JP4371393B2 - アクリダンアルケンからの化学ルミネセンスの新規な非酵素的発生方法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、市場で容易に入手しうる安価な試薬を用いた単純な化学的方法により、電子過剰(リッチ)アルケンから化学ルミネセンスを速やかに発生させるための新規な方法に関する。本発明は、また、化学ルミネセンス標識化合物、化学ルミネセンス標識化化合物の製造におけるその使用、および、検定方法における該標識化化合物の使用に関する。本発明は、さらに、特には電気泳動ゲル内における、アナライトの検出および化学ルミネセンス標識化アナライトの検出のための検定方法に関する。この方法は、免疫検定、核酸プローブ検定等において有用である。
【0002】
従来技術
アナライトの化学ルミネセンス検出は、生物医学的分析、食物試験、病原同定、法廷調査および環境汚染物スクリーニング等の多くの分野で重要性を増してきていると考えられる。化学ルミネセンスの終点を試験または検定に取り入れるという手段により、種々の形態、例えば、酵素標識のための化学ルミネセンス物質や、ミセル、リポソームまたはラテックス粒子のような構造内に、若しくは、標識としての化学発光化合物を用いることにより保護された化学ルミネセンス化合物、が得られる。これらの目的のために、多数の化合物が考案されてきている(R.Handley,H.Akhavan−Tafti,A.P.Schaap,J.Clin.Ligand Assay,20(4)302−312(1997))。小さな分子で検出すべき種を標識するために化学ルミネセンス化合物を使用することには、多数の標識を付与し、かつ、すばやく化学ルミネセンスを発生させるという能力のために、興味が集まっている。それにもかかわらず、全ての用途において優秀であることが証明されている単一の標識および検出構成はない。
【0003】
化学ルミネセンス標識 ルミノール、イソルミノールおよび関連の環式ジアシルヒドラジドは、結合置換基を含むようその構造を変成させることにより直接標識として適合せられた最初の化学ルミネセンス化合物である。不十分な光の発生が検出感度を制限するため、それらの使用は、多くの用途に対して満足なものではない。0.1〜1%の低い化学ルミネセンス量子効率、および、全てのフォトンを放射するための数分程度の時間は、瞬間的な光強度を減ずる。
【0004】
アクリジニウムエステルおよびアクリジニウムスルホンアミドは、化学ルミネセンス免疫検定において広範囲に用いられている(例えば、米国特許5,656,500号明細書、米国特許5,521,103号明細書、およびこれらの中に列挙された参考文献を参照)。これらの標識の主な利点は、代表的に1〜2秒の短時間の放射とともに、化学ルミネセンスの高い収率(約10%)である。かかる短いフラッシュにおける光エネルギーの開放により、高い光強度が生成する。しかしながら、これらの標識の使用は、ある一定の重大な不利益を有する。アクリジニウムエステルおよび極少量のスルホンアミドは、加水分解がアルカリ性pHで促進されており、非ルミネセンス性カルボン酸にまで加水分解するという傾向がある。環の9−位置における水の作用に起因する疑似塩基形態というよく知られた問題は、アクリジニウム環の再生成への独立した反応段階を必要とする。
【0005】
ルテニウムまたはオスミウム含有複合体は、犠牲アミン電子供与体の存在下で電気化学的に酸化されたときに化学ルミネセンスを発生させる。この反応は、電気化学的な工程と光検出工程とを同時に行うために、より高価で複雑な装置を必要とする。
【0006】
酵素および光タンパク質であるエクオリン等の多くの巨大分子が標識として用いられているが、一方、これらの使用には、ターゲット種に対し結合しうる標識の数を制限し、また、担体および表面上に非特異的に付着する傾向を有する、という不利益がある。
【0007】
検定分野の最終目標として残されていることは、水溶性の小さな分子であり、高い化学ルミネセンス効率を有し、単純な化学活性試薬による反応中ですばやく光を放射し、長期貯蔵において安定であり、かつ、副反応を受けない化学ルミネセンス標識化合物を開発することである。本発明は、かかる化合物を提供するものである。
【0008】
標識の手法 有機および生物学的分子に対する化学結合標識のための幅広い多様な手法については、文献中に記載されている(例えば、L.J.Kricka, リガンド−バインダー検定、Marcel Dekker,Inc.,New York,1985,pp.15−51およびM.Z.Atassi,「タンパク質の化学変成および開裂」タンパク質の免疫化学、第1章、Vol.1,Plenum Press,New York 1977,pp.1−161、および、これらの中に記載された参考文献を参照)。抗体およびタンパク質は、タンパク質中に存在するある一定の求核性基(−SH,−OH.−NH2,−COOH)と化学的に活性な基との反応によって都合よく標識される。適切に官能化された(functionalized)核酸およびDNAプローブもまた、標識上の対応する反応基と反応することによって標識されうる。標識されうる多くの他のタイプの分子としては、抗体、酵素、タンパク質抗原、ペプチド、ハプテン、ステロイド、炭水化物、脂肪酸、ホルモン、ヌクレオシドおよびヌクレオチド等がある。
【0009】
ゲル中の化学ルミネセンス検出 化学ルミネセンス基質を用いたゲル中の酵素アルカリホスファターゼの検出方法については、文献中に記載がある(N.Theodosiou,C.Chalot,C.Ziomek,BioTechniques,13(6),898−901(1992))。本出願人は、ゲル中における化学ルミネセンス標識化化合物の電気泳動分離および化学ルミネセンス検出についての報告は全く知らない。
【0010】
発明の概要
本発明の目的は、市場で容易に入手しうる安価な試薬を用いた単純な化学的方法により、化学ルミネセンス化合物から化学ルミネセンスを発生させるための方法を提供することにある。
【0011】
また、本発明の他の目的は、単純な化学ルミネセンス反応を用いた検定方法を提供することにある。
【0012】
本発明のさらに他の目的は、化学ルミネセンス標識化化合物(標識された化合物)の製造のための標識化合物を提供することにある。
【0013】
本発明のさらに他の目的は、化学ルミネセンス標識化化合物を提供することにある。
【0014】
本発明の目的は、下記式I(式中、Z1およびZ2は、窒素原子、酸素原子および硫黄原子から相互に無関係に選択される)で表される標識化合物を提供することにもある。
【0015】
本発明のさらに他の目的は、化学ルミネセンス標識それ自体、または、化学ルミネセンス標識化化合物から化学ルミネセンスを発生させるための方法を提供することにある。
【0016】
本発明のさらに他の目的は、検出のための化学ルミネセンス標識化化合物を提供すること、それをゲル中で電気泳動分離に供すること、および、それをゲル中において直接化学ルミネセンス反応により検出すること、による、ゲル中のアナライトの検出方法を提供することにある。
【0017】
本発明のさらにまた他の目的は、化学ルミネセンス標識化化合物を用いた化学ルミネセンス検定方法を提供することにある。代表的な検定には、免疫検定、核酸ハイブリッド形成検定、他のリガンド−バインダー検定、食品、環境および工業サンプル中のアナライトの検出等がある。
【0018】
一般的記述
現代の生物医学的分析は、サンプル中における低発生量のアナライトのためかまたは限定されたサンプル量のために、ごく少量の化合物を検出する能力を必要とする。加えて、非常に広範囲の濃度にわたって精確に化合物の量を検出することが可能でなければならない。化学ルミネセンス標識化合物およびその方法がこれらのタイプの分析に好適であることは、本明細書中で明らかにされる。
【0019】
本発明は、一般に、化学ルミネセンスの発生方法およびこれらの方法において使用する化合物に関する。このような方法には、アクリダンアルケンおよび市場で容易に入手しうる単純で安価な試薬が用いられ、これらから化学ルミネセンスが発生する。光発生反応は、検定、信号法、緊急照明および新案物の分析的方法等の、多くの技術的に認められた目的のために用いることができる。
【0020】
本発明は、また、検定を行う目的のために、化学結合により、または、物理的な相互作用を通じて有機および生物学的分子と結合しうる化学ルミネセンス標識化合物に関する。ここに記載する方法によれば、本発明の化学ルミネセンス化合物の反応は、可視光としての化学ルミネセンスを発生する。得られた化学ルミネセンスの強度は、化学ルミネセンス標識の、それゆえに、標識化化合物の量の直接的な基準を与える。
【0021】
本発明は、さらに、生物学的分子の分離において用いられるタイプの電気泳動ゲル中での化学ルミネセンス標識化化合物の検出方法に関する。本発明の化学ルミネセンス標識化化合物は、ゲルに対して適用することができ、電気泳動的に分離され、また、ブロッティング膜組織を通過させる必要なしで、その後ゲル中で検出することができる。
【0022】
本発明の方法において有用なアクリダン化合物は、下記式I、
(式中、基R1〜R11の少なくとも1個は下記式、
−L−RG
(式中、Lは単結合または他の二価もしくは多価の基であってもよい結合基であり、RGは化学ルミネセンス標識化合物を他の化合物と結合させることを可能にする反応基である)で表される標識置換基であってよく、Z1およびZ2はO、SおよびNR12から相互に無関係に選択され、R12はアルキル基、アリール基、アルキルスルホニル基およびアリールスルホニル基から選択され、R1は酸により除去しうる基であり、R2およびR3は1〜50個の非水素原子を含む有機基であり、また、R4〜R11は夫々水素原子または非干渉置換基もしくは基である)で表される構造を有する。
