ES2203656T3 - Analisis de proteccion de aductos. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN ENSAYO DE PROTECCION POR ADUCCION QUE IMPLICA LA UTILIZACION DE UN LIGANDO MARCADO Y UN LIGANDO QUE ALTERA LA SEÑAL DEL PRIMERO. EL LIGANDO QUE ALTERA LA SEÑAL MODIFICA, PREFERENTEMENTE, LA CAPACIDAD PARA PRODUCIR UNA SEÑAL DETECTABLE DEL LIGANDO MARCADO CUANDO ESTE NO FORMA PARTE DEL COMPLEJO ANALITO:LIGANDO, COMPARADO CON SU HABILIDAD PARA ALTERAR LA SEÑAL PRODUCIDA POR UN LIGANDO MARCADO QUE FORMA PARTE DEL COMPLEJO DE UNION. LA PRESENCIA O CANTIDAD DE ANALITO PUEDE DETERMINARSE DETECTANDO LA SEÑAL PRODUCIDA POR EL MARCAJE INALTERADO. EL ENSAYO DE PROTECCION POR ADUCCION ES MUY VERSATIL, POR EJEMPLO, LA ALTERACION DE LA SEÑAL PUEDE LLEVARSE A CABO BAJO UNA AMPLIA GAMA DE CONDICIONES (POR EJEMPLO, PH, TEMPERATURA, Y RESISTENCIA IONICA), Y TANTO LA ALTERACION DE LA ETIQUETA COMO EL DISPARO DE LA SEÑAL PUEDEN LLEVARSE A CABO A TEMPERATURA ESENCIALMENTE CONSTANTE PARA CONSEGUIR UN ALTO GRADO DE SENSIBILIDAD.

Description

Análisis de protección de aductos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para el análisis de la presencia o una cantidad de un analito en una muestra.

Antecedentes de la invención

El análisis de la presencia o una cantidad de un analito en una muestra puede proporcionar una valiosa información como p. ej., si un organismo particular, gen o proteína está presente en la muestra. El análisis de analitos puede efectuarse empleando un socio de unión capaz de reconocer y unirse a una porción característica del analito. Por ejemplo, pueden emplearse anticuerpos marcados y sondas de oligonucleótidos en análisis de diagnóstico para detectar la presencia de un organismo, gen, o proteína en una nuestra.

Una sonda de oligonucleótidos puede hibridar con una secuencia de ácido nucleico diana complementaria que permite la detección de la secuencia de un ácido nucleico diana. La detección de la presencia o una cantidad de una secuencia diana de un ácido nucleico puede emplearse en diferentes tipos de análisis entre los que se incluyen la subsiguiente detección de la presencia de un microorganismo o grupo de microorganismos en una muestra mediante un sondeo para detectar la secuencia de un ácido nucleico, característica de un microorganismo o grupo de microorganismos (p. ej., Hogan y col., con el título “Nucleic Acid Probes for Detection and/or Quantitation of Non-Viral Organisms” (“Sondas de ácido nucleico para la detección y/o cuantificación de organismos no víricos”), Publicación Internacional nº WO 88/03957), detectando la presencia de un virus mediante el sondeo para detectar una secuencia característica del virus (p. ej., McDonough y col., con el título “Detection of Human Immuno-deficiency Virus Type 1 (Detección del virus de inmuno-deficiencia humana tipo 1”) Publicación Internacional nº WO 94/23069, y McDonough y col., con el título “Nucleic Acid Amplification Oligonucleotides and Probes to Human Hepatitis B Virus" (“Oligonucleótidos y sondas para la amplificación de ácido nucleico para el virus de la hepatitis B humana" Publicación Internacional nº WO 93/22469); y detección de si una secuencia particular de ácido nucleico es accesible para la hibridación a un oligonucleótido complementario (p. ej., Nelson y col., con el título “Oligonucleotide Screening Assay" (“Análisis de exploración de oligonucleótidos") Publicación Internacional nº WO 95/03427).

Pueden emplearse diferentes marcas y formatos de análisis para detectar la presencia o una cantidad de un analito en una muestra. Ejemplos de marcas detectables son p. ej., los radioisótopos, grupos fluorescentes, grupos quimioluminiscentes, enzimas, substratos de enzimas y ligandos.

En conjunto, los formatos de análisis pueden caracterizarse como "heterogéneos" u "homogéneos" en función de si el socio de unión unido al analito está físicamente separado del socio de unión que no está unido al analito. Los análisis heterogéneos implican la separación física del socio de unión unido al analito, del socio de unión no unido al analito, y pueden efectuarse por ejemplo, empleando soportes para la unión bien el socio de unión unido al analito o bien el socio de unión no unido al analito. Por ejemplo, Arnold y col., Publicación Internacional nº WO 88 /06633 describe el uso de soportes policatiónicos que pueden emplearse en un paso de separación física implicando polinucleótidos y mención de otros soportes que pueden emplearse para la separación física de polinucleótidos; y Harlow y col., Antibodies; A Laboratory Manual ("Anticuerpos.; un manual de laboratorio"), Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, describe un análisis sandwich en donde un anticuerpo unido a un soporte se une con el analito y el analito se detecta a continuación empleando otro anticuerpo en donde los contaminados no unidos se lavan del soporte sólido.

Ejemplos de análisis que pueden efectuarse de una manera homogénea son p. ej., los inmunoensayos descritos en las patentes U.S. n^{os} 3.654.090, 3.817.837 y 4.190.496; análisis que emplean cromóforos que contienen pares fluorescentes/ extintores descritos por las patentes n^{os} 4.199.599, 4.174.384 y 4.318.707; análisis que emplean un conjugado formado de una substancia asociada de unión específica copulada a un reactante quimioluminiscente en donde la actividad del reactante quimioluminiscente está afectada por la reacción entre la substancia de unión específica en el conjugado y una unión específica oponente, como se describe por Boguslaski y col., patente U.S. nº 4.383.031; análisis que implican fluorescencia de polarización como se describe en la patente nº 4.668.640; análisis empleando una sonda doble que implican una primera sonda marcada con un catalizador y una segunda sonda que contiene un apoluminiscente como describe la patente U.S. nº 4.670.379; análisis que emplean un sistema de transferencia de energía como describe Elazar y col., Publicación Europea nº 0 159 719; análisis que emplean un grupo quimioluminiscente y un grupo absorbedor/ emisor, como describe Heller y col., Publicación Europea nº 0 070 685, y Morrison y col., Publicación Europea nº 0 070 686; y análisis que emplean una marca como describe Arnold y col., patente U.S. 5.283.174, Nelson y col., "Detection of Acridinium Esters By Chemiluminiscence" ("Detección de ésteres de acridinio por quimioluminiscencia") en: Nonisotopic DNA Probe Techniques ("Técnicas de sondas de ADN no isotópicas") (Kricka ed., Academic Press, 1992) páginas 275-311, Nelson y col., Clin. Chem. Acta 194: 73-90, 1990, y Arnold y col., Clin. Chem. 35: 1588-1594, 1989 [las patentes EP-A-0709466 y 0639648 describen ligandos que alteran la señal que dan como resultado la hidrólisis de los ligandos que alteran la señal, que no están unidos a la señal].

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a un análisis de protección de un aducto que implica el empleo de un socio de unión marcado y un ligando que altera la señal. El ligando que altera la señal puede alterar preferencialmente la capacidad de la marca que no forma parte del complejo "socio de unión:analito", para producir una señal detectable, con respecto a la capacidad de alterar la señal producida por la marca que forma parte del complejo "socio de unión:analito". La presencia o cantidad de analito puede determinarse detectando la señal producida por la marca no alterada. El análisis de protección de un aducto es muy versátil. Por ejemplo, la alteración de la señal puede efectuarse bajo un amplio margen de condiciones (p. ej., pH, temperatura, y resistencia iónica) y tanto la alteración de la marca como la activación de la señal pueden efectuarse a una temperatura esencialmente constante para lograr un alto grado de sensibilidad.

El análisis de protección de un aducto se efectúa empleando un socio de unión que contiene una marca que puede activarse preferencialmente para producir una señal detectable. Una "señal detectable" quiere significar un cambio en el entorno causado por la marca, el cual cambio puede medirse. Ejemplos de señales detectables incluyen la emisión de luz y cambios de la absorbancia.

Mediante la palabra "activación" quiere darse a entender la causa de que una marca produzca una señal detectable. En una versión preferida la producción de la señal se provoca por una agente activador. Diferentes tipos de agentes activadores pueden emplearse para producir una señal detectable a partir de una marca. Ejemplos de pares "agente activador/marca" incluyen los siguientes: substrato/enzima o enzima/substrato, los cuales causan un cambio en la absorbancia; peróxido de hidrógeno/marca quimioluminiscente que causa una emisión de luz; y luz/marca fluorescente que causa una emisión de luz.

Las marcas preferidas son aquellas que pueden activarse para emitir luz. La activación de una substancia emisora de luz provoca la formación de una molécula en estado de excitación la cual emite luz.

La formación de un aducto mediante un ligando alterador de la señal, altera y de preferencia impide la producción de una señal mediante la marca. Un "ligando alterador de la señal" se refiere a un compuesto que puede asociarse con una marca para formar un aducto que altera la producción de una señal a partir de la marca. De preferencia, la formación de un aducto es reversible.

"Alteración de la producción de una señal" se refiere a un cambio en el tipo, cantidad o cinética de una señal producida a partir de una marca. De preferencia, la señal producida es una emisión de luz y la alteración de la emisión de luz se logra causando uno o más de los siguientes efectos: (1) emisión de luz a una diferente longitud de onda; (2) una disminución en la emisión de luz; y (3) cambiando la cinética de la emisión de luz. De preferencia la formación de un aducto impide la emisión de luz.

Las expresiones "alteración preferente de la producción de una señal" y "discriminación" se refiere a la alteración de la producción de una señal a partir de una marca presente en un socio de unión no unido a un analito (marca no unida), la cual tiene lugar en una extensión mayor que la alteración de la producción de una señal a partir de una marca presente en un socio de unión unido a un analito (marca unida). La diferencia en la producción de una señal mediante marcas presentes en socios de unión unidos o sin unir, es suficiente para permitir a un experto en la técnica el detectar la presencia y/o cantidad de analito. La alteración preferencial de la producción de una señal puede medirse en términos de un ratio de alteración diferencial expresada como el tiempo en el cual la mitad de la señal producida a partir de la marca presente en un socio de unión unido al analito se altera (t_{1/2} marca unida) dividido por el tiempo en el cual la mitad de la marca presente en un socio de unión no unido por el analito, se altera (t_{1/2} marca no unida).

