JP4431272B2 - ペルオキシダーゼにより化学ルミネセンスを発生する新規化合物 - Google Patents
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Description
【０００１】
技術分野
本発明は、ペルオキシドおよび過酸化物と反応して化学ルミネセンスを発生させる、化学ルミネセンス組成物に関する。特には、本発明は、ペルオキシドおよび過酸化物と反応して励起状態カルボニル化合物を生成する、新規な電子過剰（リッチ）アルケンを含む組成物に関する。本発明は、さらに、免疫検定、核酸プローブ検定等において、ペルオキシダーゼを検出するため、および、ペルオキシダーゼ標識化（標識されている）特異的結合パートナーを検出するための検定法に関する。
【０００２】
従来技術
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のようなペルオキシダーゼ酵素は、生物学的分子および他の重要なアナライト、例えば、薬物、ホルモン、ステロイドおよび癌のマーカー、についての酵素結合検定法において、マーカーまたは標識としてしばしば用いられる。これらの酵素の化学ルミネセンス検出は、サンプル中の酵素の量または酵素標識化アナライト若しくはアナライトに対する標識化特異的結合パートナーの量の定量的尺度を規定する、安全で、便利かつ高感度の手段を提供する。他の化学ルミネセンス反応スキムは、特定のペルオキシダーゼ酵素の標識の定量のために発展してきた。
【０００３】
ａ．化学ルミネセンスペルオキシダーゼ基質
よく知られたルミノールやイソルミノールのようなアミノ置換環式アシルヒドラジドは、発光のための基本条件の下で、Ｈ2Ｏ2およびペルオキシダーゼ触媒（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ＨＲＰ）と反応する。この反応は、Ｈ2Ｏ2の検出およびペルオキシダーゼについての分析法に関する基礎として用いられている。ルミノール、例えば、（８−アミノ−５−クロロ−７−フェニルピリド［３，４−ｄ−ピリダジン−１，４（２Ｈ，３Ｈ）ジオン（Ｍ．Ｉｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１９３（２），５４０−５（１９９３））；ピリダジノキノキサリノン（米国特許第５，３２４，８３５号）および１，３−２置換ピラゾロ［４’，３’：５’，６’］ピリド−［２，３−ｄ］−ピラジンジオン（Ｙ．Ｔｏｍｉｎａｇａ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６，８６４１−４（１９９５））のヘテロ環式類似体は、ペルオキシダーゼおよび過酸化物と反応して化学ルミネセンスを発生させることが知られている。ペルオキシダーゼおよび過酸化物により酸化されると化学ルミネセンス性となる他のヒドラジド化合物には、ヒドロキシ置換フタルヒドラジドがある（米国特許第５，５５２，２９８号）。
【０００４】
出願人は、米国特許第５，４９１，０７２号、第５，５２３，２１２号および第５，５９３，８４５号において、ペルオキシダーゼの検出中および検定法中における使用に関し、過酸化物およびペルオキシダーゼとの反応時に光を発生させる化学ルミネセンス性Ｎ−アルキルアクリダン−カルボン酸エステル、チオエステル、および、スルホンアミドを開示している。ＰＣＴ出願（ＷＯ９４／０２４８６）には、スピロアクリダン化合物と過酸化水素との化学ルミネセンス性反応が記載されている。反応は、ホースラディッシュペルオキシダーゼの付加により促進される。
【０００５】
ルシフェリンと総称される、生物学的起源を有する種々の化合物は、ペルオキシダーゼにより酸化される（Ｌ．Ｊ Ｋｒｉｃｋａ ａｎｄ Ｇ．Ｈ．Ｇ．Ｔｈｏｒｐｅ，ｉｎ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｋ．Ｖａｎ Ｄｙｋｅ ａｎｄ Ｒ．Ｖａｎ Ｄｙｋｅ，ｅｄｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９０，ｐｐ．７７−９８中に要約されている）。一定の場合には、過酸化水素は酵素がオキシダーゼとして作用する場合には利用できない。
【０００６】
一定のフェノール化合物は、ペルオキシダーゼによる酸化時に化学ルミネセンスを発生させる。その例としての、ピロガロールＢ−１およびプルプロガリンＢ−２は、クマリン型化合物クマリン、アンベリフェロンおよびエスカリン（Ｄ．Ｓｌａｗｉｎｓｋａ，Ｊ．Ｓｌｏｗｉｎｓｋｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．，４，２２６−３０（１９８９））と同様に、Ｋｒｉｃｋａ ａｎｄ Ｔｈｏｒｐｅの同文献中に列挙されており、また；フロログルシノールＢ−３（Ｍ．Ｈａｌｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，３０，１６５−７（１９７９））；およびアセトアミノフェンＢ−４（Ｋ．Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｇ．Ｃｉｌｅｎｔｏ，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，５１，７１９−２３（１９９０））がある。
