクレオチドとともに全細菌／酵母プローブ混合物が細菌核 酸の存在を示すために対照として使用された。Ｈｏｇａｎら（上記文献、”非ウ イルス生物体の検出および／または定量のための核酸プローブ”と題された）は 適した全細菌／酵母プローブ混合物の例を与えている。データは、プローブはラ イム病関連ボレリア種ボレリア ブルグドルフェリとハイブリダイズし、それを その密接な系統発生学的近縁種ボレリア ヘルムシーと区別していることを示し ている。 実施例２． 増幅に続いてのオリゴヌクレオチドプローブを用いるボレリア生物 体の検出 少数のボレリア生物体の検出はハイブリダイゼーションによるアッセイに先だ ってのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの増幅により促進できる。この実験において、約 ３０，０００生物体からの精製Ｂ．ブルグドルフェリＤＮＡがＢ．ブルグドルフ ェリ ｒＲＮＡ配列と相補的または相同なオリゴヌクレオチドで増幅された。一つ の増幅オリゴヌクレオチドは３’末端の配列ＩＤ番号：７および５’末端のＴ７ プロモーター配列配列ＩＤ番号：４３から合成されたプロモーター−プライマー から成り(以後プロモーター−プライマーはその標的結合領域の配列ＩＤ番号で 同定されるであろう)、および第二のオリゴヌクレオチドは配列、配列ＩＤ番号： ８または９のプライマーから成っている。増幅混合物は５０ｍＭトリスＨＣｌ、 ｐＨ８．５、４０ｍＭ酢酸カリウム、６ｍＭ ＧＴＰ、６ｍＭ ＡＴＰ，２．５ ｍＭ ＵＴＰ、２．５ｍＭ ＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴ ＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、１７．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭ ジチオスレイトール、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２ｍＭス ペルミジン、３０ピコモルのプロモーター−プライマー配列ＩＤ番号：７および ３０ピコモルのプロモーター−プライマー配列ＩＤ番号：８または９を１００μ ｌの最終容量に含んでいた。混合物は９５℃で８分加熱し、４２℃まで冷却して ９００単位のＭＭＬＶ逆転写酵素（ＲＴ）および４００単位のＴ７ ＲＮＡポリ メラーゼを添加した。４２℃で２時間インキュベーション後、増幅反応液の２０ μｌが非標識ヘルパー配列ＩＤ番号：３および５を持つ配列ＩＤ番号：１のアク リジニウムエステル標識プローブとのハイブリダイゼーションによりアッセイさ れた。二回の反応の結果が報告されている。 これらのデータは、ボレリアＲＮＡに相補的な配列ＩＤ番号：１のプローブはｒ ＲＮＡ配列の直接的検出または増幅生成物の検出に使用してもよいことを示して いる。これらの結果は、配列ＩＤ番号：７（５’末端に配列ＩＤ番号：４３を加 えて）および配列ＩＤ番号：８かまたは９を持つプライマーの組はＢ．ブルグド ルフェリ 核酸を増幅できることを示している。配列ＩＤ番号：９がより有効な負 のセンスプライマーであることも明かである。実施例３ １６Ｓ ｒＲＮＡ配列へハイブリダイズするプライマーを用いるボレ リア核酸の増幅 この実施例において、ボレリアからの核酸が１６ＳリボソームＲＮＡ配列に相 補的または相同的なプライマーで増幅された。Ｂ．ブルグドルフェリまたはＢ． ヘルムシー 細胞からの溶解物がＲＮＡの保存領域へ方向付けられたプローブによ るハイブリダイゼーションにより定量された。ＲＮＡは希釈され、３０ピコモル の５’末端に配列、配列ＩＤ番号：４３を持つ配列ＩＤ番号：８のプロモーター −プライマーおよび３０ピコモルのプライマー配列ＩＤ番号：７を含む反応混合 物へ加えられた。最終反応条件は、１００ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．５、３５ ｍＭ塩化カリウム、４ｍＭ ＧＴＰ、４ｍＭ ＡＴＰ、４ｍＭ ＵＴＰ、４ｍＭ ＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ 、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ジチオスレイトー ル、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２ｍＭスペルミジンであった。混合物は９ ５℃で５分加熱し、４２℃まで冷却して８００単位のＭＭＬＶ ＲＴおよび４０ ０単位のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを添加した。４２℃で２時間インキュベーシ ョン後、反応液の２０μｌが、１５ｍＭのアルドリチオール存在下、配列、配列 ＩＤ番号：２で合成されたプローブ、および配列ＩＤ番号：４および６の非標識 ヘルパープローブを用いて実施例１に記載したようにハイブリダイゼーションに よりアッセイされた。結果はプライマーでのボレリア ブルグドルフェリ核酸の 増幅は成功し、少量のボレリアｒＲＮＡの検出を可能にした。大過剰のＢ．ヘル ムシー 核酸存在下でさえも有意な交差反応は観察されなかった。３回の反応の結 果が報告されている。 実施例４ ハイブリダイゼーションアッセイプローブ番号２および１０を用いる ボレリアの増幅および検出 この実施例においては、増幅は実施例３のように実行されるが、ただし配列Ｉ Ｄ番号：８のプロモーター−プライマー（配列ＩＤ番号：４３の５’プロモータ ー配列を持つ）および配列ＩＤ番号：１１のプライマーが使用され、および配列 ＩＤ番号：１０のプローブが使用された。この実施例で使用されたアクリジニウ ムエステル標識プローブおよび非標識ヘルパープローブは表に示されている。こ れらのデータは、これらのプライマーがＢ．ブルグドルフェリおよびＢ．ヘルム シー ｒＲＮＡ配列の両方を増幅でき、プローブは開示されたアッセイシステムで 二つの生物体間を区別したことを示している。 実施例５ ２３ＳリボソームＲＮＡへ方向付けられたプローブを用いるボレリア の検出 Ｂ．ブルグドルフェリの２３Ｓ ｒＲＮＡ配列は報告されている、Ｊ．