【0023】
発明を実施するための最良の形態
定義
酸 − 水に添加した際、生ずる溶液のpHを低下させる化合物。ここで使用される酸には、鉱酸、例えば塩酸、硝酸、硫酸及び過塩素酸、有機酸、例えばシュウ酸、酢酸及びプロピオン酸のようなカルボン酸や他の型の有機酸、例えばピクリン酸及び塩化アルミニウム、塩化鉄のようなルイス酸などがある。
【0024】
アルキル基 − 分枝か、直鎖又は環状の、1〜20個の炭素原子を有する炭化水素基。ここで使用する低級アルキル基とは、8個以下の炭素原子を有するアルキル基を称する。
【0025】
アルケニル基 − 分枝か、直鎖又は環状の、少なくとも1個の炭素−炭素二重結合を有し、2〜20個の炭素原子を有する炭化水素基。ここで使用する低級アルケニル基とは、8個以下の炭素原子を有するアルケニル基を称する。
【0026】
アルキニル基 − 分枝又は直鎖の、少なくとも1個の炭素−炭素三重結合を有し、2〜20個の炭素原子を有する炭化水素基。ここで使用する低級アルキニル基とは、8個以下の炭素原子を含有するアルキニル基を称する。
【0027】
アナライト − 検定によって試料中からその存在又はその量が測定される物質。アナライトには、特異的な結合親和力を持つ特異的な相手が存在する有機及び生物学的分子などがある。アナライトを例示すれば、以下のものに限定するものではないが、一本鎖、又は二本鎖DNAやRNA、DNA−RNA複合体、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体フラグメント、抗体−DNAキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン及びビオチンなどがある。その他のアナライトの例には、医薬物質、ホルモン及び農薬などがある。
【0028】
アリール基 − 水素原子以外の1個以上の置換基で置換し得る1〜5個の芳香環を有する芳香環含有の基。
【0029】
生物医学的分析 − 注目するアナライトの生物学的起源サンプルの分析。かかる分析とは、免疫検定、ウェスタンブロット、ノーザンブロット、サザンブロット、DNAハイブリッド形成検定、DNA配列分析、コロニーハイブリッド形成法、遺伝子発現分析、高処理量医薬物質スクリーニング、伝染病薬剤又は病原体の検出などである。
【0030】
グリコシル − 六単糖及び五単糖を包含する炭水化物の残基で、1個以上の糖単位を含有する。例としては、果糖、ガラクトース、葡萄糖、グルクロネート、マンノース、リボース、N−アセチルグルコサミンなどである。
【0031】
ハロゲン − フッ素、塩素、臭素又はヨウ素原子。
【0032】
ヘテロアリール基 − 少なくとも1個の環の炭素原子が窒素、酸素又はイオウ原子で置換され、また水素原子以外の1個以上の置換基で置換され得る1〜5個の炭素環状芳香環を有する芳香環含有の基。
【0033】
ルミネセンス − 電子的励起状態に励起した場合に、発光できる能力。励起1重項状態からの壊変の場合は蛍光として、励起3重項状態からの壊変の場合はリン光として、いずれも発光できる。
【0034】
過酸化物 − O−O結合を有する化合物で、好ましくは過酸化水素又は過酸化水素の複合体、例えば、尿素過酸化物(urea peroxide)、過ホウ酸又は過炭酸。
【0035】
サンプル − 検定すべき1個以上のアナライトを含有し、又は含有すると思われる液体。化学ルミネセンス性反応法によって分析される標準的なサンプルは、生物学的サンプルで、体液、例えば血液、血漿、血清、尿、精液、唾液、セルリゼート(cell lysates)、組織抽出物などである。別の種類のサンプルとしては、食品のサンプル及び土壌あるいは水のような環境関連のサンプルなどがある。
【0036】
特異的結合対 − 相互に結合親和力を示す二つの物質。その例は、抗原−抗体、ハプテン−抗体又は抗体−抗体対、相補的オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、ホルモン−受容体、レクチン−炭水化物、IpG−タンパク質A、核酸−核酸結合タンパク質及び核酸−抗核酸抗体などである。
【0037】
置換 − 基における、少なくとも1個の水素原子を、他の原子又はC,O,N,S,P,Si,B,Se,F,Cl,Br及びIから選択される1〜50個の原子を有する基により置き換えることをいう。置換基に関しては、特に指示しない限り複数の置換位置が存在し得ることを意図するものであるということに留意を要する。
【0038】
下記化学式Iで表される化学ルミネセンス化合物が、ある試薬との反応で短い強力な閃光としての化学ルミネセンスを発生するということは、予期し得ない発見であった。化学ルミネセンス検定において、例えば標識として、検出のために本化合物を使用することにより、アナライトの高感度検出が可能となる。本発明の化学ルミネセンス化合物は、次の一般式I、
(式中、Z1及びZ2は相互に無関係にO,S及びNR12から選択され、R12はアルキル基、アリール基、アルキルスルホニル基及びアリールスルホニル基から選択され、R1は酸によって除去され得る1〜約50個の非水素原子を有する基であり、R2及びR3は、C,N,O,S,P及びハロゲン原子から選択される1〜50個の非水素原子を有する有機の基であり、R4〜R11は、相互に無関係に水素原子及び化学ルミネセンスの発生を妨害しない置換基から選択され、かつ、基R1〜R11の少なくとも1個は標識置換基となり得る)で表される。標識置換基が存在する場合には、R1又はR2のうちの1つであることが好ましい。
【0039】
化学ルミネセンスの発生方法 本発明の化学ルミネセンスの発生方法においては、化学式Iの化合物は、
a)化学式Iの化合物を酸と接触させ、第1の反応生成物を生成する工程と、
b)第1の反応生成物を塩基性の環境を提供するに充分な量の塩基と接触させる工程とを包含する反応に供し、これら工程の少なくとも1つに、反応のためのオキシダントを提供し、これにより第2の反応生成物を生成させ、塩基性環境下で光を発生させる。反応がアルカリ性pHで実施される場合には、光の強度は室温で、急速に、多くは1秒或いはそれ以内で最高水準に達する。
【0040】
第1工程で用いる酸は低pH環境、少なくとも3以下、好ましくは1以下を提供できるものでなければならない。鉱酸が、その低コストと優れた酸度とによって好ましいものである。若干の場合、酸化性の鉱酸、例えば硝酸が好ましい。酸は、代表的には0.001M〜1Mの範囲内の濃度で用いられる。
【0041】
オキシダントは、過酸化物又はアルキルヒドロペルオキシドとすることができる。好ましい過酸化物には、過酸化水素、尿素過酸化物、過硫酸塩及び過ホウ酸塩などがある。オキシダントはまた、金属酸化物、例えばCrO3,MnO2又は陰イオン性錯体、例えば過ヨウ素酸塩IO4 -又は過マンガン酸塩MnO4 -、又は金属過酸化物、例えばNa2O2とすることができる。また、別のオキシダントとしては、ヘム又はヘモグロビンなどがある。例えば、酸が硝酸の場合には、酸も又若干オキシダントとして機能し得る。オキシダントを、第1工程で酸と組み合わせるか、あるいは第2工程で塩基と組み合わせるか、いずれが好ましいかの選択は、酸の選択と、塩基中でのオキシダントの安定性および反応性に左右される。一般に、酸が酸化性の酸である場合には、オキシダントを塩基と組み合わせるのが有利である。他の場合は、オキシダントを酸と組み合わせるのが有利である。
【0042】
本発明の実用に有用な塩基性化合物は、水に添加した際に、得られる溶液のpHの上昇を起こす化合物である。これには、水酸化物塩で、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたは水酸化リチウム、水酸化アンモニウム及び水酸化テトラアルキルアンモニウム、炭酸塩及び塩基性金属酸化物などがある。有機塩基の使用も又期待される。好ましい塩基はアルカリ金属水酸化物である。
【0043】
反応は、代表的には5℃〜50℃、好ましくは20℃〜40℃の温度で、通常は、室温で行われる。本発明の反応は、ペルオキシダーゼで被覆した固体支持体、例えばビーズ、管、膜、ミクロウェルプレート(microwell plate)の表面と接触し得る水溶液で実施する。若干の検定フォーマットにおいては、緩衝溶液中で、結合反応を含む検定工程を遂行することが望ましい。酸は、緩衝能力を上回り、かつ溶液のpHを3以下に、好ましくは約1か、それ以下に下げるに充分な量および濃度で使用しなければならない。
【0044】
化学ルミネセンス検定方法
本発明の他の側面は、アナライトを検出する方法に化学ルミネセンス反応を使用することであり、化学ルミネセンス反応により発光させ、生じた光を検出し、かつ定量が所望される場合には、発光量をアナライトの量と関係づけることを包含するものである。光の強さとアナライトの量との関係は、化学ルミネセンス化合物の既知の量で検量線を作ることによって容易に識別できるようになる。全体の化学ルミネセンス反応は、下記の反応によって示すことができる。
【0045】
若干の検定フォーマットでは、化学式Iで表される化合物が、標識置換基を有さずに、他の手段でアナライトと関係させてもよい。例えば、化学ルミネセンス化合物をリポソームまたはラテックス粒子内に封入してもよく、これらは順番に標識置換基または特異的結合パートナーを有する。後者の例には、リポソーム−抗体複合体(conjugates)、リポソームオリゴヌクレオチド複合体、粒子−抗体、粒子抗原及び粒子DNA複合体などがある。リポソーム又はラテックス粒子を酸と接触させると、化学ルミネセンスリポソーム又は粒子と酸化物及び塩基とが化学ルミネセンス反応を起こし、アナライトの検出を可能にする。
