KR19990022460A - 어덕트 보호 검사법 - Google Patents

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마이클 벡커
노만 씨. 넬슨
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다니엘 엘. 캐시앙, 헨리 엘. 노르호프
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Abstract

본 발명은 표지된 결합 상대와 신호 변경 리간드의 사용을 포함한 어덕트 보호 검사법을 주로 다룬 것이다. 신호 변경 리간드는 결합 상대:분석물 복합체의 일부분인 표지에서 발생되는 신호를 변경시키는 능력에 비해 결합 상대:분석물 복합체의 일부분이 아닌 표지의 검출가능한 신호를 발생시키는 능력을 우선적으로 변경시킬 수 있다. 분석물의 존재 또는 양은 변경되지 않은 표지에서 발생되는 신호를 검출함으로써 측정할 수 있다. 어덕트 보호 검사법은 매우 다양하게 실행된다. 예를 들면, 신호의 변경은 넓은 범위의 조건 (예, pH, 온도 및 이온강도) 하에서 실시할 수 있으며 표지 변경과 신호 촉발 모두를 본질적으로는 일정한 온도에서 실시하여 고도의 감도를 달성할 수 있다.

Description

어덕트 보호 검사법
시료 중의 분석물의 존재 또는 양을 검사함으로써 특정한 생물, 유전자 또는 단백질이 시료 중에 존재하는지 여부와 같은 가치있는 정보를 얻어낼 수 있다. 분석물 검사는 분석물의 특징적인 부분을 인식하고 그와 결합할 수 있는 결합 상대를 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 표지된 항체 및 올리고뉴클레오티드 프로브를 진단용 검사에 사용하여 생물체, 유전자 또는 단백질의 존재를 검출할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 프로브는 상보적인 표적 핵산 서열에 혼성화하여 표적 핵산 서열의 검출을 가능하게 한다. 표적 핵산 서열의 존재 또는 양을 검출하는 것은 다음: 어느 미생물 또는 미생물군에 특징적인 핵산 서열을 탐지함으로써 시료에서 그 미생물 또는 미생물군의 존재를 검출하는 것 (예를 들면, Hogan et al., 국제 특허 출원 제PCT/US88/03009호, 국제 특허 공개 제88/03957호 “비-바이러스 행물체의 검출 및(또는) 정량을 위한 핵산 프로브" (본 명세서에 참고로 포함시킴)), 어느 바이러스에 특징적인 서열을 탐지함으로써 그 바이러스의 존재를 검출하는 것 (예를 들면, McDonough et al., 국제 특허 출원 제 PCT/US94/03130호, 국제 특허 공개 제94/23069호 “사람 면역결핍증 바이러스 타입 1의 검출", 및 McDonough et al., 국제 특허 출원 제PCT/US93/04004호, 국제 특허 공개 제93/22469호 “사람 간염 B 바이러스에 대한 프로브와 핵산 증폭 올리고뉴클레오티드" (두 문헌 다 본 명세서에 참고로 포함시킴)), 및 특정한 핵산 서열이 상보적인 올리고뉴클레오티드에의 혼성화를 위해 접근가능한지 검출하는 것 (예를 들면, Nelson et al., 국제 특허 출원 제PCT/US94/08024호, 국제 특허 공개 제05/03427호 ”올리고뉴클레오티드 스크리닝 검사법" (본 명세서에 참고로 포함시킴))을 비롯한 여러 가지 형태의 검사에 사용할 수 있다.
시료에서 분석물의 존재 또는 양을 검출하는 데는 여러 가지 표지 및 검사 형식을 사용할 수 있다. 검출할 수 있는 표지의 예에는 방사성 동위원소, 형광성 잔기, 화학 발광성 잔기, 효소, 효소 기질 및 리간드 등이 있다.
전체로 볼 때, 검사 형식은 분석물에 결합한 결합 상대가 분석물에 결합하지 않은 결합 상대와 물리적으로 분리되는지 여부에 따라 “이질적" 또는 “균질적"이라고 간주할 수 있다. 이질적 검사는 분석물에 결합한 결합 상대를 분석물에 결합하지 않은 결합 상대에서 물리적으로 분리시키는 것을 포함하며 예를 들면 분석물에 결합한 결합 상대 또는 분석물에 결합하지 않은 분석 상대 중 어느 하나에 결합하는 지지체를 사용하여 실행할 수 있다. 예를 들면, 아놀드 (Arnold) 등의 국제 특허 출원 제PCT/US88/00550호, 국제 특허 공개 제88/06633호에는 폴리뉴클레오티드가 관계하는 물리적 분리 단계에 사용할 수 있는 다중 양이온성 지지체의 사용이 설명되어 있으며, 폴리뉴클레오티드의 물리적 분리를 위해 사용할 수 있는 다른 지지체가 언급되어 있고, 문헌 [Harlow et al., Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]에는 지지체에 결합한 항체가 분석물에 결합한 다음 다른 항체를 사용하여 분석물을 검출하는데 결합하지 않은 오염물은 고상 지지체에서 세척 제거되는 샌드위치 검사법이 설명되어 있다 (상기 두 문헌은 본 명세서에 참고로 포함시킴).
균질적 방식으로 실시할 수 있는 검사법의 예에는 미국 특허 제3,654,090호, 동 3,817,837호, 및 동 4,190,496호에 설명된 면역검사법, 미국 특허 제4,199,559호, 동 4,174,384호, 및 동 4,318,707호에 설명된 형광기/소거기 쌍을 함유한 발색단을 이용한 검사법, 보구슬라스키 (Boguslaski) 등의 미국 특허 제4,383,031호에 설명된 것처럼 화학 발광성 반응물질에 연결된 특이적 결합 상대 물질로 형성된 복합체를 이용하되 화학 발광성 반응물질의 활성이 복합체 중의 특이적 결합 물질과 특이적 결합 대상물 사이의 반응에 영향을 받는 검사법, 미국 특허 제4,668,640호에 설명된 것처럼 분극 형광을 포함하는 검사법, 미국 특허 제4,670,379호에 설명된 것처럼 촉매로 표지된 하나의 표지와 유도형광기를 함유한 제2의 표지를 포함한 이중 프로브를 사용한 검사법, 엘라자르 (Elazar) 등의 유럽 특허 출원 제85105130.0호, 공고 제0 159 719호에 설명된 것처럼 에너지 전달계를 사용한 검사법, 헬러 (Heller) 등의 유럽 특허 출원 제82303699.1호, 공고 제0 070 685호 및 모리슨 (Morrison) 등의 유럽 특허 출원 제82303700.7호, 공고 제0 070 686호에서 설명한 것처럼 화학발광 잔기와 흡수기/방출기 잔기를 사용한 검사법, 및 아놀드 등의 미국 특허 제5,283,174호, 넬슨 등[Nonisotopic DNA Probe Techniques (Kricka ed., Academic Press, 1992) 중 “Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence" pp. 275-311], 넬슨 등 (Clin. Chem. Acta 194:73-90, 1990) 및 아놀드 등 (Clin. Chem. 35:1588-1594, 1989)에 설명된 것과 같은 표지를 사용한 검사법이 포함된다 (이 절에서 언급된 문헌은 모두 본 명세서에 참고로 포함시킴).
〈발명의 요약〉
본 발명은 표지된 결합 상대와 신호 변경 리간드의 사용을 포함한 어덕트(adduct) 보호 검사법을 주로 다룬 것이다. 신호 변경 리간드는 결합 상대:분석물 복합체의 일부분인 표지에서 발생되는 신호를 변경시키는 능력에 비해 결합 상대:분석물 복합체의 일부분이 아닌 표지의 검출가능한 신호를 발생시키는 능력을 우선적으로 변경시킬 수 있다. 분석물의 존재 또는 양은 변경되지 않은 표지에서 발생되는 신호를 검출함으로써 측정할 수 있다. 어덕트 보호 검사법은 매우 다양하게 실행된다. 예를 들면, 신호의 변경은 넓은 범위의 조건 (예를 들면, pH, 온도 및 이온강도) 하에서 실시할 수 있으며 표지 변경과 신호 촉발 모두를 본질적으로는 일정한 온도에서 실시하여 고도의 감도를 달성할 수 있다.
어덕트 보호 검사법은 바람직하게는 검출가능한 신호를 발생시키도록 촉발될 수 있는 표지를 함유한 결합 상대를 사용하여 실시한다. “검출가능한 신호"는 측정할 수 있는, 표지에 의해 야기되는 환경의 변화를 말한다. 검출가능한 신호의 예에는 빛의 방출 및 흡광도의 변화가 포함된다.
“촉발"이란 표지가 검출가능한 신호를 발생시키게 만드는 것을 뜻한다. 바람직한 실시태양에서 신호 발생은 촉발제에 의해 야기된다. 표지에서 검출가능한 신호를 발생시키는 데 여러 가지 종류의 촉발제를 사용할 수 있다. 촉발제/표지 쌍의 예로는 흡광도의 변화를 야기하는 기질/효소 또는 효소/기질, 빛의 방출을 야기하는 과산화수소/화학 발광성 표지, 및 빛의 방출을 야기하는 빛/형광성 표지 등이 있다.
바람직한 표지는 빛을 방출하도록 촉발시킬 수 있는 것들이다. 빛 방출 물질의 촉발은 빛을 방출하는 여기 상태 분자의 형성을 초래한다.
신호 변경 리간드에 의한 어덕트 형성은 표지에 의한 신호 발생을 변경시키는데, 바람직하게는 신호 발생을 막는다. “신호 변경 리간드"는 표지와 연합하여 표지로부터의 신호 발생을 변경시키는 어덕트를 형성할 수 있는 화합물을 말한다. 바람직하게는, 어덕트 형성은 가역적이다.
“신호 발생의 변경"은 표지로부터 발생되는 신호의 종류, 양 또는 동력학적 특성의 변화를 말한다. 바람직하게는, 발생되는 신호는 빛 방출이고 빛 방출의 변경은 다음 중 하나 이상을 야기시킴으로써 이루어진다: (1) 상이한 파장에서 빛 방출, (2) 빛 방출의 감소, (3) 빛 방출의 동력학적 특성 변경. 바람직하게는, 어덕트 형성은 빛 방출을 막는다.
“신호 방출의 우선적인 변경" 및 “구별"이란 용어는 분석물에 결합한 결합 상대 상에 존재하는 표지 (결합 표지)에 기원을 둔 신호 발생의 변경보다 더 큰 정도로 일어나는, 분석물에 결합하지 않은 결합 상대 상에 존재하는 표지 (미결합 표지)에 기원을 둔 신호 발생의 변경을 뜻한다. 결합 또는 미결합 결합 상대 상에 존재하는 표지들에 의한 신호 발생의 차이는 당업자가 분석물의 존재 및(또는) 양을 검출할 수 있게 하기에 충분하다. 신호 발생의 우선적인 변경은 분석물에 결합한 결합 상대 상에 존재하는 표지로부터 생산된 신호의 반이 변경되는 시간 (t1/2결합 표지)을 분석물에 결합하지 않은 결합 상대 상에 존재하는 표지의 반이 변경되는 시간 (t1/2미결합 표지)으로 나눈 것으로 표현되는 미분 변경 비율로 환산하여 측정할 수 있다.