【０００７】
酸素または過酸化物およびペルオキシダーゼの存在下で弱い化学ルミネセンスを発生させることが報告されている他の種々の化合物としては、合成シッフ塩基含有ポリマー（（Ｒ．Ｚｏｕｌｉｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｌ．Ｃｚｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，６０，９５−１０３（１９９５））；キサンテン染料の存在下で、過酸化水素を用いて、または用いずに、インドール−３−酢酸（Ｓ．Ｋｒｙｌｏｖ，Ａ．Ｃｈｅｂｏｔａｒｅｖａ，ＦＥＢＳ，３２４（１），６−８（１９９３）；チロシン、トリプトファンおよびクロールプロマジン（Ｍ．Ｎａｋａｎｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．４，２３１−４０（１９８９））およびＭＣＬＡ Ｂ−８ Ｍ．（Ｍｉｔａｎｉ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．９，３５５−６１（１９９４））があり，これらは夫々以下に示すＢ−５〜Ｂ−８のような構造を有している。
上述の参考文献中には、本明細書中で開示される化合物のペルオキシダーゼによる化学ルミネセンス性酸化が開示されているものはない。
【０００８】
ｂ．エノールとＨＲＰとの反応
一連の論文には、エノール化可能なアルデヒドのペルオキシダーゼ触媒化空気酸化が記載されている（Ｈ．Ｇａｌｌａｒｄｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７８９，５７−６２（１９８４）；Ｗ．Ｊ．Ｂａａｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｄ．，１４（４），１９０−２（１９８６）；Ｉ．Ｎａｎｔｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，６３（６），７０２−８（１９９６））。反応基質は、アルデヒドとの平衡時においてはエノール形態は少量であると考えられる。アルデヒドの反応はエノールホスフェートにより触媒されるが、エノールホスフェートそのものは消費されない。参考文献によれば、エノールホスフェートはペルオキシダーゼと反応して化学ルミネセンスを発生させることはないことがわかる。蛍光エネルギー受容体へのエネルギー移動は、発光を増大させる（Ｍ．Ｔ．Ｇｒｉｊａｌｂａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，６３（６），６９７−７０１（１９９６））。エノールシリルエーテル（Ｂａａｄｅｒ，ｉｂｉｄ）またはエノールアセテートのようにマスクされたアルデヒドは共役検定法において用いられ、この方法では、エノールは最初の段階でマスクを外されてもとの位置にエノールを生成し、続いてペルオキシダーゼと反応して化学ルミネセンスを発生させる（Ａ．Ｃａｍｐａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，６３（６），７４２−５（１９９６））。
【０００９】
ｃ．ペルオキシダーゼエンハンサー
非常に多くのエンハンサーが、ペルオキシダーゼと前述のルミノールやアクリダンカルボン酸誘導体等の既知の化学ルミネセンス性基質との反応からの、化学ルミネセンスの量および持続時間を増大させるために用いられている。これらには、Ｄ−ルシフェリンのようなベンゾチアゾール誘導体、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−フェニルフェノール、ナフチルのような種々のフェノール化合物、および、Ｇ．Ｔｈｏｒｐｅ，Ｌ．Ｋｒｉｃｋａ，ｉｎ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｎｅｗ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，Ｊ．Ｓｃｈｏｌｍｅｒｉｃｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，ｐｐ．１９９−２０８（１９８７）中に列挙されているような芳香族アミン等がある。アミノ置換環式アシルヒドラジドのペルオキシダーゼによる化学ルミネセンス性酸化におけるエンハンサーとして作用する他の化合物には、４−（４−ヒドロキシフェニル）−チアゾール（Ｍ．Ｉｉ，ｉｂｉｄ）、米国特許第５，１７１，６６８号中に開示された一群の化合物、２−ヒドロキシ−９−フルオレノン、および、米国特許第５，２０６，１４９号中に開示されているような一群のヒドロキシ置換ベンゾキサゾール誘導体、並びに、米国特許第５，６２９，１６８号中に記載されているような一定のフェニルホウ素酸化合物等がある。上述の参考文献中には、ペルオキシダーゼ単独による、または、エンハンサーを伴った、本発明の化合物の、化学ルミネセンス性酸化が開示されているものはない。