【0046】
他の好ましい検定フォーマットでは、化学式Iで表される化合物は、アナライト又は特異的結合対の部分との結合を可能とする標識置換基を有する。
【0047】
他の好ましい検定フォーマットでは、化学式Iで表される化合物は、検出すべき化合物に化学ルミネセンス標識を付与するために、化学ルミネセンス標識化合物として用いられる。これら検定では、化学式Iで表される化合物は更に化学式−L−RG(Lは任意である結合基)で表される標識置換基を有し、実際には化学ルミネセンス部分を反応性の基、RGに結合させるためのものである。
【0048】
化学ルミネセンス化合物 化学式Iで表される化合物において、基R1はZ1置換二重結合に結合している場合には、酸によって除去し得る基であり、C,N,O,S,P,Si及びハロゲン原子から選択される1〜約50個の非水素原子を有する任意の基とすることができる。好ましい基は、1〜20個の炭素原子を有する、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のアリール基、置換又は無置換のアラルキル基、1〜20個の炭素原子を有する置換又は無置換のアルキル若しくはアリールカルボニル基、トリ(C1〜C8アルキル)シリル基、SO3 -基、グリコシル基及び化学式 PO(OR’)(OR”)で表されるホスホリル基であり、ここでR’及びR”は相互に無関係に、水素原子、1〜20個の炭素原子を有する、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のアリール基、置換又は無置換のアラルキル基、トリアルキルシリル基、アルカリ金属陽イオン、アルカリ土類陽イオン、アンモニウム及びホスホニウム陽イオンから選択される基である。好ましいR1基はリン酸塩の基PO3M2であり、Mはアルカリ金属イオンである。
【0049】
基R2は、C,N,O,S,P,Si及びハロゲン原子から選択される1〜約50個の非水素原子を有する任意の基で、光を生成させる基とすることができる。後者の意味するところは、化学式Iで表される化合物を本発明の反応に供したとき、光を生じ、1種以上の化学ルミネセンス中間体の発生も伴い得るということである。R2は、好ましくは1〜20個の炭素原子を有する、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のアリール基、置換又は無置換のアラルキル基、1〜20個の炭素原子を有する置換又は無置換のアルキル若しくはアリールカルボニル基、トリ(C1〜C8アルキル)シリル基、SO3 -基、グリコシル基及び化学式 PO(OR’)(OR”)で表されるホスホリル基であり、ここでR’及びR”は相互に無関係に、水素原子、1〜20個の炭素原子を有する、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のアリール基、置換又は無置換のアラルキル基、トリアルキルシリル基、アルカリ金属陽イオン、アルカリ土類陽イオン、アンモニウム及びホスホニウム陽イオンから選択される基である。置換アルキル基の例には、シアノエチル基又はトリメチルシリルエチル基などがある。好適実施形態としては、R2は、化学式 −L−RGで表される標識置換基で置換されたアリール基、好ましくはフェニル基である。
【0050】
基R3は、C,N,O,S,P,Si及びハロゲン原子から選択される1〜50個の非水素原子を有する有機基である。更に好ましくは、R3は、1〜20個の非水素原子を有する。有機基は、好ましくはアルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基及びアラルキル基から成る群から選択される基である。R3として更に好ましい基には、置換又は無置換のC1〜C4アルキル基、置換又は無置換のベンジル基、アルコキシアルキル基、カルボキシアルキル基及びアルキルスルホン酸基などがある。基R3は、R7又はR8と結合して5又は6員環を形成し得る。
【0051】
化学式Iで表される化合物において、基R4〜R11は相互に無関係に、H又は発光を生ぜしめる置換基であり、一般にはC,N,O,S,P,Si及びハロゲン原子から選択される1〜50個の原子を有する。存在し得る代表的な置換基は、これに限定されるものではないが、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、置換アミノ基、カルボキシル基、カルボアルコキシ基、カルボキシアミド基、シアノ基及びスルホネート基などである。隣接した基の対、例えば、R4−R5又はR5−R6は、相互に結合して2個の基が結合している環に縮合している、少なくとも1個の5又は6員環を有する炭素環又はヘテロ環を形成し得る。かかる縮合ヘテロ環は、N,O又はS原子を含有でき、かつ、上掲のもののようにH以外の環置換基を含有できる。基R4〜R11の1個又はそれ以上が、化学式 −L−RGで表される標識置換基となり得る。R4〜R11は水素原子、ハロゲン原子及びアルコキシ基、例えばメトキシ基、エトキシ基、t−ブトキシ基などから選択されることが好ましい。化合物の好適な基は、R5,R6,R9又はR10のうちの一つをハロゲン原子として有し、かつ、基R4〜R11のうちのその他のものが水素原子である。
【0052】
置換基は、化合物の性能を変更し、あるいは合成の簡便さを得るために、種々の量で、かつ、アクリダン環における選択された環又は鎖上の部位に導入することができる。かかる性能とは、例えば、化学ルミネセンスの量子収量、酵素との反応速度、極大光の強度、発光の持続時間、発光の波長及び反応媒体への溶解性などである。特定の置換基とそれらの作用を下記に特定の実施例において示すが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【0053】
結合基(L) 結合基は結合、原子又は原子の直鎖または枝分れ鎖であって、その内の若干は環状構造の部分であってもよい。置換基は通常1〜約50個の非水素原子を有し、より一般的には1〜約30個の非水素原子を有する。鎖を構成する原子はC,O,N,P,S,Si,B及びSe原子から選択され、好ましくはC,O,N,P及びS原子である。ハロゲン原子は、置換基として鎖上又は環上にあってもよい。結合置換基を有する代表的な官能基には、アルキレン、アリーレン、アルケニレン、エーテル、過酸化物、ケトンとしてのカルボニル、エステル、カルボナートエステル、チオエステル又はアミド基、アミン、アミジン、カルバメート、尿素、イミン、イミド、イミダート、カルボジイミド、ヒドラジン、ジアゾ、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホナートエステル、チオエーテル、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホネートエステル、サルフェートエステル、及びチオウレア基などがある。
【0054】
反応基 反応基RGは、その存在が共有結合又は物理的力によって他の分子との結合を促進する原子又は基である。若干の実施形態においては、他の化合物への本発明の化学ルミネセンス標識化合物の結合は、例えば反応基がハロゲン原子又はトジレート基のような離脱基である場合や、化学ルミネセンス標識化合物が求核置換反応によって他の化合物に共有結合している場合には、反応基からの1個又はそれ以上の原子の損失を伴う。他の実施形態においては、共有結合形成による他の化合物への化学ルミネセンス標識化合物の結合は、マイケル付加のような付加反応で起こるか、又は反応基がイソシアナート又はイソチオシアナート基である場合に起こるような反応基内の結合の再編成を伴う。更に他の実施形態では、結合が共有結合形成を伴わないで、むしろ物理的な力であり、その場合には反応基は変化することなくそのままである。物理的な力とは、引力、例えば水素結合、静電気的又はイオン的引力、塩基スタッキングのような疎水性引力、及び特異的親和性相互作用、例えばビオチン−ストレプトビオチン、抗原−抗体及びヌクレオチド−ヌクレオチド相互作用を意味する。
【0055】
有機および生物学的分子への標識の化学的結合のための反応基
【0056】
好ましい反応基は、OH,NH2,COOH,SO2CH2CF3,N−ヒドロキシコハク酸イミドエステル及びマレイン酸イミド基などである。
【0057】
2官能の結合試薬も、適度な反応性基にて有機及び生物学的分子に標識を結合させるために用いることができる(L.J.Kricka,Ligand−Binder Assays,Marcel Dekker,Inc.,New York,1985,18〜20頁,表2.2及びT,H Ji,“Bifunctional Reagents,”Methods in Enzymology,91,580〜609頁(1983)参照)。2官能の試薬には2種類あり、最終の構造に組み込まれるものと、そうではなく、2個の反応物を結合させることにのみ作用するものとがある。
【0058】
好ましい化合物の群は、化学式II、
で表され、ここで、R4〜R11はいずれも水素原子である。基Z1,Z2,R1,R2及びR3は上記に定義したものと同じである。
【0059】
他の好ましい種類の化合物は、化学式III、
で表され、ここで、R1とともにZ1はホスフェート基であり、Z2はO,S及びNR12から選択され、R2,R3およびR4〜R11は上記に定義したものと同じであり、かつ、R’及びR”は、相互に無関係に、アルキル基、置換アルキル基及びアルカリ金属イオンから選択される。