De esta forma, un primer aspecto de la invención se refiere a un método para analizar la presencia o cantidad de un analito en una muestra. El método implica los siguientes pasos:

a) exposición de la muestra a un socio de unión marcado;

b) tratamiento de la muestra con un ligando alterador de la señal capaz de alterar preferencialmente la marca presente en un socio de unión que no forma parte de un complejo "socio de unión:analito"; y

c) detección de la señal producida a partir de la marca que no ha sido alterada.

La señal de detección producida a partir de la marca que no ha sido alterada, puede lograrse provocando que la marca produzca una señal y midiendo la producción de la señal que no ha sido alterada. Por ejemplo, la presencia de una marca que emite luz, no alterada por un ligando, puede lograrse provocando que la marca emita luz mediante técnicas estándar, y midiendo la cinética, cantidad o longitud de onda de la luz de emisión.

En una versión preferida, las marcas son marcas emisoras de luz tales como marcas fluorescentes, quimioluminiscentes y bioluminiscentes. La emisión de luz puede medirse empleando un equipo estándar tal como un luminómetro o fluorómetro. De preferencia, la alteración preferencial de la producción de la señal y la emisión de luz se efectúa a temperatura esencialmente constante. "Temperatura esencialmente constante" significa el mantenimiento de la temperatura dentro de un margen no mayor del 250%, con más preferencia no mayor del 100%, con mayor preferencia el 25%, con más preferencia el 10%, y con la mayor preferencia el 5%. En una versión más preferida la alteración preferencial de la marca y la provocación de la emisión de luz se efectúa a temperatura ambiente (aproximadamente 20-25ºC) a temperatura esencialmente constante.

El análisis de protección de aductos puede efectuarse empleando diferentes formatos. Por ejemplo el análisis puede efectuarse con o sin un paso de separación. La evitación del paso de separación simplifica el análisis y proporciona ventajas tales como ahorro de tiempo, reactivos y sencillez de automatización.

El paso de separación para eliminar posteriormente el socio de unión marcado no unido al analito o los contaminantes, puede efectuarse antes de provocar la emisión de luz. Se prefiere un paso de separación cuando el análisis se efectúa en muestras clínicas que no han experimentado una purificación.

De esta forma, el análisis referenciado proporciona la detección de la presencia o cantidad de un analito, el cual implica la alteración preferencial de la señal producida por una marca presente en un socio de unión no unido al analito, permitiendo con ello que la señal producida por la marca presente en el socio de unión unido al analito sea inequívocamente detectada. La versatilidad del análisis tiene numerosos aspectos útiles entre los que se incluyen la capacidad de efectuar la alteración de la marca en un amplio margen de condiciones tampón para lograr una alta sensibilidad, la capacidad de efectuar el análisis empleando una temperatura esencialmente constante para lograr rápidamente un alto grado de sensibilidad, y la capacidad de efectuar el análisis a temperatura ambiente para lograr un alto grado de sensibilidad. Las ventajas de esta clase de análisis incluyen la facilidad de empleo debido a menos pasos de manipulación, ahorro de tiempo, y el ser más compatible con la automatización.

Se describen en la presente varios ejemplos de diferentes aspectos y versiones de la presente invención, tales como diferentes estructuras de marcas y ligandos alteradores de la señal. A no ser que se indique expresamente en las reivindicaciones, estos ejemplos y otros ejemplos que aquí se describen no tienen el propósito de limitar la invención.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de las siguientes figuras, descripción detallada de la invención, y las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 ilustra gráficamente la alteración preferencial de la producción de una señal empleando el sulfito de sodio y una sonda marcada con éster de acridinio.

La figura 2 ilustra la provocación de la emisión de luz de una molécula quimioluminiscente empleando peróxido de hidrógeno.

La figura 3 ilustra el análisis de protección del aducto empleando cantidades crecientes de la substancia diana.

La figura 4 y 5 proporcionan ejemplos de socios de unión que contienen una marca de éster de acridinio fijada a una región de unión. La región de unión se indica en las figuras mediante "sonda".

Descripción detallada de la invención

El análisis de protección de aductos facilita la detección de un analito aprovechando la formación de un aducto para alterar preferentemente la producción de una señal a partir de una marca presente en un socio de unión no unido a un analito. El análisis implica la formación de un micro-entorno protector cuando un socio de unión marcado forma un complejo con un analito. La marca presente en un socio de unión unido con el analito, está de preferencia protegida de la formación de un aducto, mediante un ligando alterador de la señal. El análisis de protección de un aducto puede emplearse para detectar rápidamente la presencia y/o cantidad de analito con un alto grado de sensibilidad.

La producción de una señal como indicación de la presencia o cantidad de analito puede medirse en diferentes tiempos puntuales después de dar principio al paso de alteración preferencial de la señal. En una versión, la producción de la señal se mide después de un tiempo que permite la formación de un aducto estable, por ejemplo en equilibrio. La medición de la producción de la señal en la que la formación del aducto con la marca presente en los socios de unión unidos y sin unir, es relativamente constante durante el tiempo, puede facilitar la obtención de resultados reproducibles durante un margen de tiempo más largo, y permite realizar numerosos experimentos a la vez y leer los resultados un tiempo después.

En otra versión, la señal se mide un tiempo después de la activación cuando el ratio de la señal producida por la marca presente en el socio de unión unido respecto a la señal producida por la marca presente en el socio sin unir, es maximizado. A este respecto, el análisis de protección del aducto puede transcurrir más rápidamente que los análisis hidrolíticos en donde la marca presente en el socio de unión no unido está preferencialmente alterada mediante la escisión del grupo lábil (ver, ejemplo 4 y 5 más abajo). Arnold y col., patente U.S. nº 5.284.174, Nelson y col., "Detection of Acridinium Esters by Chemiluminiscence" ("Detección de ésteres de acridinio por quimioluminiscencia"), en: Nonisotopic DNA Probe Techniques ("Técnicas de sondas de ADN no isotópicas"), (Kricka ed., Academic Press, 1992) páginas 275-311, Nelson y col., Clin. Chem. Acta 194:73-90, 1990 y Arnold y col., Clin. Chem. 35:1588-1594, 1989, describe análisis que preferentemente pueden ser efectuados mediante escisión hidrolítica preferencial de la marca presente en el socio de unión no unido.

La formación del aducto que tiene lugar con la marca presente en los socios de unión unidos o sin unir, se ilustra mediante las ecuaciones 1 y 2, en donde “marca sin unir” se refiere a la marca presente en el socio de unión no complejado con el analito, “marca unida” se refiere a la marca presente en el socio de unión complejado con el analito, “ligando” se refiere a un ligando que altera la señal, “marca” indica la marca que puede ser activada para producir una señal, y “marca-ligando” indica la formación de un aducto que altera la señal.

Ecuación 1

Marca sin unir * + ligando = marca sin unir - ligando

K_{2} = \frac{(marca \ sin \ unir - ligando)}{(marca \ sin \ unir *) \ (ligando)}

Ecuación 2

Marca unida * + ligando = marca unida - ligando

K_{1} = \frac{(marca \ unida - ligando)}{(marca \ unida *) \ (ligando)}

La alteración preferencial de la producción de la señal está afectada por las diferencias de K_{1} y K_{2} y la relación en la cual las dos reacciones alcanzan el equilibrio. Una constante de equilibrio de la ecuación 1 más alta, da como resultado más marca presente en el socio de unión sin unir que es alterado en el equilibrio. Una constante de equilibrio de la ecuación más baja da como resultado menos marca presente en el socio de unión unido que es alterado en el equilibrio. Como la reacción representada por la ecuación 1 transcurre a una velocidad mayor que la ecuación 2, más marca presente en el socio de unión sin unir se altera preferentemente durante las reacciones iniciales con los ligandos que alteran la señal.

Los factores que afectan la alteración preferencial de la producción de la señal incluyen la cantidad y tipo del analito, la cantidad y tipo del socio de unión marcado, la cantidad y tipo del ligando, y posibles interacciones con otros componentes presentes durante el análisis. Así el diseño y componentes de un análisis particular debe tomar en cuenta la naturaleza y fuente del analito, el tipo de ligando que altera la señal empleada, la naturaleza del socio de unión marcado, la capacidad del socio de unión para formar un complejo con el analito para formar un micro-entorno de protección para la marca, y el entorno en el cual el análisis tiene lugar.

I. Sensibilidad

La presente invención puede emplearse para detectar la presencia de un analito con un alto grado de sensibilidad. La sensibilidad refleja la capacidad de un análisis para detectar con exactitud la presencia de un analito. La sensibilidad toma en consideración el fondo resultante tanto de la producción de la señal de la marca presente en el socio de unión sin unir el cual no ha sido alterado y la capacidad del ligando de alteración de la señal para discriminar entre la marca presente en los socios de unión unidos y sin unir.

La figura 1 ilustra la relación entre la alteración preferencial de la producción de la señal y el fondo. Cada curva ilustra la provocación de la emisión de luz en presencia de un ligando alterador de la señal. La curva híbrida se refiere a una marca unida protegida de la alteración de la señal mientras la curva de la sonda se refiere a la marca presente en el socio de unión no unido. Los valores t_{1/2} para el cálculo del ratio de alteración diferencial, pueden obtenerse a partir de las pendientes de las dos curvas. Los puntos en donde las dos curvas se estabilizan indican que se ha alcanzado el equilibrio. El punto en donde la curva de la sonda se estabiliza indica también un fondo.

Para las sondas de oligonucleótidos empleadas para detectar un analito de ácido nucleico, el ratio de alteración diferencial se determina por medición del t_{1/2} del híbrido dividido por el t_{1/2} de la sonda marcada. De preferencia, el ratio de alteración diferencial es por lo menos 2 veces mayor, con más preferencia por lo menos 15 veces mayor, con mayor preferencia por lo menos 75 veces mayor, y con la mayor preferencia por lo menos 100 veces mayor.

Con más preferencia el análisis se efectúa en condiciones de alta sensibilidad en donde la señal producida es igual o mayor que la media del fondo más dos veces la desviación estándar. La desviación estándar puede calcularse empleando técnicas estándar y ecuaciones como sigue:

\newpage

Ecuación 3

S.D.=\sqrt{\frac{\frac{\sum^{n}}{i=1}(x_{i}-\overline{x})^{2}}{n=1}}

en donde \upbar{x} es la media de la muestra, x es una lectura particular, y n es el número total de mediciones.

Con más preferencia, el análisis se efectúa en condiciones en donde la señal producida es igual o mayor que la media del fondo más tres veces la desviación estándar, con más preferencia por lo menos 4 veces la desviación estándar y con la mayor preferencia, por lo menos 5 veces la desviación estándar.