【００１０】
ｄ．界面活性剤による化学ルミネセンス性ペルオキシダーゼ反応の促進
重合体および単量体界面活性剤を用いたペルオキシダーゼ触媒化反応において発生する化学ルミネセンスの促進は、当該技術分野において既知である。促進は、例えば、エミッターの蛍光量子収率を増大させることにより、励起状態で生成する生成物分子のパーセンテージを増大させることにより、競合する副反応の阻害を通じて化学ルミネセンス性反応を引き起こす分子の部分を増加させることにより、または、酵素触媒の作用を促進することにより、１またはそれ以上の段階の結果に影響を及ぼすことで引き起こすことができる。化学ルミネセンス反応における重合体および単量体界面活性剤の作用に関して、明確なまたは矛盾のないパターンは存在しない。界面活性剤化合物があるとしても、特定の過程からの化学ルミネセンスを促進し、かつ、実際の実験によってのみ決定することができることを予想することは不可能である。
【００１１】
カチオンポリマー界面活性剤ポリ−Ｎ−エチル−４−ビニル−ピリジニウムブロミドは、ルミノールの負帯電インシュリン−ペルオキシダーゼ複合体による化学ルミネセンス性反応を完全に阻害し、化学ルミネセンスを天然の酵素を用いた場合の最低限度まで減少させる（Ｓ．Ｂ．Ｖｌａｓｅｎｋｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．４，１６４−１７６（１９８９））。
【００１２】
発行済みの日本国特許出願番号０６，２４２，１１１号および文献（Ｒ．Ｉｗａｔａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３１，１７０−４（１９９５））には、バックグラウンド放射または高められた信号若しくはノイズを低下させるための、ルミノールの化学ルミネセンス性過酸化における非イオン界面活性剤および脱脂乳の使用が開示されている。
【００１３】
上述の参考文献には、本発明の化合物のペルオキシダーゼによる化学ルミネセンス性酸化または界面活性剤を用いた化学ルミネセンスの促進が開示されているものはない。
【００１４】
ｄ．ＨＲＰを用いた検定法 酵素ホースラディッシュペルオキシダーゼは、ルミノールまたはイソルミノールを基質として用いた化学ルミネセンス性検出を伴う酵素免疫検定およびＤＮＡハイブリッド形成検定法において、広く使用されていることが知られている。ＨＲＰ複合体および促進されたルミノール化学ルミネセンス性検出を用いた市場で入手しうるキットは有用である。化学ルミネセンス性ペルオキシダーゼ検定法は、また、前述の米国特許第５，４９１，０７２号、５，５２３，２１２号、および、５，５９３，８４５号中にも開示されている。本発明の化合物を基質として用いた化学ルミネセンス性ペルオキシダーゼ検定法が開示されている参考文献はない。
【００１５】
発明の概要
本発明の目的は、ペルオキシダーゼおよび過酸化物と反応して化学ルミネセンスを発生させる化合物を含む組成物を提供することにある。
【００１６】
本発明の他の目的は、ペルオキシダーゼおよび過酸化物との反応によりペルオキシダーゼの検出のための化学ルミネセンスが得られる化合物を含む組成物を提供することにある。
【００１７】
本発明の目的はまた、二重結合の一端が、異なる基Ｘ若しくはＲ1と夫々結合している、酸素原子または硫黄原子から選択される２個の原子により置換され、かつ、二重結合の他端が、励起状態生成物Ａ1Ａ2Ｃ＝Ｏ*が下記式Ｉの化合物とペルオキシダーゼおよび過酸化物との反応において生ずるように選択される基Ａ1およびＡ2により置換されている、炭素−炭素二重結合を有する下記式Ｉ、