따라서, 본 발명의 첫 번째 측면은 시료 중의 분석물의 존재 또는 양을 검사하는 방법을 주로 다룬 것이다. 이 방법은
(a) 시료를 표지된 결합 상대에 노출시키는 단계,
(b) 표지된 결합 상대:분석물 복합체의 일부가 아닌 결합 상대 상에 존재하는 표지를 우선적으로 변경시킬 수 있는 신호 변경 리간드로 시료를 처리하는 단계,
(c) 변경되지 않은, 표지에서 발생한 신호를 검출하는 단계
를 포함한다.
변경되지 않은, 표지에서 발생한 신호를 검출하는 것은 표지가 신호를 발생시키도록 촉발하고 변경되지 않은 신호의 발생을 측정함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들면, 리간드에 의해 변경되지 않은 빛 방출 표지의 존재는 표준적인 기술로 표지가 빛을 방출하도록 촉발하고 빛 방출의 동력학적 특성, 양 또는 파장을 측정함으로써 이루어질 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 표지는 형광성, 화학 발광성 및 생물 발광성 표지와 같은 빛 방출 표지이다. 빛 방출은 광도계 또는 형광광도계와 같은 표준적인 장비를 사용하여 측정할 수 있다. 바람직하게는, 신호 발생의 우선적인 변경 및 빛 방출은 실질적으로 일정한 온도 하에서 실시된다. “실질적으로 일정한 온도"는 온도를 250% 이하, 더욱 바람직하게는 100%, 더욱 바람직하게는 25%, 더욱 바람직하게는 10% 이하, 및 가장 바람직하게는 5% 이하의 범위 내로 유지하는 것을 말한다. 보다 바람직한 실시태양에서는 우선적인 표지 변경 및 빛 방출의 촉발을 실온 (약 20-25℃)에서 실질적으로 일정한 온도로 실시한다.
어덕트 보호 검사는 여러가지 형식을 이용하여 실시할 수 있다. 예를 들면, 검사는 분리 단계를 포함하거나 포함하지 않고 수행할 수 있다. 분리 단계의 회피는 검사를 단순화시키고 시간, 시약의 절약 및 자동화의 단순성과 같은 잇점을 제공한다.
분석물에 결합하지 않은 표지된 결합 상대 또는 오염물을 제거하는 분리 단계는 빛 방출을 촉발하기에 앞서 수행할 수 있다. 검사가 정제를 거치지 않은 임상시료에 대해 사용될 때에는 분리 단계가 바람직하다.
따라서, 본 발명의 검사는 분석물에 결합하지 않은 결합 상대 상에 존재하는 표지에서 발생하는 신호의 우선적인 변경을 수반함으로써 분석물에 결합한 결합 상대 상에 존재하는 표지에서 생산된 신호가 명확하게 검출되는 것을 허용하여 분석물의 존재 또는 양의 검출을 가능하게 한다. 이 검사의 융통성은 넓은 범위의 완충 조건 하에서 표지 변경을 실시하여 고감도를 달성하는 능력, 실질적으로 일정한 온도를 이용하여 검사를 실시하여 고도의 감도를 신속히 달성하는 능력, 및 검사를 실온에서 실시하여 고도의 감도를 달성하는 능력을 비롯하여 수많은 유용한 측면을 가진다. 이러한 검사의 잇점에는 보다 적은 조작 단계로 인한 사용의 용이성, 시간 절약 및 자동화에 보다 적합한 것 등이 있다.
상이한 표지 구조 및 신호 변경 리간드와 같은, 본 발명의 여러 가지 측면 및 실시태양의 각종 실시예를 본 명세서에서 설명한다. 청구의 범위에서 언급하지 않는 한 이들 실시예 및 본 명세서에 제시된 다른 실시예는 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다.
본 발명의 다른 특징 및 잇점은 아래의 도면, 발명의 상세한 설명 및 청구의 범위로부터 자명해질 것이다.
본 발명은 시료 중의 분석물의 존재 또는 양을 검사하는 방법을 다룬 것이다.
도 1은 소듐 술파이트 및 아크리디늄 에스테르-표지된 프로브를 사용하여 신호 발생의 우선적인 변경을 그래프.
도 2는 과산화수소를 사용한 화학 발광성 분자의 빛 방출 촉발.
도 3은 점증량의 표적을 사용한 어덕트 보호 검사법.
도 4 및 도 5는 결합 영역에 연결된 아크리디늄 에스테르 표지를 함유한 결합 상대의 예. 결합 영역은 도면에서 “프로브"로 표시.
어덕트 보호 검사는 어덕트 형성을 활용하여 분석물에 결합하지 않은 결합 상대 상에 존재하는 표지로부터의 신호 발생을 우선적으로 변경시킴으로써 분석물의 검출을 용이하게 한다. 이 검사는 표지된 결합 상대가 분석물과 복합체를 이룰 때 보호 미세 환경의 형성을 수반한다. 분석물과 결합한 표지된 결합 상대 상에 존재하는 표지는 신호 변경 리간드와의 어덕트 형성으로부터 우선적으로 보호된다. 어덕트 보호 검사는 고도의 감도로 분석물의 존재 및(또는) 양을 신속히 검출하는 데 사용할 수 있다.
분석물의 존재 또는 양의 표시로서의 신호 발생은 우선적 신호 변경 단계를 시작한 후 상이한 여러 시점에서 측정할 수 있다. 한 실시태양에서는, 안정한 어덕트 형성을 허용하는 시간 후에, 예컨대 평형상태에서 신호 발생을 측정한다. 결합 및 미결합 결합 상대 상에 존재하는 표지와의 어덕트 형성이 시간의 흐름에 대해 비교적 일정한 때 신호 발생을 측정하는 것은, 보다 넓은 시간 범위에 걸쳐 재현성있는 결과를 얻는 것을 돕고 다수의 실험을 일시에 행하고 결과를 나중에 판독하는 것을 허용할 수 있다.
다른 한 실시태양에서는, 촉발 후 미결합 상대 상에 존재하는 표지에서 발생한 신호에 대한 결합한 결합 상대 상에 존재하는 표지에서 발생한 신호의 비율이 최대가 되었을 때 신호를 측정한다. 이 점에 있어서, 어덕트 보호 검사는 미결합 결합 상대 상에 존재하는 표지가 이탈기를 절단해냄으로써 우선적으로 변경되는 가수분해 검사보다 신속히 진전될 수 있다 (아래 실시예 4 및 5 참조). 아놀드 등의 미국 특허 제5,284,174호, 넬슨 등 [Nonisotopic DNA Probe Techniques (Kricka ed., Academic Press, 1992) 중 "Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence" pp. 275-311], 넬슨 등 [Clin. Chem. Acta 194:73-90, 1990] 및 아놀드 등 [Clin. Chem. 35:1588-1594, 1989]에는 미결합 결합 상대 상에 존재하는 표지의 우선적인 가수분해적 절단에 의해 실행될 수 있는 검사법이 설명되어 있다 (상기 문헌들 각각은 본 명세서에 참고로 포함시킴).
결합 또는 미결합 결합 상대 상에 존재하는 표지와 이루어지는 어덕트 형성은 하기 수학식 1 및 수학식 2로 설명되는데, 여기서 “미결합 표지"는 분석물과 복합체를 이루지 않은 결합 상대 상에 존재하는 표지를 말하고, “결합 표지"는 분석물과 복합체를 이룬 결합 상대 상에 존재하는 표지를 말하며, “리간드"는 신호 변경 리간드를 말하고, “표지*"는 그 표지가 신호를 발생시키도록 촉발될 수 있음을 표시하며, “표지-리간드"는 신호 변경 어덕트의 형성을 표시한다.
신호 발생의 우선적인 변경은 K1과 K2의 차이 및 두 반응이 평형상태에 도달하는 속도에 영향을 받는다. 수학식 1의 평형 상수가 보다 높으면 평형상태에서 미결합 결합 상대 상에 존재하는 보다 많은 표지가 변경되는 결과가 온다. 수학식 2의 평형 상수가 보다 낮으면 평형상태에서 결합 결합 상대 상에 존재하는 보다 적은 표지가 변경되는 결과가 온다. 수학식 1로 표시되는 반응이 수학식 2보다 빠른 속도로 진행되므로 미결합 결합 상대 상에 존재하는 보다 많은 표지가 신호 변경 리간드와의 초기 반응 동안 우선적으로 변경된다.
신호 발생의 우선적인 변경에 영향을 미치는 요인들에는 분석물의 양 및 종류, 표지된 결합 상대의 양 및 종류, 리간드의 양 및 종류, 그리고 분석시에 존재하는 다른 성분과의 가능한 상호작용이 포함된다. 따라서, 특정한 검사의 설계 및 구성 요소는 분석물의 속성과 출처, 사용되는 신호 변경 리간드의 종류, 표지된 결합 상대의 속성, 분석물과 복합체를 이루어 표지에 대한 보호 미세 환경을 형성하는 결합 상대의 능력, 검사가 이루어지는 환경을 고려에 넣어야 한다.
〈I. 감도〉
본 발명은 분석물의 존재를 고도의 감도로 검출하는 데 사용할 수 있다. 감도는 분석물의 존재를 정확히 검출하는 검사의 능력을 반영한다. 감도에는 변경되지 않은, 미결합 결합 상대에 존재하는 표지로부터의 신호 발생과 결합 및 미결합 결합 상대 상에 존재하는 표지를 구별하는 신호 변경 리간드의 능력 양쪽에 기인한 배경이 고려된다.
도 1은 신호 발생의 우선적인 변경과 배경 사이의 관계를 보여주는 것이다. 각 곡선은 신호 변경 리간드 존재시 빛 방출의 촉발을 도시한 것이다. 하이브리드 곡선은 신호 변경으로부터 보호된 결합 표지를 말하고, 프로브 곡선은 미결합 결합 상대 상에 존재하는 표지를 말한다. 미분 변경 비율을 계산하기 위한 t1/2값은 두 곡선의 기울기에서 얻을 수 있다. 두 곡선이 평평해지는 점들은 평형상태에 도달했음을 표시한다. 프로브 곡선이 평평해지는 점은 배경 노이즈를 표시하기도 한다.
핵산 분석물을 검출하는 데 사용되는 올리고뉴클레오티드 프로브의 경우, 미분 변경 비율은 표지된 프로브의 t1/2로 나눈 하이브리드의 t1/2를 측정함으로써 확정된다. 바람직하게는, 미분 변경 비율은 2 배 이상, 더욱 바람직하게는 15 배 이상, 더더욱 바람직하게는 75 배 이상, 가장 바람직하게는 100 배 이상이다.
더욱 바람직하게는, 발생하는 신호가 배경의 평균에 표준편차의 두 배를 더한 것과 동등하거나 그보다 더 큰 고감도 조건하에서 검사를 실시한다. 표준편차는 표준적인 기술과 하기 수학식 3을 사용하여 계산할 수 있다.
식 중, x-는 표본 평균이고, xi는 특정한 판독 치이며, n은 총 측정회수이다.
더욱 바람직하게는, 발생하는 신호가 배경의 평균에 표준편차의 세 배, 더욱 바람직하게는 4 배 이상, 가장 바람직하게는 5 배 이상을 더한 것과 동등하거나 그보다 더 큰 조건하에서 검사를 실시한다.