II Analito

El análisis de protección del aducto puede emplearse para detectar la presencia y/o una cantidad de diferentes tipos de analitos, incluyendo secuencias de ácidos nucleicos y epitopos antigénicos. La cantidad de analito presente en una muestra depende de la muestra que se analiza y de si se ha llevado a cabo alguna técnica para aumentar la cantidad de analito antes de la detección. Por ejemplo, el número de analitos de ácido nucleico puede aumentarse empleando técnicas tales como la PCR (p. ej., como está descrito en Mullis y col., patente U.S. nº 4.683.202) y amplificación basada en la transcripción (p. ej., como está descrito en Kacian y col., en la patente U.S. nº 5.399.491).

A. Detección de ácidos nucleicos diana

La detección de una secuencia de ácido nucleico diana (p. ej., una secuencia de ácido nucleico buscada para ser detectada o medida), puede efectuarse empleando una sonda de ácido nucleico la cual es suficientemente complementaria de la secuencia de ácido nucleico diana para distinguir la secuencia de otras secuencias de ácidos nucleicos que pueden estar presentes en la muestra. La especificidad de una muestra está afectada por numerosos factores conocidos en la técnica tales como el grado de complementariedad entre la sonda y las secuencias de ácido nucleico diana y las condiciones de hibridación (p. ej., ver Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual ("Clonación molecular: un manual de laboratorio") (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) y Hogan y col., Publicación internacional WO 88/03957 (ver más arriba).

B. Detección de antígenos

Los anticuerpos pueden emplearse para detectar la presencia de un epitopo particular presente en un antígeno. Harlow y col., Antibodies; A Laboratory Manual ("Anticuerpos; un manual de laboratorio"), Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, describe la producción y el empleo de los anticuerpos.

III. Socio de unión marcado

Los socios de unión marcados constan de una marca unida a un socio de unión. La región de unión permite al socio de unión unirse a un analito, mientras que la marca puede ser activada para producir una señal detectable.

El análisis de protección de un aducto puede efectuarse con una cantidad en exceso de un socio de unión marcado o con una cantidad en exceso de analito. La provisión de una cantidad en exceso de un socio de unión ofrece la ventaja de una mayor sensibilidad a concentraciones bajas de analito. Una posible desventaja de tener una marca en exceso es que está presente más socio de unión marcado lo cual requiere más ligando para reducir el fondo. Sin embargo, debido a la alta sensibilidad que puede lograrse con el análisis de protección de un aducto, se prefiere una cantidad en exceso de socio de unión marcado para efectuar el análisis.

A. Marcas

El análisis de protección de un aducto puede efectuarse empleando diferentes tipos de marcas tales como marcas colorimétricas, bioluminiscentes, fluorescentes y quimioluminiscentes. Los factores a tener en cuenta en la selección de la marca incluyen los siguientes: (1) la marca debe escogerse de forma que su capacidad para ser activada para producir una señal pueda ser alterada mediante la formación del aducto. (2) la marca puede protegerse de la formación del aducto mediante el micro-entorno protector formado después de la unión del socio de unión al analito, y (3) la marca no evita que el socio de unión reconozca al analito.

Ejemplos de marcas colorimétricas incluyen marcas que contienen una enzima que puede combinar con un substrato para producir un producto que ocasiona un cambio en la absorbancia y marcas que contienen un substrato que puede combinar con una enzima para producir un cambio de la absorbancia. Por ejemplo, el ligando alterador de la señal puede alterar la señal del enzima/substrato formando un aducto con el enzima/substrato alterando con ello la reacción catalizada por la enzima. Otro ejemplo, son las marcas que absorben luz a una longitud de onda dada y esta absorbancia se altera mediante la reacción con un ligando.

\newpage

La presente invención se efectúa de preferencia empleando sondas de ácido nucleico que tienen una marca de emisión de luz la cual está protegida de la formación de aducto mediante la hibridación de la sonda a un ácido nucleico diana. Marcas de emisión de luz preferidas, son las quimioluminiscentes o las fluorescentes. Las marcas quimioluminiscentes pueden activarse mediante una reacción química tal como el calor y la oxidación, mientras que las marcas fluorescentes pueden ser activadas mediante la luz. Las marcas que pueden activarse para emitir luz son generalmente capaces de fluorescer, aunque en algunos casos la activación de una marca "quimioluminiscente" mediante luz puede dar como resultado una menor emisión de luz que la quimioluminiscencia.

1. Marcas quimioluminiscentes

Las marcas quimioluminiscentes se activan para emitir luz mediante un agente activador que ocasiona la formación de una molécula en estado excitado, el cual decae con la misma emisión de luz. La marca quimioluminiscente puede contener un grupo lábil unido a la molécula quimioluminiscente el cual se escinde durante la reacción química causando la emisión de luz. Alternativamente, la marca quimioluminiscente puede no contener un grupo lábil escindido durante la activación de la emisión de luz. Más adelante, se describen ejemplos de moléculas quimioluminiscentes que tienen un grupo lábil que puede ser escindido durante la activación de la emisión de luz. Ejemplos de moléculas quimioluminiscentes que no tienen un grupo lábil escindido durante la activación, incluyen los dioxetanos, oxalatos, dioxetanonas, y quelatos de rutenio. Ejemplos de diferentes tipos de moléculas quimioluminiscentes figuran en
Campbell, Chemiluminiscence: Principles and Application in Biology and Medicine ("Quimioluminiscencia: principios y aplicación en Biología y Medicina"), Ellis Horwood Ltd., Chichester England, 1988.

La figura 2 ilustra la reacción de emisión de luz de una marca quimioluminiscente que emplea peróxido de hidrógeno como agente de activación. Las condiciones favorables para la activación de una marca quimioluminiscente y los métodos de detección de la luz emitida ya son conocidos en la técnica. P. ej., ver Nelson y col., "Detection of Acridinium Esters by Chemiluminiscence" ("Detección de ésteres de acridinio por quimioluminiscencia") ver más arriba, y Arnold y col., patente U.S. nº 5.283.174, ver más arriba.

Ejemplos de marcas quimioluminiscentes, la producción de dichas marcas, la unión de las marcas a los socios de unión y los factores que afectan generalmente la estabilidad de las marcas quimioluminiscentes son conocidos en la técnica. Ver Beheshti y col., patente U.S. nº 5.290.936; Campbell y col., patente U.S. nº 4.946.958; Law y col., patentes U.S. n^{os} 4.918.192, 4.745.181, 5.110.932 y 5.241.070; Mattingly y col., titulado "Chemiluminescent Acridinium and Phenantridinium Salts." ("Sales de acridinio y fenantridinio quimioluminiscentes"), publicación europea nº 0 273 115; McCapra y col., patente U.S. nº 5.281.712; McCapra. patente U.S. nº 5.283.334; McCapra y col., patente U.S. nº 5.284.951; McCapra. patente U.S. nº 5.321.136; McCapra y col., titulado "Assays Utilizing Improved Chemiluminescent Esters, Thioesters and Amides" ("Análisis utilizando ésteres, tioésteres y amidas quimioluminiscentes perfeccionados") publicación de patente europea nº 0 322 926; Ramakrishnan y col., patente U.S. nº 5.284.952; Reddy y col., titulado "Chemiluminiscent Compounds" ("Compuestos quimioluminiscentes"), publicación internacional nº WO 92/09580; Sato y col., titulado "Acridinium Compounds and Conjugates Thereof" ("Compuestos de acridinio y conjugados de los mismos"), publicación europea nº 0 609 885; y Sheehan y col., patente U.S. nº 3 539 574. Estos factores incluyen la estructura de la molécula quimioluminiscente, el tipo y posición de los substituyentes en la molécula quimioluminiscente y el grupo lábil, y la estructura del grupo de engarce que une un grupo lábil a una molécula quimioluminiscente. Por ejemplo, diferentes tipos de grupos de engarce pueden estar presentes, incluyendo los ésteres, amidas, tiolésteres y sulfonilamidas; la estabilidad de la molécula quimioluminiscente puede verse afectada por el emplazamiento de los grupos voluminosos y grupos captadores o donantes de electrones en ciertas posiciones; y los grupos lábiles preferidos para una eficiente quimioluminiscencia tienen un pK_{2} \leq 11, de preferencia < 11, con más preferencia 5 a 8, y son preferentemente un anillo arilo o un sistema de anillos.

Aizawa y col., en el trabajo titulado "Method of Making Acridinium Derivatives Luminisce and Method of Detecting Test Material Therewith" ("Método para obtener derivados de acridinio luminiscentes y método de detección de materiales de análisis con los mismos"), publicación europea nº 0 617 107 A1, describe la producción y empleo del anión superóxido (O^{2-}) para la activación de la emisión de luz de los derivados del acridinio. Los métodos descritos por Aizawa y col., son apropiados para generar emisión de luz a pH neutro.

Las marcas quimioluminiscentes preferidas contienen una molécula quimioluminiscente con un sistema anular de arilos y un grupo lábil. De preferencia, el sistema anular de arilos tiene de 1 a 4 grupos arilo y contiene una carga positiva (p. ej., la carga positiva está presente localizada bien en un anillo o bien en un substituyente de un anillo). Más preferentemente, el sistema anular de arilos cargado positivamente, contiene un arilo heterocíclico substituido.

Las moléculas quimioluminiscentes preferidas que tienen un grupo lábil tienen la siguiente estructura:

\newpage

Estructura I

1

en donde el sistema anular de arilos contiene de uno a cuatro grupos cíclicos, y uno de los grupos está unido al carbono de engarce "c", con más preferencia el sistema anular de arilos está positivamente cargado, con mayor preferencia el sistema anular de arilos contiene un arilo heterocíclico cargado positivamente unido a "c"; ejemplos de arilos heterocíclicos incluyen el acridinio, benz[a]acridinio, benz[b]acridinio, benz[c]acridinio, un catión benzimidazol, quinolinio, isoquinolinio, quinolizinio, quinolinio cíclico substituído, piridinio, pirimidininio, piridazinio, pirazininio, fenatridinio y quinozalinio;

R_{2} se selecciona del grupo formado por S, O y NH, de preferencia R_{2} es O;

R_{3} se selecciona del grupo formado por O, N, S, halógeno, fósforo substituído, azufre substituído, boro substituído y arsénico substituído, de preferencia R_{3} es o bien O, N o S, con más preferencia R_{3} es O o S, con la mayor preferencia R_{3} es O;

R_{4} se selecciona del grupo formado por alquilo, alquenilo, arilo, alcoxilo y ariloxilo, o está ausente cuando R_{3} es halógeno, de preferencia R_{4} es un arilo, con más preferencia R_{4} es un fenilo opcionalmente substituído; y

R_{5} es nada a no ser que R_{3} sea N, si R_{3} es N, entonces R_{5} se selecciona del grupo formado por hidrógeno, alquilo, alquenilo, arilo, alcoxilo y ariloxilo, de preferencia R_{5} es nada.