【0060】
化学式IIIで表される好ましい化合物は、R4〜R11がいずれも水素原子であり、R3がアルキル基であり、更に好ましくは低級アルキル基である。更に好ましいのは化学式IV、
で表される化合物である。
【0061】
好ましい標識化合物は、化学式V〜X、
で表され、ここで、R”およびR’は、水素原子、アルキル基、シアノエチル基及びアルカリ金属イオンから選択され、好ましい反応基RGには、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基(NH2)、マレイン酸イミド、NHSエステル及びトリフロロエタンスルホネート基(CF3CH2SO3)があり、また、AcOはアセトキシ基を表す。
【0062】
他の面では、本発明は化学ルミネセンス標識化合物に関する。これは、検出すべき化合物と、標識置換基を有する化学式Iの化学ルミネセンス標識化合物との反応によって生成する複合体を意味する。化学式V、
で表される標識化合物を用いて複合体を調製する場合には、化学ルミネセンス標識で標識すべき化合物は、Vの反応基RGによって結合されることになる。結合の結果、反応基RGの部分が置換される。例えば、N−ヒドロキシコハク酸イミドエステルがRGである場合には、N−ヒドロキシコハク酸イミドの部分が失われて結合を生じる。別の場合として、例えば、RGが、標識される化合物上の−SH基と反応するマレイン酸イミド基であるか、又はアミン若しくは−OH基と反応するイソシアナートである場合には、RGはそのままである。更に他の場合として、全RGが失われて結合を生じる場合がある。例としては、RGが脱離基、例えばハライド、アジド、-N3又はp−トルエンスルホネートである場合である。
【0063】
化学ルミネセンス標識化化合物を調製する場合には、代表的には、たとえ必要なくともモル過剰の化学ルミネセンス標識化合物を使用する。化学ルミネセンス標識化合物は、好ましくは標識すべき化合物の少なくとも5倍のモル過剰で、また通常は少なくとも1倍のモル比で使用される。化学ルミネセンス標識化化合物は、1種の標識基又はその基の多数のコピーで標識してもよい。一般に、発生し得る信号量を高めるために、多数の標識を含有せしめることが望ましい。
【0064】
合成法 化学式Iで表される化合物は、種々の方法で調製できる。好ましい方法では、Z1がOであり、かつ、Z2がO,S又はNR12の場合は、化合物Iはエステル、チオエステル又はアミドのエノラートを化学式Z1−LGで表される試薬と反応させることによって調製できる。ここで、LGは下記の式で例示されるような離脱基を表す。
一般的な離脱基には、ハロゲン原子、例えばクロリド、ブロミド及びヨージド、スルホネート、例えばメタンスルホネート、p−トルエンスルホネート及びトリフロロメタンスルホネート、カルボキシレート、例えばアセテート及びベンゾエート、特にはZ1がアシル基の場合、Z1−LGは酸無水物、メトサルフェートのようなサルフェート、及び他の基、例えばイミダゾール、トリアゾール及びテトラゾール、マレイン酸イミド、コハク酸イミドキシ基などがある。
【0065】
両方のZ基がS原子である化学式Iで表される化合物を調製する方法には、下記の2種の式、
に従う好適なカルボニル化合物へのリチオシラン化合物又はホスホラスイリドの求核付加などがある(F.A.Carey,A.S.Court,J.Org.Chem.,37,1926〜29頁,(1972))。
【0066】
別の方法では、E.J.Corey及びA.P.Kozikowski,Tetrahedron Lett.,925−8頁,(1975)に開示され、下記式、
に示されるように、エステルがビス(ジアルキルアルミニウム)ジチオール試薬との反応によってケテンジチオアセタールに転化する。
【0067】
更に他の方法においては、活性メチレン基の陰イオンをCS2と反応させ、またジチオカルボキシレートをR1基含有試薬R1−LGと反応させ、ジチオエステルを生成する。後者の方法論の例は、I.Shahak及びY.Sasson,Tetrahedron Lett.,4207〜10頁(1973)に開示されている。チオエステルをエノラートに転化し、化学式X−LGの試薬と反応させる。
【0068】
化学ルミネセンス標識化合物の調製法は一般に、化学式Iの前駆物質の化合物を調製し、それを、当業者に一般に知られている1またはそれ以上の付加反応に供し、基R1〜R11、好ましくはR1又はR2の1つに結合する標識置換基を提供するものである。一般原理を説明するための多くの実施例を下記に示した。
【0069】
アナライト 検定法に本発明の化学ルミネセンス法を適用することによって検定できる物質には、多くの種類の有機及び生物学的分子などがある。かかる検定は一般に、少なくとも1対の特異的結合パートナー間の特異的結合反応の使用を伴う。特異的結合パートナーの少なくとも1個を、上記の方法で、化学式Iで表される化合物と会合させる。アナライトの例には、医薬物質、ホルモン、農薬物質、農薬物質代謝産物、DNA、RNA、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体フラグメント、抗体−DNAキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、炭水化物、レクチン、受容体、アビジン、ストレプトアビジン及びビオチンなどがある。結合パートナーの例には、抗原−抗体、ハプテン−抗体若しくは抗体−抗体のペア、相補的オリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、ホルモン−受容体、レクチン−炭水化物、IgG−タンパク質A、核酸−核酸結合タンパク質及び核酸−抗核酸抗体などがある。
【0070】
過酸化物はオキシダントとして機能し得るため、本発明の化学ルミネセンス反応は、過酸化水素の検出法にも使用できる。本発明の方法が、酸素の還元と自生の基質の酸化によってH2O2を発生するオキシダーゼ酵素とデヒドロゲナーゼ酵素との検出にも使用できることは、当業者には明らかである。更に、アナライトに対する検定法において、生物学的分子又は特異的結合対の部分に対する複合体としてオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼ酵素を存在させてもよい。
【0071】
検定法 本発明の方法による検定法では、化学ルミネセンス化合物をアナライト又は特異的結合対の部分と会合させる。化合物が標識置換基を有する場合には、該会合は共有結合形態を取り得る。一つの例は、化学ルミネセンス免疫検定法である。かかる検定法は、通常マニュアルのフォーマットと共に自動多試験免疫検定システムにも使用される。本発明の反応によって達せられる化学ルミネセンス発生の速度は、大容量迅速試験装置に用いるのに、特に有利に適合する。
【0072】
代表的な免疫検定法において、アナライトのハプテン、抗原又は抗体は、該アナライトに対する化学ルミネセンス標識化特異的結合パートナー又はアナライトの標識化類似物(labeled analog)の存在又は量を検出することによって検定される。多くの検定法のフォーマットと免疫化学的手段遂行のためのプロトコルは業界でよく知られている。これらの検定法は概括的には二つの範疇に分かれる。競合検定法はアナライト及びアナライト類似物、例えば検出可能な標識化アナライト分子を持った特異的抗体の免疫学的結合を特徴とする。サンドイッチ検定法は、二つの内の一つが検出可能標識化されている当該二つの抗体を、アナライトと順次又は同時に結合させることによって得られる。このようにして形成された検出可能標識化結合ペアは、本発明の化合物及び方法で検定できる。業界で慣用されているようなビーズ、チューブ、ミクロウェル、磁性粒子、ラテックス粒子、シリカ粒子、試験ストリップ、膜及びフィルターなどの固体表面又は支持体に結合した標識化種を用いて測定を行うことができる。
【0073】
本発明の方法により放射された光は、ルミノメーター、X線フィルム、高速写真フィルム、CCDカメラ、または、視覚的等、任意好適手段により検出され得る。検出装置の選択は、用途、および、価格、便宜性、スペクトルの感度および永久的な記録の必要性の考慮により決定される。
【0074】
本発明の検出方法の特に有用な用途は、標識化核酸プローブの使用による核酸の検出である。標識化プローブを用いた核酸の分析および化学ルミネセンス検出のための方法、例えば、溶液ハイブリット形成検定、サザンブロッティングにおけるDNA検出、ノーザンブロッティングによるRNA、DNAアミノ酸配列分析(sequencing)、DNAフィンガープリント法、コロニー(colony)ハイブリッド形成およびプラークリフト法(plaque lifts)は、全て十分に確立された技術である。標識は、プローブオリゴヌクレオチドまたは捕獲(capture)オリゴヌクレオチドとの直接複合化として存在することができ、または、当業者に公知の方法を用いた間接的な結合手段を通じて一体化させることができる。間接的な結合手段の例には、ハプテン標識化オリゴヌクレオチドおよびアンチハプテンHRP複合体、または、ビオチニル化オリゴヌクレオチドおよびアビジンHRP複合体を用いること等がある。かかる核酸検定法は、ブロッティング膜においてまたは溶液中で、当業者に公知であるようなビーズ、管、ミクロウェル(microwells)、磁性粒子または試験ストリップ等の固体表面に結合したオリゴヌクレオチドを用いて行うことができる。
【0075】
