JPH06509542A - オリゴマーを合成するための改良法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 オリゴマーを合成するための改良法 発明の背景 本発明はオリゴマーを合成するための改良法に関する。

オリゴマーの化学的合成法、特にデオキシヌクレオシドから構成されるオリゴマ ーの合成法が開発されている。これらの方法としてはホスホトリエステル法及び 亜リン酸トリエステル法が挙げられる。これらの合成法は溶液中で行うことがで き、それによりダイマーが得られ、次いでそのダイマーはクロマトグラフィーに より精製する。精製ダイマーは互いに連結することによりテトラマーなどを合成 できる。好ましくは、固相支持体に結合させた５°−〇−保保護ヌクレオトド使 用する固相法を用いる。固相法では、５゛−〇−保保護ヌクレオトド固相支持体 に結合させ、交互の末端５゛−脱保護反応とカップリング反応を使用する鎖の組 み立てによってオリゴマーを合成していく。溶液法及び固相法ともに、反応を終 結させるために過剰量の試薬を加え、適当な溶媒を用いて支持体を洗浄すること により未反応の成分を除去する。脱保護とカンブリングのサイクルは所望のオリ ゴマー長が得られるまて続ける。次いで、得られたオリゴマーを支持体から切断 し、保護基を除去して得られた脱保護オリゴマーを精製する。これらの合成法に 適切な固相支持体にはシリカゲル、制御孔ガラスピーズ（ＣＰ　Ｇ）及びポリス チレンなどがある。［一般的には、Ｇａ１ｔ、　Ｍ、　ＳのＯｌｉｇｏｎｕｃｌ ｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃ ｈ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８５）を参照のことコオリゴマーの固相合成 のための装置は市販されている。装置の製造元から提供されている説明書には、 オリゴマー合成のための反応体と試薬との好ましい比率が記載されている。カッ プリング工程では、大過剰のモノマーとモノマーのアクチヘーターとが推奨され ている。酸化工程て推奨されている酸化試薬には、大量の水（約２％〜約２５％ 又はそれ以上）が含まれている。

発明の概要 本発明はオリゴマーを合成するための改良法に関する。

本発明は、水分の少ない酸化試薬を酸化工種で使用する改良合成法によれば、高 いカップリング効率（約９５％又はそれ以上）をもってオリゴマーが比較的大量 に（約１５μｌｌ１ｏｌ又はそれ以上）合成でき、カップリング工程ではヌクレ オシドモノマー及びアクチベーターを有意に低い当量で使用すればよい、という 本発明者らの知見を基礎としている。

本発明は１つの態様として、第１のヌクレオシドの５゛−酸素と第２のヌクレオ シド（又はモノマー、第１図参照）の３゛−酸素との間にヌクレオシド間結合を 形成させる方法であって、第１のヌクレオシドがその５°−酸素に結合したブロ ッキング基を有し、かつその３゛−酸素を介して支持体と結合しているか、又は ５゛−ヌクレオシド間結合を介して別のヌクレオシドもしくはオリゴマーと結合 しており、第２のヌクレオシドがその５°−酸素に結合したブロッキング基を有 し、かつその３°酸素に結合する以下の式で示されるカップリング基が式：Ｐ Ｒ。

［式中、Ｘ、はハロゲン又は置換アミノであり、Ｒ１はアルキル、アリール、置 換されていることあるアルコキシ又は置換されていることあるアリールオキシで ある］を有していること、を特徴とする方法を目的とする。この方法は第１のヌ クレオシドを脱ブロッキング条件下に処理し、５°−酸素からブロッキング基を 除去して遊離の５゛−ヒドロキシ基を生成させることを包含する。次いで、活性 化及びカップリング条件下に脱ブロックした第１のヌクレオシドと第２のヌクレ オシドとをアクチベーターの存在下に接触させ、３価のリン基を有するヌクレオ シド間結合によって第１のヌクレオシド及び第２のヌクレオシドをカップリング させる。

ヌクレオシド間結合の３価のリンは、約２％又はそれよりも少ない水分であるが 第１のヌクレオシドの１当量に対して少なくとも約１〜約５当量の水分（好まし くは約０．　１％〜約ｏ、５９６の水分）を含有している低水分酸化試薬を包含 する酸化条件下、５価のリンに酸化する。この酸化試薬は適当な酸化剤を、好ま しくは約１００ｍＭから２００ｍＭ酸化剤で含有し、第１のヌクレオシドの１当 量当たり少なくとも約１〜約５当量の酸化剤を含有する。適当な酸化剤には、ヨ ウ素（Ｉ２）などがある。酸化工程以下は、第１のヌクレオシドにおける反応し なかった５°−ヒドロキシ基を非反応性の状態にするため、それらをキャップす るキャッピング工程である。好ましい態様では、第２のヌクレオシド又はモノマ ーをキャッピング工程にて第１のヌクレオシドの１当量当たり約１〜約５当量、 より好ましくは約１．２〜約３当量の比率で存在させる。第１のヌクレオシドの １当量当たり第２のヌクレオシド約１．５〜約２当量の比率が特に好ましい。こ の反応は、所望の鎖長のオリゴマーが得られるまで付加的なモノマーを伸長オリ ゴマーに加えて繰り返す。同相の反応では、オリゴマーが合成されたなら、常法 によって固相支持体からオリゴマーを切断する。

通常推奨されている試薬比率と酸化試薬を使用してメチルホスホネート・オリゴ マーを合成すれば、比較的低い全体的なカップリング効率しか得られず、従って 満足できない収量、特に約１５μｍｏｌ又はそれ以上の調製物しか得られない。

具体的には、本発明者らは、この改良法により、改善された収量でメチルホスホ ネート・オリゴマーが大規模に製造でき、同時にモノマー及びアクチベーターが 顕著に少なくて済むことを、意外にも見いだした。少ない量のモノマーの使用は 、モノマーが高価であることから、オリゴマーをより経済的に合成できる点で特 記すべき利点といえる。