Los compuestos de estructura I cargados positivamente están iónicamente asociados con un ión opuesto. Varios diferentes aniones tales como un halógeno, sulfato, alquilsulfato, halosulfato, haloborato, haloacetato, halofosfato y fosfato pueden servir como ión opuesto.

Con más preferencia la marca quimioluminiscente está formada por un acridinio unido a un grupo lábil como se indica en la estructura II.

Estructura II

2

en donde R_{1} se selecciona del grupo formado por H, alquilo, alquenilo, alquinilo y arilo; de preferencia R_{1} es un alquilo inferior, con más preferencia metilo;

n es o bien 0, 1, 2, 3, ó 4, de preferencia n es o bien 0, 1 ó 2;

m es o bien 0, 1, 2, 3, ó 4; de preferencia m es o bien 0, 1 ó 2;

cada X está independientemente seleccionada del grupo formado por alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, amino, amino substituido, carboxilo, hidroxilo, alcoxilo, nitro, sulfonilo, halógeno, tiol, amido, acetilo, acetilo substituido y ariloxilo, y los substituyentes restantes del anillo A son hidrógeno, de preferencia cada X es independientemente entre sí un alquilo o un alcoxilo, con más preferencia cada X es independientemente entre sí un alquilo inferior o un alcoxilo inferior, con mayor preferencia cada X es independientemente entre sí metilo o metoxilo;

cada Y se selecciona independientemente entre sí del grupo formado por alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, amino, amino substituido, carboxilo, hidroxilo, alcoxilo, nitro, sulfonilo, halógeno, tiol y ariloxilo, y los substituyentes del anillo C restante son hidrógeno, de preferencia cada Y es independientemente entre sí un alquilo o un alcoxilo, con más preferencia cada Y es alquilo inferior o alcoxilo inferior y con mayor preferencia cada Y es independientemente entre sí metilo o metoxilo; y

R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} se definen como se ha descrito más arriba para los compuestos de estructura I.

Otras moléculas quimioluminiscentes más preferidas unidas a grupos lábiles tienen un sistema de anillo heterocíclico seleccionado del grupo formado por benz(a)acridinio, benz(b)acridinio, benz(c)acridinio, catión benzimidazol, quinolinio, isoquinolinio, quinolizinio, quinolinio cíclico substituido, piridinio, pirimidininio, piridazinio, pirazininio, penatridinio y quinozalinio; en donde cada anillo del sistema de anillos está substituido de la misma manera que un compuesto de estructura II, en donde cada carbono disponible puede cada uno independientemente entre sí tener un substituyente X/Y, con más preferencia cada anillo contiene 0 a 2 substituyentes; y uno de los anillos es un anillo heterocíclico positivamente cargado, que contiene un N unido a R_{1} y un átomo de carbono está unido a un grupo de engarce.

2. Marcas fluorescentes

Las marcas fluorescentes contienen típicamente un grupo aromático que puede ser excitado por la luz para producir una molécula en estado de excitación. La unión del ligando alterador de la señal puede alterar la fluorescencia. Como se ha indicado más arriba, las marcas de quimioluminiscencia tales como los ésteres de acridinio pueden ser también marcas fluorescentes. Por lo tanto, ejemplos de marcas fluorescentes incluyen aquellas marcas descritas como quimioluminiscentes en la sección III.A.1 de más arriba. Ejemplos de marcas fluorescentes incluyen también insertadores o fijadores de ranuras tales como la rodamina, fluoresceína, rutenio, haluros de etidio y acridina.

Las marcas fluorescentes preferidas tienen un sistema de electrón pi conjugado, de preferencia un anillo aromático. La fluorescencia del anillo aromático puede alterarse mediante la disrupción de la aromaticidad del anillo aromático como por ejemplo, mediante la formación de un aducto.

3. Definiciones químicas

A continuación sigue una descripción de algunos de los grupos químicos que pueden estar presentes en las diferentes marcas. Las diferentes estructuras químicas básicas que se indican pueden estar substituídas con diferentes grupos. Las substituciones de cada uno de los diferentes grupos descritos más adelante pueden hacerse con un átomo o átomos que son no reactivos (es decir, no reaccionan con el analito, impiden la formación de un aducto alterador de la señal, o impiden la producción de una señal). Ejemplos de substituciones en la estructura básica se indican también más adelante.

Un "acetilo" se refiere a C(=O)-CH_{3}.

Un "amino" se refiere a –NH_{2}.

Un "amido" se refiere a C(=O)-NH_{2}.

Un grupo "alquilo" se refiere a un hidrocarburo alifático saturado opcionalmente substituído, incluyendo una cadena lineal, cadena ramificada, y grupos alquilo cíclicos. De preferencia, el grupo alquilo tiene de 1 a 25 carbonos y contiene no más de 20 heteroátomos. Con más preferencia, es un alquilo inferior de 1 a 12 carbonos, con mayor preferencia de 1 a 4 carbonos. Los heteroátomos se seleccionan de preferencia del grupo formado por nitrógeno, azufre, fósforo y oxígeno.

Un grupo "alquenilo" se refiere a un hidrocarburo opcionalmente substituído que contiene por lo menos un doble enlace, incluyendo una cadena lineal, una cadena ramificada y grupos alquenilo cíclicos, todos los cuales pueden estar opcionalmente substituídos. De preferencia el grupo alquenilo tiene de 2 a 25 carbonos y contiene no más de 20 heteroátomos. Con más preferencia, es un alquenilo inferior de 2 a 12 carbonos, con más preferencia de 2 a 4 carbonos. Los heteroátomos se seleccionan de preferencia del grupo formado por nitrógeno, azufre, fósforo y oxígeno.

\newpage

Un grupo "alquinilo" se refiere a un hidrocarburo no saturado opcionalmente substituido que contiene por lo menos un triple enlace, incluyendo una cadena lineal, una cadena ramificada y grupos alquinilo, todos los cuales pueden ser opcionalmente substituídos. De preferencia, el grupo alquinilo tiene de 2 a 25 carbonos y contiene no más de 20 heteroátomos. Con más preferencia, es un alquinilo inferior de 2 a 12 carbonos, con más preferencia, de 2 a 4 carbonos. Los heteroátomos se seleccionan de preferencia del grupo formado por nitrógeno, azufre, fósforo y oxígeno.

Un "arilo" se refiere a un grupo aromático opcionalmente substituído que tiene por lo menos un anillo con un sistema de electrón pi conjugado e incluye grupos arilo carbocíclico, arilo heterocíclico, biarilo y triarilo. Ejemplos de substituyentes de substitución de arilo incluyen alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, amino, amino substituido, carboxilo, hidroxilo, alcoxilo, nitro, sulfonilo, halógeno, tiol y ariloxilo.

Un "arilo carbocíclico" se refiere a un arilo en donde todos los átomos del anillo aromático son átomos de carbono. Los átomos de carbono están opcionalmente substituidos como se ha descrito más arriba para un arilo. De preferencia, el arilo carbocíclico es un fenilo opcionalmente substituído.

Una "arilo heterocíclico" se refiere a un arilo que tiene de 1 a 3 heteroátomos como átomos de anillo en el anillo aromático y el resto de átomos del anillo son átomos de carbono. Heteroátomos adecuados incluyen oxígeno, azufre y nitrógeno. Ejemplos de arilo heterocíclico incluyen el furanilo, tienilo, piridilo, pirrolilo, N-alquilo inferior pirrolo, pirimidilo, pirazinilo e imidazolilo. El arilo heterocíclico está opcionalmente substituido como se ha descrito más arriba para un arilo.

Un "alcoxilo" se refiere a "-O-alquilo" en donde "alquilo" se define como se ha descrito más arriba, y "O" es un oxígeno. De preferencia, el alcoxilo es un O-alquilo inferior.

Un "ariloxilo" se refiere a un "-O-arilo" en donde el "arilo" se define como se ha descrito más arriba y "O" es un oxígeno.

"Nitro" se refiere a NO_{2}.

"Sulfonilo" se refiere a S(O)_{2}-R, en donde R es un átomo o átomos no reactivos. Ejemplos de R incluyen alquenilo, alquinilo, arilo, halógeno, amino y amino substituido.

Un "acetilo substituido" se refiere a C(=O)-CH(R)_{2}, en donde cada R es cualquier átomo o átomos químicos no reactivos, con la condición de que por lo menos un R no sea hidrógeno. Ejemplos de dichas substituciones incluyen hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, amino, carboxilo y alcoxilo.

Un "amino substituido" se refiere a -NH-R en donde R es cualquier átomo o átomos químicos no reactivos. Ejemplos de tales substituciones incluyen alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, amino, carboxilo y alcoxilo.

Un "fósforo substituído" se refiere a -P(R)_{3} en donde cada R es un átomo o átomos químicos no reactivos. Ejemplos de R incluyen O, =O, S, CH_{3}, Se, y As.

Un "azufre substituido" se refiere a la presencia de cualquier átomo o átomos distintos del hidrógeno los cuales obedecen la estequiometría química y son no reactivos.

Un "boro substituído" se refiere a la presencia de cualquier átomo o átomos distintos del hidrógeno los cuales obedecen la estequiometría química y son no reactivos.

Un "arsénico substituído" se refiere a la presencia de cualquier átomo o átomos distintos del hidrógeno los cuales obedecen la estequiometría química y son no reactivos.

B. Región de unión

Una región de unión se designa para reconocer parte del analito, y permite la formación de un micro-entorno con un analito el cual protege a la marca, de la alteración de la señal mediante la formación de un aducto. De preferencia, la región de unión contiene una secuencia de ácido nucleico complementaria en algún grado con una secuencia de ácido nucleico diana. Por ejemplo, una sonda de oligonucleótidos puede ser diseñada para hibridar específicamente con una secuencia de ácido nucleico diana característica de un microorganismo particular. Por otro lado, puede emplearse una sonda de hibridación sin un alto grado de especificidad, en diferentes análisis. Ejemplos de aplicaciones en las cuales un alto grado de especificidad de la sonda no es necesaria incluyen aquellos en las que la sonda se designa para hibridar con más de una secuencia afin, y en donde el ácido nucleico diana se separa de los contaminantes. El ácido nucleico diana puede separarse de los contaminantes, por ejemplo, empleando una sonda de captura (p. ej., ver Collins titulado "Target and Background Capture Methods and Apparatus for Affinity Assays" ("Métodos de captura de la diana y del fondo, y aparato para análisis de afinidad"), publicación europea nº 0 265 244 B1).

Otro ejemplo de una región de unión es un dominio de unión de epitopo de anticuerpo. Los anticuerpos pueden ser empleados para detectar la presencia de un epitopo particular presente en un antígeno. Por ejemplo, los anticuerpos pueden emplearse para detectar una proteína antigénica particular. Harlow y col., Antibodies; A Laboratory Manual ("Anticuerpos; un manual de laboratorio"), Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, describe la producción y empleo de anticuerpos.