で表される化合物を含む組成物を提供することにある。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、式Ｉ（式中、Ａ1およびＡ2は炭素原子と共に結合してヘテロ環式または炭素環式環を形成する）で表される化合物を含む組成物を提供することにある。特には、環は、窒素原子、硫黄原子または酸素原子含有ヘテロ環式環の基とすることができる。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、式Ｉ（式中、Ｚ2がＯである場合には、酸素原子と結合している基は、アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、ホスフェートモノ−、ジ−、若しくはトリエステル基、カルボキシルエステル基、スルフェート基、糖基またはシリルエステル基の一部であり、また、Ｚ2がＳである場合には、硫黄原子と結合している基は、等価なチオ基の一部である）で表される化合物を含む組成物を提供することにある。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、本発明の組成物を用いた、ペルオキシダーゼおよび過酸化物との反応における化学ルミネセンスの発生方法を提供することにある。
【００２１】
さらにまた、本発明の目的は、本発明の化合物とペルオキシダーゼとの反応において発生させる化学ルミネセンスの促進のための方法および組成物を提供することにある。
【００２２】
本発明のさらにまた他の目的は、免疫検定、拡散プローブ検定、ウェスタンブロット検定法、サザンブロット検定法、および、アナライトの検出のための酵素標識を付与する一般によく知られた方法を用いた他の検定法において、ペルオキシダーゼおよび複合体の検出において使用するための化学ルミネセンス性組成物および方法を提供することにある。従って、検定法は、ペルオキシダーゼまたは複合体の検出によるかかる検定法においてアナライトを検出し、かつ、アナライトの存在または量とそれによって発生させる化学ルミネセンスとを関係づけるために有用である。
【００２３】
発明を実施するための最良の形態
定義
アルキル基 − 分枝か、直鎖又は環状の、１〜２０個の炭素原子を有する炭化水素基。ここで使用する低級アルキル基とは、８個以下の炭素原子を有するアルキル基を称する。
【００２４】
アルケニル基 − 分枝か、直鎖又は環状の、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を有し、２〜２０個の炭素原子を有する炭化水素基。ここで使用する低級アルケニル基とは、８個以下の炭素原子を有するアルケニル基を称する。
【００２５】
アルキニル基 − 分枝又は直鎖の、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を有し、２〜２０個の炭素原子を有する炭化水素基。ここで使用する低級アルキニル基とは、８個以下の炭素原子を含有するアルキニル基を称する。
【００２６】
アナライト − 検定によって試料中からその存在又はその量が測定される物質。アナライトには、特異的な結合親和力を持つ特異的結合パートナーが存在する有機及び生物学的分子などがある。アナライトを例示すれば、以下のものに限定するものではないが、一本鎖、又は二本鎖ＤＮＡやＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ複合体、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体フラグメント、抗体−ＤＮＡキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン及びビオチンなどがある。その他のアナライトの例には、加水分解酵素、加水分解酵素阻害剤およびジヒドロキシ芳香族化合物などがある。
【００２７】
アリール基 − 水素原子以外の１個以上の置換基で置換し得る１〜５個の芳香環を有する芳香環含有の基。
【００２８】
生物医学的分析 − 注目するアナライトの生物学的起源サンプルの分析。かかる分析とは、免疫検定、ウェスタンブロット、ノーザンブロット、サザンブロット、ＤＮＡハイブリッド形成検定、ＤＮＡ配列分析、コロニーハイブリッド形成法、遺伝子発現分析、高処理量医薬物質スクリーニング、伝染病薬剤又は病原体の検出などである。
【００２９】
グリコシル − 六単糖及び五単糖を包含する炭水化物の残基で、１個以上の糖単位を有する。例としては、果糖、ガラクトース、葡萄糖、グルクロネート、マンノース、リボース、Ｎ−アセチルグルコサミンなどである。
【００３０】
ハロゲン − フッ素、塩素、臭素又はヨウ素原子。
【００３１】
ヘテロアリール基 − 少なくとも１個の環の炭素原子が窒素、酸素又はイオウ原子で置換され、また水素原子以外の１個以上の置換基で置換され得る１〜５個の炭素環状芳香環を有する芳香環含有の基。
【００３２】
ルミネセンス − 電子的励起状態に励起した場合に、発光できる能力。励起１重項状態からの壊変の場合は蛍光として、励起３重項状態からの壊変の場合はリン光として、いずれも発光できる。
【００３３】
過酸化物 − Ｏ−Ｏ結合を有する化合物で、好ましくは過酸化水素又は過酸化水素の複合体、例えば、尿素過酸化物（ｕｒｅａ ｐｅｒｏｘｉｄｅ）、過ホウ酸又は過炭酸。
【００３４】