〈II. 분석물〉
어덕트 보호 검사는 핵산 서열 및 항원성 에피토프를 비롯하여 상이한 여러 종류의 분석물의 존재 및(또는) 양을 검출하는 데 사용할 수 있다. 시료 중에 존재하는 분석물의 양은 검사되는 시료 및 검출에 앞서 분석물의 양을 증가시키기 위해 어떤 기술이 실시되느냐 여부에 달려있다. 예를 들면, 핵산 분석물의 수는 PCR (예를 들어, 멀리스 (Mullis) 등의 미국 특허 제4,683,202호에서 설명된 것과 같음) 및 전사 기재 증폭 (예를 들어, 케이시안 (Kacian) 등의 미국 특허 제5,399,491호에서 설명된 것과 같음)과 같은 기술을 사용하여 증가시킬 수 있다 (이들 문헌 모두 본 명세서에 참고로 포함시킴).
A. 표적 핵산의 검출
표적 핵산 서열 (즉, 검출 또는 측정하고자 하는 핵산 서열)의 검출은 표적 핵산 서열에 충분히 상보적이어서 그 서열을 시료 중에 존재할 수도 있는 다른 핵산 서열과 구별하는 핵산 프로브를 사용하여 실시할 수 있다. 프로브 특이성은 프로브와 표적 핵산 서열의 상보성의 정도 및 혼성화 조건과 같은, 당업계에 공지된 수많은 요인들에 영향을 받는다 (예를 들어, 샘브룩 등 (Sambrook et al)의 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)] (본 출원에 참고로 포함시킴) 및 호간 등의 국제 특허 출원 제PCT/US88/03009호, 상게 참조).
B. 항원 검출
항체를 사용하여 항원 상에 존재하는 특정한 에피토프의 존재를 검출할 수 있다. 할로우(Harlow) 등[Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] (본 출원에 참고로 포함시킴)은 항체의 생산 및 사용을 설명하고 있다.
〈III. 표지된 결합 상대〉
표지된 결합 상대는 결합 상대에 연결된 표지로 이루어진다. 결합 영역은 결합 상대가 분석물에 결합하는 것을 가능하게 하며, 표지는 검출가능한 신호를 발생시키도록 촉발시킬 수 있다.
어덕트 보호 검사는 과량의 표지된 결합 상대 또는 과량의 분석물 상태로 실시할 수 있다. 과량의 표지된 결합 상대를 공급하는 것은 낮은 분석물 농도에서 감도가 증가된다는 잇점을 준다. 과량의 표지가 존재하는 경우의 있음직한 단점은 더 많은 표지된 결합 상대가 존재하고 그에 따라 배경을 저하시키기 위해 더 많은 리간드가 요구된다는 것이다. 그럼에도 불구하고, 어덕트 보호 검사로 달성할 수 있는 높은 감도 때문에, 검사를 실시하는 데 과량의 표지된 결합 상대가 선호된다.
A. 표지
어덕트 보호 검사는 비색식, 생물 발광성, 형광성 및 화학 발광성 표지와 같은 상이한 여러 종류의 표지를 사용하여 실시할 수 있다. 표지 선택에서 고려해야할 요인에는 다음 사항이 포함된다: (1) 표지는 신호를 발생시키도록 촉발되는 능력이 어덕트 형성에 의해 변경될 수 있어야 한다. (2) 표지는 분석물과 결합 상대의 결합시에 형성되는 보호 미세환경에 의해 어덕트 형성으로부터 보호될 수 있다. (3) 표지는 결합 상대가 분석물을 인식하는 것을 막지 않는다.
비색식 표지의 예에는 기질과 결합하여 흡광도에 변화를 유발하는 생성물을 생산할 수 있는 효소를 함유한 표지 및 효소와 결합하여 흡광도에 변화를 가져올 수 있는 기질을 함유한 표지가 포함된다. 예를 들면, 신호 변경 리간드는 효소/기질과 어덕트를 형성함으로써 효소 촉매 반응을 변경시켜 효소/기질에서 나오는 신호를 변경시킬 수 있다. 또다른 예는 주어진 파장에서 빛을 흡수하며 리간드와의 반응에 의해 이 흡광도가 달라지는 표지이다.
본 발명은 바람직하게는 표적 핵산과 프로브의 혼성화에 의해 어덕트 형성으로부터 보호되는 빛 방출 표지를 가진 핵산 프로브를 사용하여 수행한다. 바람직한 빛 방출 표지는 화학 발광성 또는 형광성이다. 화학 발광성 표지는 가열 또는 산화와 같은 화학 반응에 의해 촉발될 수 있는 반면 형광성 표지는 빛에 의해 촉발될 수 있다. 일부 경우에는 빛에 의한 “화학 발광성" 표지의 촉발이 화학 발광보다 더 적은 빛 방출을 가져올 수도 있지만, 빛을 방출하게 만들 수 있는 표지는 일반적으로 형광을 낼 수 있다.
1. 화학 발광성 표지
화학 발광성 표지는 붕괴하는, 그에 따라 빛을 방출하는 여기 상태 분자의 형성을 유발하는 촉발제에 의해 빛을 방출하도록 촉발된다. 화학 발광성 표지는 빛 방출을 유발하는 화학 반응시에 절단되는, 화학 발광성 분자에 연결된 이탈기를 함유할 수 있다. 이와 다르게는, 화학 발광성 표지는 빛 방출의 촉발시에 절단되는 이탈기를 함유하지 않을 수도 있다. 빛 방출의 촉발시에 절단될 수 있는 이탈기를 가진 화학 발광성 분자의 예는 아래에 서술하였다. 촉발시에 절단되는 이탈기를 갖지 않은 화학 발광성 분자의 예에는 디옥세탄, 옥살레이트, 디옥세타논 및 루테늄 킬레이트가 포함된다. 여러 종류의 화학 발광성 분자의 예를 문헌 [Campbell, Chemiluminescence: Principles and Application in Biology and Medicine, Ellis Horwood Ltd., 잉글랜드 치체스터, 1988] (본 명세서에 참고로 포함시킴)에서 볼 수 있다.
도 2는 과산화수소를 촉발제로 사용한 화학 발광성 표지의 빛 방출 반응을 보여준다. 화학 발광성 표지를 촉발시키는 데 유리한 조건 및 방출된 빛을 검출하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예컨대 넬슨 등 [Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence-상게] 및 아놀드 등의 미국 특허 제5,283,174호-상게를 참조한다.
화학 발광성 표지의 예, 그러한 표지의 생산, 결합 상대와 표지의 연결 및 화학 발광성 표지의 안정성에 일반적으로 영향을 주는 요인은 당업계에 공지되어 있다. 베헤슈티 (Beheshti) 등의 미국 특허 제5,290,936호, 캠벨 (Campbell) 등의 미국 특허 제4,946,958호, 로 (Law) 등의 미국 특허 제4,918,192호, 동 4,745,181호, 동 5,110,932호 및 동 5,241,070호, 매팅리 (Mattingly) 등의 [Chemiluminescent Acridinium and Phenantridinium Salts], 유럽 특허 출원 제87114490.3호, 공고 제0 273 115호, 맥카프라 (McCapra) 등의 미국 특허 제5,281,712호, 맥카프라의 미국 특허 제5,283,334호, 맥카프라 등의 미국 특허 제5,284,951호, 맥카프라의 미국 특허 제5,321,136호, 맥카프라 등의 [Assays Utilizing Improved Chemiluminescent Esters, Thioesters and Amides], 유럽 특허 출원 제88121915.8호, 유럽 특허 공고 제0 322 926호, 라마크리슈난 (Ramakrishnan) 등의 미국 특허 제5,284,952호, 레디 (Reddy) 등, [Chemiluminescent Compounds], 국제 특허 출원 제PCT/US91/06861호, 국제 특허 공개 제92/09580호, 사또 (Sato) 등의 [Acridinium Compounds and Conjugates Thereof], 유럽 특허 출원 제94101664.4호, 유럽 특허 공고 제0 609 885호, 쉬한(Sheehan) 등의 미국 특허 제3,539,574호를 참조한다 (상기 문헌 각각은 본 명세서에 참고로 포함시킴). 상기 요인들에는 화학 발광성 분자의 구조, 화학 발광성 분자 및 이탈기 상의 치환체의 종류 및 위치, 그리고 이탈기를 화학 발광성 분자에 연결하고 있는 연결기의 구조가 포함된다. 예를 들면, 에스테르, 아미드, 티올에스테르 및 술포닐아미드를 비롯하여 여러 종류의 연결기가 존재할 수 있고, 화학 발광성 분자의 안정성은 특정한 위치에 부피가 큰 기 및 전자 인출 또는 공여기를 두는 것에 영향을 받을 수 있으며, 효율적인 화학 발광을 위해 바람직한 이탈기는 pKa가 11 이하, 바람직하게는 11 미만, 더욱 바람직하게는 5 내지 8이고 더욱 바람직하게는 아릴 고리 또는 고리계이다.
아이자와 (Aizawa) 등의 문헌 [Method of Making Acridinium Derivatives Luminesce and Method of Detecting Test material Therewith], 유럽 특허 출원 제93919625.1호, 공개 제0 617 107 A1호에는 아크리디늄 유도체의 빛 방출을 촉발시키기 위한 수퍼옥사이드 음이온 (O2 -)의 생산 및 사용이 설명되어 있다 (이 문헌은 본 명세서에 참고로 포함시킴). 아이자와 등이 설명한 방법은 중성 pH에서 빛 방출을 발생시키는 데 적당한 것으로 지시되어 있다.
바람직한 화학 발광성 표지는 아릴 고리계가 있는 화학 발광성 분자 및 이탈기를 함유한다. 바람직하게는, 아릴 고리계는 1 내지 4 개의 아릴기를 가지며 양의 전하를 담고 있다 (즉, 양전하는 한 고리에 편재하거나 어느 고리 치환체에 편재함으로써 존재함). 더욱 바람직하게는, 양전하를 띤 아릴 고리계는 치환된 헤테로고리 아릴을 함유한다.
이탈기를 가진 바람직한 화학발광성 분자는 다음 화학식 1의 구조를 가진다.
식 중,
아릴 고리계는 1 내지 4 개의 고리형 기를 함유하며 이들 기 중 하나가 연결 탄소 “C"에 연결되어 있고, 더욱 바람직하게는 아릴 고리계는 양전하를 띠고, 더욱 바람직하게는 아릴 고리계는 “C"에 연결된 양전하를 띤 헤테로고리 아릴을 함유하며, 헤테로고리 아릴의 예에는 아크리디늄, 벤즈[a]아크리디늄, 벤즈[b]아크리디늄, 벤즈[c]아크리디늄, 벤즈이미다졸 양이온, 퀴놀리늄, 이소퀴놀리늄, 퀴놀리지늄, 고리형 치환 퀴놀리늄, 피리디늄, 피리미디니늄, 피리다지늄, 피라지니늄, 페난트리디늄 및 퀴노잘리늄이 포함되고,
R2는 S, O 및 NH로 이루어진 군에서 선택되며, 바람직하게는 R2가 O이고,
R3는 O, N, S, 할로겐, 치환 인, 치환 황, 치환 붕소 및 치환 비소로 이루어진 군에서 선택되며, 바람직하게는 R3가 O, N 또는 S 중 하나이고, 더욱 바람직하게는 R3가 O 또는 S이며, 가장 바람직하게는 R3가 O이고,
R4는 알킬, 알케닐, 아릴, 알콕시 및 아릴옥시로 이루어진 군에서 선택되거나, R3가 할로겐일 때에는 존재하지 않으며, 바람직하게는 R4가 아릴이고, 더욱 바람직하게는 R4가 치환 또는 미치환 페닐이며,
R5는 R3가 N이 아닌 한 없고, R3가 N이면 R5는 수소, 알킬, 알케닐, 아릴, 알콕시 및 아릴옥시로 이루어진 군에서 선택되며, 바람직하게는 R5가 없다.