C. Síntesis de socios de unión marcados

Los socios de unión que contienen marcas pueden obtenerse empleando técnicas estándar. En conjunto la marca debe tener una estructura que le permita estar presente en el micro-entorno formado por la unión del socio de unión al analito, mientras que al mismo tiempo permite que un agente activador ocasione la producción de una señal. Por ejemplo, cuando la emisión de luz de moléculas quimioluminiscentes es activada mediante un ataque oxidante, el grupo de engarce debe permanecer susceptible al ataque oxidante cuando está presente en el micro-entorno.

La marca no debe evitar que el socio de unión se una al analito y así distinga el analito de los contaminantes. Por ejemplo la capacidad de una sonda de ácido nucleico marcada para indicar la presencia de un organismo particular debe permanecer intacta.

Las sondas de ácido nucleico que tienen una secuencia de ácido nucleico y una composición de base particular, pueden ser construídas empleando técnicas estándar. La modificación de la composición de la base puede efectuarse por ejemplo, para aumentar la estabilidad del oligonucleótido mediante la alquilación de la posición 2'-O- (p. ej., un grupo 2'-metoxilo) (ver Miller y col., titulado "Oligonucleotides Modified to Improve Stability at Acid pH" ("Oligonucleótidos modificados para aumentar la estabilidad en pH ácido"), publicación internacional nº WO 94/15619. La síntesis orgánica de los oligonucleótidos puede efectuarse añadiendo nucleótidos en un paso de manera prudente. Eckstein, F., Oligonucleotides and Analogues. A Practical Approach ("Oligonucleótidos y análogos. Un método práctico"), capítulos 1-5, 1991, revisa la síntesis orgánica de oligonucleótidos; Caruthers y col., en Methods In Enzymology ("Métodos en enzimología") vol 154 p. 287 (1987), describe un procedimiento para la síntesis orgánica de oligonucleótidos que contienen engarces fosfodiéster empleando la química estándar de fase sólida de la fosforamidita; Bhatt, patente U.S. nº 5.252.723 describe un procedimiento para la síntesis orgánica de oligonucleótidos que contienen engarces fosforo-tioatos; y Klem y col., titulado "Improved Process for the Synthesis of Oligomers" ("Proceso perfeccionado para la síntesis de oligómeros") publicación internacional nº WO 92/07864, describe la síntesis orgánica de oligonucleótidos que tienen diferentes engarces internucleótidos incluyendo los engarces metil fosfonatos.

Una marca puede unirse a un socio de unión de ácido nucleico empleando técnicas tales como las descritas por Arnold y col., titulado “Non-nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes” (“Reactivos de engarce no nucleótidos para sondas de nucleótidos”) publicación europea nº 0313219; Arnold y col., patente U.S. nº 5.185.439; y Nelson y col., “Detection Of Acridinium Esters By Chemiluminiscence" (“Detección de ésteres de acridinio por quimioluminiscencia") en Nonisotopic DNA Probe Techniques (“Técnicas de sonda de ADN no isotópicas) (Kricka ed., Academic Press, 1992) páginas 275-311. Estas referencias describen la producción de un socio de unión conteniendo un éster de acridinio unido a una región de unión de ácido nucleico. Sin embargo, pueden emplearse técnicas análogas para unir otras marcas a otros socios de unión. (Se indican referencias adicionales para la producción de socios de unión unidos a marcas, en la sección III.A.1, ver más arriba).

Pueden unirse moléculas emisoras de luz a anticuerpos empleando técnica tales como las descritas por Weeks y col., Immunoassays using acridinium esthers, Methods Enzymol ("Inmunoanálisis empleando ésteres de acridinio, Métodos de enzimología"), 133: 365-368 (1986), y las referencias mencionadas en la Sección III.A.1, ver más arriba, referentes a la unión de marcas emisoras de luz, con anticuerpos. Los anticuerpos pueden producirse empleando técnicas estándar tales como las descritas por Harlow y col., ver más arriba.

IV. Ligando alterador de la señal

Los ligandos alteradores de la señal, adecuados para el análisis de protección de aductos pueden discriminar entre la marca presente en un socio de unión no unido y la marca presente en un socio de unión unido al analito. La cantidad de ligando empleado en un análisis puede afectar el análisis por diferentes caminos. Por ejemplo, la provisión de una cantidad mayor de ligando puede aumentar el número de marcas alteradas presentes en socios de unión unidos y sin unir.

Los ligandos preferidos son aquellos que reaccionan rápidamente con la marca presente en el socio de unión sin unir y/o proporcionan una constante de equilibrio alta de la ecuación 1, mientras que reaccionan muy lentamente con la marca presente en el socio de unión unido al analito y/o que tiene una constante de equilibrio baja de la ecuación 2. Con más preferencia, el ligando alterador de la señal reacciona rápidamente con la marca presente en el socio de unión no unido al analito proporcionando una constante de equilibrio alta de la ecuación 1, y reacciona lentamente con la marca en el socio de unión unido proporcionando una constante de equilibrio baja de la ecuación 2.

Los ligandos alteradores de la señal preferidos son nucleófilos capaces de discriminar entre la marca presente en los socios de unión unidos y sin unir, bajo condiciones de análisis y las cuales forman un fuerte aducto con la marca presente en el socio de unión sin unir. Por ejemplo, en el caso de marcas emisoras de luz preferidas que tienen un grupo de engarce unido a un grupo lábil, el aducto formado debe inhibir que el grupo de engarce sea oxidado por agentes oxidantes tales como el peróxido de hidrógeno y el ión superóxido. Arnold y col., patente U.S. nº 4.950.613 y Hammond y col., J. Biolumin. Chemilumin. 6:35-43, 1991, describen ligandos capaces de formar un aducto de protección con un éster de acridinio que impide la emisión de luz.

Los ligandos preferidos tienen un par aislado de electrones que permiten al ligando actuar como un nucleófilo fuerte. Con más preferencia, el par aislado de electrones está presente en un elemento del grupo VI, y con mayor preferencia el elemento es azufre. De preferencia el elemento que contiene el par aislado de electrones no es adyacente a un sistema de electrones pi o grupo nitrilo. Por ejemplo, el elemento que contiene el par aislado de electrones no debe ser adyacente a un anillo aromático. Ejemplos de ligandos alteradores de la señal, adecuados, incluyen el tetrahidro-tiopeno, propanotiol, bencilmercaptano, sulfito, sulfito de glicol, hidrosulfito, metabisulfito, tiosulfato, tiofosfato, metaarsenito, telurito, arsenito y tiocianato.

V. Detección de secuencias diana de ácido nucleico

El análisis de protección de aductos se efectúa de preferencia empleando una sonda de ácido nucleico para detectar la presencia de una secuencia diana de ácido nucleico. El grado de protección proporcionado por un híbrido sonda:diana, marcado, a una marca está influenciado por factores que incluyen el tipo de bases de nucleótido pre-sentes y las secuencias de nucleótidos de la sonda y el híbrido.

El análisis de protección de aductos puede emplearse para detectar diferentes dianas de ácido nucleico tales como ADN y ARN. El análisis se efectúa de preferencia empleando ARN dianas. Los métodos para producir dianas de ARN y ARN amplificado a partir de ADN, o dianas de ARN amplificado a partir de ARN, ya son conocidas en la técnica. P. ej., Kacian y col., patente U.S. nº 5.399.491.

VI. Ejemplos

Más adelante se describen diferentes ejemplos para ilustrar diferentes aspectos y versiones de la presente invención. Estos ejemplos ilustran la presente invención empleando ésteres de acridinio como una marca. Los ésteres de acridinio, como muchos otros especies catiónicas heteroaromáticas, reaccionan reversiblemente con nucleófilos para formar aductos. Como resultado de la formación del aducto, varias importantes propiedades del éster de acridinio resultan marcadamente alteradas. El sitio preferido para la formación del aducto sobre el éster de acridinio es la posición
C-9. La formación del aducto altera el espectro visible del éster de acridinio, inhibe fuertemente la fluorescencia del éster de acridinio, estabiliza el enlace éster del éster de acridinio para la hidrólisis, e inhibe la reacción de un agente activador tal como el ión peróxido o superóxido con éster de acridinio para generar quimioluminiscencia.

Estos ejemplos no se presentan en forma alguna con la intención de limitar la invención descrita. Los ejemplos ilustran la metodología con diferentes marcas, y los ligandos que alteran las señales pueden ser fácilmente detectados mediante procedimientos de rutina para asegurar que tienen la actividad deseada. Por ejemplo, las marcas dentro de una fórmula descrita en la presente descripción pueden ser investigadas para determinar aquellas marcas que tengan la actividad más apropiada.

Ejemplo 1 Discriminación preferencial de una marca en socios de unión unidos y sin unir

Se han descubierto compuestos que contienen átomos de azufre que tienen un par de electrones libres que no están conjugados a un anillo aromático o a un grupo nitrilo que forman aductos fuertes con sondas monocatenarias marcadas con éster de acridinio, pero no con las mismas sondas hibridadas a un analito de ácido nucleico diana. Este ejemplo ilustra el empleo de un ligando alterador de la señal con preferencia a una marca alteradora presente en un socio de unión sin unir.

Hibridación

A 15 \mul de tampón 2X de hibridación (100 mM de succinato de litio (pH 5,2), 8,5% (p/v) de laurilsulfato de litio, 1,5 mM de EDTA, 1,5 mM de EGTA), se añadieron 1 pmol de una sonda marcada con éster de acridinio (AE) (7 x 10^{7} RLU/pmol) y 4 pmoles de diana. La secuencia de la sonda marcada con AE fué proporcionada por SEQ. ID. NO. 1: 5'-GGGGTTCTT*T TCGCCTTTCC CTCACGG, en donde * indica la posición de la marca de éster de acridinio. La secuencia diana fué proporcionada por SEQ. ID. NO. 2: 5'-CCGTGAGGGA AAGGCGAAAA GAACCCC.

La solución resultante se ajustó a 30 \mul con agua, se calentó a 60ºC durante 30 minutos y se diluyó a 500 \mul con tampón 1X de hibridación.

Protección del aducto

En un tubo de 12 x 75 mm (Sarstedt) se añadieron 2 \mul de sonda o híbrido marcado con AE (400.000 RLU). A esta solución se añadieron 100 \mul de tampón formador de aducto (10 mM de sulfito de sodio, 30 mM de tampón de borato (pH 8,7), 1,5% de Triton TX100). A continuación, se agitó la solución con el Vortex y se dejó asentar a temperatura ambiente (aproximadamente 22-25ºC) para diferentes cantidades de tiempo. Se midió la quimioluminiscencia de la solución resultante, mediante la adición de Detect I (0,1% (v/v) de H_{2}O_{2} en 0,001 N de NHNO_{2}), seguido de 0,5-2 segundos más tarde por una inyección de Detect II (200 \mul de NaOH 1N. Se totalizó la emisión de luz durante un intervalo de 5 segundos.