サンプル − 検定すべき１個以上のアナライトを含有するか、又は含有すると思われる液体。化学ルミネセンス反応法によって分析される代表的なサンプルは、生物学的サンプルで、体液、例えば血液、血漿、血清、尿、精液、唾液、セルリゼート（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅｓ）、組織抽出物などである。別の種類のサンプルとしては、食品のサンプル及び土壌あるいは水のような環境関連のサンプルなどがある。
【００３５】
特異的結合対 − 相互に結合親和力を示す二つの物質。その例は、抗原−抗体、ハプテン−抗体又は抗体−抗体対、相補的オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、ホルモン−受容体、レクチン−炭水化物、ＩｐＧ−タンパク質Ａ、核酸−核酸結合タンパク質及び核酸−抗核酸抗体などである。
【００３６】
置換 − 基における、少なくとも１個の水素原子を、非水素原子基により置き換えることをいう。置換基に関しては、特に明示しない限り複数の置換位置が存在し得ることに留意を要する。
【００３７】
下記に示す式Ｉの化合物が過酸化物およびペルオキシダーゼと反応して化学ルミネセンスを発生させることが期せずして見出された。ペルオキシダーゼの存在下で化学ルミネセンスを発生させる本発明の化合物は、二重結合の一端で、酸素原子または硫黄原子から選択される２個の原子にて置換された炭素−炭素二重結合を有し、かつ、下記式Ｉ、
（式中、Ｚ1およびＺ2は相互に無関係に酸素原子または硫黄原子から選択され、Ｒ1は１〜約５０個の非水素原子を有する有機基であり、Ｘは１〜約５０個の非水素原子を有する基であり、また、Ａ1およびＡ2は、電子的励起状態生成物Ａ1Ａ2Ｃ＝Ｏ*が以下の反応、
に従って、式Ｉの化合物とペルオキシダーゼとの反応において生ずるように選択される基である）で表される。
【００３８】
基Ａ1、Ａ2、Ｚ1、Ｚ2、ＸおよびＲ1は、得られる化合物Ｉが電子過剰（リッチ）炭素−炭素二重結合を有するように選択される。一般に、酸素原子および硫黄原子から選択されるＺ1およびＺ2を有する、一般式Ｉで表されるほとんどの化合物は、十分に電子過剰（リッチ）の炭素−炭素二重結合を有する。Ａ1および／またはＡ2が強く電子求引性基である化合物は、作用せず、好ましくない。
【００３９】
基Ｒ1は、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子、ケイ素原子またはハロゲン原子から選択される１〜約５０個の非水素原子を有するいかなる有機基であってもよく、発光を生ぜしめる。このことは、式Ｉの化合物がペルオキシダーゼおよび過酸化物と反応した場合には光が発生し、またこれには１個またはそれ以上の化学ルミネセンス性中間体の生成を伴い得ることを意味する。Ｒ1基として作用しうる基には、限定はされないが、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基および置換アラルキル基等がある。水素原子以外の置換基、例えば、イオン性基または極性基が、様々な個数で、かつ、Ｒ1の炭素鎖または環上の選択された位置において、化合物の特性を改質するため、または、合成の便宜のために、結合していてもよい。かかる特性には、例えば、化学ルミネセンス量子収率、酵素との反応速度、最大発光強度、発光の持続時間、発光波長、反応媒体中での溶解度等がある。特異的結合パートナーのような他の分子との共有カップリングが可能な１またはそれ以上の基も、Ｒ1における置換基とすることができる。特異的置換基およびその作用の具体例は以下の特異例中で図示するが、本発明の範囲はこれにより制限されるものではない。
【００４０】
基Ｘは、１〜２０個の炭素原子を有する置換または無置換のアルキル基、置換または無置換のアリール基、置換または無置換のアラルキル基、１〜２０個の炭素原子を有する置換または無置換のアルキル若しくはアリールカルボニル基、トリ（Ｃ1〜Ｃ8アルキル）シリル基、ＳＯ3 -基、グリコシル基、および、式ＰＯ（ＯＲ’）（ＯＲ’’）（式中、Ｒ’およびＲ’’は、相互に無関係に、１〜２０個の炭素原子を有する置換または無置換のアルキル基、置換または無置換のアリール基および置換または無置換のアラルキル基、トリアルキルシリル基、アルカリ金属カチオン、アルカリ土類カチオン、アンモニウムおよびホスホニウムカチオンから選択される）で表されるホスホリル基から選択される。置換アルキル基は、水素原子以外の基、例えば、イオン性基または極性基を少なくとも１個有し、かつ、化合物Ｉの特性を改質するため、または、合成の便宜のために、Ｒ’またはＲ’’の炭素鎖または環上の選択された位置において結合していてもよい。置換アルキル基の具体例としては、シアノエチル基またはトリメチルシリルエチル基等がある。
【００４１】