Ｃｌｉ ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ．３０：３０８２（１９９２）およびＪ．Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌ ．１７４：３７６６−３７７４（１９９２）。ボレリア２３Ｓ ｒＲＮＡ 配列へ方向付けられた特異的プライマーおよびプローブを設計するため、密接に 関連した生物体の配列が必要とされた。ボレリア ヘルムシー、ボレリア コリ アセエ および ボレリア トゥリカテをＢＳＫ Ｈブロス（Ｓｉｇｍａ）中で数 日増殖させ、ペレット化し、５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ８．０に再懸濁した。 ＤＮＡは溶解に続いてトリスＨＣｌ［ｐＨ８．０］で平衡化したフェノール中に 調製された。最終生成物はエタノール沈澱により単離した。２３Ｓ ｒＤＮＡ配 列の５’および３’部分をポリメラーゼ連鎖反応およびＡｍｐｌｉＴａｑポリメ ラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて、ボレリア種の保存領域またはＢ ．ブルグドルフェリ 特異的配列に方向付けられたプライマーで増幅した。精製ア ンプリコンは³⁵Ｓ−ｄＮＴＰ取り込みを用い、Ｐｒｏｍｅｇａ（ｆｍｏｌキット ）またはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（サーカムベントキット）か らの市販品として入手可能なキットを使用して配列決定した。得られた配列は報 告されているボレリア ブルグドルフェリ配列（Ｇｅｎ−Ｂａｎｋ寄託番号Ｍ８ ８３３０、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：３０８２（１９９２）お よびＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：３７６６−３７７４（１９９２））と比 較した。Ｂ．ブルグドルフェリがＢ．ヘルムシーおよびＢ．トゥリカテから変異 している特異的配列が２３Ｓプローブ設計のために選ばれた。この領域は大腸菌 の塩基１４７８−１５００に対応し、Ｂ．ヘルムシーおよびＢ．トゥリカテはこ の領域に同一のヌクレオチド配列を持っていたが、Ｂ．ブルグドルフェリでは４ 塩基変化していた。一つのプローブがＢ．ブルグドルフェリに設計され、第二の プローブはＢ．ヘルムシーおよびＢ．トゥリカテに設計された（配列ＩＤ番号： ２２）。ｒＲＮＡ配列は以下に示されている： 増幅効率およびプローブ特異性を示すため、以下の実験が実施された。７ｍｌ の培養物を０.７５ｍｌの１０ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、２ｍＭ Ｅ ＤＴＡ、４０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ８を含む０．７５ｍｌの溶液を再懸濁し、 ６０℃で５分間加熱することにより細胞溶解物をＢ．ブルグドルフェリ株Ｎ４０ およびＢ．トゥリカテの培養物から調製した。各々の試料中の核酸の量を定量す るため、実施例１に記載したように異なった量の試料およびボレリア２３Ｓ ｒ ＲＮＡの保存領域に方向付けられたプローブとハイブリダイゼーションを実施し た。得られた値は既知の標品の結果と比較した。 Ｂ．ブルグドルフェリまたはＢ．トゥリカテ溶解物中の既知量の核酸を、３０ ピコモルの５’プロモーター配列（配列ＩＤ番号：４３）および配列ＩＤ番号： １９かまたは配列ＩＤ番号：２０の３’標的ハイブリダイゼーション領域で合成 したプロモーター−プライマーおよび配列ＩＤ番号：１８を持つプライマーを含 む１００μｌの反応液で増幅した。溶解物は適当な濃度に水で希釈し、プライマ ーおよびプロモーター−プライマーを含む溶液に加え、９５℃で１５分加熱した 。モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴ）９００単位およ び４００単位のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを加えた。最終増幅混合物は５０ｍＭ トリスＨＣｌ、ｐＨ８．５、３５ｍＭ塩化カリウム、４ｍＭ ＧＴＰ、４ｍＭ ＡＴＰ、４ｍＭ ＵＴＰ、４ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴ Ｐ、１．２ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２０ｍ Ｍ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、５％グリセロールを含んでいる。４２℃で ２時間インキュベーション後、全１００μｌの増幅反応液を配列ＩＤ番号：２１ のアクリジニウムエステル標識プローブによるハイブリダイゼーションでアッセ イした。ハイブリダイゼーションは０．０５Ｍコハク酸リチウム ｐＨ５、０． ６Ｍ Ｌ ｉＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、および１ ０ｍＭ ＥＧＴＡを含む２００μｌの溶液中、６０℃で１０分間で実施し、続い て３００μｌの０．１５Ｍ四ホウ酸ナトリウムｐＨ８．５、１％トリトン^RＸ− １００を加えた。この混合物は６０℃で１５分間インキュベートし、室温まで冷 却した。各々のチューブの残存化学発光を、１ｍＭ硝酸および０．１％過酸化水 素の自動注入、続いて１Ｎの水酸化ナトリウムを注入装置を備えた続いてＧｅｎ −Ｐｒｏｂｅ ＬＥＡＤＥＲ^R Ｉルミノメータでアッセイした。結果はＲＬＵ で示されている。 別の実験において、配列、配列ＩＤ番号：１９を持つオリゴヌクレオチドがプ ライマーとして使用された。配列ＩＤ番号：１８および１９および配列ＩＤ番号 ：２３および１９を持つプライマーはＢ．ブルグドルフェリ株Ｂ２１およびＢＮ ４０両方のｒＲＮＡ配列を増幅することが示された（データは示されていない） 。実施例６ ２３Ｓ ｒＲＮＡへ方向付けられたハイブリダイゼーションアッセイ プローブを用いるボレリア ヘルムシーの特異的検出 この実施例においては、Ｂ．