Resultados

Como se muestra en la figura 1, el sulfito de sodio reacciona muy rápidamente con la sonda AE y después de 150 segundos la reacción alcanza el equilibrio. En cambio, cuando la misma sonda AE se híbrida con un ácido nucleico diana complementario, el híbrido AE resultante reacciona mucho más lentamente con sulfito de sodio.

A concentraciones más bajas de sulfito de sodio, se forma menos aducto con éster de acridinio, pero la formación de aducto es todavía más fuerte y más rápida sobre la sonda AE que sobre el híbrido AE. A concentraciones más altas de sulfito de sodio (200 mM) se forma más aducto sobre el éster de acridinio pero la discriminación entre la sonda AE y el híbrido AE ha disminuído.

Ejemplo 2 Detección de una secuencia diana

La capacidad del análisis de protección de aductos para detectar la presencia de una secuencia diana se examinó empleando un gran exceso de sonda marcada con éster de acridinio y cantidades decrecientes de una diana complementaria.

Hibridación

A 20 \mul de tampón de hibridación se añadieron varias cantidades de diana y 0,05 pmoles de sonda. La secuencia de la diana marcada con AE fué proporcionada por SEQ. ID. NO. 3: 5'- ATCATCCATG TATTGAT*AGA TAACTATGTC TGG, en donde * indica la posición de la marca de éster de acridinio. La secuencia diana fué proporcionada por SEQ. ID. NO. 4: 5'-CCAGACATAG TTATCTATCA ATACATGGAT GAT. La solución resultante se calentó a continuación a 60ºC durante 30 minutos.

Protección de la aducción

A un tubo de 12 x 75 mm (Sarstedt) se añadieron 200 \mul de solución formadora de aducto (60 mM de tetraborato de sodio (pH 8,8), 2% (v/v) Tx100, 20 mM de sulfito de sodio). La solución se agitó con el Vortex y se incubó 15 segundos a temperatura ambiente. La quimioluminiscencia de la solución resultante se midió por inyección de Detect I seguido 0,5 segundos más tarde por una inyección de Detect II. La emisión de luz se totalizó durante un período de tiempo de 5 segundos.

Resultados

Como muestra la figura 3 el análisis de protección de un aducto es capaz de detectar la presencia de una secuencia diana empleando un gran exceso de sonda marcada con éster de acridinio y cantidades decrecientes de una diana complementaria.

Ejemplo 3 Diferentes estructuras de éster de acridinio

Este ejemplo ilustra el empleo de diferentes derivados de éster de acridinio en el análisis de protección de un aducto y el diferente efecto que las estructuras derivadas del éster de acridinio tienen sobre las proporciones de formación de aducto. El efecto de los grupos dadores de electrones sobre el anillo de acridinio se estudió empleando el 1-metil-AE y 2,7 dimetil-AE. El efecto de diferentes grupos lábiles engarzados al ácido nucleico se estudió empleando el o-AE, naftil AE, o-Me-Cin-AE, o-diMe-AE, y o-diBr-AE. La estructura de estos diferentes ésteres de acridinio está mostrada en las figura 4 y 5. El sulfito de sodio o metabisulfito de sodio se emplearon como ligando alterador de la señal.

Hibridación

A 15 \mul de 2X tampón de hibridación (0,2 M de succinato de litio (pH 5,2), 1,0 M de LiCl, 0,2% de Triton X-100), se añadieron 0,1 pmoles de sonda (7 x 10^{7} RLU/pmoles) y 0,1 pmoles de ADN diana. La secuencia de la sonda marcada AE fué proporcionada por SEQ. ID. NO. 5: 5'-GCTCGTTGCG GGACTT*AACC CAACAT, en donde * indica la posición de la marca de éster de acridinio. La secuencia diana fué proporcionada por SEQ. ID. NO. 6: 5'-ATGTTGGGTT AAGTCCCGCA ACGAGC. La solución resultante se ajustó a 30 \mul con agua, se calentó a 60ºC durante 60 minutos, y se diluyó a 500 \mul con tampón de hibridación 1X.

Protección del aducto

En un tubo de 12 x 75 mm (Sarstedt) se añadieron 30 \mul de tampón borato (30 mM de borato (pH 8,8), 1% de Triton X100) y 3 a 5 \mul de sonda o híbrido (200.000 - 300.000 RLU): A esta solución se añadieron 10 \mul de 0,1 M de sulfato de sodio ó 0,1 M de metabisulfito de sodio. La solución se agitó a continuación con el Vortex y se dejó asentar a temperatura ambiente para diferentes cantidades de tiempo. La quimioluminiscencia de la solución resultante se midió mediante la inyección de Detect I seguida 0,5-2 segundos más tarde por la inyección de Detect II. La emisión de luz se totalizó durante un período de 5 segundos.

Resultados

Cuando estaba unido bien a una sonda o bien a un híbrido, el éster de acridinio con anillos de acridinio sin substituir (AE, o-AE, naftil-AF, o-Me-Cin-AE, o-diMe-AE y o-diBr-AE), formó aductos con sulfito de sodio y metabisulfito de sodio aproximadamente a la misma velocidad (dentro de un factor de diez). En cambio, los 1-Me-AE y 2,7-di-Me-AE formaron aductos más de diez veces más lentamente que los derivados del éster de acridinio sin substituir. La velocidad más lenta de formación del aducto mediante estos derivados metilados puede explicarse mediante las propiedades dadoras del electrón de los grupos metilo que pueden reducir el cambio positivo en la posición C-9 del éster de acridinio reduciendo con ello las velocidades de formación de aducto.

Los resultados de estos experimentos figuran en la tabla I.

TABLA I

Condición	Compuesto	Sonda t_{1/2} (sec)	Híbrido t_{1/2} (sec)	DA
Sulfito de sodio (10 mM) 30 mM de	AE	1,8	54	30
borato (pH 8,8), 1% TX100	o-AE	\leq 1,1	23,8	21,6
	o-diMe-AE	\leq 1,5	60	\geq 40
	Naftil-AE	2,3	11,8	5,1
	o-Me-Cin-AE	4,6	73	15,9
	1-Me-AE	17,9	- - -	- - -
	2,7di-Me-AE	> 77	- - -	- - -
Metabisulfito de sodio (10 mM) 30	AE	3,3	107	32,4
mM de borato (pH 8,8) 1% TX100	o-AE	2,7	64,6	24
	o-diMe-AE	- - -	- - -	- - -
	Naftil-AE	2,7	46,2	17,1
	o-Me-Cin-AE	8,3	- - -	- - -
	1-Me-AE	18,5	- - -	- - -
	2,7-diMe-AE	>98	- - -	- - -
Sulfito de sodio (10 mM) 30 mM de	AE	2	- - -	- - -
borato (pH 8,8), 1% TX100	o-diBr-AE	4	- - -	- - -
	2,7-diMe-AE	49	- - -	- - -
Sulfito de sodio (15 mM) 30 mM de	AE	- - -	22	- - -
borato (pH 8,8), 1,5% TX100	o-diBr-AE	- - -	8	- - -
	2,7-diMe-AE	- - -	444	- - -

DA se refiere a la alteración diferencial de la marca de la producción de la señal para el análisis de protección de aductos.

Así pues, la estructura de la marca afecta su capacidad para formar un aducto. Por ejemplo, para una marca unida a una sonda o un híbrido, la velocidad de formación del aducto mediante o-diBr-AE es 24 y 45 veces más rápida, respectivamente, que la velocidad de formación del aducto mediante 2,7-diMe-AE unido a la misma sonda o híbrido.

Ejemplo 4 Detección de un desaparejamiento de una base única

Este ejemplo ilustra la capacidad del análisis de protección del aducto para detectar desaparejamientos de pares de bases únicos. Se hibridó una sonda con tres diferentes secuencias diana, a las que se llamó TW (diana tipo salvaje), TM1 (diana desaparejada uno), y TM2 (diana desaparejada dos). La hibridación de la sonda con TW proporcionó un híbrido sin ningún desaparejamiento, la hibridación de la sonda con TM1 proporcionó un híbrido con un desaparejamiento, y la hibridación de la sonda con TM2 proporcionó un híbrido con dos desaparejamientos adyacentes.

Se midió la velocidad de formación del aducto de la sonda hibridada con TW, TM1 y TM2. Con fines de comparación, se determinaron también las velocidades de hidrólisis para cada sonda y diana, empleando solución de álcali en un análisis hidrolítico.

Secuencias de la sonda y la diana

En este ejemplo se emplearon las siguientes secuencias de la sonda y la diana (en donde * indica la posición de la marca de éster de acridinio):

Sonda AE

SEQ. ID. No. 7: 5'-CGTTACTCGG ATG*GCCCAAA TATCGCCAC

Diana tipo salvaje (TW)

SEQ. ID. No. 8: 5'-GTGGCGATAT TTGGGC*CATC CGAGTAACG

Diana mutante 1 (TM1)

SEQ. ID. No. 9: 5'-GTGGCGATAT TTGGGG*CATC CGAGTAACG

Diana mutante 2 (TM2)

SEQ. ID. No. 10: 5'-GTGGCGATAT TTGGGC*GATC CGAGTAACG

Hibridación

A 60 \mul de tampón de hibridación (100 mM de succinato de litio (pH 5,2), 8,5% de laurilsulfato de litio, 1,5 mM de EDTA, 1,5 mM de EGTA), se añadieron 2,5 pmoles de diana y 0,05 pmoles de sonda. La solución resultante se calentó a 60ºC durante 30 minutos y a continuación se diluyó en 500 \mul de succinato de litio 50 mM (pH 5,2) y 250 mM de cloruro de litio.

Protección del aducto

En un tubo de 12 x 75 mm (Sarstedt) se añadieron 100 \mul de tampón de borato (60 mM de borato (pH 8,8), 2% (v/v) de TX100) y 10 \mul de sonda o híbrido. A esta solución se añadieron 100 \mul de sulfito de sodio 20 mM. La solución se agitó a continuación con el Vortex y se dejó reposar a temperatura ambiente durante diferentes cantidades de tiempo. La quimioluminiscencia de la solución resultante se midió mediante la inyección de Detect I seguida 0,5 segundos más tarde por la inyección de Detect II. La emisión de luz se totalizó durante un período de tiempo de 5 segundos.

