ITTO940177A1 - Procedimento per la determinazione di biomolecole mediante un sistema di amplificazione enzimatica. - Google Patents
Procedimento per la determinazione di biomolecole mediante un sistema di amplificazione enzimatica. Download PDFInfo
- Publication number
- ITTO940177A1 ITTO940177A1 IT94TO000177A ITTO940177A ITTO940177A1 IT TO940177 A1 ITTO940177 A1 IT TO940177A1 IT 94TO000177 A IT94TO000177 A IT 94TO000177A IT TO940177 A ITTO940177 A IT TO940177A IT TO940177 A1 ITTO940177 A1 IT TO940177A1
- Authority
- IT
- Italy
- Prior art keywords
- biomolecule
- enzyme
- process according
- group
- biomolecules
- Prior art date
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 26
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 17
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims abstract description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 12
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 8
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 8
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 4
- JCXJVPUVTGWSNB-UHFFFAOYSA-N Nitrogen dioxide Chemical compound O=[N]=O JCXJVPUVTGWSNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 3
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 3
- -1 mono-substituted phenyl Chemical group 0.000 claims description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 3
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000000229 (C1-C4)alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229910006069 SO3H Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 claims description 2
- RJSYPKWVIJGNLO-UHFFFAOYSA-N CCOClOC Chemical compound CCOClOC RJSYPKWVIJGNLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 claims 1
- 238000006056 electrooxidation reaction Methods 0.000 claims 1
- CPRRHERYRRXBRZ-SRVKXCTJSA-N methyl n-[(2s)-1-[[(2s)-1-hydroxy-3-[(3s)-2-oxopyrrolidin-3-yl]propan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]carbamate Chemical compound COC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CO)C[C@@H]1CCNC1=O CPRRHERYRRXBRZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 abstract description 21
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 abstract description 8
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 abstract description 8
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 abstract description 4
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 abstract description 4
- XDIYNQZUNSSENW-UUBOPVPUSA-N (2R,3S,4R,5R)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O XDIYNQZUNSSENW-UUBOPVPUSA-N 0.000 abstract description 2
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 abstract description 2
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 abstract description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004082 amperometric method Methods 0.000 abstract 1
- 150000004053 quinones Chemical class 0.000 abstract 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 4
- XKZQKPRCPNGNFR-UHFFFAOYSA-N 2-(3-hydroxyphenyl)phenol Chemical compound OC1=CC=CC(C=2C(=CC=CC=2)O)=C1 XKZQKPRCPNGNFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 230000005518 electrochemistry Effects 0.000 description 2
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- XHXFXVLFKHQFAL-UHFFFAOYSA-N phosphoryl trichloride Chemical compound ClP(Cl)(Cl)=O XHXFXVLFKHQFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- HZRLBXXCBSUKSG-UHFFFAOYSA-N (2-hydroxyphenyl) dihydrogen phosphate Chemical compound OC1=CC=CC=C1OP(O)(O)=O HZRLBXXCBSUKSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- PASDCCFISLVPSO-UHFFFAOYSA-N benzoyl chloride Chemical compound ClC(=O)C1=CC=CC=C1 PASDCCFISLVPSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003575 carbonaceous material Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- GTKRFUAGOKINCA-UHFFFAOYSA-M chlorosilver;silver Chemical compound [Ag].[Ag]Cl GTKRFUAGOKINCA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ZOMNIUBKTOKEHS-UHFFFAOYSA-L dimercury dichloride Chemical class Cl[Hg][Hg]Cl ZOMNIUBKTOKEHS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010439 graphite Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Biomolecole come anticorpi, antigeni, DNA possono essere misurate a concentrazioni particolarmente basse per via amperometrica mediante l'impiego di un enzima marker quale la fosfatasi alcalina in congiunzione con una nuova classe di substrati para- o orto-idrossiarilfostati di formula generale: (FORMULA I) in cui Ar è fenile o naftile eventualmente sostituito, che per ossidazione elettrodica danno origine a chinoni. Questo sistema può essere utilizzato in congiunzione ad un secondo sistema enzimatico di amplificazione costituito dall'elettrodo di misura stesso e dal sistema glucosio - glucosio ossidasi permettendo di abbassare i limiti di sensibilità delle misurazioni di biomolecole oppure di ridurre sensibilmente i tempi per la determinazione.