ヘルムシーに対するプローブの特異性が示される 。Ｂ．ブルグドルフェリ、Ｂ．ヘルムシーおよびＢ．トゥリカテは２３Ｓ ｒＲ ＮＡ核酸配列レベルで非常に密接に関係している。Ｂ.ブルグドルフェリ２３Ｓ ｒＲＮＡプローブのように、２３Ｓ ｒＲＮＡの同一の領域でＢ．ヘルムシーお よびＢ．トゥリカテの両方を検出するようにプローブが設計された。Ｂ．ブルグ ドルフェリ またはＢ．ヘルムシー／Ｂ．トゥリカテ配列の両方を含む二つの合成 標的が合成され、各々の標的がハイブリダイゼーションが５５℃で１５分実施さ れることを除いて前記の条件下で配列ＩＤ番号：２２のプローブとハイブリダイ ズさせた。０．１５Ｍ四ホウ酸ナトリウムｐＨ８．５、１％トリトン^RＸ−１０ ０を含む３００μｌの溶液を加えた後、反応液は５５℃で５分インキュベートさ れた。試料は上記のようにルミノメーターで読みとられた。結果は、本プローブ はＢ．ブルグドルフェリ配列からＢ．ヘルムシー配列を区別できることを示して いる。 実施例７ ２３Ｓ ｒＲＮＡハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いる ボレリアの増幅および検出 次に、Ｂ．トゥリカテ核酸の増幅および検出が示される。Ｂ．トゥリカテ細胞 溶解物は３０ピコモルの配列、配列ＩＤ番号：１８から合成されたプライマーお よび３０ピコモルの５’配列、配列ＩＤ番号：４３および３’標的ハイブリダイ ゼーション領域配列ＩＤ番号：１９を持つプロモーター−プライマーで増幅され た。全増幅反応液は２．５ピコモルの非標識ヘルパープローブ配列ＩＤ番号：２ ３の存在下、配列ＩＤ番号：２２のプローブを用い、５５℃で１５分ハイブリダ イズされ、０．１５Ｍ四ホウ酸ナトリウムｐＨ８．５、１％トリトン^RＸ−１０ ０を加え、ルミノメーターで読みとられた。Ｂ．ヘルムシーと同一の信号が予期 され、なぜなら、２３Ｓ ｒＲＮＡのこの領域は二つの生物体の配列が同一であ るからである。 実施例８ 血液中に観察される微生物存在下でのボレリアの特異的増幅および特 異的検出 プライマー配列ＩＤ番号：１８および３’末端に配列ＩＤ番号：２０を持つプ ロモーター−プライマーが血液単離物に観察されることが予期される一団の生物 体から調製される細胞溶解物の増幅に使用された。各々の細胞溶解物から少なく とも３ｘ１０^-19モルのｒＲＮＡがヌクレオチド配列配列ＩＤ番号：２１（表８ ）または配列ＩＤ番号：２２（データは示されていない）で合成されたプローブ で試験された。両方のプローブとも非ボレリア種との交差反応は観察されなかっ た。配列ＩＤ番号：２２のプローブはＢ．トゥリカテ培養物で強い信号を与え（ ＞２，０００，０００ＲＬＵ）、Ｂ．トゥリカテ細胞の存在が確認された。配列 ＩＤ番号：２１による検出の結果は下記の表に示されている。 上記のデータは本明細書で開示および請求された新規増幅オリゴヌクレオチド およびプローブはボレリアｒＲＮＡ配列を増幅できおよびライム病関連ボレリア （ボレリア ブルグドルフェリ）を他の細菌およびボレリア属の他の構成菌から 区別できることが確認された。実施例９ １６Ｓリボソームプローブを用いるボレリアの増輻および特異的検出 １６Ｓリボソーム核酸に特異的なハイブリダイゼーションアッセイプローブ配 列ＩＤ番号：１がボレリア存在を検出するため、およびこのハイブリダイゼーシ ョンアッセイプローブが血液中に普通に観察される他の生物体と交差反応しない ことを決定するために使用された。ハイブリダイゼーションプローブは細胞溶解 物中で、ヘルパーオリゴヌクレオチド配列ＩＤ番号：３および５の存在下、ボレ リア 核酸にハイブリダイズされた。アッセイは上記実施例１に記載されたように 直接ハイブリダイゼーションフォーマットを用いて実施された。各々の試料中の リボソームｒＲＮＡの存在は試料を全細菌プローブおよびヘルパーオリゴヌクレ オチド配列ＩＤ番号：５８、５９、６０および６１、または真菌プローブおよび ヘルパープローブ配列ＩＤ番号：６２および６３とハイブリダイズすることによ り確認された。このアッセイでは、３０，０００相対的光ユニット（ＲＬＵ）よ り大きな値は陽性と考えられる。このアッセイの結果は下記表９に示されている 。 実施例１０ 三つの異なった系統発生学的群からのライム病関連ボレリアの増幅 および検出 報告されている配列は異なったライム病関連ボレリア間のプローブ配列ＩＤ番 号：２により標的とされる部位にｒＲＮＡ配列の保存が示されている。以下のデ ータは本発明のプライマーおよびプローブが、ライム病に関連したボレリアの三 つの系統発生学的グループ化を示す一つ以上の地理的場所からの単離物の増幅お よび検出に有用であることを示している。溶解物はＢ．ブルグドルフェリ株Ｎ４ ０（グループＩ）、Ｂ．ガリニー株ＩＰ−９０（ロシア単離物）および株０１４ Ａ（ＮＢＳ１６）（グループＩＩ）およびＢ．アフゼリー株ＩＰ−３（ロシア単 離物）および株０９Ａ（ＡＣＡ１、スエーデン単離物）からの培養物から、約１ ５ｍｌの培養液からの細胞を３０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６.８、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡおよび３％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウムを含む ０．１ｍｌの溶液に再懸濁することにより調製される。各々の溶解物中の核酸量 を定量するため、異なった量の溶解物および２３Ｓ ｒＲＮＡ保存領域に方向付 けられたプローブでハイブリダイゼーションを実施した。得られた値は既知の標 品の結果と比較された。既知の量のＢ．ブルグドルフェリ、Ｂ．ガリニーおよびＢ．アフゼリー 溶解物（約＝３ｘ１０−１９モルのＲＮＡ）は、配列ＩＤ番号： ８の３’標的ハイブリダイズ領域（Ｂ．ブルグドルフェリ１６Ｓ ｒＲＮＡと相 補的）の５０ピコモルのプライマー、および配列ＩＤ番号：１１のｒＲＮＡとし て同じセンスのプライマー、および５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８、２５ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＭｇＣｌ₂，２．５Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅ ｒｋｉｎ− Ｅｌｍｅｒ）を含むポリメラーゼ連鎖反応により増幅された。反応液は９５℃で ２分間加熱し、次に５５℃１分、７２℃１分、９５℃０．５分のサイクルを３５ 回行い、続いてアッセイまでに４℃に冷却する。アガロースゲル電気泳動は、三 つすべての系統発生学的群からの核酸はエチジウムブロミド染色により検出可能 な１７５塩基対断片を産生した。Ｂ．アフゼリー株０９Ａ核酸を含む試料の配列 ＩＤ番号：２アクリジニウムエステル標識プローブへの５６℃でのハイブリダイ ゼーションはこのプローブでの陽性信号を明らかにした（バックグラウンドの少 なくとも１９倍）。Ｂ．ブルグドルフェリ、Ｂ．ガリニー株ＩＰ−９０または株 ０１４ＡまたはＢ．アフゼリー株ＩＰ−３核酸は６０℃でハイブリダイズさせた 場合、少なくともバックグラウンドの１７８倍の信号を与えた。Ｂ．アフゼリー ０９８株は他の単離物よりも低いハイブリダイゼーション信号を与えたが、しか し、バックグラウンドを制して明らかに検出された。実施例１１ ５６℃でのライム病関連ボレリアの特異的増幅および検出 この実施例では、配列、配列ＩＤ番号：８から合成された３０ピコモルのプロ モーター−プライマーおよび配列ＩＤ番号：１１のプライマーを含む１００μｌ の反応液が使用された。溶解物は水で適した濃度に希釈され、プロモータープラ イマーを含む溶液に加えられ、９５℃で１５分加熱し、５分で４２℃まで冷却し た。モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴ）９００単位、 および４００単位のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを加えた。最終増幅混合物は５０ｍ ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８.５、３５ｍＭ塩化カリウム、４ｍＭ ＧＴＰ、４ｍＭ Ａ ＴＰ、４ｍＭ ＵＴＰ、４ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴＰ 、１．２ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２０ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、５％グリセロールを含んでいる。４２℃で２ 時間インキュベーション後、全１００μｌの増幅反応液を配列ＩＤ番号：２のア クリジニウムエステル標識プローブおよび非標識ヘルパープローブ配列ＩＤ番号 ：４および６または配列ＩＤ番号：１０と非標識ヘルパー配列ＩＤ番号：４およ び６によるハイブリダイゼーションでアッセイした。 ハイブリダイゼーション は０．０５Ｍコハク酸リチウム ｐＨ５、０．６Ｍ ＬｉＣｌ、１％（ｗ／ｖ） ラウリ ル硫酸リチウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、および１０ｍＭ ＥＧＴＡを含む２００ μｌの溶液中、５６℃で１５分間で実施し、続いて３００μｌの０．１５Ｍ四ホ ウ酸ナトリウムｐＨ８．５、１％トリトン^RＸ−１００を加えた。この混合物は ５６℃で１５分間インキュベートし、室温まで冷却した。各々のチューブの残存 化学発光を、１ｍＭ硝酸および０．１％過酸化水素の自動注入、続いて１Ｎの水 酸化ナトリウムを注入装置を備えた続いてＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅ ＬＥＡＤＥＲ^R Ｉルミノメータでアッセイした。結果はＲＬＵで示されている。 これらのデータは温度５６℃でのプローブ配列ＩＤ番号：２のハイブリダイゼ ーションでもＢ．ブルグドルフェリおよびＢ．ヘルムシー間の明瞭な区別が可能 であることを示している。 実施例１２ プロモーター配列を含む増幅プライマーを用いるボレリア核酸の増 幅 プライマーなしでプロモーター−プライマーのみを用いる方式で増幅オリゴヌ クレオチドおよびプローブを使用してもよい。この方式はＰＣＴ公開番号ＷＯ９ ３／２２４６１号に記載されている。二つのプロモータープライマーが合成され 、 各々が５’末端で標的相補的配列（配列ＩＤ番号：８）の３’末端に共有結合で 結合されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、配列ＩＤ番号：４３、 ５’−ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ−３’を含ん でいる。一つのプロモータープライマーは遊離の３’ＯＨ基を持つように合成さ れ、１００μｌ反応液当たり４ピコモルで使用された。第二のプロモータープラ イマーは３’末端にアルカンジオールを持つように合成され、１００μｌ反応液 当たり２６ピコモルで使用された。ボレリア溶解物は水で適した濃度に希釈され 、プロモータープライマーを含む溶液に加えられ、９５℃で５分加熱し、１５分 で４２℃まで冷却した。モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴ）９００単位、および４００単位のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを加えた。最終 増幅混合物は５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８.５、３５ｍＭ塩化カリウム、４ｍＭ ＧＴＰ、４ｍＭ ＡＴＰ、４ｍＭ ＵＴＰ、４ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ｄＡＴＰ 、１ｍＭ ｄＴＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、２０ｍＭ ＵＴＰ 、４ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、 １ｍＭ ｄＧＴＰ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２０ｍＭ Ｎ−アセチルーＬ−シス テイン、５％グリセロールを含んでいる。