양전하를 띤 화학식 1의 화합물은 반대 이온과 이온의 힘으로 결합하고 있다. 할로겐, 황산 이온, 알킬황산 이온, 할로황산 이온, 할로붕산 이온, 할로아세트산 이온, 할로인산 이온 및 인산 이온과 같은 여러 가지 상이한 음이온을 반대이온으로 사용할 수 있다.
더욱 바람직하게는 화학 발광성 표지는 하기 화학식 2에 도시된 것처럼 이탈기가 연결되어 있는 아크리디늄으로 만들어진다.
식 중,
R1은 H, 알킬, 알케닐, 알키닐 및 아릴로 이루어진 군에서 선택되며, 바람직하게는 R1은 저급 알킬, 더욱 바람직하게는 메틸이고,
n은 0, 1, 2, 3 또는 4이며, 바람직하게는 n은 0, 1 또는 2이고,
m은 0, 1, 2, 3 또는 4이며, 바람직하게는 m은 0, 1 또는 2이고,
각각의 X는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아미노, 치환 아미노, 카르복시, 히드록시, 알콕시, 니트로, 술포닐, 할로겐, 티올, 아미도, 아세틸, 치환 아세틸 및 아릴옥시로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되며, 나머지 A 고리 치환체는 수소이고, 바람직하게는 각각의 X는 독립적으로 알킬 또는 알콕시이고, 더욱 바람직하게는 각각의 X는 독립적으로 저급 알킬 또는 저급 알콕시이며, 가장 바람직하게는 각각의 X는 독립적으로 메틸 또는 메톡시이고,
각각의 Y는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아미노, 치환 아미노, 카르복시, 히드록시, 알콕시, 니트로, 술포닐, 할로겐, 티올 및 아릴옥시로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되며, 나머지 C 고리 치환체는 수소이고, 바람직하게는 각각의 Y는 독립적으로 알킬 또는 알콕시이고, 더욱 바람직하게는 각각의 Y는 독립적으로 저급 알킬 또는 저급 알콕시이며, 가장 바람직하게는 각각의 Y는 독립적으로 메틸 또는 메톡시이고,
R2, R3, R4및 R5는 상기 화학식 1의 화합물에 설명된 것과 같이 정의된다.
이탈기에 연결된 다른 더욱 바람직한 화학발광성 분자는 벤즈[a]아크리디늄, 벤즈[b]아크리디늄, 벤즈[c]아크리디늄, 벤즈이미다졸 양이온, 퀴놀리늄, 이소퀴놀리늄, 퀴놀리지늄, 고리형 치환 퀴놀리늄, 피리디늄, 피리미디니늄, 피리다지늄, 피라지니늄, 페난트리디늄 및 퀴노잘리늄으로 이루어진 군에서 선택된 헤테로고리 고리계를 갖는데, 여기서 고리계의 각 고리는 각각의 가능한 탄소가 각각 독립적으로 X/Y 치환체를 가질 수 있는 화학식 2의 화합물과 동일한 방식으로 치환되며, 더욱 바람직하게는 각 고리가 0 내지 2 개의 치환체를 함유하고, 고리 중 하나는 R1에 연결된 N과 연결기에 연결된 탄소 원자를 함유한 양전하를 띤 헤테로고리 고리이다.
2. 형광성 표지
형광성 표지는 전형적으로, 빛에 의해 여기되어 여기 상태 분자를 만들어낼 수 있는 방향족 기를 함유한다. 신호 변경 리간드의 결합은 형광을 변경시킬 수 있다. 위에서 기술한 것처럼, 아크리디늄 에스테르와 같은 화학발광성 표지는 형광성 표지일 수도 있다. 따라서, 형광성 표지의 예는 앞의 단락에서 화학발광성인 것으로 서술한 표지들을 포함한다. 형광성 표지의 예에는 로다민, 플루오레신, 루테늄, 에티듐 할로겐화물 및 아크리딘과 같은 인터컬레이터 또는 그루브 결합제 역시 포함된다.
바람직한 형광성 표지는 공액 pi 전자계, 바람직하게는 방향족 고리를 가진다. 방향족 고리에서 나오는 형광은 어덕트 형성 등에 의해 방향족 고리의 방향성을 두절시킴으로써 변경시킬 수 있다.
3. 화학적 정의
다음은 여러 가지 표지에 존재할 수 있는 화학적 관능기의 일부에 대한 설명이다. 본 명세서에 제시된 여러 가지 기본적 화학 구조는 다른 기로 치환할 수 있다. 아래에 설명된 여러 가지 기들 각각의 치환은 반응성이 없는 (즉, 분석물과 반응하거나, 신호 변경 어덕트 형성을 막거나 신호 발생을 막지 않는) 원자 또는 원자들을 사용하여 행할 수 있다. 기본적인 구조에 대한 치환의 예도 아래에 제시하였다.
“아세틸"은 C(=O)-CH3를 말한다.
“아미노"는 -NH2를 말한다.
“아미도"는 C(=O)-NH2를 말한다.
“알킬"기는 직쇄, 분지쇄 및 고리형 알킬기를 포함하여 치환되거나 되지 않은 포화 지방족 탄화수소를 말한다. 바람직하게는, 알킬기는 1 내지 25 개의 탄소 원자를 가지며 20 개 이하의 헤테로원자를 함유한다. 더욱 바람직하게는, 알킬기는 탄소수 1 내지 12, 더욱 바람직하게는 탄소수 1 내지 4의 저급 알킬이다. 헤테로원자는 바람직하게는 질소, 황, 인 및 산소로 이루어진 군에서 선택된다.
“알케닐"기는 모두 경우에 따라 치환될 수 있는 직쇄, 분지쇄 및 고리형 알케닐기를 포함하여 치환되거나 되지 않은, 하나 이상의 이중결합을 함유한 탄화수소를 말한다. 바람직하게는, 알케닐기는 2 내지 25 개의 탄소 원자를 가지며, 20 개 이하의 헤테로원자를 함유한다. 더욱 바람직하게는, 알케닐기는 탄소수 2 내지 12, 더욱 바람직하게는 탄소수 2 내지 4의 저급 알케닐이다. 헤테로원자는 바람직하게는 질소, 황, 인 및 산소로 이루어진 군에서 선택된다.
“알키닐"기는 모두 경우에 따라 치환될 수 있는 직쇄, 분지쇄 및 고리형 알키닐기를 포함하여 치환되거나 되지 않은, 하나 이상의 삼중결합을 함유한 불포화 탄화수소를 말한다. 바람직하게는, 알키닐기는 2 내지 25 개의 탄소 원자를 가지며, 20 개 이하의 헤테로원자를 함유한다. 더욱 바람직하게는, 알키닐기는 탄소수 2 내지 12, 더욱 바람직하게는 탄소수 2 내지 4의 저급 알키닐이다. 헤테로원자는 바람직하게는 질소, 황, 인 및 산소로 이루어진 군에서 선택된다.
“아릴"은 공액 pi 전자계가 있는 하나 이상의 고리를 가진 치환되거나 되지 않은 방향족기를 말하며, 탄소고리 아릴, 헤테로고리 아릴, 비아릴 및 트리아릴 기를 포함한다. 아릴 치환 치환체의 예에는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아미노, 치환 아미노, 카르복시, 히드록시, 알콕시, 니트로, 술포닐, 할로겐, 티올 및 아릴옥시가 포함된다.
“탄소고리 아릴"은 방향족 고리 상의 모든 원자가 탄소 원자인 아릴을 말한다. 이 탄소 원자는 아릴에 대해 위에 설명한 것처럼 경우에 따라 치환될 수 있다. 바람직하게는, 탄소고리 아릴은 치환되거나 되지 않은 페닐이다.
“헤테로고리 아릴"은 방향족 고리에 있는 고리 원자로 1 내지 3 개의 헤테로원자를 가진 아릴을 말하며, 나머지 고리 원자는 탄소 원자이다. 적절한 헤테로원자에는 산소, 황 및 질소가 포함된다. 헤테로고리 아릴의 예로는 푸라닐, 티에닐, 피리딜, 피롤릴, N-저급 알킬 피롤로, 피리미딜, 피라지닐 및 이미다졸릴 등이 있다. 헤테로고리 아릴은 아릴에 대해 위에 설명한 것처럼 경우에 따라 치환될 수 있다.
“알콕시"는 “알킬"이 위에 설명한 것과 같이 정의되고 “O"가 산소인 “O-알킬"을 말한다. 바람직하게는, 알콕시는 O-저급 알킬이다.
“아릴옥시"는 “아릴"이 위에 설명한 것과 같이 정의되고 “O"가 산소인 “O-아릴"을 말한다.
“니트로"는 NO2를 말한다.
“술포닐"은 S(O)2-R을 말하는데, 여기서 R은 반응성이 없는 원자 또는 원자들이다. R의 예에는 알케닐, 알키닐, 아릴, 할로겐, 아미노 및 치환 아미노가 포함된다.
“치환 아세틸"은 C(=O)-CH(R)2를 말하는데, 여기서 적어도 한 개의 R이 수소가 아니라면 각각의 R은 반응성이 없는 임의의 원자 또는 원자들이다. 이러한 치환체의 예에는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아미노, 카르복시 및 알콕시가 포함된다.
“치환 아미노"는 -NH-R을 말하는데 여기서 R은 반응성이 없는 임의의 원자 또는 원자들이다. 이러한 치환체의 예에는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아미노, 카르복시 및 알콕시가 포함된다.
“치환 인"은 -P(R)3를 말하는데, 여기서 각각의 R은 반응성이 없는 임의의 원자 또는 원자들이다. R의 예에는 O, =O, S, CH3, Se 및 As가 포함된다.
“치환 황"은 화학양론적 조건을 따르며 반응성이 없는, 수소가 아닌 임의의 원자 또는 원자들의 존재를 말한다.
“치환 붕소"는 화학양론적 조건을 따르며 반응성이 없는, 수소가 아닌 임의의 원자 또는 원자들의 존재를 말한다.
“치환 비소"는 화학양론적 조건을 따르며 반응성이 없는, 수소가 아닌 임의의 원자 또는 원자들의 존재를 말한다.
B. 결합 영역
결합 영역은 분석물의 일부를 인식하면서 분석물과 함께 어덕트 형성에 의한 신호 변경으로부터 표지를 보호하는 미세 환경의 형성을 허용하도록 설계된다. 바람직하게는, 결합 영역은 표적 핵산 서열에 어느 정도까지 상보적인 핵산 서열을 함유한다. 예를 들면, 특정한 미생물의 특징적인 표적 핵산 서열에 특이적으로 혼성화하도록 올리고뉴클레오티드 프로브를 설계할 수 있다. 반면, 고도의 특이성이 없는 혼성화 프로브는 다른 검사에 사용할 수 있다. 프로브의 고도의 특이성이 요구되지 않는 응용처의 예에는 프로브가 두 가지 이상의 관련 서열에 혼성화하도록 설계되는 경우와 표적 핵산이 불순물에서 분리되어 있는 경우가 포함된다. 표적 핵산 서열은 예컨대 포획 프로브를 사용함으로써 (예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함시키는 콜린스 (Collins)의 문헌 [Target and Background Capture Methods and Apparatus for Affinity Assays], 유럽 특허 출원 제87309308.2호, 공고 제0 265 244 B1호 참조) 불순물에서 분리할 수 있다.