定　義 本明細書で使用している以下の用語は、特に明記しない限り次の意味を有してい る。

「ヌクレオシド」なる用語はヌクレオノル部分又は単位を包含するものてあり、 それらと相互変換可能に使用される。

「ヌクレオチド」なる用語は、リン酸基、糖及び窒素含有塩基から構成される核 酸のサブユニットを意味する。ＲＮＡては、糖はりホースである。ＤＮＡでは２ −デオキシリポースである。この用語はこのようなサブユニットの同族体も包含 する。

「ヌクレオチドマルチマー」なる用語は、ヌクレオシド間リン酸結合によって連 結されたヌクレオチドの鎖、又はその同族体を意味する。

「オリゴヌクレオチド」は、一般に約３〜約１００のヌクレオチドの長さを有す るヌクレオチドマルチマーであるが、１００以上の長さのヌクレオチドを意味す る場合もある。これは通常、ヌクレオチドのモノマーから合成されると考えられ る。

「デオキシリポオリゴヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドモノマーか ら構成されるオリゴヌクレオチドである。

「ポリヌクレオチド」は、一般に約１００又はそれ以上の長さのヌクレオチドの ヌクレオチドマルチマーを意味する。これは普通、生物起源であり、又は酵素的 手段によって入手される。

「モノマー単位」は、本発明のヌクレオチド試剤又は非−ヌクレオチド試剤のい ずれかの単位であって、その試剤がポリマー形成に役立つものをいう。

［非−ヌクレオチドモノマー単位」は、オリゴマーのハイブリダイゼーションに は有意に関与しないモノマー単位を意味する。このようなモノマー単位は例えば 、ヌクレオチドとの有意な水素結合に関与してはならないものであり、要すれば 、架橋結合アルキル化、挿入剤及びキレート化剤などの、標的配列とオリゴマー とのハイブリダイゼーション後に相互作用できるグループを包含することができ る。

「オリゴヌクレオチド／非−ヌクレオチドマルチマー」は、一般に１００ヌクレ オチドよりも少ない合成起源のマルチマーであるが、２００ヌクレオチドを過剰 に含有することもてき、かつまた１つ又はそれ以上の非−ヌクレオチドモノマー 単位を含有している。

「オリゴマー」なる用語は、オリゴヌクレオチド、非イオン性オリゴヌクレオシ ド・アルキル−及びアリール−ホスホネート同族体、オリゴヌクレオチドのホス ホロチオエート同族体、オリゴヌクレオチドのホスホアミデート同族体、中性の リン酸エステルオリゴヌクレオチド同族体、例えばホスホトリエステル及び他の オリゴヌクレオチド同族体及び修飾オリゴヌクレオチドを意味し、これにはさら にヌクレオチド／非−ヌクレオチドポリマーも包含される。また、この用語には 、モノマー単位間にある１つ又はそれ以上のホスホン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕ ｓ）基結合がホルムアセタール結合、スルファメート結合又はカルバメート結合 などの非−ホスホン酸結合によって置き換えられているヌクレオチド／非−ヌク レオチドポリマーも包含される。

「アルキル−又はアリール−ホスホネートオリゴマー」なる用語は、少なくとも １つのアルキル−又はアリール−ホスホネート（亜リン酸）結合がホスホジエス テル結合と置き換わっているヌクレオシド間（又はモノマー間）リン（ｐｈｏｓ ｐｈｏｒｕｓ）基結合を有するヌクレオチド／非−ヌクレオチドポリマー）を意 味する。

「メチルホスホネートオリゴマー（又はＭＰ−才リゴマ−）」なる用語は、少な くとも１つのメチルホスホネートヌクレオノド間結合がホスホジエステルヌクレ オノド間結合と置き換わっているヌクレオシド間（又はモノマー間）リン基結合 を有するヌクレオチドオリゴマー（又はヌクレオチド／非−ヌクレオチドポリマ ー）を書味する。

本明細書に記載している種々のすリボマー配列の中、例えばＡｐＡなどにおける 「ｐ」はリン酸ジエステル結合を表し、例えばＣｐＧなどの「２」は、メチルホ スホネート結合を表す。他の配列の中には、リンジエステル結合のタイプを示す ためのｐ又はＰのいずれも使用せずに記載しているものもある。この場合、ＡＴ ＣなどのＡはＡの３°−炭素とＴの５゛炭素との間のリン酸ジエステル結合を示 しており、ＡＴＣ又はΔＴｌなどのΔは、Ａの３“−炭素とＴ又は工の５゛−炭 素との間のメチルホスホネート結合を示している。

「非−有害条件」なる用語は、オリゴマーの骨格及びその糖、並びに塩基成分、 そして固相支持体にも実質的に悪影響を及ぼさない（反応又は合成の）条件を説 明するためのものである。当業者ならば、機能性、カップリング方法、脱ブロッ キング及び脱保護操作、及びこれらの基準に適合する開裂条件を容易に確定でき る。

「脱ブロッキング条件」なる用語は、リボース又はデオキシリポース基の５゛− ＯＨ基からブロッキング（又は保護）基を除去するために使用する条件を説明す るものである。

「脱保護条件」なる用語は、ヌクレオシド塩基から保護基を除去するために使用 する条件を説明するものである。

「キャップ」又は「キャッピング」なる用語は、反応サイクルにおいて第２のヌ クレオシドの活性化カップリング基と縮合（即ち、反応）できなかった（個々の 反応サイクルにおける）第１のヌクレオノドの５′−ヒドロキシ基をブロックし 、以後の反応サイクルにて反応できなくさせる反応サイクル中の１工程を意味す る。

「ローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）Ｊなる用語は、ポリマー試薬のポリマー部分 又は支持体に（結合部分によって）カップリング又は結合されるヌクレオシジル 部分（又はヌクレオシド）の量を意味し、これは通常、支持体１ｇ当たりのμｍ ｏｌヌクレオシドで表される。

「支持体」なる用語は、ヌクレオシドが結合してオリゴマーを合成することので きる固体粒子物質を意味する。オリゴマーの合成に使用する支持体は普通、実質 的に不活性であり、オリゴマーの合成に使用する試薬とは反応しないものである 。

図面の簡単な説明 第１図は本発明の方法に従ってオリゴマーを固相合成するための一般的な反応式 を説明するものである。

本発明は、リン含有ヌクレオシド支持体によってカップリングされたヌクレオシ ドモノマー単位からなるオリゴマーを合成するための改良法に関する。

一般的な反応経路 本発明は一般的な態様として、水分の少ない酸化試薬を酸化工程で使用する、第 １のヌクレオシドの５゛−酸素と第２のヌクレオシドの３゛−酸素との間にヌク レオシド間結合を形成させる改良法を目的とする。第１のヌクレオシドは好まし くは、ブロックされた５°−ヒドロキシ基を有し、かつ３′−炭素に保護された ヒドロキシ基を有しているか、又は好ましくは３゛−酸素を介して固相支持体と 結合しているか、又はオリゴマーの一部となることのできる別のヌクレオシドの ５゛−酸素と結合しているリン含有基と３′−酸素を介して結合している。好ま しくは、別のヌクレオシド又はオリゴマーを固相支持体に結合させる。第２のヌ クレオシドはその５°−酸素に結合しているブロッキング基及びその３′−酸素 に結合しているカップリング基を有しており、そのカップリング基は好ましくは 式。

Ｐ Ｒ。

［式中、ｘｌはハロゲン又は置換アミノであり、Ｒ１はアルキル、アリール、置 換されていることあるアルコキシ又は置換されていることあるアリールオキシで あるコで示される基である。

本発明のホスホン酸含有ヌクレオシド支持体を形成させる基本的な固相反応は第 １図に示している通りであり、それには以下の４つの工程が包含される：（ａ） 第１のヌクレオシドの５′−ヒドロキシを脱ブロッキングし、（ｂ）カップリン グ及び活性化条件下、アクチベーターの存在下に第１のヌクレオシドを含有する 反応混合物に、第２のヌクレオシド（又は第１図における「モノマー」）を加え 、第２のヌクレオノドが第１のヌクレオシドと「カップリング」又は「縮合」し 、３価のリン基を含有するヌクレオシド間結合を形成させ、（Ｃ）　低水分酸化 試薬を用いて、３価のリン基を５価のリン基に酸化し、そして（ｄ）　キャッピ ングして第１のヌクレオシドの未反応（又は未カップリング）５′−ヒドロキシ 基をブロッこのように、本発明は１つの態様として、式（Ｉ）：「 ［式中、Ｔは１級ヒドロキシ基のためのブロッキング基であり、Ｂは塩基であり 、 Ｒはヒドロキシ、アルキル、アリール、置換されていることあるアルコキシ、又 は置換されていることあるアリールオキシであり、Ｓｐは支持体又は式（■）： （ここに、Ｒ及びＳｐは式（１）における定義と同意義である）て示されるヌク レオシド５′−リンエステルである］て示されるデオキシリボヌクレオシドリン 酸又は亜リン酸エステルを製造するための方法であって、該第１のブロックされ たヌクレオシドを脱ブロックし、式（■）： で示される第１のヌクレオシドを得、この化合物を式：（■）Ｌ式中、Ｘ、はハ ロゲン又は置換アミノである］で示さ第１る化合物とアクチベーターの存在下に 反応させ、式（Ｖ）：−Ｐ て示される化合物を生成させ、次に約２％又はそれ以下の水分、又は第１のヌク レオシド１当量当たり少なくとも約１〜約５当量の水分、好ましくは約０．　１ ％〜約０．５％の水分を含有する低水分酸化剤の存在下、得られた化合物を式（ １）で示される化合物に酸化的に変換することを特徴とする方法を目的とするも のである。

（ａ）　脱プロツキング工程 この工程は、第１のヌクレオシドを処理してブロッキング基を除去し、第２のヌ クレオシドのカップリング基と反応できる５−ヒドロキシを生成させる工程であ る。ブロッキング基としては、通常酸不安定であり、非−有害条件にて除去でき るジー（ｐ−アニソール）フェニルメチル［”ジメトキシトリチル”、”トリチ ル”又は”ＤＭＴ”］が好ましい。適当な脱トリチル化の試薬はジクロロメタン 中、ジクロロ酢酸である。

ジメトキシトリチル陽イオンを含有する酸性溶液は明るいオレンジ色であるので 、先行する反応順序のカップリング効率を得るために、脱トリチル化を行う毎に 流出溶液を採取し、測光分析学的に検定できる。

（ｂ）　カップリング工程 カップリング工程は水分に敏感である。従って、カップリング工程の前に第１の ヌクレオシド支持体から水分を除去しなければならない。脱ブロッキングの後、 第１のヌクレオシドを減圧下に乾燥し、好ましくは第１の活性化ヌクレオシド（ モノマー）を導入する前にアルゴンを導入する。カップリング基のＸ１置換分は ジアルキルアミノ基である。このようなカップリング基は活性化させて、第１の ヌクレオシドの５°−ヒドロキシとの反応性を高めるのが好ましい。テトラゾー ルは適当なアクチベーターであり、ジアルキルアミノ基の窒素原子のプロトン化 と、置換反応を介するヌクレオシド−３°−０−ホスホモノテトラゾリドの形成 とによって機能するものである。両者の化合物種は、第１のヌクレオシドの５° −ヒドロキシ基による核置換反応を迅速に受け、ヌクレオシド間３価リン結合を 形成させる。