Hidrólisis

En un tubo de 12 x 75 mm (Sarstedt) se añadieron 100 \mul de tampón de borato (190 mM de tetraborato de sodio (pH 7,6), 6,9% (v/v) de TX-100, 0,02% de gelatina de pescado (Fisher)) y 10 \mul de sonda o híbrido. La solución resultante se calentó a 60ºC y se extrajo una muestra en diferentes tiempos la cual se añadió a 200 \mul de HCl 0,4 N que contenía 0,1% (v/v) de H_{2}O_{2}. La quimioluminiscencia de la solución resultante se midió mediante la inyección de Detect II y la emisión de luz se totalizó durante un período de tiempo de 5 segundos.

\newpage

Resultados

Los resultados figuran en la tabla II.

TABLA II

	APA	HA
Híbrido	Sonda t_{1/2}	Híbrido t_{1/2}	Sonda t_{1/2}	Híbrido t_{1/2}
	(segundos)	(segundos)	(minutos)	(minutos)
P + TW	3,4	34,9	0,68	18,7
P + TM1	3,4	58,9	0,68	1,91
P + TM2	3,4	13,4	0,68	3,06

"P" se refiere a la sonda. "APA" se refiere al análisis de protección del aducto, "HA" se refiere al análisis de hidrólisis.

En el análisis de hidrólisis, los híbridos desaparejados hidrolizaron más rápidamente que el mismo híbrido sin ningún desaparejamiento, y un desaparejamiento de un solo par de bases en el análisis, redujo significativamente la producción de una señal del híbrido desaparejado.

El efecto de un desaparejamiento en el análisis de protección de aductos, difiere marcadamente del efecto de un desaparejamiento en el análisis de hidrólisis. En contraste con los resultados obtenidos durante el análisis de hidrólisis, un único desaparejamiento puede dar como resultado una mayor o menor discriminación entre la marca presente en las sondas unidas y sin unir en el análisis de protección de aductos. Así pues, el efecto de un desaparejamiento en el análisis de protección de aductos, aunque es reproducible para un híbrido sonda:diana particular desaparejado, puede variar para diferentes híbridos sonda: diana (es decir, puede aumentar o disminuir la protección).

La tabla II ilustra también la diferencia en la alteración de las velocidades de producción de la señal para el análisis de protección de aductos y el análisis de hidrólisis. En la tabla II la velocidad de alteración diferencial de la producción de la señal para el análisis de protección de la aducción se mide en segundos mientras que la alteración por hidrólisis de la velocidad de producción de la señal se mide en minutos. En conjunto, la alteración de la velocidad de producción de la señal fue aproximadamente 12 a 32 veces más rápida en el análisis de protección de aductos, comparada con al análisis de hidrólisis.

Ejemplo 5 Diferentes estructuras de ácidos nucleicos

La relación entre las velocidades de formación de aductos y el tipo de ácido nucleico (ARN o ADN) presente en la sonda o diana se resume en este ejemplo. En estos experimentos, se hibridó una sonda pequeña de ARN o de ADN marcada AE, a una diana pequeña complementaria de ARN o ADN, o a una diana grande ribosómica de ARN. Para fines de comparación, se determinaron también las velocidades de hidrólisis de cada sonda y el híbrido resultante. A no ser que se especifique otra cosa, los análisis se efectuaron como se ha descrito en el ejemplo 3, empleando el siguiente oligonucleótido:

(I) Sondas

SEQ. ID. No. 5, sonda de ADN marcada con éster de acridinio en la posición 16/17; y

SEQ. ID. No. 11: GCUCGUUGCG GGACUU*AACC CAACAU, en donde * indica la posición de la marca de éster de acridinio.

(II) Dianas

SEQ. ID. No. 6 (ADN diana); y

SEQ. ID. No. 12 (ARN diana); 5'-AUGUUGGGUU AAGUCCCGCA ACGAGC.

\newpage

Hibridación con ARNr diana

A 15 \mul de tampón de hibridación 2X, se añadieron 2 \mug (1,25 pmoles) de ARNr de E. coli. La solución resultante se ajustó a 30 \mul con agua y se calentó a 70ºC durante 10 minutos. A continuación, se añadió a la solución una décima de pmol de la sonda SEQ. ID. No. 5 marcada con éster de acridinio en la posición 16/17. La solución se calentó a 60ºC durante una hora, se enfrió a temperatura ambiente, y se diluyó hasta 500 \mul con tampón de hibridación 1X.

Resultados

Los resultados figuran en la tabla III.

TABLA III

Sonda	Diana	Sonda t_{1/2}	Híbrido t_{1/2}	DA	Sonda t_{1/2}	Híbrido t_{1/2}	DH
		(segundos)	(segundos)		(minutos)	(minutos)
ARN^{1}	ARN^{3}	\leq 0,78	78,1	\geq 100	1,7	37,9	22,3
ARN^{1}	ADN^{4}	\leq 0,78	44,5	\geq 57	1,7	10,8	6,35
ADN^{2}	ARN^{3}	2,1	177,7	84	1,4	46,5	34,5
ADN^{2}	ADN^{4}	14, 2,1	20,2,32,8	14,3,15,6	1,4	17,6	13
ADN^{2}	ARNr	1,5	73,5	48	1,4	45,1	33,2

"DA" se refiere a la velocidad de formación del aducto diferencial. "DH" se refiere a la velocidad de hidrólisis diferencial. DA y DH son ambos, mediciones de ratios de alteración diferencial. "ARN^{1}" se refiere a una sonda de SEQ. ID. No. 11. "ADN^{2}" se refiere a una sonda de SEQ. ID. No. 5. "ARN^{3}" se refiere a una diana de SEQ. ID. No. 12. "ADN^{4}" se refiere a una diana de SEQ. ID. No. 6.

El comportamiento observado en la tabla III puede relacionarse con la conformación de los diferentes híbridos de ácido nucleico. Los híbridos ADN/ADN están en la conformación B, los híbridos ARN/ARN están en la conformación A, y los híbridos de ácidos nucleicos que contienen una cadena de ADN y una cadena de ARN se cree que adoptan conformaciones similares a A.

El efecto de una diana ARN y/o una sonda ARN en la discriminación es diferente para el análisis de protección de aductos y el análisis de hidrólisis. En el análisis de protección de aductos, la discriminación aumenta cuando, tanto la diana como la sonda, son ARN. En cambio, para el análisis de hidrólisis, se observó la mayor cantidad de discriminación para una sonda de ADN y una diana de ARN. Además, el análisis de protección de aductos proporcionó más discriminación que el análisis de hidrólisis en las condiciones experimentales empleadas en el ejemplo.

En general, las conformaciones similares a A tienen unas velocidades de formación de aductos similares a las conformaciones a A. En cambio, las velocidades de hidrólisis de estas conformaciones similares a A se parecen a la velocidad de hidrólisis de una conformación B cuando la cadena de la diana es de ADN mientras que se parecen a la velocidad de hidrólisis de una conformación A cuando la cadena de la diana es ARN.

Así pues, las velocidades de formación de aductos dependen de si una sonda y/o una diana es de ADN o ARN y estas velocidades no correlacionan directamente con las velocidades de hidrólisis correspondientes de marcas idénticamente asociada con estas moléculas.

Ejemplo 6 Efectos de la situación de una marca empleando una marca AE

Para examinar la dependencia de las velocidades de formación de aductos en la situación del lugar del engarce éster de acridinio, se preparó un juego de sondas que contenían el sitio del engarce del éster de acridinio en diferentes posiciones a lo largo de la sonda. Este juego de sondas se hibridaron a continuación a dianas complementarias y los híbridos marcados AE y las sondas marcadas AE se hicieron reaccionar con sulfito de sodio. Con fines de comparación, se midieron las velocidades de hidrólisis del mismo juego de sondas e híbridos mediante un análisis de hidrólisis. Como se resume más adelante, las velocidades de formación de aductos varían mucho (10 veces) de una base a la próxima a lo largo de un híbrido y menos (2,6 veces) de una base a la próxima a lo largo de una sonda. En cambio, la variación de velocidades de hidrólisis a lo largo de un híbrido o de una sonda son menores (2 veces y 1,6 veces, respectivamente). Así pues, la capacidad de un aducto para discriminar entre una sonda marcada AE y un híbrido marcado AE puede ser considerablemente potenciada variando la posición del sitio del engarce AE.

TABLA IV

	SITIO DEL ENGARCE
	7/8	9/10	11/12	12/13	13/14	14/15	15/16	17/18
Sonda t^{1/2}	1,3	2,3	1,4	1,4	3,4	2,8	1,8	2,4
(segundos)
Híbrido	29,4	65,3	12,1	39,2	34,9	19,9	22,7	122
t_{1/2} (seg.)
DA	22,6	28,4	8,6	28	10,3	7,1	12,6	50,8
Sonda t_{1/2}	0,63	0,68	0,9	0,96	0,68	0,7	0,76	0,99
(segundos)
Híbrido	18,6	16,5	13,3	19,2	18,7	20,6	28	21,3
t_{1/2} (seg.)
DH	29,5	24,3	14,8	20	27,5	29,4	36,8	21,5

Los análisis se efectuaron como se ha descrito en el ejemplo 4.

Ejemplo 7 Acción de diferentes ligandos que alteran la señal

Para facilitar la detección de un analito mediante la alteración preferencial de la producción de la señal de una marca no unida, es importante que un compuesto formador de aducto reaccione fuertemente con la marca. La tabla V resume los experimentos realizados, en donde varios nucleófilos se hacen reaccionar con una sonda marcada AE no unida.

Para cada nucleófilo, el porcentaje de sonda que no formó un aducto se determinó durante un margen de concentración de nucleófilo. Los compuestos que contenían un par de electrones o átomos libres, distintos del azufre (sulfato, hipofosfito), no formaron aductos fuertes con el éster de acridinio.

En cambio, los compuestos que contenían átomos de azufre con un par de electrones libres formaron aductos fuertes con ésteres de acridinio (tetrahidrotiofeno, propanotiol, sulfito de sodio, bencil mercaptano, hidrosulfito de sodio, glicol sulfito, metabisulfito, tiofosfato de sodio y tiosulfato de sodio). Solamente un compuesto conteniendo azufre, el disulfuro de propilo, no formó un aducto fuerte con el acridinio debido a su limitada solubilidad con el agua. Además del azufre, los compuestos que contienen otro átomo del grupo VIb (telurito de potasio) o un átomo del grupo Vb (metaarsenito) formaron también aductos fuertes con éster de acridinio.

Para medir la capacidad de ligandos alteradores de la señal para inhibir preferencialmente una sonda marcada AE no unida, se hicieron reaccionar cantidades equivalentes de sonda sin unir y unida (híbrido AE) con diferentes concentraciones de cada ligando alterador de la señal empleando los procedimientos descritos en el ejemplo 1. La discriminación se midió bien cinéticamente mediante el cálculo de una ratio DA, o bien termodinámicamente mediante el cálculo del porcentaje de híbrido y sonda que no formaron un aducto en el equilibrio (% de híbrido/% de sonda). Los ligandos alteradores de la señal que no discriminaron entre la sonda AE y el híbrido AE sin unir, presentan un DA o ratio (%de híbrido/% de sonda) de 1 mientras que aquellos que no discriminan entre las marcas presentes en las sondas sin unir y las sondas unidas, tienen unos ratios mayores de 1.