基Ａ1およびＡ2は、相互に無関係に水素原子または有機基から選択されて、化合物Ｉと過酸化物およびペルオキシダーゼとの反応において電子的励起状態生成物Ａ1Ａ2Ｃ＝Ｏ*を生成するものであり、制限されるものではないが、少なくとも１個が水素原子でないとの条件で、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基および置換アラルキル基、ヘテロアリール基、置換へテロアリール基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルアミノ基、アリールアミノ基、アルキルチオおよびアリールチオ基等である。基Ａ1およびＡ2は、共に結合して、Ａ1およびＡ2を引き離している炭素原子を含むヘテロ環式または炭素環式環を形成してもよい。一般に、基Ａ1およびＡ2は、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子およびハロゲン原子から選択される１〜５０個の非水素原子と、さらに、通常は１〜２０個の非水素原子を有する。
【００４２】
式Ｉで表される好適化合物の最初の群においては、Ａ1およびＡ2のうちの１個が、置換または無置換のアリール基であり、もう１個が、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基、置換アラルキル基、ヘテロアリール基、置換へテロアリール基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルアミノ基、アリールアミノ基、アルキルチオおよびアリールチオ基から選択される。好ましくは、アリール基の少なくとも１個がアミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、および、ＯＹ’（式中、Ｙ’はハロゲン原子またはアルカリ金属イオンである）から選択される少なくとも１個の基で置換されている。アリール基は、１−４縮合炭素環式またはヘテロ環式５または６員環を有する。１またはそれ以上の環がヘテロ環式環である場合、環中のヘテロ原子は窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選択される。好適なアリール基は、フェニル基、ナフチル基、アンスリル基およびピレニル基であり、これらのうちのいずれかが、非水素置換基により置換されていてもよい。より好適なものは、フェニル基およびナフチル基である。
【００４３】
本発明の方法により反応して化学ルミネセンスを発生させる式Ｉの化合物の特定具体例としては、下記構造式
（式中、Ｙは水素原子、アルカリ金属イオンまたは置換若しくは無置換のアルキル基、置換若しくは無置換のアリール基、置換若しくは無置換のアラルキル基またはトリアルキルシリル基であり、Ｙ’はアルカリ金属イオン、アルキルカルボキシエステル、アリールカルボキシエステル、置換若しくは無置換のアルキル基、置換若しくは無置換のアリール基、置換若しくは無置換のアラルキル基またはトリアルキルシリル基であり、また、Ｙ’’は、水素原子またはハロゲン原子、特には塩素原子である）で表される化合物が挙げられる。これらの構造に関して表されているのは１個の二重結合異性体のみであるが、本発明の方法においては、異性体かまたはその２個の混合物かのいずれを用いてもよいことがわかっている。上述の制限を受ける他の構造は、本発明の方法において有用であるような技術分野における技術の１つを生み出す。
【００４４】
好適化合物の２番目の群は、下記式II、
（式中、Ａ1およびＡ2は共に結合して「Ｈｅｔ」で示すヘテロ環式環を形成する）で表される。ヘテロ環式環系は、窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を有する、少なくとも１個の５または６員環を有する。基Ｚ1、Ｚ2、ＸおよびＲ1は、上記で定義したものと同様である。
【００４５】
ヘテロ環式環系は、環外二重結合を有する環の炭素原子と共に複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）中に存在する、窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を有する。好適なヘテロ環式化合物には、下記式IIIおよびIV、
（式中、ＱはＮＲ6、酸素原子および硫黄原子から選択され、ＺおよびＲ1は上記で定義されたものと同様であり、また、Ｒ2〜Ｒ6は、以下で定義する）で表される化合物およびこれらの二重結合異性体または該異性体の混合物等がある。
【００４６】
戻って式IIを参照すると、基Ｈｅｔを有してもよい環構造の具体例としては下記の構造等があり、環外二重結合の位置にアステリスクが記されている。すべての可能な置換パターンを明確に示さなくても、かかる環構造の具体例において、夫々の環の位置に水素以外の置換基が存在してもよい。本明細書中で述べる方法の実施に際して有用な他のヘテロ環式環化合物は、特に以下に列挙したものだけではなく、式IIの範囲内に入っていればよいことは、熟練の技術者には明らかであるだろう。