Description
DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "Procedimento per la determinazione di biomolecole mediante un sistema di amplificazione enzimatica”
La presente invenzione si riferisce ad un procedimento per la determinazione della presenza o concentrazione di biomolecole in un campione, quale ad esempio antìcorpi, antigeni, acidi nucleici o in genere molecole aventi attività biologica, mediante un sistema di amplificazione enzimatica utilizzante un enzima idrolitico come marker.
E' noto che enzimi vengono usati come sonde per marcare molecole di cui si vuole determinare la concentrazione in un determinato campione. La fosfatasi alcalina è uno dei marker più utilizzati nelle misure di immuno saggio o in altri campi della diagnostica clinica, ad esempio come marker di sonde del DNA. I metodi noti per la rivelazione delle biomolecole marcate con fosfatasi comprendono l'incubazione della biomolecola marcata con un substrato idrolizzabile dall'enzima e la rivelazione per via amperometrica del prodotto di reazione idrolitica.
Per la determinazione dell'attività della fosfatasi alcalina sono stati riportati differenti tipi di substrato quali p-nitrofenilfosfato e p-amminof enilfosfato. La sostituzione in questi substrati del gruppo fosfato con un gruppo OH a carattere fenolico, operata dalla fosfatasi alcalina varia le caratteristiche del composto utilizzato come substrato e permette la rivelazione per via amperometrica del prodotto di reazione. In questo modo, mediante la misura del fenolo formato nella reazione si può determinare la concentrazione o l’attività della fosfatasi alcalina. Per aumentare la sensibilità del metodo, è stata sintetizzata e testata una gran varietà di substrati, come illustrato dai seguenti riferimenti bibliografici:
a) H.T.Tang, C.E. Lunte, H.B.Halsall, W.R.Heineman, Ana1.Chim.Acta 214 (1988), 187-195;
b) .i.Kulys, v.Razumas e Malinauskas J., Electroanal.Chem., 116 (1989) 11;
c) O.Kulys, V.Razumas e Malinauskas,Anal.Chim.Acta 117 (1980) 387;
d) R.Q.Thompson , Anal.Chim.Acta 271 (1993) 223I problemi che si vogliono risolvere con la presente invenzione sono relativi all'abbassamento dei limiti di rivelazione nella determinazione di una serie di biomolecole, quali anticorpi, antigeni e acidi nucleici utilizzando un enzima marker con attività idrolitica di fosfatasi. Con il termine di "enzima con attività idrolitica di fosfatasi" si intendono comprendere tutti gli enzimi, quali in particolare la fosfatasi alcalina stessa, che sono in grado di operare la sostituzione del gruppo fosfato di un estere fosforico con un gruppo ossidrilico.
In vista di tale problema tecnico, lo scopo primario della presente invenzione è quello di fornire substrati di reazione per le biomolecole marcate con detti enzimi, che permettano la rivelazione della biomolecola marcata o di molecole con essa interagenti, a concentrazioni particolarmente basse in confronto a quelle misurabili con i substrati attualmente disponibili, oppure che permettano di abbassare i tempi di analisi necessari grazie all’azione di amplificazione del segnale generata dall'azione dell’enzima sui substrati stessi, in quanto l'abbassamento dei limiti di rivelazione permette di ridurre i tempi necessari per l’amplificazione.
In vista di tali scopi, costituisce oggetto dell’invenzione un procedimento per la determinazione della presenza o concentrazione di una biomolecola in un campione di prova, in cui detta biomolecola è marcata con un enzima avente attività idrolitica di fosfatasi o è compresa in un complesso formato da due o più biomolecole, almeno una delle quali è marcata con detto enzima e detta biomolecola o complesso è posto a contatto con un substrato idrolizzabile dall’enzima in condizioni atte a causare l’idrolisi ed in cui il prodotto di idrolisi è ossidato per via elettrochimica per misurare la corrente di ossidazione, caratterizzato dal fatto che come substrato si utilizza un composto di formula generale:
(I)
in cui Ar è fenile o naftile non sostituito o mono-, di- o tri-sostituito con radicali scelti indipendentemente uno dall'altro dal gruppo che consiste di C1-C4 alchile, C1-C4 alcossi, alogeno, nitro (N02), solfonico (S03H).
Composti preferiti nell’ambito dell’invenzione sono quelli in cui quando Ar è fenile, il gruppo ossidrile è in posizione orto o para rispetto al gruppo di estere fosforico e quando Ar è naftile, il gruppo ossidrile è in posizione 2 o 4 rispetto al gruppo fosforico.