４２℃で３．５時間インキュベーショ ン後、３０μｌの増幅反応液を配列ＩＤ番号：２のアクリジニウムエステル標識 プローブおよび非標識ヘルパープローブ配列ＩＤ番号：４および６によるハイブ リダイゼーションでアッセイした。 ハイブリダイゼーションは０．０５Ｍコハ ク酸リチウム ｐＨ５、０．６Ｍ ＬｉＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチ ウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、および１０ｍＭ ＥＧＴＡを含む２００μｌの溶液 中、６０℃で１５分間で実施し、続いて３００μｌの０．１５Ｍ四ホウ酸ナトリ ウムｐＨ８．５、１％トリトン^RＸ−１００を加えた。この混合物は６０℃で１ ５分間インキュベートし、室温まで冷却した。各々のチューブの残存化学発光を 、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ ＬＥＡＤＥＲ^R Ｉルミノメータでアッセイした。表に は同一条件下、同一のプロモーター配列、配列ＩＤ番号：４３、５’−ＡＡＴＴ ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ−３’および３’標的相補的 領域配列ＩＤ番号：９を含んでいるプロモーター−プライマー対を用いて得られ たデータも示されている。１００μｌ当たり遊離３’ＯＨを持つ４ピコモルのプ ロモーター −プライマーおよび３’アルカンジオール基を持つように合成された２６ピコモ ルの同じプロモータープライマーが使用された。 他の態様は以下の請求の範囲内に存在する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 カーター，ニック アメリカ合衆国カリフォルニア州92116, サン・ディエゴ，ノース・アベニュー 4620，アパートメント ナンバー10

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ボレリア属のメンバーを検出するためのハイブリダイゼーションアッセイプ ローブであって、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、ボレリア核 酸配列の少なくとも一部にハイブリダイズする１０から１００ヌクレオチド長の オリゴヌクレオチドプローブを含み、該ボレリア核酸配列は： および から成る群より選択される配列と実質的に対応することを特徴とするプローブ。 ２．該プローブが、該ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、ボレリ ア 核酸配列とは優先的にハイブリダイズするが、系統発生学的に密接に関連した 微生物の核酸とはハイブリダイズしない、請求項第１項に記載の核酸ハイブリダ イゼーションアッセイプローブ。 および から成る群より選択される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドプローブと実質的 に対応し、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でボレリア属のメン バーを検出するための核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブ。 ４．請求項第１項に記載のオリゴヌクレオチドおよび少なくとも一つのヘルパー オリゴヌクレオチドを含むプローブ混合物。 ５．該ヘルパーオリゴヌクレオチドが１０−１００ヌクレオチド長のオリゴヌク レオチドであり、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、ボレリア核 酸配列にハイブリダイズし、該ヘルパーオリゴヌクレオチドは： および から成る群より選択される配列と実質的に対応する核酸配列を持つ、請求項第４ 項に記載のプローブ混合物。 ６．該オリゴヌクレオチドが： と実質的に対応するヌクレオチド配列を持ち、かつ該ヘルパーオリゴヌクレオチ ドが： および から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌ クレオチドである、請求項第４項に記載のプローブ混合物。 ７．該オリゴヌクレオチドが： と実質的に対応するヌクレオチド配列を持ち、かつ該ヘルパーオリゴヌクレオチ ドが： および から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌ クレオチドである、請求項第４項に記載のプローブ混合物。 ８．該オリゴヌクレオチドが： と実質的に対応するヌクレオチド配列を持ち、かつ該ヘルパーオリゴヌクレオチ ドが核酸配列： と実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドである、請求項第４項に 記載のプローブ混合物。 ９．該オリゴヌクレオチドが： または と実質的に対応するヌクレオチド配列を持ち、かつ該ヘルパーオリゴヌクレオチ ドが核酸配列： と実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドである、請求項第４項に 記載のプローブ混合物。 １０．ライム病関連ボレリアを検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ プローブであって、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、ライム病 関連ボレリア核酸配列に優先的にハイブリダイズするが、ボレリア ヘルムシー に存在する核酸配列とはハイブリダイズしない１０から１００ヌクレオチド長の オリゴヌクレオチドプローブをみ、該ボレリア核酸配列は： および から成る群より選択される配列と実質的に対応することを特徴とするプローブ。 および から成る群より選択される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドプローブと実質的 に対応し、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でライム病関連ボレ リア を検出するための核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブ。 １２．請求項第１０項に記載のオリゴヌクレオチドおよび少なくとも一つのヘル パーオリゴヌクレオチドを含むプローブ混合物。 １３．該プローブが： または と実質的に対応する核酸配列を持ち、該ヘルパーオリゴヌクレオチドは１０−１ ００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、およびストリンジェントハイ ブリダイゼーション条件下でライム病関連ボレリア核酸配列にハイブリダイズし 、該ヘルパーオリゴヌクレオチドは： および から成る群より選択される配列と実質的に対応する核酸配列を持つ、請求項第１ ２項に記載のプローブ混合物。 １４．該プローブが： または と実質的に対応する核酸配列を持ち、該ヘルパーオリゴヌクレオチドは１０−１ ００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、およびストリンジェントハイ ブリダイゼーション条件下でライム病関連ボレリア核酸配列にハイブリダイズし 、該ヘルパーオリゴヌクレオチドは： および から成る群より選択される配列と実質的に対応する核酸配列を持つ、請求項第１ ２項に記載のプローブ混合物。 １５．ライム病関連ボレリアを検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ プローブであって、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、ライム病 関連ボレリア核酸配列に優先的にハイブリダイズするが、ボレリア ヘルムシー に存在する核酸配列とはハイブリダイズしない１０から１００ヌクレオチド長の オリゴヌクレオチドプローブを含み、該核酸配列は： から成る群より選択される配列と実質的に対応することを特徴とするプローブ。 １６．請求項第１５項に記載のオリゴヌクレオチドおよび少なくとも一つのヘル パーオリゴヌクレオチドを含むプローブ混合物。 １７．該プローブが： または と実質的に対応する核酸配列を持ち、該ヘルパーオリゴヌクレオチドは１０−１ ００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、およびストリンジェントハイ ブリダイゼーション条件下でライム病関連ボレリア核酸配列にハイブリダイズし 、該ヘルパーオリゴヌクレオチドは： および から成る群より選択される配列と実質的に対応する核酸配列を持つ、請求項第１ ６項に記載のプローブ混合物。 １８．ボレリア核酸と、 および から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌ クレオチドとの間で形成される核酸ハイブリッドを含む、ボレリア属のメンバー を検出するための組成物。 １９．ボレリア核酸と、 および から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌ クレオチドとの間で形成される核酸ハイブリッドを含む、ボレリア核酸を増幅す るための組成物。 ２０．ボレリア核酸と、核酸配列： に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドとの間で形成される核酸 ハイブリッドを含み、およびさらに： および から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌ クレオチドを含む組成物。 ２１．さらにヘルパーオリゴヌクレオチドを含む、請求項第１８項に記載の組成 物。 ２２．ボレリア核酸と、 および から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌ クレオチドとの間で形成される核酸ハイブリッドを含む、ライム病関連ボレリア を検出するための組成物。 ２３．ライム病関連ボレリアの存在を検出するための方法であって、ストリンジ ェントハイブリダイゼーション条件下、試験試料とストリンジェントハイブリダ イゼーション条件下でライム病関連ボレリア１６Ｓ標的核酸配列とはハイブリダ イズできるが、ボレリア ヘルムシーからの核酸配列とはハイブリダイズできな い核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブを接触させる工程を含み、該標 的核酸配列は： および から成る群より選択される配列と実質的に対応することを特徴とする方法。 ２４．ライム病関連ボレリアの存在を検出するための方法であって、ストリンジ ェントハイブリダイゼーション条件下、試験試料とストリンジェントハイブリダ イゼーション条件下でライム病関連ボレリア標的２３Ｓ核酸配列とはハイブリダ イズできるが、ボレリア ヘルムシーからの核酸配列とはハイブリダイズできな い核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブを接触させる工程を含み、該標 的核酸配列は： から成る群より選択される配列と実質的に対応することを特徴とする方法。 ２５．試験試料中のボレリア核酸の数を増加させるための方法であって、 ａ）以下のヌクレオチド配列： および の一つまたはそれ以上に実質的に対応する核酸配列に結合するかまたはそれを通 した延長を起こす一つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチドで該核酸を増幅 することを含み、ここで該増幅オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼによ り認識されまたはＲＮＡポリメラーゼによる開始または延長を促進する核酸配列 を随意に持つことを特徴とする方法。 ２６． ｂ）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、ボレリア核酸に 特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッ セイプローブで増幅された核酸を検出する工程をさらに含む、請求項第２５項に 記載の方法。 ２７．試験試料中のボレリア核酸を増幅する方法であって、該核酸を、以下のヌ クレオチド配列： と実質的に対応する核酸配列に結合するかまたはそれを通しての延長を起こすで あろう一つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチド、および以下のヌクレオチ ド配列： および と実質的に対応する核酸配列に結合するであろう、またはそれを通しての延長を 起こすであろう第二の増幅オリゴヌクレオチドで増幅することを含み、ここで該 増幅オリゴヌクレオチドの一つはＲＮＡポリメラーゼにより認識されまたはＲＮ Ａポリメラーゼによる開始または延長を促進する核酸配列を随意に持つことを特 徴とする方法。 ２８． ｂ）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、ボレリア核酸に 特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッ セイプローブで増幅された核酸を検出する工程をさらに含む、請求項第２７項に 記載の方法。 ２９．試験試料中のボレリア核酸を増幅する方法であって、該核酸を、以下のヌ クレオチド配列： の一つと実質的に対応する核酸配列に結合するかまたはそれを通しての延長を起 こすであろう一つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチド、および以下の配列 ： と実質的に対応する核酸配列に結合するかまたはそれを通しての延長を起こすで あろう第二の増幅オリゴヌクレオチドで増幅することを含み、ここで該増幅オリ ゴヌクレオチドの一つは、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されまたはＲＮＡポリ メラーゼによる開始または延長を促進する核酸配列を随意に持つことを特徴とす る方法。 ３０． ｂ）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、ボレリア核酸に 特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッ セイプローブで増幅された核酸を検出する工程をさらに含む、請求項第２９項に 記載の方法。 ３１．試験試料中のボレリア核酸配列の数を増加させる方法であって、該核酸を 以下のヌクレオチド配列： と実質的に対応する核酸配列に結合するかまたはそれを通しての延長を起こすで あろう一つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチド、および以下の配列： および と実質的に対応する核酸配列に結合するかまたはそれを通しての延長を起こすで あろう第二の増幅オリゴヌクレオチドで増幅することを含み、ここで該増幅オリ ゴヌクレオチドの一つは、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されまたはＲＮＡポリ メラーゼによる開始または延長を促進する核酸配列を随意に持つことを特徴とす る方法。 ３２． ｂ）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、ボレリア核酸に 特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッ セイプローブで増幅された核酸を検出する工程をさらに含む、請求項第３１項に 記載の方法。 ３３．該ボレリア核酸がライム病関連ボレリア、またはボレリア ヘルムシー核 酸である、請求項第３１項に記載の方法。 ３４．該オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブが： および から成る群より選択される配列と実質的に対応する核酸配列を持つ、請求項第３ １項に記載の方法。 および から成る群より選択される配列と実質的に対応ずる配列を持つ増幅オリゴヌクレ オチド。 ３６．ヌクレオチド配列： または （ここで最も３’の１９ヌクレオチドは厳密に示されているとおりである）と実 質的に対応するヌクレオチド配列を持つ増幅オリゴヌクレオチド。 ３７．ＲＮＡポリメラーゼにより認識されまたはＲＮＡポリメラーゼによる開始 または延長を促進する５’配列をさらに含む、請求項第３５または３６項に記載 のオリゴヌクレオチド。 ３８．ボレリア核酸と、請求項第３６または３７項に記載の核酸配列を持つオリ ゴヌクレオチドとの間で形成される核酸ハイブリッドを含む、ボレリア核酸増幅 のための組成物。 および から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応する核酸配列を持つ少なくと も一つのオリゴヌクレオチドを含むキット。 ４０． 該オリゴヌクレオチドが または である場合： および され；または 該オリゴヌクレオチドが または である場合： および され；または 該オリゴヌクレオチドが および である場合： および から成る群より選択される配列に実質的に対応する核酸配列を持つ少なくとも一 つのヘルパープローブを持つ、請求項第３９項に記載のキット。 および から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応する核酸配列を持ち、ＲＮＡ ポリメラーゼにより認識されるまたはＲＮＡポリメラーゼによる開始または延長 を促進する５’配列を随意に持つ二つのオリゴヌクレオチドを含むキット。 ４２．該二つのオリゴヌクレオチドが の群から選択される場合： および または該オリゴヌクレオチドが および から選択される場合： および から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応する核酸配列を持つ少なくと も一つのオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項第４１項に記載のキット。 ４３．以下の配列： および または と実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを含むキット。 ４４．