Como se resume en la tabla V, casi todos los compuestos que formaron aductos fuertes con la marca presente en una sonda sin unir formaron aductos más fácilmente con la marca presente en la sonda sin unir que con la marca presente en la sonda unida. Los compuestos que no discriminaron contenían o bien un átomo de azufre conjugado a un anillo aromático (tiofenilo, 5-mercapto-1-metil tetrazol, ó 2-mercaptoimida-zol) o bien un átomo de azufre conjugado con un grupo nitrilo (tiocianato).

TABLA V

3

4

5

Ejemplo 8 Efecto de la secuencia sobre APA

Para examinar la dependencia de las velocidades de formación del aducto sobre la secuencia de un ácido nucleico, se hibridaron las sondas de ADN: SEQ. ID. No. 1 (marcada con AE en la posición 7/8), SEQ. ID. No. 5 (marcada con AE en la posición 16/17), y SEQ. ID. No. 13 (SEQ. ID. No. 13: 5'-CTAAAGCGCT T*TCCACCACA AGAC, en donde * indica la posición de la marca de éster de acridinio), con dianas de ADN complementarias (SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 6 ó SEQ. ID. No. 14 (5'-GTCTTGTGGT GGAAAGCGCT TTAG) y se hicieron reaccionar con sulfito de sodio.

Método A

El método A se efectuó como se ha descrito en el ejemplo 3.

Método B

El método B se efectuó como sigue:

Hibridación

A 15 \mul de tampón de hibridación 2X se añadió 1 pmol de sonda marcada con AE (7 x 10^{7} RLU/pmol) y 4 pmoles de diana. La solución resultante se ajustó a 30 \mul con agua, se calentó a 60ºC durante 30 minutos, y se diluyó a 500 \mul con tampón de hibridación 1X.

Protección del aducto

En un tubo de 12 x 75 mm (Sarstedt) se añadieron 2 \mul de sonda marcada con AE o híbrido (400.000 RLU). A esta solución se añadieron 100 \mul de tampón formador de aducto (10 mM de sulfito de sodio, 30 mM de tampón de borato (pH 8,7) y 1,5% de Triton TX100). A continuación, se agitó con el Vortex la solución y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante diferentes períodos de tiempo. La quimioluminiscencia de la solución resultante se midió mediante una inyección de Detect I seguida 0,5-2 segundos más tarde por una inyección de Detect II. La emisión de luz se totalizó durante un período de 5 segundos.

Resultados

Los resultados de estos experimentos figuran en la tabla VI.

TABLA VI

Condición	Sonda	Diana	Sonda	Híbrido	DA
	(SEQ.ID.No)	(SEQ.ID.No)	t_{1/2}(seg.)	t_{1/2}(seg.)
A. 10 mM de sulfito de sodio, 30 mM	13	14	< 0,64	9,1	> 14,2
de borato pH 8,8, 1% de Tx100	5	6	1,75	26,5	15
B. 10 mM de sulfito de sodio, 30 mM	5	6	2,1	31	14,7
de borato pH 8,7 1,5% de Tx100	1	2	< 0,9	15	> 15,5

SEQ. ID. No 1 se marcó con AE en la posición 7/8. SEQ. ID. No. 5 se marcó con AE en la posición 16/17, y SEQ. ID. No 13 se marcó con AE en la posición 11/12.

Las secuencias de las tres sondas diferentes marcadas con AE, así como también sus correspondientes híbridos reaccionan con sulfito de sodio en tres grados diferentes. La sonda SEQ. ID. No 5 reacciona más lentamente que la sonda SEQ. ID. No. 1, la cual reacciona a su vez más lentamente que la sonda SEQ. ID. No 13. Así pues, la formación del aducto es afectada por la secuencia de la sonda marcada con AE así como también la secuencia del correspondiente híbrido.

Claims (20)

1. Un método de análisis para un analito en una muestra que comprende los pasos de:

a) exposición de dicha muestra a un socio de unión marcado que contiene una región de unión con el analito y una marca;

b) tratamiento de dicha muestra expuesta a dicho socio de unión marcado con un ligando alterador de la señal, el cual forma un aducto con dicha marca de dicho socio de unión marcado cuando dicho socio de unión marcado no está unido a dicho analito,

en donde dicha marca de dicho socio de unión marcado está preferencialmente protegida de formar un aducto con dicho ligando alterador de la señal cuando dicho socio de unión marcado se une a dicho analito, de tal forma que dicho ligando alterador de la señal altera la producción de la señal de dicho socio de unión marcado no unido a dicho analito en una extensión mayor de lo que altera la producción de la señal de dicho socio de unión marcado unido a dicho analito; y

c) detección de la señal producida por dicha marca la cual no ha sido alterada, como una indicación de la presencia o cantidad de dicho analito en dicha muestra.

2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho socio de unión es una sonda de ácido nucleico y dicho analito es una secuencia de un ácido nucleico diana.

3. Un método para analizar la detección de una región diana de un ácido nucleico diana, en una muestra, que comprende los pasos de:

a) exposición de dicha muestra a una sonda de ácido nucleico que comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia de ácido nucleico capaz de unirse a dicha región diana y una marca;

b) tratamiento de dicha muestra expuesta a dicha sonda con un ligando alterador de la señal, el cual forma un aducto con dicha marca de dicha sonda cuando dicha sonda no está unida a dicha región diana, en donde dicha marca de dicha sonda está preferencialmente protegida de formar un aducto con dicho ligando alterador de la señal cuando dicha sonda está unida a dicha región diana, de tal forma que dicho ligando alterador de la señal altera la producción de la señal de dicha sonda no unida a dicha diana en una extensión mayor que la que altera la producción de la señal de dicha sonda unida a dicha región diana; y

c) detección de la señal producida por la marca la cual no ha sido alterada como una indicación de la presencia o cantidad de dicha región diana en dicha muestra.

4. El método de la reivindicación 3, en donde dicha región diana es ARN.

5. El método de las reivindicaciones 1 ó 3, en donde dicho análisis se efectúa sin separación del socio de unión o sonda unidos a dicho analito o dicha región diana, respectivamente, del socio de unión o sonda no unidos a dicho analito o dicha región diana, respectivamente.

6. El método de las reivindicaciones 1 ó 3, que además comprende la separación del socio de unión o sonda unidos a dicho analito o dicha región diana, respectivamente, del socio de unión o sonda no unidos a dicho analito o dicha región diana, respectivamente, antes de dicho paso (c).

7. El método de las reivindicaciones 1 ó 3, en donde dichos pasos (b) y (c) se efectúan a una temperatura esencialmente constante.

8. El método de la reivindicación 7, en donde dicho análisis se efectúa aproximadamente a temperatura ambiente.

9. El método de las reivindicaciones 1 ó 3, en donde en dicho paso (c) se detecta la absorbancia de la luz.

10. El método de las reivindicaciones 1 ó 3, en donde en dicho paso (c) se detecta la emisión de luz.

11. El método de la reivindicación 10, en donde dicha marca tiene la estructura química:

1

en donde dicho sistema anular arilo comprende de uno a cuatro grupos cíclicos y uno de dichos grupos está unido al carbono "C" de engarce,

R_{2} se selecciona del grupo formado por S, O y NH;

R_{3} se selecciona del grupo formado por O, N, S, halógeno, fósforo substituido, azufre substituido, boro substituido y arsénico substituido;

R_{4} se selecciona del grupo formado por alquilo, alquenilo, arilo, alcoxilo, y ariloxilo, o está ausente cuando R_{3} es halógeno; y

R_{5} no es nada a no ser que R_{3} sea N, si R_{3} es N entonces R_{5} se selecciona del grupo formado por hidrógeno, alquilo, alquenilo, arilo, alcoxilo y ariloxilo.

12. El método de la reivindicación 11, en donde dicho sistema arilo está cargado positivamente.

13. El método de la reivindicación 12, en donde dicho sistema anular arilo tiene de uno a cuatro grupos cíclicos;

dicho R_{3} se selecciona del grupo formado por O, N, y S,

dicho R_{4} es arilo,

y dicho R_{5} no es nada.

14. El método de la reivindicación 13, en donde dicha marca tiene la estructura:

2

en donde R_{1} se selecciona del grupo formado por H, alquilo, alquenilo, alquinilo y arilo;

n es ó bien 0, 1, 2, 3 ó 4;

m es ó bien 0, 1, 2, 3 ó 4;

cada X se selecciona independientemente entre sí del grupo formado por alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, amino, amino substituido, carboxilo, hidroxilo, alcoxilo, nitro, sulfonilo, halógeno, tiol, amido, acetilo, acetilo substituido y ariloxilo; y

cada Y se selecciona independientemente entre sí del grupo formado por alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, amino, amino substituido, carboxilo, hidroxilo, alcoxilo, nitro, sulfonilo, halógeno, tiol, amido, acetilo, acetilo substituido y ariloxilo.

15. El método de la reivindicación 14, en donde

dicho n es ó bien 0, 1 ó 2;

dicho m es ó bien 0, 1 ó 2;

dicho R_{3} es O,

dicho R_{4} es arilo,

y dicho R_{5} no es nada.

16. El método de la reivindicación 15, en donde cada una de dichas X es, independientemente entre sí, o bien alquilo o bien alcoxilo;

cada una de dichas Y es, independientemente entre sí, o bien alquilo o bien alcoxilo; y

dicho R_{4} es un fenilo opcionalmente substituído.

17. El método de la reivindicación 16, en donde dicho R_{4} se selecciona del grupo formado por orto-metilcinamato-fenilo, orto-dimetil-fenilo, orto-dibromofenilo y fenilo sin substituir.

18. El método de las reivindicaciones 1 ó 3, en donde dicho ligando se selecciona del grupo formado por tetrahidrotiofeno, propanotiol, bencilmercaptano, sulfito, glicol sulfito, hidrosulfito, metabisulfito, tiosulfato, tiofosfato, metaarsenito, telurito, arsenito y tiocianato.

19. El método de las reivindicaciones 1 ó 3, en donde dicho ligando contiene o bien un átomo de azufre con un par de electrones libres, un átomo de telurito con un par de electrones libres, o un átomo de arsenito con un par de electrones libres, en donde dicho átomo de azufre, dicho átomo de telurito o dicho átomo de arsenito, no está conjugado a un anillo aromático o nitrilo.

20. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde dicho aducto es un aducto reversible.