Quando il sostituente o i sostituenti sul gruppo Ar sono alchile, alcossi o alogeno, essi sono preferibilmente scelti tra metile, etile, metossi, etossi e cloro. Particolarmente preferiti sono parae orto-idrossi-fenilfosfati non sostituti o mono-sostituiti con metile, etile, metossi, etossi, cloro, NO2 , S03H.
Gli esteri mono-fosforici di difenoli o dinaftoli di formula (I), sono preparati a partire dai corrispondenti difenoli o dinaftoli, previa protezione di uno dei gruppi ossidrile con un gruppo protettore, ad esempio con l'impiego di un composto come il benzoilcloruro in grado di reagire con il gruppo OH stesso. L'estere così prodotto viene posto a contatto con un prodotto fosforilante, ad esempio ossitricloruro di fosforo e quindi il derivato fosforilato viene trattato con una base, ad esempio ammoniaca, atta a rigenerare il gruppo fenolico inizialmente protetto.
In presenza di un enzima con attività idrolitica di fosfatasi, i composti di formula (I) sono soggetti a idrolisi con formazione dei corrispondenti difenoli o dinaftoli che hanno proprietà chimico-fisiche differenti da quelle del substrato enzimatico e che possono essere determinati per via elettrochimica su un elettrodo polarizzato ad un potenziale idoneo, essendo i difenoli o dinaftoli - formati nell’interazione con l’enzima - elettroattivi in un intervallo di potenziali (da -0,1050V a 1V, usando come riferimento l'elettrodo argento-argento cloruro) nettamente inferiori a quello di ossido-riduzione dei composti fosforilati di partenza, dando quindi luogo, a differenza del substrato di origine, ad una corrente elettrica misurabile.
Nel procedimento secondo l'invenzione, la concentrazione di biomolecole o molecole aventi attività biologica può essere determinata direttamente o indirettamente mediante la marcatura con un enzima come sopra specificato, ad esempio ricorrendo ai metodi tipici degli immuno saggi o a quelli dei saggi di ibridizzazione degli acidi nucleici, che permettono l’ottenimento di sequenze specifiche, mediante una reazione a catena utilizzante polimerasi.
Viene riportato nel seguito un esempio di applicazione del metodo sviluppato ai saggi di immuno assay utilizzanti antigeni o anticorpi specifici per varie biomolecole. In questi saggi, la fosfatasi alcalina, molecola marker, viene legata in modo covalente all’antigene o all'anticorpo. Dopo l’incubazione del sistema anticorpo-antigene,opportunamente immobilizzati e marcati, la formazione del legame specifico tra anticorpo ed antigene in presenza dell’analita da determinare e l'allontanamento delle molecole che non hanno interagito, il sistema viene posto a contatto con un eccesso del composto di formula (I) per un periodo di tempo che può variare da pochi secondi ad alcuni minuti.Al termine di questo secondo periodo di incubazione, si procede per via elettrochimica alla determinazione del difenolo o dinaftolo formato dall’azione catalitica dell’enzima marker, in particolare, si polarizza l'elettrodo di lavoro, costituito in genere da una superficie metallica (quale platino, oro) o da un materiale carbonaceo (quale grafite, pasta di carbone) ad un potenziale di lavoro compreso tra -0,15V e 1V rispetto ad un elettrodo a calomelano saturo (elettrodo di riferimento) e si misura la corrente di ossidazione.
in questo stadio è preferibile l'aggiunta di un secondo sistema enzimatico di amplificazione alla celia elettrochimica, ad esempio costituito da glucosio ossidasi-glucosio che utilizzando il chinone formatosi all’elettrodo come ossidante del sistema enzimatico glucosio ossidasi-glucosio permette un ulteriore aumento della corrente e quindi un abbassamento del limite di rivelazione della biomolecola a cui l'enzima è coniugato. L’aumento di corrente ottenuta dovuta aldifenolo o dinaftolo generatonel periodo di incubazione e successivamente mediante l'azione amplificante del sistema elettrodo-glucosio-glucosio ossidasipermettedicalcolare la quantità di biomolecole marcate con l'enzima e quindi quella dell'analita.In questomodo,è possibile determinarequantitàparticolarmentebasse,anche dell'ordine delle attomole, dell'analita.