以下の配列： および または と実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを含むキット。 ４５．以下の配列： および （ここで最も３’の１９ヌクレオチドは厳密に示されているとおりである）と実 質的に対応する）と実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを含む キット。 ４６．以下の配列： または と実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを含むキット。 ４７．以下の配列： または または と実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを含むキット。 ４８．以下の配列： または または と実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを含むキット。 ４９．ボレリア ヘルムシーを検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ プローブであって、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でボレリア ヘルムシー 核酸配列とは優先的にハイブリダイズするが、ボレリア ブルグドル フェリ に存在する核酸配列とはハイブリダイズしない、１０から１００ヌクレオ チド長のオリゴヌクレオチドプローブを含み、該ボレリア ヘルムシー核酸配列 は： および から成る群より選択される配列と実質的に対応することを特徴とするプローブ。 ５０．請求項第４９項に記載のハイブリダイゼーションアッセイプローブおよび 少なくとも一つのヘルパーオリゴヌクレオチドを含むプローブ混合物。 ５１．該プローブが： または に実質的に対応するヌクレオチド配列を持ち、かつ該ヘルパーオリゴヌクレオチ ドが１０から１００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、ストリンジェ ントハイブリダイゼーション条件下でボレリア ヘルムシー核酸配列とハイブリ ダイズし、該ヘルパーオリゴヌクレオチドが： および から成る群より選択される配列と実質的に対応する核酸配列を持つ、請求項第５ ０項に記載のプローブ混合物。 ５２．ボレリア ヘルムシーを検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ プローブであって、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でボレリア ヘルムシー 核酸配列とは優先的にハイブリダイズするが、ボレリア ブルグドル フェリ に存在する核酸配列とはハイブリダイズしない、１０から１００ヌクレオ チド長のオリゴヌクレオチドプローブを含み、該ボレリア ヘルムシー核酸配列 は： および から成る群より選択される配列と実質的に対応することを特徴とするプローブ。 ５３．請求項第５２項に記載のオリゴヌクレオチドおよび少なくとも一つのヘル パーオリゴヌクレオチドを含むプローブ混合物。 ５４．オリゴヌクレオチドが： または に実質的に対応するヌクレオチド配列を持ち、かつ該ヘルパーオリゴヌクレオチ ドが１０から１００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、ストリンジェ ントハイブリダイゼーション条件下でボレリア ヘルムシー核酸配列とハイブリ ダイズし、該ヘルパーオリゴヌクレオチドが： および から成る群より選択される配列と実質的に対応する核酸配列を持つ、請求項第５ ３項に記載のプローブ混合物。 ５５．ボレリア ヘルムシーの存在を検出するための方法であって、ストリンジ ェントハイブリダイゼーション条件下、試験試料とストリンジェントハイブリダ イゼーション条件下でボレリア ヘルムシー標的核酸配列とはハイブリダイズす るであろうが、ボレリア ブルグドルフェリからの核酸配列とはハイブリダイズ しないであろう核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブを接触させる工程 を含み、該ボレリア ヘルムシー標的核酸配列は： および から成る群より選択される配列と実質的に対応することを特徴とする方法。 ５６．ボレリア ヘルムシーの存在を検出するための方法であって、ストリンジ ェントハイブリダイゼーション条件下、試験試料とストリンジェントハイブリダ イゼーション条件下でボレリア ヘルムシー標的核酸配列とはハイブリダイズす るであろうが、ボレリア ブルグドルフェリからの核酸配列とはハイブリダイズ しないであろう核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブを接触させる工程 を含み、該ボレリア ヘルムシー標的核酸配列は： および から成る群より選択される配列と実質的に対応することを特徴とする方法。 ５７．ボレリア ヘルムシー核酸と、 および から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌ クレオチドとの間で形成される核酸ハイブリッドを含む組成物。 ５８．少なくとも一つのヘルパーオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項第５ ７項に記載の組成物。 または および または および または から成る群より選択される配列と実質的に対応するヌクレオチド配列を持つ第二 のオリゴヌクレオチドをさらに含み、ここで該ヘルパーオリゴヌクレオチドは： および から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応するオリゴヌクレオチドであ る、請求項第５８項に記載の組成物。 または または または から成る群より選択される配列と実質的に対応するヌクレオチド配列を持つ第二 のオリゴヌクレオチドをさらに含み、ここで該ヘルパーオリゴヌクレオチドは： および から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応するオリゴヌクレオチドであ る、請求項第５８項に記載の組成物。