従って、１つの態様では、第２のヌクレオシド（モノマー）の試料とテトラゾー ル溶液の試料とを乾燥アルゴン充填容器内で混合し、次いでモノマー−テトラゾ ール混合物を、脱保護された第１のヌクレオシドを含有する容器内に迅速に注入 し、約３分反応させることにより、カップリング工程を行うことができる。固相 反応では、カンブリング混合物（活性化モノマー）を濾過して除去する。　次い で、以後の酸化工程の前にアセトニトリルにより支持体を洗浄する。

高いカンブリング効率を得るために通常は、第１のヌクレオシドに対して大過剰 のモノマーが、またモノマーに対してアクチベーターが使用されてきた。Ｍｉｌ ｌｉｇｅｎ［パイオサ−刊などのＤＮＡ合成装置の製造元は、第１のヌクレオシ ド１当量当たり約４４８〜約７３当量のモノマーの使用を推奨し、またモノマー １当量当たり約１０〜約１５当量のアクチベーターの使用を推奨している（効率 的には、第１のヌクレオシド１当量当たり約４８〜約１１０当量のアクチベータ ーの使用である）。従来は、特にメチルホスホネート・オリゴマーの合成では、 これらの反応条件を使用しても貧弱なカップリング効率しか得られなかった（約 ８８又はそれ以下）。

本発明の方法によれば、第１のヌクレオシドに対してモノマーを、またモノマー に対してアクチベーターを有意に低い比率で使用しても、９５．５％又はそれ以 上のオーダーの高いカンブリング効率が得られることが見いだされた。この知見 は、約１５μｍｏｌ又はそれ以上のオーダーでオリゴマーを大量に合成する際に 特に有益である。約１２０μｍｏｌ又はそれ以上のオリゴマーの調製物において 、高いカップリング効率は維持される。このような大規模な製造では、大過剰の モノマーを使用することは経済的に不都合であるばかりでなく、製造元から教示 された試薬及び比率を使用し、大過剰のモノマー及びアクチベーターを使用した としても、上記のように貧弱なカップリング効率（約８３％オーダー）しか得ら れない。十分に高いカンブリング効率を得ることは、鎖の長さを増大させるオリ ゴマー合成に特に重要である。１８ｍｅｒを平均カップリング効率的８３％で合 成する場合、その収率はたったの・１．２％にしかならない。しかし、平均力・ ツブリング効率が約９５５％てあれば、１８ｍｅｒの合成の場合、約４６％の収 率が得られる。従って、合成しようとするオリゴマーの鎖の長さが増大するに連 れて、カップリング効率の小さな相違が全体の収率に及ぼす影響が倍加され、従 って１反応サイクルにおける小さなカップリング効率の増大はオリゴマー収率の 有意な改善を導くことができることになる。特に実施例５及び第４表を参照のこ と。

本発明者らは、本発明の方法を行えば、第１ヌクレオシドの１当量当たり約１〜 約５、好ましくは約１．５〜約３、より好ましくは約２．５〜約３当量のモノマ ーを使用し、モノマーの１当１当たり約２〜約５、好ましくは約２，２〜約３当 量のアクチベーターを使用すれば、高いカップリング効率を得ることができるこ とを見いだした（効率的には、第１ヌクレオシド１当量当たり、約２〜約２５、 好ましくは約３．３〜約１５、より好ましくは約４．４〜約８．４当量のアクチ ベーターを使用する）。

（ｃ）　酸化工程 ヌクレオシド間結合における比較的不安定な３価リンを、酸化試薬での処理によ り安定な５価のリン結合に変換する。この試薬は通常、ヨウ素、テトラヒドロフ ラン、２．６−ルチジン、及び少な（とも約２％〜約２５％又はそれ以上の水を 含有している。

比較的大量の水を含有する酸化試薬がオリゴマーの合成に使用されており、Ｍｉ ｌｌｉｇｅｎなどのＤ　Ｎ　Ａｇｏｕｓｅｉ装置の製造元から推奨されている。

例えば、バイオサーチＤＮＡ合成装置の製造元であるＭｉｌｌｉｇｅｎは、ヌク レオシド間結合１当量（即ち、第１のヌクレオシド１当量）当たり２．３当量の ヨウ素（Ｉ２）及び７１６当量の水、又は約９％の水を含有する酸化試薬を推奨 している。市販されている酸化試薬は少なくとも２％の水を、約２５％まで又は それ以上含有している。

本発明者らは、本発明の方法に従って低い水分の酸化試薬を使用すれば、カップ リング工程において高いカップリング効率が得られ、また高い全体カップリング 効率を維持しつつ３価リンから５価リンへの酸化を高いレベルで得ることのでき ることを意外にも見いだした。これらの低水分酸化試薬は、従来使用されていた 酸化試薬よりも１〜２桁の程度少ない、極く少量の水しか含有していない。即ち 、本発明者らは、約０．２５％〜約０．１８％の範囲の水（又は第１のヌクレオ シド１当量当たり約２．２当量の水）又はそれ以下で水を含有する試薬などの約 ０．１％〜約０５％オーダーで水を含有する酸化試薬は良好な酸化収率をもって 効率的に機能し、全体の高いカップリング効率が得られることを、驚くべきこと に見いだした。従って、本発明では、約２％以下の水を含有し、第１のヌクレオ シド１当量当たり少なくとも約１〜約５当量の水を含有している低水分酸化試薬 を使用し、ヌクレオシド間結合の３価リンをヌクレオシド間結合の５１ｉ［１ｉ のリンに酸化させる。好ましくは、酸化試薬は約１００ｍＭ〜約２００ｍＭ酸化 剤を含有し、第１のヌクレオシド１当量当たり少なくとも約２〜約５当量の酸化 剤を含有している。適当な酸化剤には、ヨウ素（Ｉ２）がある。