【００４７】
【００４８】
【００４９】
式IIIおよびIVで表される上記の化合物のすべてにおいて、基Ｒ2〜Ｒ5は夫々相互に無関係に水素原子または光を発生させる置換基であり、一般に、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子およびハロゲン原子から選択される１〜５０個の原子を有する。存在し得る代表的な置換基には、制限はされないが、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、置換アミノ基、カルボキシル基、カルボアルコキシ基、カルボキシアミド基（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、シアノ基およびスルホネート基等がある。隣接する基のどちらか一方または双方の対、すなわち、Ｒ2−Ｒ3またはＲ4−Ｒ5は、共に結合して、環外二重結合を有する環と縮合している、少なくとも１個の５または６員環を有する炭素環式またはヘテロ環式環系を形成してもよい。かかる縮合ヘテロ環式環は、窒素原子、酸素原子または硫黄原子を有していてもよく、また、上記で言及したもののような、水素原子以外の環の置換基を有していてもよい。
【００５０】
上述の化合物のすべてにおいて、基Ｒ6は、基内の原子の結合価を満足するために要求される必要な数の水素原子に加えて、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子およびハロゲン原子から選択される１〜５０個の非水素原子を有する有機基である。より好適には、Ｒ6は、１〜２０個の非水素原子を有する。有機基は、好適にはアルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基およびアラルキル基を含む基から選択される。Ｒ6に関してより好適な基には、置換または無置換のＣ1〜Ｃ4アルキル基、置換または無置換のベンジル基、アルコキシアルキル基およびカルボキシアルキル基等がある。
【００５１】
置換基は、様々な個数で、かつ、ヘテロ環式環上の選択された環または鎖の位置において、化合物の特性を改質するため、または、最終的なホスフェート化合物の合成の便宜のために、導入することができる。かかる特性には、例えば、化学ルミネセンス量子収率、酵素との反応速度、最大光強度、発光の持続時間、発光波長および反応媒体中での溶解度等がある。特異的置換基およびその作用は、以下の特異例中で図示するが、これは、いかなる点においても本発明の範囲をこれにより制限するものではない。
【００５２】
好ましい種類の化合物は、下記式Ｖ、
（式中、Ｒ1は少なくとも１個の炭素環式またはヘテロ環式芳香環を有するアリール環基であり、さらに置換されていても、または、置換若しくは無置換のアルキル基であってもよく、Ｚ1は酸素原子および硫黄原子から選択され、また、ＸおよびＲ6は上記で定義されたものと同様のものである）で表される。
【００５３】
基Ｒ7〜Ｒ14は、同一であっても異なっていてもよく、夫々、炭素原子、水素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子およびハロゲン原子から選択される１〜５０個の原子を有してもよく、かつ、光の発生をもたらす置換基であり、制限はされないが、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、置換アミノ基、カルボキシル基、カルボアルコキシ基、カルボキシアミド基（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、シアノ基およびスルホネート基等とすることができる。Ｒ7〜Ｒ14は、好適には、水素原子、ハロゲン原子およびアルコキシ基、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｔ−ブトキシ基等から選択される。化合物の好適な基は、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ12またはＲ13のうちの１個を塩素原子として有し、また、Ｒ7〜Ｒ14のうちの他の１個がハロゲン原子である。
【００５４】
より好適には、下記式VI、
（式中、ＺおよびＲ1は上記で定義されたものと同様のものであり、Ｘはホスホリル基−ＰＯ（ＯＲ’）（ＯＲ’’）（式中、Ｒ’およびＲ’’は相互に無関係に、１〜２０個の炭素原子を有する、置換または無置換のアルキル基、置換または無置換のアリール基および置換または無置換のアラルキル基、トリアルキルシリル基、アルカリ金属カチオン、アルカリ土類カチオン、アンモニウム、および、ホスホニウムカチオンから選択される）である）で表される化合物である。
【００５５】