標識化アナライト、例えば、核酸、蛋白質または抗体の検出のための本発明の化学ルミネセンス反応の使用は、他の化学ルミネセンス標識方法以上の予期せぬ利益を与える。化学ルミネセンス標識化アナライトが、電気泳動を受けて、アクリルアミドおよびアガロースのようなゲル中で直接検出され得ることが、思いがけなく見出されている。驚くことに、標識化アナライトは、電気的ポテンシャル、および、従来技術に基づき予期されるような、工程中で適用される電流において、破壊または誘発(triggered)されることはない。ゲル中で電気泳動的に分離された標識化アナライトの化学ルミネセンス検出は、本出願人の知る限りではこれまで成功しておらず、分離されたアナライトの化学ルミネセンスによる検出には、非標識化アナライトのブロッティング膜への移動および間接的な方法による膜における検出が必要であった。本化学ルミネセンス検出方法は、ゲル中で誘発する場合には適切な強度が得られ、従ってブロッティング工程と結合反応の必要性が排除される。膜移動工程の必要性が排除されることにより検出方法に有意な進歩をもたらす本新技術は、特にDNA系列ラダー(ladder)の検出によく適合している。
【0076】
他の例示的使用法は、ゲル中か、又はウェスタンブロッティングの技術によるタンパク質の免疫学的検出である。アナライトとして注目されているタンパク質を含有する試料は、電気泳動的分離に供される。分離されたタンパク質は、ゲル中で直接検出されるか、又は毛細管作用又は電界の助けによってニトロセルロース又はPVDFの膜のようなブロッティング膜に移される。移したタンパク質は、特異的一次抗体及び認識しかつ一次抗体に結合する標識化二次抗体で検出される。標識の定量的測定は、アナライトタンパク質の存在を反映するものである。ウェスタンブロッティングに対して本発明の方法を適合させるには、本発明の化学ルミネセンス標識化合物で二次抗体を標識する。この技術の変形、例えばビオチン化抗体や化学ルミネセンス標識化アビジンの使用は、本発明の範囲内と考えられる。
【0077】
多数アナライト検定法は、種々のアナライトを標識するために2個又はそれ以上の識別可能な化学ルミネセンス標識を同時に使用して行うことができる。適切に選択された化学ルミネセンス標識は、種々の発光波長にもとづいて相互に無関係に検出し得る。あるいはまた、2個又はそれ以上の異なる標識は、発光に要する時間によって識別可能とすることもできる。化学ルミネセンス多数アナライト検定法は、米国特許第5656207号明細書に開示されているが、その記載内容を本明細書に参考として取り入れる。多数アナライト検定法には、1の核酸の2種の異なる領域または1の抗原の2種の抗原決定基のような、同一アナライトにおける多数領域の検出も含まれる。この種の検定法は、例えば、遺伝子の並置(juxtapositions)の検出や、又は検出の特異性の増大に有用である。
【0078】
本化学ルミネセンス反応に添加剤として界面活性剤を使用することは有利であり、分析感度の向上をもたらすことができる。本発明の実施に有用な非イオン界面活性剤には、一例としてポリオキシエチレン化アルキルフェノール、ポリオキシエチレン化アルコール、ポリオキシエチレン化エーテル及びポリオキシエチレン化ソルビトールエステルなどがある。陽イオン界面活性剤は、CTABのような4級アンモニウム塩化合物などで放射される化学ルミネセンスのレベルを高めるために用いるのに有利である。
【0079】
他の実施形態として、蛍光エネルギー受容体を用いて、極大発光を長波長に移し(赤色シフト)かつ/又は放射されるルミネセンス量を増加させることができる。フルオレッサー(fluorescer)は化学式Iで表される化合物と共有結合でき、あるいはまた分離種として反応溶液に添加するか、又はポリマーと結合するか、若しくはミセル或はポリマーと静電気的に会合させることができる。
【0080】
実施例
1.アクリダンホスフェート化合物の合成 下記化合物1〜13(Y=Na)及び1a〜13a(Y=CH2CH2CN)の調製は、出願人のPCT出願WO97/26245号公報に記載されている。
【0081】
2.アクリダン誘導体14の合成
THF中フェニル10−メチルアクリダン−9−カルボキシレート(250mg、0.79mmol)溶液を、−78℃でLDAにより脱プロトン化した。同時に、(EtO)2POCl(205mg、1.2mmol)とピリジン(94mg、1.2mmol)をスポイトで添加して、15分間攪拌を継続した。ドライアイス浴を取り除いて、さらに2時間攪拌を継続した。揮発分を除去して、残渣から2工程のクロマトグラフィで生成物を単離した。30%酢酸エチル/ヘキサンを用いたカラムクロマトグラフィ精製で、蛍光性不純物を含有する生成物の分離を行った。10%酢酸エチル/CH2Cl2を用いた分取TLC(薄層クロマトグラフィの略、以下同じ)によって最終精製を行った。1H NMR(アセトン−d6)δ1.08(t,6H),3.46(s,3H),3.76〜3.97(m,4H),6.79〜7.91(m,13H).
【0082】
3.アクリダン誘導体15の合成
THF中フェニル10−メチルアクリダン−9−チオカルボキシレート(1.0g、3mmol)溶液を、−78℃でLDAにより脱プロトン化した。同時に、(EtO)2POCl(958mg、5mmol)とピリジン(2.5mL、3mmol)をスポイトで添加して、15分間攪拌を継続した。ドライアイス浴を取り除いて、さらに2時間攪拌を継続した。揮発分を除去して、残渣から2工程のクロマトグラフィで生成物を単離した。30〜100%酢酸エチル/ヘキサンを用いたカラムクロマトグラフィ精製で、青及び緑色の蛍光性不純物を含有する生成物の分離を行った。12%酢酸エチル/CH2Cl2を用いる分取TLCによって最終精製を行った。1H NMR(アセトン−d6)δ 1.01(t,6H),3.49(s,3H),3.74−3.96(m,4H),6.91−7.45(m,11H)7.78(d,1H)7.99(d,1H).
【0083】
4.アクリダン誘導体16の合成
THF中フェニル10−メチルアクリダン−9−カルボキシレート(311mg、1mmol)溶液を、−78℃でLDA溶液に滴下した。−78℃で30分後、無水酢酸(161.3mg、1.6mmol)をスポイトで添加して、ドライアイス浴を取り除いた。1時間後、揮発分を除去して、残渣からクロマトグラフィで生成物を単離した。5%酢酸エチル/ヘキサンを用いたカラムクロマトグラフィ精製で、白色固体としての90mgの純分の画分および若干の出発物質を含有する第2画分(250mg)を得た。1H NMR(CDCl3)δ 2.04(s,3H),3.44(s,3H),6.82〜7.65(m,13H).
【0084】
5.アクリダン誘導体17の合成
THF中フェニル10−メチルアクリダン−9−チオカルボキシレート(1.05g)溶液を、−78℃でLDAにより脱プロトン化した。10mLのTHF中の無水酢酸(0.45mL)を滴下して、ドライアイス浴を取り除き、一夜、攪拌を継続した。揮発分を除去して、残渣からクロマトグラフィで生成物を単離した。5〜20%酢酸エチル/ヘキサンを用いたカラムクロマトグラフィ精製で、1.15gの化合物40を灰白色固体として得た。1H NMR(CDCl3)δ 1.89(s,3H),3.48(s,3H),6.95〜7.06(m,4H),7.20〜7.34(m,5H),7.40〜7.44(m,2H),7.62(d,1H),7.79(d,1H).
【0085】
6.アクリダン誘導体18の合成
THF中フェニル10−メチルアクリダン−9−カルボキシレート(333.4mg,1.06mmol)溶液を、−78℃で30分間LDAにより脱プロトン化した。濃橙色の溶液を、10mLの乾燥THF中t−ブチルジメチルシリルクロリド(253.4mg,1.68mmol)で処理した。ドライアイス浴を取り除いて、さらに2時間攪拌を継続した。揮発分を除去して、5%酢酸エチル/ヘキサンを用いたクロマトグラフィで、生成物を油状物質(212mg)として残渣から単離した。1H NMR(CDCl3)δ −0.12(s,6H),0.77(s,9H),3.37(s,3H),6.75〜7.38(m,12H),7.79(dd,1H).
【0086】
7.アクリダン誘導体19の合成
THF中フェニル10−メチルアクリダン−9−チオカルボキシレート(322.3mg,0.97mmol)溶液を、−78℃でLDAにより脱プロトン化した。5mLの乾燥THF中のt−ブチルジメチルシリルクロリド(270mg,1.8mmol)を迅速に加えて、ドライアイス浴を取り除き、90分間攪拌を継続した。揮発分を除去して、5%酢酸エチル/ヘキサンを用いたクロマトグラフィで、330mgの生成物を油状物質として残渣から単離し、これを放置して固化させた。1H NMR(CDCl3)δ −0.09(s,6H),0.73(s,9H),3.43(s,3H),6.84〜7.01(m,4H),7.16〜7.47(m,7H),7.73〜7.76(m,1H),7.90〜7.93(m,1H).
【0087】
8.アクリダン誘導体20の合成
フェニル10−メチルアクリダン−9−チオカルボキシレート1.0gを、−70℃で60mLの乾燥THF中LDAによりエノラートに転化した。温度を−70℃で1時間維持した後、0.76gのメチルトリフラートを加え、反応混合物を室温まで加温した。この混合物を4日間放置した。CH2Cl2(150mL)を添加して、溶液を水で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。ヘキサン:CH2Cl2,70/30の溶離剤での分取TLCによって粗製物を精製した。1H NMR(CDCl3)δ 3.53(s,3H),3.56(s,3H),6.93〜7.45(m,11H),7.71(d,1H),7.93(d,1H).