カンブリング工程は特に水に敏感であることから、有意に低い量の水を含有する 上記の低水分酸化試薬を使用することはさらに有益であり、これらの低水分酸化 試薬を酸化工程で使用すると、伸長オリゴマーが次の反応サイクルのカップリン グ工程にさらされる前には、除去されるべき水分は非常に少な（なる。従って、 同相反応において低水分酸化試薬を使用すると、伸長オリゴマー鎖を担持する支 持体を乾燥させることが必要である洗浄工程が短縮でき、従って支持体の乾燥に 要する溶媒又は乾燥剤の全体の量を減少させることができる。

酸化工程は、上記の低水分酸化試薬（ヨウ素、水分、テトラヒドロフラン及び２ ．６−ルチジンを含有する試薬）を使用すると、１分よりも短い時間で一般に完 了する。固相反応では、酸化した後に、第１のヌクレオシドを担持する支持体を アセトニトリルによって、それと流体物（洗浄液）が無色になるまで十分に洗浄 し、次いでキャッピング試薬を加える。

（ｄ）　キャッピング工程 キャンピング工程は、第２のヌクレオシドの活性化カップリング基と反応しなか った第１のヌクレオシドの残った遊離ヒドロキシ基を非反応性にするためのもの である。このキャッピング工程により、所望のヌクレオシド配列の鎖を増やす方 向性のみて、以後の添加反応を進行させることができる。通常のキャッピング工 程では、第１のヌクレオシドの未縮合の５°−ヒドロキシ基（その反応サイクル 内の）を、それらをさらなる鎖伸長に対して不活性（又は非反応性）にする無水 酢酸によってアセチル化する。４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を使用 し、このアセチル化反応を触媒する。

これらを加える場合、得られる混合物は迅速に暗色化し劣化しかねないので、各 サイクルにおいて使用する直前に無水酢酸及びＤＭＡＰ溶液の試料を混合するの が好ましい。あるいは、無水酢酸及びＤＭＡＰ溶液は同時に加えることができる 。キャッピングは約２分又はそれ以下の時間で一般に完了する。過剰のキャッピ ング試薬は濾過して除去する：　支持体はアセトニトリルで洗浄し、次いでジク ロロメタンで洗浄し、そして次の反応又は合成サイクルを開始させる。

前に縮合されなかった５゛−ヒドロキシを伸長させないためのキャッピング工程 を使用することは、脱プロソキング工程において放出されるＤＭＴ量を反応サイ クルのカップリング効率と正比例させることを意味し、従って脱ブロッキング（ 又は脱トリチル化）工程にて放出されるＤＭＴ量を測定すれば、カップリング効 率をモニターできることになる。さらに、過剰のカンブリング試薬は、固相支持 体に残った酸化試薬由来の残余の水分を捕獲するのに役立つ。

本発明をより理解し易（するため、一連の実験結果を説明する実施例を以下に記 載する。本発明に関連するこれらの実施例は当然ながら、本発明を特別に限定す るものではな（、現在知られており又は後に開発される、当業者の知識の範囲内 にある本発明の改変は以下に記載する請求の範囲内に包含されるものと考えられ るべきである。

５°−０−ＤＭＴ−保護ヌクレオシド（得られるオリゴマーの３゛−末端になる ）から誘導した、１５０μｍｏｌヌクレオノドヌクレオシド分な固相支持体を、 バイオサーチ８８００　ＤＮＡ合成装置の反応容器内に入れた。この支持体を、 ジクコロメタン中の２５％ジクロロ酢酸５Ｘ１４．６厘ｌ容量で処理した。後に 分光測定分析を行ってカップ１ルグ効率を測定するため、明るいオレンジ色した 溶液を採取した。次いて、支持体を乾燥アセトニトリル７Ｘ１７．５ｍＮで洗浄 した。この支持体にホスホンアミダイト・七ツマ−（４００μｍｏｌ又は２．７ 当量、又は加えるモノマーがＴならば、若干少な（約２．５当量を使用できる） の１００ｍＭ溶液４ｍｌを加えた。得られた混合物を撹拌し、テトラゾール（１ ，９８，７’。

８９４μｍｏｌ、４５０ｍＭ又はモノマーに対して２２４当量）を加えた。この 混合物を約３分間撹拌し、濾過し、次いでアセトニトリル２　Ｘ　２．　８ｍｆ で洗浄した。支持体に酸化剤（２５ｇ／Ｌ　Ｉ２．０．１８％水、２５％２．　 ５−ルチ’）ン、７４８２％テトラヒドロフラン）４．０６肩ｌ（支持体ローデ ィングに対して２゜７当量）を加える。この混合物を約１分間撹拌し、次いで濾 過し、乾燥アセトニトリル４　ｘ　ｌ　８ｍｌで洗浄した。次いで、支持体上の 物質（ジヌクレオチド）を、ＣＡＰ　Ａ溶液（４０％無水酢酸、６０％テトラヒ ドロフラン）１ｏ１及びＣＡＰＢ溶液（無水ピリジン中、０．６２５％４−ジメ チルアミノピリジン）１０ｍ＋１’の同時添加によって処理した。得られた混合 物を約１分間撹拌し、次いで濾過した。支持体をアセトニトリル６×１８ＩＮで 洗浄した。

伸長しているオリゴマー鎖にさらにヌクレオシドモノマー単位を加えるために、 適当なヌクレオシドモノマーを使用して上記の操作を繰り返し、所望の長さと配 列を有するオリゴマーを合成する。