결합 영역의 또다른 예는 항체 에피토프 결합 도메인이다. 항원에 존재하는 특정한 에피토프의 존재를 검출하는 데 항체를 사용할 수 있다. 예를 들면, 항체를 사용하여 특정한 항원성 단백질을 검출할 수 있다. 할로우 등의 [Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] (본 출원에 참고로 포함시킴)은 항체의 생산 및 사용을 설명하고 있다.
C. 표지된 결합 상대 합성
표지를 함유한 결합 상대는 표준적인 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 종합적으로 보아 표지는 분석물과 결합 상대의 결합에 의해 형성되는 보호 미세환경 내에 존재할 수 있게 하는 한편 동시에 촉발제가 신호 발생을 일으킬 수 있게 하는 구조를 가져야 한다. 예를 들면, 화학 발광성 분자의 빛 방출이 산화성 공격에 의해 촉발되는 경우에는 연결기는 미세환경 내에 존재할 때 산화성 공격을 받아들일 수 있는 상태로 남아있어야 한다.
표지는 결합 상대가 분석물에 결합하는 것과 분석물을 불순물과 구별하는 것을 막아서는 안된다. 예를 들면, 표지된 핵산 프로브가 특정한 생물체의 존재를 표시하는 능력은 온전하게 남아있어야 한다.
특정한 핵산 서열 및 염기 조성을 가진 핵산 프로브는 표준적인 기술을 사용하여 구성할 수 있다. 염기 조성의 수정은 예컨대 2'-O-위치의 알킬화 (예를 들어, 2'-메톡시기)에 의해 올리고뉴클레오티드의 안정성을 증가시키기 위해 실시할 수 있다 (밀러 등 (Miller et al)의 문헌 [Oligonucleotides Modified to Improve Stability at Acid pH], 국제 특허 출원 제PCT/US94/00157호, 국제 특허 공개 제94/15619호 (본 명세서에 참고로 포함시킴) 참조). 올리고뉴클레오티드의 유기 합성은 단계적 방식으로 뉴클레오티드를 첨가함으로써 실시할 수 있다. 문헌 [Eckstein, F., Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Chap. 1-5, 1991]은 올리고뉴클레오티드의 유기 합성을 개괄하고 있고, 문헌 [Caruthers et al., In Methods In Enzymology vol. 154 p. 287 (1987)]은 표준 포스포르아미다이트 고체상 화학반응을 이용하여 포스포디에스테르 연결부를 함유한 올리고뉴클레오티드의 유기합성을 위한 과정을 설명하고 있고, 바트 (Bhatt)의 미국 특허 제5,252,723호에는 포스포로티오에이트 연결부를 함유한 올리고뉴클레오티드의 유기 합성을 위한 과정이 설명되어 있으며, 클렘 등(Klem et al)의 문헌 [Improved Process for the Synthesis of Oligomer], 국제 특허 공개 제92/07864호에는 메틸-포스포네이트 연결부를 비롯한 여러 가지 뉴클레오티드간 연결부를 갖는 올리고뉴클레오티드의 유기 합성이 설명되어 있다.
표지는 아놀드 등의 문헌 [Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes], 유럽 특허 출원 제88308766호, 공고 제313219호, 아놀드 등의 미국 특허 제5,185,439호 및 넬슨 등 [Nonisotopic DNA Probe Techniques (Kricka ed., Academic Press, 1992) 중 “Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence" pp. 275-311]에서 설명된 것과 같은 기술을 사용하여 핵산 결합 상대에 연결시킬 수 있다. 상기 문헌들은 핵산 결합 영역에 연결된 아크리디늄 에스테르를 함유한 결합 상대를 생산하는 데 주안점을 두고 있다. 그러나, 다른 표지를 다른 결합 상대에 연결시키는 데 유사한 기술을 사용할 수 있다. (표지에 연결된 결합 상대 생산을 위한 그 밖의 참고문헌은 상기 III.A.1 단락에 언급되어 있다.)
빛 방출 분자는 문헌 [Weeks et al., Immunoassays using acridinium esters, Methods Enzymol. 133:366-368 (1986)] 및 빛 방출 표지를 항체에 연결시키는 것과 관련하여 상기 III.A.1 단락에 언급된 문헌에 설명된 것과 같은 기술을 사용하여 항체에 연결시킬 수 있다. 항체는 할로우 등의 상게서에 설명된 것과 같은 표준적인 기술을 사용하여 생산할 수 있다.
〈IV. 신호 변경 리간드〉
어덕트 보호 검사에 적합한 신호 변경 리간드는 미결합 결합 상대 상에 존재하는 표지와 분석물에 결합한 결합 상대 상에 존재하는 표지를 구별할 수 있다. 검사에 사용하는 리간드의 양은 여러 가지 면에서 검사에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 리간드를 더 많이 공급하면 결합 및 미결합 결합 상대 상에 존재하는 변경된 표지의 수를 증가시킬 수 있다.
바람직한 리간드는 미결합 결합 상대 상에 존재하는 표지와 신속히 반응하고(하거나) 수학식 1의 평형상수가 높게 만드는 한편 분석물에 결합한 결합 상대 상에 존재하는 표지와는 매우 느리게 반응하고(하거나) 수학식 2의 평형상수가 낮게 만드는 것들이다. 더욱 바람직하게는, 신호 변경 리간드는 분석물에 결합하지 않은 결합 상대 상에 존재하는 표지와는 신속히 반응하여 수학식 1의 평형상수가 높게 만들고, 결합한 결합 상대 상에 있는 표지와는 느리게 반응하여 수학식 2의 평형상수가 낮게 만든다.
바람직한 신호 변경 리간드는 검사 조건 하에서 결합 및 미결합 결합 상대 상에 존재하는 표지를 구별할 수 있고 미결합 결합 상대 상에 존재하는 표지와는 강한 어덕트를 형성하는 친핵체이다. 예를 들면, 이탈기에 연결된 연결기를 가진 바람직한 빛 방출 표지의 경우, 형성된 어덕트는 과산화수소 및 수퍼옥사이드 이온과 같은 산화제에 의해 연결기가 산화되는 것을 막아야 한다. 아놀드 등의 미국 특허 제4,950,613호 및 문헌 [Hammond et al., J. Biolumin. Chemilumin. 6:35-43, 1991]에는 아크리디늄과 보호 어덕트를 형성하여 빛 방출을 막을 수 있는 리간드가 설명되어 있다 (이들 두 문헌은 본 명세서에 참고로 포함시킴).
바람직한 리간드는 리간드가 강력한 친핵체로 작용하는 것을 가능하게 해주는 비결합 전자쌍을 가지고 있다. 더욱 바람직하게는, 비공유 전자쌍은 VI족 원소에 존재하며, 가장 바람직하게는 그 원소가 황이다. 바람직하게는, 비공유 전자쌍을 함유한 원소는 공액 pi 전자계 또는 니트릴기에 인접해 있지 않다. 예를 들면, 비공유 전자쌍을 함유한 원소는 방향족 고리에 인접해서는 안된다. 적절한 신호 변경 리간드의 예에는 테트라히드로티오펜, 프로판티올, 벤질메르캅탄, 술파이트, 글리콜 술파이트, 히드로술파이트, 메타비술파이트, 티오술페이트, 티오포스페이트, 메타아스나이트, 텔루라이트, 아스나이트 및 티오시아네이트가 포함된다.
〈V. 핵산 표적 서열의 검출〉
어덕트 보호 검사는 바람직하게는 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 핵산 프로브를 사용하여 수행한다. 표지된 프로브:표적 하이브리드에 의해 표지에 제공되는 보호의 정도는 존재하는 뉴클레오티드의 종류, 프로브 및 하이브리드의 뉴클레오티드 서열과 같은 요인들에 영향을 받는다.
어덕트 보호 검사는 DNA 및 RNA와 같은 여러 가지 핵산 표적을 검출하는 데 사용할 수 있다. 이 검사는 바람직하게는 RNA 표적을 사용하여 실시한다. RNA를 생산하고 DNA에서 출발하여 RNA 표적을 증폭시키거나 RNA에서 출발하여 RNA 표적을 증폭시키는 방법들은 당업계에 공지되어 있다. 예, 케이시안 등의 미국 특허 제5,399,491호.
아래에서는 본 발명의 여러 가지 측면 및 실시태양을 보여주기 위해 실시예를 제공하였다. 이들 실시예는 아크리디늄 에스테르를 표지로 사용하여 본 발명을 설명한다. 다른 많은 양이온성 헤테로원자 물질과 마찬가지로 아크리디늄 에스테르는 친핵체와 가역적으로 반응하여 어덕트를 형성한다. 어덕트 형성의 한 결과로 아크리디늄 에스테르의 중요한 성질 몇 가지가 현저하게 달라진다. 아크리디늄 에스테르 상에서 어덕트 형성에 바람직한 부위는 C-9 위치이다. 어덕트 형성은 아크리디늄 에스테르의 가시광선대 스펙트럼을 변경시키고, 아크리디늄 에스테르 형광을 강력하게 억제하며, 아크리디늄 에스테르의 에스테르 결합을 가수분해에 대해 안정화시키고, 과산화물 이온 또는 수퍼옥사이드 이온과 같은 촉발제와 아크리디늄 에스테르와의 화학 발광을 일으키는 반응을 억제한다.
본 실시예는 어떤 식으로든 본 발명을 제한하려는 의도가 아니다. 실시예는 여러 상이한 표지와 신호 변경 리간드를 일상적인 방법으로 쉽게 동정하여 원하는 활성을 갖는 것을 보장하는 방법론을 예시하는 것이다. 예를 들면, 본 명세서에 설명된 구조식에 속하는 표지들을 스크리닝하여 가장 적합한 활성을 가진 표지를 결정할 수 있다.
〈실시예 1: 결합 및 미결합 결합 상대 상에 있는 표지의 우선적인 구별〉
방향족 고리 또는 니트릴기와 공액 상태에 있지 않는 자유 전자쌍을 가진 황 원자를 함유한 화합물은 아크리디늄 에스테르로 표지된 단일가닥 프로브와는 강력한 어덕트를 형성하지만 표적 핵산 분석물에 혼성화한 같은 프로브와는 그렇지 않은 것으로 밝혀졌다. 본 실시예는 미결합 결합 상대에 존재하는 표지를 우선적으로 변경시키기 위한 신호 변경 리간드의 사용을 설명한다.
혼성화
15 ㎕의 2X 혼성화 완충액 (100 mM 리튬 숙시네이트 (pH 5.2), 8.5% (w/v) 리튬 라우릴 술페이트, 1.5 mM EDTA, 1.5 mM EGTA)에 1 pmol의 아크리디늄 에스테르(AE)로 표지된 프로브 (7 x 107RLU/pmol)와 4 pmol의 표적을 첨가하였다. AE-표지된 프로브 서열은 하기 서열 1로 주어지는데, 여기서*는 아크리디늄 에스테르 표지의 위치를 나타낸다. 표적 서열은 하기 서열 2로 주어진다.
서열 확인 번호 1:
5'-
서열 확인 번호 2:
5'-
그 결과 얻어진 용액에 물을 넣어 30 ㎕로 조정하고, 60℃에서 30 분 동안 가열한 다음 1X 혼성화 완충액을 써서 500 ㎕로 희석하였다.