【0088】
9.アクリダン誘導体21の合成
10−メチル−N−(フェニル)−N−(p−トルエンスルホンアミド)−アクリダン−9−カルボキシアミドを、米国特許5491072号明細書に記載のように調製した。スルホンアミドを乾燥THF中にてLDAによりエノラートに転化し、かつ、メチルトリフラートを用いてメチル化して、化合物21を製造した。
【0089】
10.アクリダン誘導体22の合成
a)アクリダン−9−カルボン酸クロリド(4.0g)を、ピリジン(2.94mL)とCH2Cl2(25mL)との溶液中4−ヒドロキシチオフェノール(2.8g)により、一夜、室温にてエステル化した。混合物を濾過し、濾液を蒸発乾燥した。残渣を反応からの沈殿と結合(coupled)して、水とCH2Cl2とで洗浄し、不純物を除去してチオエステル3.8g(70%)を得た。
【0090】
b)チオエステル(2.0g)を、アルゴン雰囲気下で3時間、室温にてCH2Cl2中亜鉛(3.9g)と酢酸とで還元した。不溶生成物を濾過して、CH2Cl2にて洗浄し、アセトンに溶解してそれを無機物から分離し、蒸発させ、アクリダンチオエステル1,7g(85%)を得た。
【0091】
c)アクリダンチオエステルを窒素気流上CH2Cl2中メチルトリフラート(3.3g)によって、一夜、室温にてメチル化した。蒸発・乾燥し、CH2Cl2と水とで分配し、乾燥して粗製生成物を得、30%酢酸エチル/ヘキサンによるカラムクロマトグラフィで精製して1.55g(88%)のN−メチル化チオエステルを得た。
【0092】
d)2gのチオエステルを、ピリジン0.91gを含有する20mLのTHF中1.25gのトリメチルシリルクロリドと、一夜、室温にて反応させることによって、フェノール性の基をTMSエーテルとして保護した。反応混合物を濾過し、濾液を蒸発・乾燥した。粗製生成物を25%酢酸エチル/ヘキサンによるカラムクロマトグラフィで精製した。
【0093】
e)チオエステルを、シリル保護基の除去を伴いながら、エノールビス(シアノエチル)ホスフェートに転化した。−78℃でTHF中2gのチオエステルとLDAとの反応によって生成したチオエステルエノラートを、更にTHF中POCl3(0.87g)とピリジン(0.45g)とに反応させた。室温で1時間後、3−ヒドロキシプロピオ−ニトリル(1.56g)をピリジン溶液として加え、混合物を一夜攪拌した。反応混合物を濾過し、蒸発して酢酸エチルによる精製用カラムにかけ、わずかに不純な生成物を得た。生成物を更に水で洗浄して残存する3−ヒドロキシプロピオニトリルを除去し、乾燥し蒸発して生成物0.92gを得た。1H NMR(CDCl3)δ 2.55(m,4H),3.50(s,3H),3.94(m,2H),4.06(m,2H),5.94(s,1H),6.85(d,2H),7.06(m,4H),7.33(m,4H),7.87(dd,2H).
【0094】
11.アクリダン誘導体23の合成
a)6−アミノヘキサノール(0.5g)を、20mLのTHF中0.556gのトリメチルシリルクロリドと0.72mLのトリエチルアミンにより、一夜、シリル化した。混合物を濾過し、残渣を蒸発・乾燥した。シリルエーテルをCH2Cl2中フェニルクロロホルメート(0.735g)と1mLのピリジンとを反応させることにより、フェニルカルバメートに転化した。溶液をCH2Cl2中に希釈して、水洗し、乾燥した。シリルエーテル基を、THF中希釈HClで切り離した。化合物Aをカラムクロマトグラフィにより単離した。
【0095】
b)フェノールをホスホリル化するため、化合物22をPOCl3及びピリジンで処理した。CH2Cl2中室温で3.5時間化合物A(下記)と反応させ、反応混合物をCH2Cl2と水とで分配し、乾燥して、20〜50%メタノール/CH2Cl2でクロマトグラフィにかけ、化合物23を得た。1H NMR(CDCl3)δ 1.17〜1.48(m,8H),2.40〜2.44(m,4H),3.01〜3.04(m,2H),3.45(s,3H),3.82〜3.96(m,6H),5.60(bt,1H),6.89〜7.29(m,15H),7.76〜7.84(m,2H).
【0096】
12.アクリダン誘導体24の合成
a)化合物23(90mg)を、NaOH/アセトン水溶液中室温で1日間溶液を攪拌することによって加水分解し、カルバメート基及びシアノエチル基を除去した。溶液を蒸発し、ゴム状の固体をメタノールにより粉末化して生成物を結晶化し、64mgを得た。1H NMR(D2O)δ 1.01〜1.46(m,8H),2.46〜2.90(2t,2H),3.33(s,3H),3.77〜3.83(m,2H),6.89〜7.3(m,10H),7.80〜7.83(d,1H),8.14〜8.17(d,1H).
【0097】
13.アクリダン誘導体25の合成
a)化合物24(15mg)を800μLのD2Oに溶解し、ミクロ遠心分離管に入れた6−マレインイミドヘキサン酸NHSエステル(8.4mg)の75μLのp−ジオキサン−d8中溶液に加えた。管を短時間回転させ、混合した。溶液をメタノールで希釈して、蒸発、乾燥した。橙色の固体をメタノール/アセトンから結晶化し、アセトンで洗浄、乾燥して、17mgの薄橙色固体を得た。1H NMR(CD3OD)δ 1.25〜1.58(m,14H),2.11(t,2H),3.09(t,2H),3.33(s,3H),3.45(t,2H),3.83〜3.85(m,2H),6.76〜7.16(m,12H),7.87〜7.89(d,1H),8.44〜8.46(d,1H).
【0098】
14.アクリダン誘導体26の合成
a)6−マレインイミドヘキサン酸NHSエステル(22.7mg)のTHF中溶液を、6−アミノヘキサノールと反応させた。30分後、溶液を遠心分離し、液体をデカントした。固体をTHFで洗浄し、上澄み液を結合した。THFを蒸発し、残渣をCH2Cl2と水とで分配した。有機層を乾燥し、蒸発して化合物Bを得た。
【0099】
b)化合物22(57mg)を、POCl3(18mg)、ピリジン(168mg)及び1.5mLのCH2Cl2の溶液中0℃でホスホリル化した。約90分後、2.5mLのCH2Cl2中B(40mg)の溶液を0℃で加え、混合物を4.5時間化攪拌した。混合物をCH2Cl2で希釈し、水洗し、乾燥し、濃縮した。化合物26を、粗製物から、分取TLCによって、単離した。1H NMR(CDCl3)δ 1.18〜1.53(m,14H),2.03(t,2H),2.28(bs,1H),2.51(m,4H),3.04〜3.05(m,2H),3.42(t,2H),3.48(s,3H),3,89〜3.97(m,6H),6.28(bs,1H),6.62(s,2H),6.89〜7.34(m,10H),7.75〜7.78(d,1H),7.81〜7.84(d,1H).
【0100】
15.アクリダン誘導体27の合成
a)化合物22(0.2g)を、93mgのAgO及び0.2gのNHSヨードアセテートとアセトニトリル中アルゴン雰囲気下、室温で1時間反応させた。混合物を濾過し、固体をアセトンで洗浄して、結合した有機溶液を蒸発した。結合した生成物を50〜75%酢酸エチル/ヘキサンを用いたクロマトグラフィによって粗製物から精製し、64mgの化合物27を得た。1H NMR(CDCl3)δ 2.48〜2.55(m,4H),2.77(s,4H),3.53(s,3H),3.88〜4.00(m,4H),4.97(s,2H),6.99〜7.94(m,12H).
【0101】
16.アクリダン誘導体28の合成
a)DMF中3−メルカプトプロパン酸(118mg)、N−ヒドロキシコハク酸イミド(192mg)及びDCC(252mg)をアルゴン気流下に攪拌した。45分後、沈殿を濾過しTHFで洗浄した。固体をアセトンに懸濁し、アセトン溶液を40%酢酸エチル/ヘキサンを用いるクロマトグラフィ精製のため分取TLCプレートにかけた。結合した生成物Cを油状物(90mg)として単離した。
b)化合物25(2.5mg)をpH6の1:1メタノール/ホスフェート緩衝溶液1mLに溶解し、次いで蒸発・乾燥し二ナトリウムホスフェート基をモノアシッド型に転化した。この化合物及び化合物Cを、ともにDMF−d6に溶解して10分間保持した。DMFを減圧下除去した。
【0102】
17.アクリダン誘導体29の合成
a)シリル基で保護された実施例13の(シリル化前の前駆物質5gから調製した)チオエステル中間体(下記)を、LDAにより脱プロトン化し、本質的に上記のような手順を用いてPOCl3でホスホリル化した。エタノール(4.75mL)をジクロロホスフェート中間体に添加して、一夜攪拌を続けた。固体を濾別し、濾液を蒸発乾固し油状物を得た。油状物を30〜50%酢酸エチル/ヘキサンを用いてクロマトグラフィにかけ、エノールジエチルホスフェート中間体2.37gを薄黄色の固体として得た。
【0103】
b)エノールジエチルホスフェート中間体(288mg)をCH2Cl2中POCl3/ピリジンで約3時間攪拌して、フェノール基においてホスホリル化した。CH2Cl2中化合物A(141mg)を添加して、溶液を室温で一夜攪拌した。溶液を水洗、乾燥、濃縮した。残渣を分取TLCによって分離して、カルバメート保護された中間体(82mg)を得た。
【0104】
c)カルバメート保護された中間体(82mg)を、水性NaOH/アセトン中、アルゴン雰囲気下室温で6時間溶液を攪拌することによって加水分解して、カルバメート基を除去した。溶液をメタノール/アセトン中に希釈して生成物を結晶化し、化合物23の21mgの第一粗生成物を得た。濾液を蒸発し、残渣を(25〜50%メタノール/CH2Cl2)クロマトグラフィにかけ、更に生成物40mgを得た。1H NMR(CDCl3)δ 1.12(s,6H),1.34〜1.72(m,8H),2.82(bt,2H),3.46(s,3H),3.74〜3.97(m,6H),6.89〜7.34(m,10H),7.76〜7.78(d,2H),8.25(5s,1H).