Esempio
Al sistema costituitoda un anticorpo,specifico per un epitopo dell’α-fetoproteina (analita) immobilizzato sulla superficie di un pozzetto, viene aggiunto un campione di 0,1 mi di plasma umano contenente l'analita a concentrazione 5ng/ml ed un eccesso diun secondo anticorpo specifico per un altro epitopodell'α-fetoproteina.Questosecondoanticorpo è legato in maniera covalente all'enzima marker (coniugato), cioè alla fosfatasi alcalina.Dopo un periodo di incubazione di un’ora, l’eccesso di coniugatoè allontanato mediante lavaggio.Nelpozzetto si aggiunge 0,1 mi di una soluzione 1 mM di pidrossifenilfosfato tamponata a pH 9,5 con borato 20 mM. Dopo un periodo di incubazione di un minuto, aliquote di 10 μΐ della soluzione di incubazione vengono aggiunte nella cella elettrochimica che contiene il secondo sistema di amplificazione glucosioglucosio ossidasi costituito da 1 mi di una soluzione contenente 0,1 M glucosio e 0,5 mg di glucosio ossidasi, tamponati a pH 7 con fosfato 0,1 M. L'aumento di corrente ottenuta, dovuta al difenolo generato nel secondo periodo di incubazione e mediante l'azione amplificante del sistema elettrodo-glucosio-glucosio ossidasi è stato di 0,95 ± 0,10 nA per ogni aggiunta di 10 μl della soluzione di incubazione nella cella di misura elettrochimica.
Rientra cosi nell’ambito dell’invenzione l’impiego di composti di formula generale (I) nella misura dell'attività di enzimi con attività idrolitica di fosfatasi, utilizzati come marker di biomolecole nelle determinazioni della concentrazione di queste molecole o di quella di molecole con esse interagenti, ad esempio in saggi immunologici, saggi di amplificazione utilizzanti la reazione a catena delle poiimerasi.
Rientrano altresì nell'ambito dell'invenzione corredi diagnostici (kit), per saggi immunologici o saggi di amplificazione comprendenti una quantità efficace di un substrato comprendente un composto di formula generale (I).
Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la determinazione della presenza o concentrazione di una biomolecola in un campione di prova, in cui detta biomolecola è marcata con un enzima avente attività idrolitica di fosfatasi o è compresa in un complesso formato da due o più biomolecole, almeno una delle quali è marcata con detto enzima g detta biomolecola o complesso è posto a contatto con un substrato idroliz2abile dall’enzima in condizioni atte a causarne l'idrolisi, caratterizzato dal fatto che come substrato si utilizza un mezzo comprendente un composto di formula generale: (I) in cui Ar è fenile o naftile non sostituito o mono-, di- o tri-sostituito con radicali scelti indipendentemente l'uno dall’altro tra C1-C4 alchile, C1-C4 alcossi, alogeno, N02 , SO3Η.
- 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui Ar è fenile non sostituito o sostituito ed in cui il gruppo ossidrile è in posizione orto o para rispetto al gruppo fosforico.
- 3. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui Ar è naftile non sostituito o sostituito ed in cui il gruppo ossidrile è in posizione 2 o 4 rispetto al gruppo fosforico.
- 4. Procedimento secondo la rivendicazione 2, in cui Ar è fenile non sostituito o mono-sostituito con un radicale scelto dal gruppo che consiste di metile, etile, metossi, etossi, cloro, N02 , S03H.
- 5. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il prodotto di reazione idrolitica enzimatica è ossidato per via elettrochimica ad un potenziale più basso del potenziale di ossidazione del substrato di partenza, con misurazione della corrente di ossidazione.
- 6. Procedimento secondo la rivendicazione 5, in cui la reazione di ossidazione elettrochimica è effettuata in presenza di un sistema enzimatico di amplificazione comprendente glucosio ossidasi-glucosio.
- 7. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui detta biomolecola è scelta dal gruppo che consiste di antigeni, anticorpi e acidi nucleici.
- 8. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6, in cui detta biomolecola è un complesso anticorpo-antigene.
- 9. Corredo per immuno saggio o per saggio di amplificazione comprendente una quantità efficace di un composto di formula generale (I) come definito nella rivendicazione 1.