어덕트 보호
12 x 75 mm 튜브 (Sarstedt)에 2 ㎕의 AE-표지된 프로브 또는 하이브리드 (400,000 RLU)를 가하였다. 이 용액에 100 ㎕의 어덕트 형성 완충액 (10 mM 소듐 술파이트, 30 mM 보레이트 완충액 (pH 8.7), 1.5% Triton TX100)을 가하였다. 그 다음 용액을 보텍싱하고 실온 (약 22-25℃)에 여러 가지 시간 동안 정치하였다. 그 결과 얻어진 용액에 Detect I (0.001 N NHNO3중 0.1% (v/v) H2O2) 주입에 이어 0.5-2 초 뒤에 Detect II (1 N NaOH 200 ㎕)를 주입하여 화학발광을 측정하였다. 빛 방출을 5 초 구간을 통해 적분하였다.
결과
도 1에 보인 것처럼 소듐 술파이트는 AE-프로브와 매우 신속히 반응하며 150초 후에는 반응이 평형상태에 도달한다. 이와 대조적으로, 동일한 AE-프로브가 상보적인 핵산 표적에 혼성화하고 있을 때 생성된 AE-하이브리드는 소듐 술파이트와 훨씬 더 느리게 반응한다.
소듐 술파이트의 농도가 낮은 쪽에서는, 아크리디늄 에스테르와의 어덕트가 더 적게 형성되지만 어덕트 형성은 AE-하이브리드에 대비해서 AE-프로브에서 한층 더 강하고 더 빠르다. 소듐 술파이트의 농도가 높은 (200 mM) 쪽에서는, 아크리디늄 에스테르에 더 많은 어덕트가 형성되지만 AE-프로브와 AE-하이브리드 사이의 구별이 감소한다.
〈실시예 2: 표적 서열의 검출〉
과량의 아크리디늄 에스테르 표지된 프로브와 점감하는 양의 상보적 표적을 사용하여 어덕트 보호 검사가 표적 서열의 존재를 검출하는 능력을 시험하였다.
혼성화
20 ㎕의 혼성화 완충액에 다양한 양의 표적과 0.05 pmol의 프로브를 첨가하였다. AE-표지된 프로브 서열은 하기 서열 3으로 주어지는데, 여기서*는 아크리디늄 에스테르 표지의 위치를 나타낸다. 표적 서열은 하기 서열 4로 주어진다. 그 결과 얻어진 용액을 다음에는 60℃에서 30 분 동안 가열하였다.
서열 확인 번호 3:
5'-
서열 확인 번호 4:
5'-
어덕트 보호
12 x 75 mm 튜브 (Sarstedt)에 200 ㎕의 어덕트 형성 용액 (60 mM 소듐 테트라보레이트 (pH 8.8), 2% (v/v) TX100, 20 mM 소듐 술파이트)을 가하였다. 그 다음 용액을 보텍싱하고 실온에서 15 초 동안 인큐베이션하였다. 그 결과 얻어진 용액에 Detect I 주입에 이어 0.5 초 뒤에 Detect II를 주입하여 화학발광을 측정하였다. 빛 방출을 5 초 시구간을 통해 적분하였다.
결과
도 3에 보이는 것처럼, 어덕트 보호 검사는 과량의 아크리디늄 에스테르 표지된 프로브와 점감하는 양의 상보적 표적을 사용하여 표적 서열의 존재를 검출할 수 있었다.
〈실시예 3: 여러 가지 아크리디늄 에스테르 구조〉
이 실시예는 어덕트 보호 검사에서 여러 가지 아크리디늄 에스테르 유도체의 용도와 여러 가지 아크리디늄 에스테르 유도체가 어덕트 형성 속도에 대해 갖는 효과를 설명한다. 1-메틸-AE와 2,7-디메틸-AE를 사용하여 아크리디늄 고리에 있는 전자 공여기의 효과를 시험하였다. o-AE, 나프틸-AE, o-Me-Cin-AE, o-diMe-AE 및 o-diBr-AE를 사용하여 핵산에 연결된 상이한 이탈기의 효과를 조사하였다. 이들 여러 가지 아크리디늄 에스테르의 구조는 도 4 및 도 5에 나타나 있다. 소듐 술파이트 또는 소듐 메타비술파이트를 신호 변경 리간드로 사용하였다.
혼성화
15 ㎕의 2X 혼성화 완충액 (0.2 M 리튬 숙시네이트 (pH 5.2), 1.0 M LiCl, 0.2% Triton X-100)에 0.1 pmol의 프로브 (7 x 107RLU/pmol)와 0.1 pmol의 DNA 표적을 첨가하였다. AE-표지된 프로브 서열은 하기 서열 5로 주어지는데, 여기서*는 아크리디늄 에스테르 표지의 위치를 나타낸다. 표적 서열은 하기 서열 6으로 주어진다. 그 결과 얻어진 용액에 물을 넣어 30 ㎕로 조정하고, 60℃에서 60 분 동안 가열한 다음 1X 혼성화 완충액을 써서 500 ㎕로 희석하였다.
서열 확인 번호 5:
5'-
서열 확인 번호 6:
5'-
어덕트 보호
12 x 75 mm 튜브 (Sarstedt)에 30 ㎕의 보레이트 완충액 (30 mM 보레이트 (pH 8.8), 1% Triton X100)과 3 내지 5 ㎕의 프로브 또는 하이브리드 (200,000-300,000 RLU)를 가하였다. 이 용액에 10 ㎕의 0.1 M 소듐 술파이트 또는 0.1 M 소듐 메타비술파이트를 가하였다. 그 다음 용액을 보텍싱하고 실온에 여러 가지 시간 동안 정치하였다. 그 결과 얻어진 용액에 Detect I 주입에 이어 0.5-2 초 뒤에 Detect II를 주입하여 화학발광을 측정하였다. 빛 방출을 5 초 구간을 통해 적분하였다.
결과
프로브 또는 하이브리드 중 하나에 부착되었을 때 미치환 아크리디늄 고리 (AE, o-AE, 나프틸-AE, o-Me-Cin-AE, o-diMe-AE 및 o-diBr-AE)를 가진 아크리디늄 에스테르는 소듐 술파이트 및 소듐 메타비술파이트와 (10 배 이내의) 대략 동일한 속도로 어덕트를 형성하였다. 이와 대조적으로, 1-Me-AE 및 2,7-di-Me-AE는 미치환 아크리디늄 에스테르 유도체보다 10 배 이상 느리게 어덕트를 형성하였다. 이들 메틸화 유도체에 의한 낮은 어덕트 형성 속도는 아크리디늄 에스테르의 C-9 위치에 있는 양전하를 감소시킴으로써 어덕트 형성 속도를 감소시킬 수 있는 메틸기의 전자 공여 성질로 설명할 수 있다.
상기 실험들의 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
이와 같이, 표지의 구조는 표지의 어덕트 형성 능력에 영향을 미친다. 예를 들면, 프로브 또는 하이브리드에 부착된 표지의 경우, o-diBr-AE에 의한 어덕트 형성 속도가 동일한 프로브 또는 하이브리드에 부착된 2,7-diMe-AE에 의한 어덕트 형성 속도보다 각각 24 및 45배 빠르다.
〈실시예 4: 단일 염기 미스매치의 검출〉
이 실시예는 어덕트 보호 검사가 단일 염기쌍 미스매치를 검출하는 능력을 설명한다. 한 프로브를 TW (야생형 표적), TM1 (미스매치 표적 1) 및 TM2 (미스매치 표적 2)라고 명명한 세 가지 상이한 표적 서열에 혼성화시켰다. TW에 대한 프로브의 혼성화에서는 미스매치가 전혀 없는 하이브리드가 만들어지고, TM1에 대한 프로브의 혼성화에서는 하나의 미스매치가 있는 하이브리드가 만들어지며, TM2에 대한 프로브의 혼성화에서는 두 개의 인접한 미스매치가 있는 하이브리드가 만들어진다.
TW, TM1 및 TM2와 혼성화한 프로브의 어덕트 형성 속도를 측정하였다. 비교를 위해 가수분해 검사법에서 알칼리 용액을 사용하여 각 프로브와 표적의 가수분해 속도도 측정하였다.
프로브 및 표적 서열
이 실시예에서는 다음의 프로브 및 표적 서열을 사용하였다 (여기서*는 아크리디늄 에스테르 표지의 위치를 표시한다).
AE 프로브:
서열 확인 번호 7:
5'-
야생형 표적 (TW):
서열 확인 번호 8:
5'-
돌연변이 표적 1 (TM1):
서열 확인 번호 9:
5'-
돌연변이 표적 2 (TM2):
서열 확인 번호 10:
5'-
혼성화
60 ㎕의 혼성화 완충액 (100 mM 리튬 숙시네이트 (pH 5.2), 8.5% 리튬 라우릴 술페이트, 1.5 mM EDTA, 1.5 mM EGTA)에 2.5 pmol의 표적과 0.05 pmol의 프로브를 첨가하였다. 그 결과 얻어진 용액을 60℃에서 30 분 동안 가열한 다음 500 ㎕의 50 mM 리튬 숙시네이트 (pH 5.2) 및 250 mM 염화리튬이 되도록 희석하였다.
어덕트 보호
12 x 75 mm 튜브 (Sarstedt)에 100 ㎕의 보레이트 완충액 (60 mM 보레이트 (pH 8.8), 2% Triton X100)과 10 ㎕의 프로브 또는 하이브리드를 가하였다. 이 용액에 100 ㎕의 20 mM 소듐 술파이트를 가하였다. 그 다음 용액을 보텍싱하고 실온에 여러 가지 시간 동안 정치하였다. 그 결과 얻어진 용액에 Detect I 주입에 이어 0.5 초 뒤에 Detect II를 주입하여 화학발광을 측정하였다. 빛 방출을 5 초 시구간을 통해 적분하였다.
가수분해
12 x 75 mm 튜브 (Sarstedt)에 100 ㎕의 보레이트 완충액 (190 mM 소듐 테트라보레이트 (pH 7.6), 6.9% (v/v) TX-100, 0.02% 생선 젤라틴 (Fisher))과 10 ㎕의 프로브 또는 하이브리드를 가하였다. 생성되는 용액을 60℃에서 여러 가지 시간 동안 가열하고 시료를 수거하여 0.1% (v/v) H2O2를 함유한 200 ㎕의 0.4 N HCl에 가하였다. 그 결과 얻어진 용액의 화학발광은 Detect II를 주입하여 측정하고, 빛 방출을 5 초 시구간을 통해 적분하였다.
결과
그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
가수분해 검사에서, 미스매치된 하이브리드는 미스매치가 없는 동일한 하이브리드보다 더 빨리 가수분해되었고, 어덕트 보호 검사에서 단일 염기쌍 미스매치는 미스매치된 하이브리드에서의 신호 발생을 현저히 감소시켰다.
어덕트 보호 검사에서 미스매치의 효과는 가수분해 검사에서의 미스매치의 효과와는 현저히 다르다. 가수분해 검사에서 얻어진 결과와는 대조적으로 어덕트 보호 검사에서는 단일 미스매치가 결합 및 미결합 프로브 상에 존재하는 표지들 간의 구별이 더 크게 또는 더 작게 되는 결과를 초래할 수 있다. 따라서, 어덕트 보호 검사에 대한 미스매치의 효과는 특정한 미스매치된 프로브;표적 하이브리드에 대해서는 재현성이 있으면서도 상이한 프로브:표적 하이브리드에 대해서는 다를 수 있다 (즉, 보호를 증가 또는 감소시킬 수 있다).