【0105】
【0106】
18.アクリダン誘導体30の合成
a)フェニル10−メチルアクリダン−9−チオカルボキシレート(0.5g)を、−78℃でTHF中LDAにより脱プロトン化し、−78℃〜室温でPOCl3/ピリジンで処理してエノールジクロロホスフェートを生成した。THF中Aの溶液を添加して、一夜攪拌を続けた。溶液を蒸発し、残渣を酢酸エチルと水との間で分配した。乾燥し酢酸エチルを蒸発して橙色の固体を得、これをヘキサンで洗浄して残ピリジンを除去した。固体を溶解し、5〜50%メタノール/CH2Cl2を用いてカラムクロマトグラフィにかけた。不純物とともに所望の生成物を含有する若干の留分を結合し、蒸発した。この物質を更に15%メタノール/CH2Cl2で分取TLCによって精製して、カルバメート保護された純粋な生成物を得た。
【0107】
c)カルバメート保護された生成物(17mg)を、NaOH/アセトン水溶液中、アルゴン雰囲気下室温で一夜溶液を攪拌することによって加水分解して、カルバメート基を除去した。溶液を蒸発し残渣をクロマトグラフィ(25〜50%メタノール/CH2Cl2)にかけ、化合物30の8mgを製造した。1H NMR(CDCl3)δ 1.07〜1.33(m,8H),2.39(t,2H),3.34(s,3H),3.40〜3.42(m,2H),6.85〜7.37(m,11H),7.68〜7.70(d,1H),8.12〜8.14(d,1H).
【0108】
19.アクリダン誘導体31の合成
a)p−ヒドロキシフェニル10−メチルアクリダン−9−カルボキシレート(米国特許5491072号明細書に記載の調製法)(1.1g)を、THF中0.46mLのクロロトリメチルシランと1.02mLのトリエチルアミンとで一夜攪拌してシリル化した。混合物を濾過して、溶液を蒸発・乾燥した。
【0109】
b)工程aのシリルエーテル化合物を、−78℃でTHF中LDAによりエノラートに転化した。30分後、THF中無水酢酸(0.5mL)の溶液を滴下した。反応を−78℃で30分間持続し、室温に加温した。揮発分を除去して、残渣を5〜10%酢酸エチル/ヘキサンを用いてクロマトグラフィにかけた。出発物質のp−ヒドロキシフェニルエステルとともに所望のエノールアセテートを含有する留分を得た。
【0110】
c)工程bからの生成物の混合物(100mg)を、室温で1時間、CH2Cl2中トリフロロエタンスルホニルクロリド(72mg)とピリジン(62mg)とを反応させた。混合物を蒸発・乾燥し、10〜50%CH2Cl2/ヘキサンを用いてクロマトグラフィにかけた。化合物31(70mg)を分離した。1H NMR(CDCl3)δ 2.09(s,3H),3.45(s,3H),3.95〜4.03(q,2H),6.85〜7.58(m,12H).
【0111】
20.アクリダン誘導体32の合成
a)3−(p−ヒドロキシフェニル)プロパン酸を、Tagawa(H.Tagawa,K.Ueno,Chem.Pharm.Bull.,26(5)1384〜93頁,1978年)の方法を適用することによって、3−(p−メルカプトフェニル)プロパン酸に転化した。簡単にいえば、出発物質の酸をエタノール、フェノール基でエステル化し、ジエチルキサンテートに転化し、異性体のキサンテートに転位させ、鹸化してメルカプト置換の酸を生じさせた。
【0112】
b)この酸のメチルエステルを、アクリジン−9−カルボキシリックアシッドクロリドと、その−SH基を介して縮合させた。アクリジン環を亜鉛/酢酸で対応するアクリダン化合物に還元して、これをメチルトリフラートで窒素原子をメチル化した。
【0113】
c)チオエステルを、エノールビス(シアノエチル)ホスフェートに転化した。チオエステルエノラートを、−78℃でTHF中LDAと1gのチオエステルの反応により生じさせ、更にこれと、THF中POCl3(0.64g)とピリジン(1.9g)とを反応させた。室温で1時間後、ピリジン1mL中3−ヒドロキシプロピオニトリル(1.14mL)と混合物を一夜攪拌した。反応混合物を濾過し、蒸発して酢酸エチルにより精製のためのカラムにかけ、ビス(シアノエチル)ホスフェートを得た。
【0114】
d)室温でアセトン/NaOH水溶液中での反応でホスフェートとカルボキシレートエステルの鹸化を起こさせ、化合物32(100mg)を得た。1H NMR(D2O)δ 2.33(t,2H),2.70(t,2H),3.34(s,3H),6.89〜7.34(m,10H),7.70〜7.80(d,1H),8.18〜8.19(d,1H).
【0115】
本出願人のPCT出願WO97/26245号公報及び米国出願番号08/928,793号明細書に記載したものから誘導して、標識置換基を付与することにより、多くの他のアクリダンホスフェート標識化合物を調製することができる。
【0116】
21.アクリダンホスフェート5の化学ルミネセンス強度のカイネティックプロフィール pH8.8のトリス緩衝液0.1M(10μL)中3.3x10-4Mのアクリダンホスフェート5を含有する試薬を0.4MのHNO3中3.6%の尿素過酸化物50μLと混合し、2分間インキュベートした。0.25MのNaOH溶液100μLを注入して化学ルミネセンスを誘発した。混合により即時発光が起こり、5秒間積算した。化学ルミネセンス放射の時間経過を図1に描いた。
【0117】
22.異なる酸の使用 アクリダンからの化学ルミネセンス発生方法における各種酸性化合物使用の可能性を表1及び2に示した。pH8.8のトリス緩衝液0.1M(10μL)中アクリダンホスフェート5(8nM又は2μM)を各種の酸溶液0.4M中3.6%の尿素過酸化物50μLと混合し、2分間インキュベートした。0.25MのNaOH溶液10μLを注入して化学ルミネセンスを誘発した。下記に要約したように、各酸は本発明方法に有効であり、迅速に発光した。光強度の値は任意単位である。合計強度は10秒間にわたって測定した。
【0118】
【表1】
アクリダンホスフェート5の8nM溶液での誘発
【0119】
【表2】
アクリダンホスフェート5の2μM溶液での誘発
【0120】
23.過酸化物/塩基の溶液による誘発
過酸化物が塩基溶液中にある誘発反応を用いることにより本発明の化合物から化学ルミネセンスを発生した。pH8.8のトリス緩衝液0.1M(10μL)中アクリダンホスフェート5の溶液2μMを0.4Mの酸50μLと混合し、2分間インキュベートした。0.25MのNaOH溶液中3.6%の尿素過酸化物100μLの添加によって化学ルミネセンスを開始した。下記に要約したように各酸は本発明方法に有効であった。合計強度は10秒間測定した。
【0121】
【表3】
【0122】
24.酸インキュベート時間の効果
アクリダンホスフェート5の溶液(0.4MのHCl中1μM)を、HCl/過酸化物インキュベート工程の長さを変えて実施例22に記述したように処理した。
【0123】
【表4】
【0124】
25.アクリダン誘導体5の検出感度
10-11〜10-17モルを含有するアクリダンホスフェート5の溶液(10μL)を、各々0.4MのHCl中3.6%の尿素過酸化物50μLに添加し、25℃で2分間インキュベートした。これらの溶液の各々に0.25MのNaOH100μLを添加することによって化学ルミネセンスを開始した。最大及び合計光強度を単一決定(single determination)によって測定した。バックグラウンドの光のレベルはこれらの条件下で0.038(最大)及び0.019(合計)であった。データを表5及び図2に示す。
【0125】
【表5】
【0126】
26.各種例示化合物の検出 表6の各化合物を0.5μM原液として調製した。10μLアリコートを別々に0.4MのHCl中3.6%の尿素過酸化物50μLに添加し、25℃で2分間インキュベートした。0.25MのNaOH100μLの添加によって化学ルミネセンスを誘発した。化学ルミネセンスを10秒間測定した。各化合物について有意なレベルを生じた。この実施例並びに実施例22及び23の条件下で誘発した場合、化合物2〜4,6〜13,18〜19及び21〜32も化学ルミネセンスを生じた。
【0127】
【表6】
【0128】
27.タンパク質への標識化合物の結合 ウシ血清アルブミン(BSA)(フルカ(Fluka))をリデュース−Imm(登録商標)(Reduce−Imm)キット(ピアース,ロックフォード(Pierce,Rockford), IL)を用いて希釈(reduce)し、遊離スルフヒドリル基を製造元の指示に従って遊離させた。
【0129】