- 10. Impiego di un composto di formula generale (I), come definito nelle rivendicazioni 1 a 4, nella misura dell'attività di un enzima fosfatasi,utilizzato come marker di biomolecole nella determinazione della concentrazione di tale molecola o di quella di molecole con essa interagenti.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT94TO000177A IT1267410B1 (it) | 1994-03-11 | 1994-03-11 | Procedimento per la determinazione di biomolecole mediante un sistema di amplificazione enzimatica. |
| DE69518995T DE69518995T2 (de) | 1994-03-11 | 1995-03-07 | Ein Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen mit Hilfe eines enzymatischen Amplifizierungssystems |
| ES95103225T ES2152337T3 (es) | 1994-03-11 | 1995-03-07 | Metodo para detectar biomoleculas por medio de un sistema de amplificacion enzimatica. |
| EP95103225A EP0671625B1 (en) | 1994-03-11 | 1995-03-07 | A process for detecting biomolecules by means of an enzymatic amplification system |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT94TO000177A IT1267410B1 (it) | 1994-03-11 | 1994-03-11 | Procedimento per la determinazione di biomolecole mediante un sistema di amplificazione enzimatica. |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ITTO940177A0 ITTO940177A0 (it) | 1994-03-11 |
| ITTO940177A1 true ITTO940177A1 (it) | 1995-09-11 |
| IT1267410B1 IT1267410B1 (it) | 1997-02-05 |
Family
ID=11412296
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| IT94TO000177A IT1267410B1 (it) | 1994-03-11 | 1994-03-11 | Procedimento per la determinazione di biomolecole mediante un sistema di amplificazione enzimatica. |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0671625B1 (it) |
| DE (1) | DE69518995T2 (it) |
| ES (1) | ES2152337T3 (it) |
| IT (1) | IT1267410B1 (it) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2805545B1 (fr) * | 2000-02-24 | 2002-05-17 | Argene Sa | Procede electrochimique de detection d'acides nucleiques |
| DE102018200262A1 (de) | 2018-01-10 | 2019-07-11 | Robert Bosch Gmbh | Biomolekulares Detektionsverfahren |
-
1994
- 1994-03-11 IT IT94TO000177A patent/IT1267410B1/it active IP Right Grant
-
1995
- 1995-03-07 EP EP95103225A patent/EP0671625B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-07 ES ES95103225T patent/ES2152337T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-07 DE DE69518995T patent/DE69518995T2/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0671625A1 (en) | 1995-09-13 |
| DE69518995D1 (de) | 2000-11-09 |
| EP0671625B1 (en) | 2000-10-04 |
| ITTO940177A0 (it) | 1994-03-11 |
| ES2152337T3 (es) | 2001-02-01 |
| IT1267410B1 (it) | 1997-02-05 |
| DE69518995T2 (de) | 2001-03-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4830959A (en) | Electrochemical enzymic assay procedures | |
| US5731148A (en) | Adduct protection assay | |
| EP0871887B1 (en) | Electrochemiluminescent enzyme immunoassay | |
| EP0125139A2 (en) | Assay techniques utilising specific binding agents | |
| CA2248893A1 (en) | Graphitic nanotubes in luminescence assays | |
| Qi et al. | Amplified fluorescence detection of mercury (II) ions (Hg 2+) using target-induced DNAzyme cascade with catalytic and molecular beacons | |
| WO1996041197A9 (en) | Adduct protection assay | |
| JPH0137693B2 (it) | ||
| US8389298B2 (en) | Methods using novel chemiluminescent labels | |
| KR20010062757A (ko) | 화학발광 분석법 | |
| Frew et al. | Measurement of alkaline phosphatase activity by electrochemical detection of phosphate esters: Application to amperometric enzyme immunoassay | |
| WO1998038332A1 (en) | Detection of microbial metabolites | |
| ITTO940177A1 (it) | Procedimento per la determinazione di biomolecole mediante un sistema di amplificazione enzimatica. | |
| Kelso et al. | Electrochemical detection of secreted alkaline phosphatase: Implications to cell based assays | |
| Kricka et al. | Chemiluminescent assay of enzymes using proenhancers and pro‐anti‐enhancers | |
| Li et al. | Sensitive fluorometric detection of alkaline phosphatase using a water-soluble conjugated polymer | |
| JP4371393B2 (ja) | アクリダンアルケンからの化学ルミネセンスの新規な非酵素的発生方法 | |
| ITTO940176A1 (it) | Substrati per la determinazione per via amperometrica dell'attivita' di un enzima avente attivta' idrolitica sugli esteri fosforici e loro impiego per tale determinazione. | |
| EP1322670B1 (en) | Electrochemiluminescence from acridan compounds | |
| EP0759171B1 (en) | Paracetamol phosphate for immunoassays | |
| EP0292169B1 (en) | Substrates for B-galactosidase | |
| Kessler | General aspects of nonradioactive labeling and detection | |
| Green et al. | Electrometric immunoassay | |
| US20070059841A1 (en) | Electrochemiluminescence from acridan compounds | |
| CH | CI NN NIN |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 0001 | Granted | ||
| TA | Fee payment date (situation as of event date), data collected since 19931001 |
Effective date: 19990331 |