以下の第１表は、従来使用されていた試薬比率と本発明の好ましい方法にて使用 する試薬比率とを比較したものである。

第２表は、本発明の一般的手法を用いて２つのメチルホスホネート・オリゴマー を合成する際に得られるカップリング効率を列挙したものである。

注　第２表に記載している合成に使用したＣモノマーのロットは、約２５％トリ エチルアミンを有していることが見いだされた。（トリエチルアミンはモノマー を精製するために溶出液中に使用しており、アセトニトリルとの連続した３回の 同時蒸留によって普通は除去される）　テトラゾールのアクチベーターは弱酸で あり、モノマーを活性化し、モノマーの支持体（又はオリゴマー鎖）へのカップ リングを高めるなどのように機能する。残余のトリエチルアミン（塩基）はテト ラゾ−ルアクチベーターを中相し、従ってカップリングを減少させると考えられ る。この場合、トリエチルアミンを通常除去する操作では、残余のトリエチルア 水　７１６　２．２ ｑｕｅ　６・７６８−７７５（１９８８）］。

低水分酸化試薬を使用する１５０μｍｏｌスケールでのオクタデカマーの合成５ ’−０−ＤＭＴ−Ｎ−イソブチリル３′−〇−スクシニルデオキシシチジン（６ １，５μｍｏｌ／ｇ）を、バイオサーチ８８００　ＤＮＡ合成装置の反応容器内 に入れた。この固相支持体を、ジクロロメタン中の２．５％ジクロロ酢酸５Ｘ　 １４゜６ｍｌ容量で処理した。後に分光測定分析を行ってカップリング効率を測 定するため、明るいオレンジ色した溶液を採取した。次いで、支持体を乾燥アセ トニトリル７Ｘ１７．５ｗｌで洗浄した。この支持体にＮ−イソブチリル−５° −０−ＤＭＴ−２’−０−デオキシグアノシンメチルホスホンアミダイト・モノ マーの濃度１１００Ｉｌ１の溶液４ｉｆ（４００μｍｏｌ、２．７当量）を加え た。撹拌した後、テトラゾール（１，９８１／、８９４４ｏ１．４５０１Ｍ濃度 、モノマーに対して２゜２４当量）を加えた。この混合物を約３分間撹拌し、次 いで濾過し、アセトニトリル２　Ｘ　２．　Ｆ３ｙｓｌで洗浄した。酸化剤（４ ，０６，１、支持体ローディングに対して２．７当量、酸化剤＝２５ｇ／Ｉ−１ ２，０，１８％水、２５％２．６−ルチジン、７４８２％テトラヒドロフラン） を加えた。この混合物を１分間撹拌し、次いで濾過し、乾燥アセトニトリル４Ｘ １ｇ＋＋ｆで洗浄した。次ぎに、支持体上の物質を、ＣＡＰ　Ａ溶液（４０％無 水酢酸、６０％テトラヒドロフラン）１０ｍｆ及びＣＡＰ　Ｂ溶液（無水ピリジ ン中、０．６２５％４−ジメチルアミノピリジンＨ□＋＋ｆの同時添加によって 処理した。得られた混合物を約１分間撹拌した。

次いて濾過し、支持体をアセトニトリル５ｘ１８ｍｉ’で洗浄した。支持体に既 に結合されているデオキシシチンンに加えられたばかりのデオキシグアノシンヌ クレオシドにおけるＤＭＴ基は、ジクロロメタン中、２．５％ジクロロ酢酸溶液 によってこの時点で離脱され始め、サイクルは繰り返されていた。この際、５゛ −ヒドロキシは、５’−０−ＤＭＴ−チミジンである次のモノマーと反応するた め、遊離状聾てあった。上記の反応を適当なモノマーを用いて１５回繰り返し、 配列５’−ＧＴＣ−ＴＴＣ−ＣＴＧ−ＣＣＣ−ＣＡＴ−ＴＧＣ−３°を得た。

実施例４ Ｍｉｌｌｉｇｅｎ　８８００　ＤＮＡ合成装置を用いてメチルホスホネートオリ ゴマーを合成する改良合成法の使用 すべてがメチルホスホネートオリゴヌクレオチドの以下のオクタデカマーは、改 良合成プロトコールを用いてＭｉｌｌｉｇｅｎ　８８００　ＤＮＡ合成装置によ り合成した： ５’−ＣＣＡ−ＣＧＡ−ＡＡＧ−ＧＣＡ−ＴＧＡ−ＣＣＧ−３”合成サイクルは 以下の２つのプログラムから構成される：ｌ　脱ブロッキング・　ジクロロ酢酸 を用いて５゛−０−ジメトキシトリチルを取り外す。乾燥アセトニトリルにより オリゴマーを洗浄し、カップリングの準備をした。

２、カップリング：　オリゴマー１当量当たり約３当量のモノマーとモノマー１ 当量当たり４，５当量のテトラゾールとを使用し、所望のオリゴヌクレオシドを 伸長オリゴマー鎖にカップリングする。

３、酸化　領　１ＭＩ２を、テトラヒドロフラン／２，６−ルチジン中０゜１Ｍ 水と共に含有する酸化試薬を用いて酸化する。

４、キャッピング：　未反応の５°−ヒドロキシ基をジメチルアミノピリジン／ 無水酢酸によってキャッピングする。

５、　次の七ツマ−の付加のためにサイクルの最初の１稈に戻る。

合成装置で用いたプログラムはＭＴＨＬ　０６（主要）及びＣＰＬＡＷＩＩ（カ ップリング）と命名し、製造元から入手した。

使用した試薬混合物は以下のものである：１、アクチベータ−：　アセトニトリ ル中、０．４５Ｍテトラゾール２、ＣａｐＡ：　アセトニトリル中、４０％無水 酢酸３、ＣａｐＢ：　ピリジン中、０６２５％ジメチルアミノピリジン４、脱ブ ロック：　ジクロロメタン中、２．５％ジクロロ酢酸５、酸化剤：　テトラヒド ロフラン／２．６−ルチジン／水（７４，８２／２５／　０．　１８　：　ｖ／ ｖ／ｖ）中、Ｏ，ＬＭ　１２６　洗液Ａ：　＜３０ｐｐｍ水を含有するアセトニ トリル７、洗液Ｂ・　＜　３０　ｐｐｍ水を含有するアセトニトリル８、モノマ ー　すべてのモノマーをアセトニトリル中、０．１Ｍに希釈する。