リデュース−Immキットからの平衡緩衝液#2の200μL中270μgのBSA含有画分をメタノールに溶解したアクリダン誘導体25の溶液50μLで室温で一夜インキュベートした。この溶液を0.01MのホスフェートpH7.5と共にセファデックス(Sephadex)G−25カラムに通した。画分を280nmで分光光度的に、また、上記のように尿素過酸化物およびHNO3を用い、続いてNaOHを用いて化学ルミネセンス検定法によって分析した。標識及びタンパク質の両方を含有する画分をプールした。生成物をBSA−APNa2と命名した。
【0130】
28.アクリダン誘導体26へのBSAの結合 化合物26による希釈BSAの標識化をメタノールの代わりにDMFを用いて前記実施例の方法によって実施した。これにより、BSAはビス(シアノエチル)ホスフェートアクリダン化合物で標識された。生成物をBSA−APCN2と命名した。
【0131】
29.化学ルミネセンス標識化BSAの検出
BSA−APNa2及びBSA−APCN2のサンプルを(Warburg及びChristian,B.Z.,310,384(1941))に記載された方法によってタンパク質含量を検定した。貯蔵溶液をレムリ(Laemmli)緩衝液(U.K.Laemmli,Nature(London),227,680(1970)参照)中に希釈し、7%のアクリルアミド−ビスアクリルアミドのゲル上に載せた。タンパク質を、室温で1〜1.5時間、120〜130VでSDS−PAGEに供した。ゲルを取り出し、ペトリ皿と透明なフィルムの縁辺から構成されるプラスチックの枠の中ヘ置いた。
【0132】
ゲル中の標識化タンパク質を、簡単な化学ルミネセンス検定法によって検出した。ゲルホルダーを安全灯の下、X線フイルムのシートの尖端に置いた。0.4MのHNO3中尿素過酸化物(3.6%)の溶液をホルダー中のゲル上に積層し、20分間放置した。溶液をホルダーから吸引蒸発(aspirated)させ、0.25MのNaOH15mLを加えて発光を開始させた。ゲルを15分間X線フイルムに暴露した。図3A及び3Bは、ゲル中それぞれ直接に標識化タンパク質BSA−APNa2及びBSA−APCN2の検出を示す。発光は、数秒間にわたって増大し、極大まで上昇し、数分にわたって減衰した。
【0133】
30.標識化タンパク質の検出感度
10-11〜10-17モルの標識化タンパク質を含有する標識化タンパク質BSA−APNa2及びBSA−APCN2の溶液をpH8.8の0.1Mトリス緩衝液中で調製した。10μLアリコートをそれぞれ0.4MのHCl中3.6%の尿素過酸化物50μLに添加し、25℃で2分間インキュベートした。これらの各溶液に0.25MのNaOH100μLを添加することによって化学ルミネセンスを開始した。合計光強度の値を単一決定によって測定した。バックグラウンドの光のレベルは、これらの条件下でBSA−APCN2及びBSA−APNa2の両方に対して0.017であった。
【0134】
【表7】
【0135】
上記の説明並びに実施例は、本発明の説明に資するためのものであって、本発明の技術的範囲を限定するものではない。特別な化合物や方法が開示されていないものでも本発明の技術思想、技術範囲から外れるものではない。本発明の範囲は、特許請求の範囲から判断されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図1】 アクリダンホスフェート5の反応に起因する化学ルミネセンスの時間分布を示すグラフである。光の生成は、混合に続いて起こり、また、1秒以内で、最大強度に達している。
【図2】 化合物の量と、室温で誘発されるアクリダンホスフェート5により放射される最大化学ルミネセンス強度との関係を示すグラフである。化学ルミネセンス放射は、0.25NaOH溶液100μLを添加することにより、開始される。
【図3】 化学ルミネセンス反応が始まってすぐ20分間、ポリアクリルアミド電気泳動ゲルをX線フィルムに爆露させることによりゲル中の化学ルミネセンス標識化タンパク質を検出したX線フィルム像である。図3AはBSA−APNa2の検出を示し、図3BはBSA−APCN2の検出を示す。
Claims (35)
- 以下の工程、a)酸と、次の一般式I、
(式中、Z1及びZ2は相互に無関係にO,S及びNR12から選択され、R12はアルキル基、アリール基、アルキルスルホニル基及びアリールスルホニル基から選択され、R1は、酸によって除去され得る、C,N,O,S,P,Si及びハロゲン原子から選択される1〜約50個の非水素原子を有する基であり、R2及びR3は、C,N,O,S,P,Si及びハロゲン原子から選択される1〜50個の非水素原子を有する有機基であり、R4〜R11は、相互に無関係に水素原子及び化学ルミネセンスの発生を阻害しない置換基から選択される)で表される化合物とを接触させて第1の反応生成物を生成させる工程と、b)第1の反応生成物を塩基性の環境を提供するに充分な量の塩基と接触させる工程とを包含する反応に供し、これら工程の少なくとも1つに、化合物Iかまたは第1の反応生成物かいずれかとの反応のためのオキシダントを付与し、これにより第2の反応生成物を生成させ、塩基性環境下で光を発生させることを含むことを特徴とする化学ルミネセンスの発生方法。 - R’及びR”が、夫々2−シアノエチル基である請求項2記載の方法。
- R’及びR”が、夫々アルカリ金属イオンである請求項2記載の方法。
- Z2がOまたはSであり、かつ、R2がフェニル及び置換フェニル基から選択される請求項2記載の方法。
- オキシダントが過酸化水素、アルキルヒドロペルオキシド、過酸化水素の錯体、過マンガン酸塩、過ヨウ素酸塩、金属酸化物及び金属過酸化物から選択される請求項1記載の方法。
- 酸が鉱酸、有機酸及びルイス酸から選択される請求項1記載の方法。
- 鉱酸が塩酸、硝酸、硫酸及び過塩素酸から選択される請求項10記載の方法。
- 塩基が水酸化物塩、炭酸塩、塩基性金属酸化物及び有機塩基から選択される請求項1記載の方法。
- 水酸化物塩がアルカリ金属塩である請求項12記載の方法。
- オキシダントが酸との混合物中に存在する請求項1記載の方法。
- 酸が塩酸であり、オキシダントが尿素過酸化物であり、かつ、塩基が水酸化ナトリウムである請求項14記載の方法。
- オキシダントが塩基との混合物中に存在する請求項1記載の方法。
- 酸が硝酸であり、オキシダントが尿素過酸化物であり、かつ、塩基が水酸化ナトリウムである請求項16記載の方法。
- 以下の工程、a)化学式Iの化合物から化学ルミネセンスを発生させる工程と、b)化学ルミネセンスを検出する工程と、c)化学ルミネセンスとサンプル中のアナライトの量とを関係づける工程と、を含む、請求項1記載の方法によるサンプル中のアナライトの検定方法。
- 化学式Iの化合物がリポソームまたはラテックス粒子内に封入されている請求項18記載の方法。
- さらに、a)化学ルミネセンス標識化化合物をゲル電気泳動に供する工程と、b)ゲル中で化学ルミネセンスを生ぜしめる工程と、を含む請求項18記載の方法。
- ゲルがアクリルアミドおよびアガロースのゲルから選択される請求項20記載の方法。
- 基R1〜R11の1個が式−L−RG(式中、Lは結合置換基、RGは反応基である)で表される標識置換基を有し、化学式Iの化合物を最初に化学ルミネセンス発生前に特異的結合対の部分と結合させる請求項1記載の方法。
- 基R1〜R11の1個が式−L−RG(式中、Lは結合置換基、RGは反応基である)で表される標識置換基を有し、化学式Iの化合物を化学ルミネセンス発生前に最初に特異的結合対の部分と結合させる請求項18記載の方法。
- アナライトが過酸化物であり、オキシダントとして作用する請求項18記載の方法。
- アナライトがオキシダーゼ酵素およびデヒドロゲナーゼ酵素から選択され、さらにオキシダーゼ酵素またはデヒドロゲナーゼ酵素を該酵素に対する基質と反応させて過酸化物を発生させる工程を含み、この際、該過酸化物がオキシダントとして作用する請求項18記載の方法。
- 反応基がOH,NH2,COOH,SO2CH2CF3,N−ヒドロキシスクシンイミドエステル及びマレイミド基から選択される請求項26記載の方法。
- R’及びR”が、夫々2−シアノエチル基である請求項29記載の方法。
- R’及びR”が、夫々アルカリ金属イオンである請求項29記載の方法。
- Z2がOまたはSであり、かつ、R2がフェニル及び置換フェニル基から選択される請求項29記載の方法。
- アナライトが、医薬物質、ホルモン、農薬物質、代謝産物、DNA、RNA、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体フラグメント、抗体−DNAキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、炭水化物、レクチンおよび受容体から選択される請求項34記載の方法。
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