표 2는 또한 어덕트 보호 검사와 가수분해 검사에 대한 신호 발생 속도의 변경에서 보이는 차이점을 보여준다. 표 2에서 어덕트 보호 검사의 경우에 신호 발생의 미분 변경 속도는 초 단위로 측정되는 반면 신호 발생의 가수분해 변경 속도는 분 단위로 측정되었다. 종합하면, 신호 발생의 변경 속도은 가수분해 검사에 비하면 어덕트 보호 검사에서 약 12 내지 32 배 더 빨랐다.
〈실시예 5: 여러 가지 핵산 구조〉
어덕트 형성 속도와 프로브 또는 표적에 존재하는 핵산의 종류 (RNA 또는 DNA) 사이의 관계를 이 실시예에서 요약하였다. 이번 실험에서는, 작은 RNA 또는 DNA AE-표지된 프로브를 작은 상보적 RNA 또는 DNA 표적 또는 큰 리보솜 RNA 표적에 혼성화시켰다. 비교를 위해, 각 프로브 및 얻어지는 하이브리드의 가수분해 속도 역시 측정하였다. 달리 언급되지 않는 한, 검사는 다음 올리고뉴클레오티드를 사용하여 실시예 3에 설명된 것처럼 실시하였다.
(I) 프로브:
16/17 위치에 아크리디늄 에스테르로 표지한 서열 확인 번호 5의 DNA 프로브, 및
하기 서열 11의 프로브 (여기서*는 아크리디늄 에스테르 표지의 위치를 표시함).
서열 확인 번호 11:
(II) 표적:
서열 확인 번호 6 (DNA 표적), 및
하기 서열 12 (RNA 표적)
서열 확인 번호 12:
5'-
rRNA 표적에의 혼성화
15 ㎕의 2X 혼성화 완충액에 2 ㎍ (1.25 pmol)의 대장균 rRNA를 가하였다. 생성된 용액에 물을 넣어 30 ㎕로 조정한 다음 70℃에서 10 분 동안 가열하였다. 그 다음 16/17 위치에 아크리디늄 에스테르로 표지된 서열 확인 번호 5 프로브 0.1 pmol을 용액에 가하였다. 용액을 60℃에서 한 시간 동안 가열하고, 실온으로 냉각시킨 다음 1X 혼성화 완충액을 써서 500 ㎕로 희석하였다.
결과
결과를 하기 표 3에 나타내었다.
표 3에서 관찰되는 양상은 여러 가지 핵산 하이브리드의 배위에 관련시킬 수 있다. DNA/DNA 하이브리드는 B 배위로 있고, RNA/RNA 하이브리드는 A 배위로 있으며, 하나의 DNA 가닥과 하나의 RNA 가닥을 담은 핵산 하이브리드는 A-유사 배위를 택하는 것으로 여겨진다.
구별에 대한 RNA 표적 및(또는) RNA 프로브의 효과는 어덕트 보호 검사와 가수분해 검사에 있어서 상이하다. 어덕트 보호 검사에서는, 표적과 프로브가 둘 다 RNA일 때 구별이 향상된다. 이와 대조적으로 가수분해 검사의 경우에는 DNA 프로브와 RNA 표적에서 최대량의 구별이 관찰된다. 더욱이, 이 실시예에 사용된 실험 조건 하에서는 어덕트 보호 검사가 가수분해 검사보다 더 큰 구별을 제공하였다.
종합하면, A-유사 배위는 A 배위와 비슷한 어덕트 형성 속도를 보였다. 이와 대조적으로, 이들 A-유사 배위의 가수분해 속도는 표적 가닥이 DNA일 때에는 B 배위의 가수분해 속도를 닮는 반면 표적 가닥이 RNA일 때에는 A 배위의 가수분해 속도를 닮는다. 따라서, 어덕트 형성 속도는 프로브 및(또는) 표적이 DNA인지 RNA인지에 따라 달라지며 이들 속도는 이들 분자와 동일하게 연결된 표지의 대응하는 가수분해 속도와 직접적으로 상관관계를 보이지 않는다.
〈실시예 6: AE-표지를 사용한 표지 위치 효과〉
아크리디늄 에스테르 연결 부위의 위치에 대한 어덕트 형성 속도의 의존성을 조사하기 위해, 프로브의 서로 다른 위치에 아크리디늄 에스테르 연결 부위를 함유한 일련의 프로브를 마련하였다. 그 다음 이 일련의 프로브를 상보적인 표적에 혼성화시키고, 생성되는 AE-표지된 하이브리드 및 AE-표지된 프로브를 소듐 술파이트와 반응시켰다. 비교를 위해, 동일한 프로브 및 하이브리드의 가수분해 속도를 가수분해 검사법으로 측정하였다. 아래에 요약한 바와 같이, 어덕트 형성 속도는 하이브리드를 따라서는 한 염기에서 다음 염기로 가면서 크게 (10 배) 달라졌으며, 프로브를 따라서는 한 염기에서 다음 염기로 가면서 더 적게 (2.6 배) 달라졌다. 이와 대조적으로, 하이브리드 또는 프로브의 한쪽에서 다른 쪽 끝으로 감에 따른 가수분해 속도의 변동은 더 작다 (각각 2 배 및 1.6 배). 따라서, AE-표지된 프로브와 AE-표지된 하이브리드를 구별하는 어덕트의 능력은 AE 연결 부위의 위치를 달리 함으로써 크게 강화할 수 있다.
〈실시예 7: 여러가지 신호 변경 리간드의 성능〉
미결합 표지에서 나오는 신호 발생의 우선적인 변경으로 분석물의 검출을 돕기 위해서는, 어덕트 형성 화합물이 표지와 강력하게 반응하는 것이 중요하다. 하기 표 5는 각종 친핵체를 미결합 AE-표지된 프로브와 반응시키는 실험을 요약한 것이다.
각 친핵체에 대해, 어덕트를 형성하지 않은 프로브의 백분율을 여러 친핵체 농도에 걸쳐 측정하였다. 황이 아닌 원자들에 자유 전자쌍을 함유한 화합물 (술페이트, 하이포포스파이트)은 아크리디늄 에스테르와 강한 어덕트를 형성하지 않았다.
이와 대조적으로, 자유 전자쌍이 있는 황 원자를 함유한 화합물은 아크리디늄 에스테르와 강한 어덕트를 형성하였다 (테트라히드로티오펜, 프로판티올, 소듐 술파이트, 벤질 메르캅탄, 소듐 히드로술파이트, 글리콜 술파이트, 메타비술파이트, 소듐 티오포스페이트, 및 소듐 티오술페이트). 황 함유 화합물 중 한 가지, 프로필 디술파이드만이 제한된 수 용해도로 인해 아크리디늄과 강한 어덕트를 형성하는 대 실패하였다. 황 외에도, 다른 VIb족 원자를 함유한 화합물 (포타슘 텔루라이트)이나 V족 원자를 함유한 것 (메타아스나이트) 역시 아크리디늄 에스테르와 강한 어덕트를 형성하였다.
신호 변경 리간드가 미결합 AE-표지된 프로브를 우선적으로 억제하는 능력를 측정하기 위해, 실시예 1에 설명한 방법을 사용하여 동등한 양의 미결합 및 결합 프로브 (AE-하이브리드)를 여러 농도의 각 신호 변경 리간드와 반응시켰다. 구별은 DA 비율을 계산함으로써 동력학적으로, 또는 평형상태에서 어덕트를 형성하지 않은 하이브리드와 프로브의 백분율을 계산함으로써 (% 하이브리드/% 프로브) 열역학적으로 측정하였다. 미결합 AE-프로브와 AE-하이브리드를 구별하지 않는 신호 변경 리간드는 DA 또는 (%하이브리드/%프로브) 비율로 1을 보이는 반면 실제로 미결합 및 결합 프로브에 존재하는 표지를 구별하는 것들은 이들 비율이 1을 넘었다.
하기 표 5에 요약된 것과 같이, 미결합 프로브에 존재하는 표지와 강한 어덕트를 형성한 화합물 거의 모두가 결합 프로브에 존재하는 표지보다 미결합 프로브에 존재하는 표지와 더 쉽게 어덕트를 형성하였다. 구별하지 못하는 화합물은 방향족 고리와 공액 상태에 있는 황원자(티오페놀, 5-메르캅토-1-메틸 테트라졸 또는 2-메르캅토이미다졸) 또는 니트릴기와 공액 상태에 있는 황원자 (티오시아네이트)를 함유하였다.
〈실시예 8: APA에 대한 서열의 효과〉
핵산의 서열에 대한 어덕트 형성 속도의 의존성을 조사하기 위해 DNA 프로브: 서열 확인 번호 1 (7/8 위치에서 AE로 표지), 서열 확인 번호 5 (16/17 위치에서 AE로 표지), 및 하기 서열 13을 상보적인 DNA 표적 (서열 확인 번호 2, 서열 확인 번호 6, 또는 하기 서열 14)에 혼성화시킨 다음 소듐 술파이트와 반응시켰다.
서열 확인 번호 13:
5'-
(*는 아크리디늄 에스테르 표지의 위치를 표시)
서열 확인 번호 14:
5'-
방법 A:
방법 A는 실시예 3에 설명된 대로 실행하였다.
방법 B:
방법 B는 다음과 같이 실행하였다:
혼성화
15 ㎕의 2X 혼성화 완충액에 1 pmol의 AE-표지된 프로브 (7 x 107RLU/pmol)와 4 pmol의 표적을 가하였다. 생성된 용액에 물을 넣어 30 ㎕로 조정하고, 60℃에서 30 분 동안 가열한 다음 1X 혼성화 완충액을 써서 500 ㎕로 희석하였다.
어덕트 보호
12 x 75 mm 튜브 (Sarstedt)에 2 ㎕의 AE-표지된 프로브 또는 하이브리드 (400,000 RLU)를 가하였다. 이 용액에 100 ㎕의 어덕트 형성 완충액 (10 mM 소듐 술파이트, 30 mM 보레이트 완충액 (pH 8.7), 1.5% Triton TX100)을 가하였다. 그 다음 용액을 보텍싱하고 실온에 여러 가지 시간 동안 정치하였다. 그 결과 얻어진 용액에 Detect I 주입에 이어 0.5-2 초 뒤에 Detect II를 주입하여 화학발광을 측정하였다. 빛 방출을 5 초 구간을 통해 적분하였다.
결과
상기 실험의 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
세 가지 상이한 AE-표지된 프로브 서열과 그의 대응 하이브리드는 소듐 술파이트와 서로 다른 정도로 반응하였다. 서열 확인 번호 5의 프로브는 서열 확인 번호 1의 것보다 느리게 반응하고, 서열 확인 번호 1은 서열 확인 번호 13의 프로브보다 더 느리게 반응한다. 이와 같이, 어덕트 형성 속도는 AE-표지된 프로브의 서열과 대응 하이브리드의 서열에 영향을 받는다.
하기 청구의 범위 내에는 다른 실시태양들이 있다. 따라서, 몇 가지 실시태양을 보이고 설명하였지만 본 발명의 취지와 범위를 벗어나지 않고도 여러 가지 수정을 가할 수 있다.