９、支持体：　デオキシグアノンンによって誘導した制御孔ガラスピースを含有 する支持体を用い、オリゴマーを合成した。

平均カップリング効率は５０４ｎｆｆｉで観察するトリチル吸光度に基づくと、 標準偏差２．０２で１サイクル当たり９６．７％であった。オリゴマー（１８ｍ ｅｒ）の全体収率は５６．５％であった。モノマーのカップリング効率は９７， ６％（Ｓｄ−１，３５、ｎ＝６）であり、Ｃモノマーでは９５．７％（ｓｄ−１ ，８５、ｎ＝５）であり、Ｇモ／７−で１ｉ９６．９％（ｓｄ−２，５５、ｎ＝ ４）であり、モしてＴモノマーでは９５．９％（ｎ＝１）であった。第３表は、 このオリゴマーを合成したときの各反応サイクルにて得られたカップリング効率 を列挙したものである。

第３表 Ｃ１１３，５％ Ｃ９８，５％ Ａ　９８．９％ Ｇ　９８．０％ Ｔ　９５．９％ Ａ　９５．９％ Ｃ９４，４％ Ｇ　９９．１％ Ｇ　９２．６％ Ａ　９５．７％ Ａ　９８．５％ Ａ　９９．０％ Ｇ　９８．１％ Ｃ９６，０％ Ａ　９７．９％ Ｃ９３，１％ ５°Ｃ９６，６％ 実施例５ 種々の水分量を有する酸化試薬を使用したカップリング効率の比較２５％〜０． ２５％の範囲の水分含量を有する酸化試薬を使用し、また低いモノマー二支持体 （又は第１のヌクレオシド）比率を使用してカップリング効率（Ｃ。

Ｅ、）を比較し、その比較を第４表で説明している。

オリゴマーはバイオサーチ８７５０又は８８００　ＤＮＡ合成装置によって合成 した。反応サイクルは記載したモノマー比率と酸化試薬を用いて上述（例えば、 実施例３及び実施例４を参照のこと）のようにして行った。

第４表 バ４を雫−チ　モノマー　平均カップ　酸化剤中　合成　規格化＊装置　比率　 リング効率　の水分％　スケール　収率８７５０　−３．７：ｌ　Ｑ６．２％　 ０．２５％　１５　ｌｌｍｏｌ　４７．９％８７５０　−３．７：１　９５．６ ％　２．５％　１５　ＩＩｍｏｌ　４２．５％８７５０　−３．７：１　９３． ５％　１０％　１５　ａｍｏｌ　２７．９％８７５０　〜３．７：１　９３．８ ％　２５％　１５１１１１１０１　２９．６％４８７５（１３２：Ｌ　９５．４ ％　１０％　１　ｌｌｍｏｌ　４０．９％８８００〜３：１　９７．１％　０． ２５％　１２９　ｐａｌ　５７．２％８８００−３：Ｉ　９６．０％　２．５％ 　１３５　ａｍｏｌ　４６．０％８８００−３：１　９４．７％　１０％　１３ ５　ｕｍｏＬ　３５．５％本２０−ｍｅｒへの規格化。即ち、計算上の平均Ｃ， Ｅの１９カツプリング（カップリング効率）。

÷ホスホジエステル合成のために使用される（試薬及び推奨容量を含む）、推奨 されている標ｆ的なバイオサーチプログラム。

Ｆｉｇｕｒｅ　１゜ フロントページの続き （７２）発明者　ライリー、ティモジ−・エイアメリカ合衆国　９３４３３　カ リフォルニア、グローバー・シティ−、ナンバー・１８、サウス・オーク・パー ク・ブールバード ２５１番

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．第１のヌクレオシドの５′−酸素と第２のヌクレオシドの３′−酸素との間 に５価のリンを有するヌクレオシド間結合を形成させるための方法において、該 第１のヌクレオシドがその５′−酸素に結合したブロッキング基を有し、かつそ の３′−酸素によって支持体と、又は５′−リン基によって別のヌクレオシド又 はオリゴマーと結合しており、そして該第２のヌクレオシドはその５′−酸素に 結合しているブロッキング基及びその３′−酸素に結合している式：▲数式、化 学式、表等があります▼ ［式中、Ｘ１はハロゲン又は置換アミノであり、Ｒ１はアルキル、アリール、置 換されていることあるアルコキシ又は置換されていることあるアリールオキシで ある］で示されるカップリング基を有しているものであって、（ａ）該第１のヌ クレオシドを脱ブロッキング条件下で処理し、５′−ブロッキング基を取り外し て遊離の５′−ヒドロキシ基を生成させ、（ｂ）活性化及びカップリング条件下 、アクチベーターの存在下に該第１のヌクレオシドと第２のヌクレオシドとを接 触させて、３価のリン基を有するヌクレオシド間結合によって第１のヌクレオシ ドと第２のヌクレオシドとをカップリングさせ、 （ｃ）約２％以下の水分を含有するが、第１のヌクレオシドの１当量に対して少 なくとも約１〜約５当量の水は含有している低水分酸化試薬を包含する酸化条件 下、３価のリン基を５価のリン基に酸化することを特徴とする形成方法。
2. ２．５価のリンを有するヌクレオシド間結合がメチルホスホネート結合を含有す る請求項１に記載の方法。
3. ３．酸化試薬が約０．１％〜約０．５％の水を含有している請求項１に記載の方 法。
4. ４．工程（ｄ）として、未反応の５′−ヒドロキシ基をキャッピングし、それを 非反応性にする工程をさらに包含する請求項１に記載の方法。
5. ５．酸化試薬が約０．１％〜約０．５％の水を含有している請求項４に記載の方 法。
6. ６．工程（ｂ）において、該第２のヌクレオシドと該第１のヌクレオシドとを、 第１のヌクレオシド１当量当たり約１〜約５当量の第２のヌクレオシドの比率で 接触させる請求項４に記載の方法。
7. ７．５価のリンを有するヌクレオシド間結合がメチルホスホネート結合を含有し ている請求項６に記載の方法。
8. ８．工程（ｂ）において、該アクチベーターと該第２のヌクレオシドとを、第２ のヌクレオシド１当量当たり約２〜約５当量のアクチベーターの比率で接触させ る請求項６に記載の方法。
9. ９．工程（ｅ）として、所望の数のヌクレオシドを含有するオリゴマーを生成さ せるに十分な回数だけ工程（ａ）から工程（ｄ）までを繰り返す工程をさらに包 含する請求項４に記載の方法。
10. １０．工程（ｂ）において、該第２のヌクレオシドと該第１のヌクレオシドとを 、第１のヌクレオシド１当量当たり約１〜約５当量の第２のヌクレオシドの比率 で接触させる請求項９に記載の方法。
11. １１．工程（ｂ）において、該アクチベーターと該第２のヌクレオシドとを、第 ２のヌクレオシド１当量当たり約２〜約５当量のアクチベーターの比率で接触さ せる請求項１０に記載の方法。
12. １２．酸化試薬が約０．１％〜約０．５％の水を含有している請求項１１に記載 の方法。
13. １３．５価のリンを有するヌクレオシド間結合がメチルホスホネート結合を含有 している請求項１２に記載の方法。
14. １４．第１のヌクレオシドが５′−ヒドロキシ基を有し、３′−酸素によって固 相支持体又は別のヌクレオシドと結合しており、第２のヌクレオシドがその５′ −酸素に結合しているブロッキング基及びその３′−酸素に結合しているカップ リング基を有しているものである、当該第１のヌクレオシドの５′−酸素と当該 第２のヌクレオシドの３′−酸素との間に５価のリンを有するヌクレオシド間結 合を形成させる方法として、該第１のヌクレオシドと該第２のヌクレオシドとを アクチベーターの存在下にカップリング及び活性化条件下にて接触させてカップ リングし、３価のリン基を有するヌクレオシド間結合を形成させる方法において 、約２％以下の水であるが、第１のヌクレオシド１当量に対して少なくとも約１ 〜約５当量の水と酸化剤とを含有する低水分酸化試薬の酸化容量を、該３価リン 基を５価リン基に酸化するに充分な酸化条件下で加えることを改良点とする方法 。
15. １５．５価リンを有するヌクレオシド間結合がメチルホスホネート結合を含有し ている請求項１４に記載の方法。
16. １６．酸化試薬が約０．１％〜約０．５％の水を含有している請求項１４に記載 の方法。
17. １７．酸化試薬が、約１００ｍＭ〜約２００ｍＭの酸化剤を含有し、かつ第１の ヌクレオシド１当量に対して少なくとも約２〜約５当量の酸化剤を含有している 請求項１４に記載の方法。
18. １８．酸化試薬が約０．１％〜約０．５％の水を含有している請求項１７に記載 の方法。
19. １９．式（Ｉ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）［式中、Ｔは１級ヒドロキシ基のため のブロッキング基であり、Ｂは塩基であり、 Ｒはヒドロキシ、アルキル、アリール、置換されていることあるアルコキシ、又 は置換されていることあるアリールオキシであり、Ｓｐは支持体又は式（ＩＩ） ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）で示されるヌクレオシド５′−リン エステルである］で示されるデオキシリボヌクレオシドリン酸又は亜リン酸エス テルを製造するための方法であって、式（ＩＩＩ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩＩ）で示される第１のヌクレオシドを 式：（ＩＶ）▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＶ）［式中、Ｘ１はハロゲ ン又は置換アミノである］で示される第２のヌクレオシドとアクチベーターの存 在下に反応させ、式（Ｖ）：▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ）で示され る化合物を得、次いで約２％以下の水分であるが、式（Ｖ）の化合物１当量当た り少なくとも約１〜約５当量の水分、及び酸化剤を含有している低水分酸化試薬 の存在下、得られた化合物を式（Ｉ）で示される化合物に酸化的に変換すること を特徴とする方法。
20. ２０．Ｒがアルキルである請求項１９に記載の方法。
21. ２１．酸化試薬が約０．１％〜約０．５％の水を含有している請求項１９に記載 の方法。
22. ２２．Ｒがメチルである請求項２１に記載の方法。
23. ２３．該第２のヌクレオシド及び該第１のヌクレオシドを、第１のヌクレオシド １当量当たり約１〜約５当量の第２のヌクレオシドの比率で反応させる請求項１ ９に記載の方法。
24. ２４．酸化試薬が約０．１％〜約０．５％の水を含有している請求項２３に記載 の方法。
25. ２５．第２のヌクレオシド１当量当たり約２〜約５当量のアクチベーターの比率 でアクチベーターを存在させる請求項２３に記載の方法。
26. ２６．酸化試薬が、１００ｍＭ〜約２００ｍＭの酸化剤を含有し、かつ化合物（ Ｖ）の１当量当たり約１〜約５当量の酸化剤を含有している請求項２５に記載の 方法。
27. ２７．酸化試薬が約０．１％〜約０．５％の水を含有している請求項２６に記載 の方法。
28. ２８．Ｒがメチルである請求項２７に記載の方法。