〈서열표〉
(1) 일반적 정보 :
(i) 출원인: 젠-프로브 인코포레이티드
미국 92121 캘리포니아주 샌디에고 캠퍼스 포인트 드라이브 9880
(ii) 발명의 명칭: 어덕트 보호 검사법
(iii) 서열수: 14
(iv) 통신 주소:
(A) 수신인: 라이언 앤드 라이언
(B) 거리: 웨스트 피프스 스트리트 633 수이트 4700
(C) 도시: 로스 앤젤레스
(D) 주: 캘리포니아
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호: 90071-2066
(v) 컴퓨터 판독 형태
(A) 매체 유형: 3.5" 디스켓, 1.44 메가바이트 저장
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형
(C) 작동 시스템: IBM P. C.P DOS 5.0
(D) 소프트웨어: 워드 퍼펙트 5.1
(vi) 국제 출원 정보
(A) 출원 번호: PCT/US 96/07776
(B) 출원 일자: 1996. 05.23
(vii) 우선권 출원 정보
(A) 출원 번호: U. S. 08/478,221
(B) 출원 일자: 1995. 06.07
(vii) 위임장/ 대리인 정보
(A) 성명: 허버, 셀던 오.
(B) 접수 번호: 38,179
(C) 참고 번호: 209/190-PCT
(ix) 통신 정보
(H) 전화 번호: (213) 489-1600
(H) 팩스: (213) 955-0440
(I) 텔렉스: 67-3510
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 핵산
(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 1
(2) 서열 2에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 핵산
(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 2
(2) 서열 3에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 33 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 핵산
(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 3
(2) 서열 4에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 33 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 핵산
(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 4
(2) 서열 5에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 핵산
(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 5
(2) 서열 6에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 핵산
(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 6
(2) 서열 7에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 핵산
(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 7
(2) 서열 8에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 핵산
(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 8
(2) 서열 9에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 핵산
(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 9
(2) 서열 10에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 핵산
(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 10
(2) 서열 11에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 핵산
(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 11
(2) 서열 12에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 핵산
(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 12
(2) 서열 13에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 핵산
(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 13
(2) 서열 14에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 핵산
(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 14

Claims (36)

  1. (a) 분석물 결합 영역과 표지로 이루어진 표지된 결합 상대에 시료를 노출시키는데, 상기 표지로부터의 신호 발생은 상기 표지된 결합 상대가 상기 분석물에 결합하고 있을 때에는 신호 변경 리간드에 의한 변경으로부터 우선적으로 보호되는 단계,
    (b) 상기 결합 상대에 노출된 상기 시료를 상기 리간드로 처리하는 단계, 및
    (c) 변경되지 않은, 표지에서 발생한 신호를 검출하는 단계
    로 이루어지는, 시료 중의 분석물을 검사하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 결합 상대가 핵산 프로브이고 상기 분석물이 표적 핵산 서열인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 검사가 상기 분석물에 결합한 결합 상대를 상기 분석물에 결합하지 않은 결합 상대로부터 분리하지 않은 채로 수행되는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계에 앞서 상기 분석물에 결합한 결합 상대를 상기 분석물에 결합하지 않은 결합 상대로부터 분리하는 단계를 더 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (b) 및 (c) 단계를 실질적으로 일정한 온도에서 실시하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 검사를 대략 실온에서 실시하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 빛 흡수도를 검출하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 빛 방출을 검출하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 리간드가 자유 전자쌍을 가진 황 원자, 자유 전자쌍을 가진 텔루르 원자, 또는 자유 전자쌍을 가진 비소 원자 중 하나를 함유하며, 상기 황원자, 상기 텔루르 원자 또는 상기 비소 원자가 방향족 고리 또는 니트릴과 공액 상태가 아닌 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 리간드가 테트라히드로티오펜, 프로판티올, 벤질메르캅탄, 술파이트, 글리콜 술파이트, 히드로술파이트, 메타비술파이트, 티오술페이트, 티오포스페이트, 메타아스나이트, 텔루라이트, 아스나이트 및 티오시아네이트로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 리간드가 자유 전자쌍을 가진 황 원자, 자유 전자쌍을 가진 텔루르 원자, 또는 자유 전자쌍을 가진 비소 원자 중 하나를 함유하며, 상기 황원자, 상기 텔루르 원자 또는 상기 비소 원자가 방향족 고리 또는 니트릴과 공액 상태가 아닌 방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 리간드가 테트라히드로티오펜, 프로판티올, 벤질메르캅탄, 술파이트, 글리콜 술파이트, 히드로술파이트, 메타비술파이트, 티오술페이트, 티오포스페이트, 메타아스나이트, 텔루라이트, 아스나이트 및 티오시아네이트로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 표지가 하기 화학식 1의 구조를 갖는 방법.
    화학식 1
    식 중,
    아릴 고리계는 1 내지 4 개의 고리형 기를 함유하며 이들 기 중 하나가 연결 탄소 “C에 연결되어 있고,
    R2는 S, O 및 NH로 이루어진 군에서 선택되고,
    R3는 O, N, S, 할로겐, 치환 인, 치환 황, 치환 붕소 및 치환 비소로 이루어진 군에서 선택되고,
    R4는 알킬, 알케닐, 아릴, 알콕시, 아릴옥시로 이루어진 군에서 선택되거나, R3가 할로겐일 때에는 존재하지 않고,
    R5는 R3가 N이 아닌 한 없고, R3가 N이면 R5는 수소, 알킬, 알케닐, 아릴, 알콕시 및 아릴옥시로 이루어진 군에서 선택된다.
  14. 제13항에 있어서, 상기 아릴계가 양전하를 띠고 있는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 아릴 고리계가 1 내지 4 개의 고리형 기를 함유하며, 상기 R3가 O, N 및 S로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 R4는 아릴이고, 상기 R5는 없는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 표지가 다음 화학식 2의 구조를 갖는 방법.
    화학식 2
    식 중,
    R1은 H, 알킬, 알케닐, 알키닐 및 아릴로 이루어진 군에서 선택되고,
    n은 0, 1, 2, 3 또는 4이고,
    m은 0, 1, 2, 3 또는 4이고,
    각각의 X는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아미노, 치환 아미노, 카르복시, 히드록시, 알콕시, 니트로, 술포닐, 할로겐, 티올, 아미도, 아세틸, 치환 아세틸 및 아릴옥시로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되고,
    각각의 Y는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아미노, 치환 아미노, 카르복시, 히드록시, 알콕시, 니트로, 술포닐, 할로겐, 티올, 아미도, 아세틸, 치환 아세틸 및 아릴옥시로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된다.
  17. 제16항에 있어서, 상기 n이 0, 1 또는 2이고, 상기 m이 0, 1 또는 2이고, 상기 R3가 O이고, 상기 R4가 아릴이고, 상기 R5가 없는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 각각의 상기 X가 독립적으로 알킬 또는 알콕시이고, 각각의 상기 Y가 독립적으로 알킬 또는 알콕시이며, 상기 R4가 치환 또는 미치환 페닐인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 R4가 오르토-메틸-신나메이트-페닐, 오르토-디메틸-페닐, 오르토-디브로모-페닐 및 미치환 페닐로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  20. (a) 표적 영역에 결합할 수 있는 핵산 서열을 가진 올리고뉴클레오티드와 표지로 이루어진 핵산 프로브에 시료를 노출시키는데, 상기 표지로부터의 신호 발생은 상기 표지가 상기 표적 영역에 결합한 프로브 상에 존재할 때에는 신호 변경 리간드에 의한 변경으로부터 우선적으로 보호되는 단계,
    (b) 상기 프로브에 노출된 상기 시료를 상기 리간드로 처리하는 단계, 및
    (c) 변경되지 않은, 표지에서 발생한 신호를 검출하는 단계
    로 이루어지는, 시료 중의 핵산 표적 영역을 검사하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 표적이 RNA인 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 검사가 상기 분석물에 결합한 프로브를 상기 분석물에 결합하지 않은 프로브로부터 분리하지 않은 채로 수행되는 방법.
  23. 제20항에 있어서, 상기 (c) 단계에 앞서 분석물에 결합한 프로브를 분석물에 결합하지 않은 프로브로부터 분리하는 단계를 더 포함하는 방법.
  24. 제20항에 있어서, 상기 (b) 및 (c) 단계를 실질적으로 일정한 온도에서 실시하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 검사를 대략 실온에서 실시하는 방법.
  26. 제20항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 빛 흡수도를 검출하는 방법.
  27. 제20항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 빛 방출을 검출하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 표지가 하기 화학식 1의 구조를 갖는 방법.
    화학식 1
    식 중,
    아릴 고리계는 1 내지 4 개의 고리형 기를 함유하며 이들 기 중 하나는 연결 탄소 “C에 연결되어 있는 아릴이고,
    R2는 S, O 및 NH로 이루어진 군에서 선택되고,
    R3는 O, N, S, 할로겐, 치환 인, 치환 황, 치환 붕소 및 치환 비소로 이루어진 군에서 선택되고,
    R4는 알킬, 알케닐, 아릴, 알콕시 및 아릴옥시로 이루어진 군에서 선택되거나, R3가 할로겐일 때에는 존재하지 않고,
    R5는 R3가 N이 아닌 한 없고, R3가 N이면 R5는 수소, 알킬, 알케닐, 아릴, 알콕시 및 아릴옥시로 이루어진 군에서 선택된다.
  29. 제28항에 있어서, 상기 아릴계가 양전하를 띠고 있는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 아릴 고리계가 1 내지 4 개의 고리형 기를 함유하며, 상기 R3가 O, N 및 S로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 R4는 아릴이고, 상기 R5는 없는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 표지가 다음 화학식 2의 구조를 갖는 방법.
    화학식 2
    식 중,
    R1은 H, 알킬, 알케닐, 알키닐 및 아릴로 이루어진 군에서 선택되고,
    n은 0, 1, 2, 3 또는 4이고,
    m은 0, 1, 2, 3 또는 4이고,
    각각의 X는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아미노, 치환 아미노, 카르복시, 히드록시, 알콕시, 니트로, 술포닐, 할로겐, 티올, 아미도, 아세틸, 치환 아세틸 및 아릴옥시로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되고,
    각각의 Y는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아미노, 치환 아미노, 카르복시, 히드록시, 알콕시, 니트로, 술포닐, 할로겐, 티올, 아미도, 아세틸, 치환 아세틸 및 아릴옥시로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된다.
  32. 제31항에 있어서, 상기 n이 0, 1 또는 2이고, 상기 m이 0, 1 또는 2이고, 상기 R3가 O이고, 상기 R4가 아릴이고, 상기 R5가 없는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 각각의 상기 X가 독립적으로 알킬 또는 알콕시이고, 각각의 상기 Y가 독립적으로 알킬 또는 알콕시이며, 상기 R4가 치환 또는 미치환 페닐인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 R4가 오르토-메틸-신나메이트-페닐, 오르토-디메틸-페닐, 오르토-디브로모-페닐 및 미치환 페닐로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  35. 제20항에 있어서, 상기 리간드가 테트라히드로티오펜, 프로판티올, 벤질메르캅탄, 술파이트, 글리콜 술파이트, 히드로술파이트, 메타비술파이트, 티오술페이트, 티오포스페이트, 메타아스나이트, 텔루라이트, 아스나이트 및 티오시아네이트로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  36. 제20항에 있어서, 상기 리간드가 자유 전자쌍을 가진 황 원자, 자유 전자쌍을 가진 텔루르 원자, 또는 자유 전자쌍을 가진 비소 원자 중 하나를 함유하며, 상기 황원자, 상기 텔루르 원자 또는 상기 비소 원자가 방향족 고리 또는 니트릴과 공액 상태가 아닌 방법.
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