好ましくはＲ’およびＲ’’のうちの少なくとも１個がアルカリ金属カチオンであり、より好ましくは双方である。アルカリ金属の中では、リチウム、ナトリウムおよびカリウムが好ましい。
【００５６】
式Ｉの化合物は、様々な方法で製造することができる。好適な方法においては、Ｚ2基が酸素原子であり、かつ、Ｚ1が酸素原子または硫黄原子である場合には、化合物Ｉは、エステルまたはチオエステルのエノラートと式Ｘ−ＬＧ（式中、ＬＧは下記スキムに従う離脱基である）で表される試薬との反応により製造することができる。
【００５７】
代表的な離脱基としては、ハロゲン原子、例えば、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子、スルホネート、例えば、メタンスルホネートおよびｐ−トルエンスルホネートおよびトリフルオロメタンスルホネート、特にＸがアシル基のときにはアセテートおよびベンゾエートのようなカルボキシレート、この場合にはＸ−ＬＧが酸無水物であってよく、メトスルフェートのようなスルフェート、およびその他の基、例えば、イミダゾール、トリアゾールおよびテトラゾール、マレイミド、サクシンイミドキシ基等がある。
【００５８】
双方のＺ基が硫黄原子である場合の式Ｉの化合物の製造方法には、下記の２つのスキムに従う、好適なカルボニル化合物に対するリチオシラン化合物またはリンイリドの求核付加がある（Ｆ．Ａ．Ｃａｒｅｙ，Ａ．Ｓ．Ｃｏｕｒｔ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，３７，１９２６〜２９，（１９７２））。
【００５９】
【００６０】
他の方法においては、Ｅ．Ｊ．Ｃｏｒｅｙ ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｋｏｚｉｋｏｗｓｋｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，９２５‐８（１９７５）中に開示されており、かつ、以下に示すように、エステルが、ビス（ジアルキルアルミニウム）−ジチオール試薬との反応により、ケテンジチオアセタールに転化する。
【００６１】
【００６２】
さらにまた他の方法においては、活性メチレン基のアニオンがＣＳ2と反応し、かつ、ジチオカルボキシレートがＲ1基を有する試薬Ｒ1‐ＬＧと反応して、ジチオエステルを形成する。後者の方法論の例は、Ｉ．Ｓｈａｈａｋ ａｎｄ Ｙ．Ｓａｓｓｏｎ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，４２０７‐１０（１９７３）中に開示されている。ジチオエステルは、エノラートに転化して、式Ｘ−ＬＧで表される試薬と反応する。
【００６３】
本発明のもう一つの面は、ペルオキシダーゼとの反応による化学ルミネセンスの発生方法における、式Ｉ〜VIのいずれかの化合物の使用にある。水性緩衝溶液中における式Ｉ〜VIの化合物とペルオキシダーゼおよび過酸化物との反応は、検出される化学ルミネセンスを容易に発生させる。反応がアルカリ性ｐＨで行われた場合、光の強度は、数分以内に室温において最大レベルに達する。反応は、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）の存在下で、自由選択的に行われる。
【００６４】
本発明者らはこの点におけるこの発見に関する特異的なメカニズムの説明をすることはないが、光は、上記式VIIで表される電子的励起状態から放射されると考えられている。発光の必要条件は、反応が式VIIの励起状態を形成するために十分なエネルギーを生成することである。VII*が発光性であれば、そのとき化学ルミネセンスは、式VIIの励起状態からの放射を介しての反応から発生する。組成物VII*が有意に発光性でないならば、そのときは化学ルミネセンスは発光エネルギー受容体を含めることにより発生させることができる。
【００６５】
好適な化学ルミネセンスの発生方法においては、化合物Ｉを、約８〜１０の間のｐＨを有するアルカリ性緩衝液中で、ペルオキシダーゼ、過酸化物およびエンハンサーと反応させて、酵素および化合物Ｉの反応において開始する、連続的な化学ルミネセンス信号を発生させる。分析精度は、以下に、より詳細に述べるように、非イオン界面活性剤の混合により増大しうる。
【００６６】
式Ｖの化合物とペルオキシダーゼとの反応からの好適な光の発生方法においては、反応は、５℃〜５０℃の間、好ましくは２０℃〜４０℃の間の温度で、水性緩衝溶液中にて、７〜１０．５の間、好ましくは８．５〜１０の間のｐＨにおいて行われる。化合物Ｖは、１μＭ〜２０ｍＭの間、好ましくは１０μＭ〜１ｍＭの間の濃度で用いられる。酵素は、遊離ペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ複合体であってもよい。光は式VIIIの励起状態から放射される。
【００６７】
本発明の化合物は、代表的には、１００〜２００ｎｍの広い発光波長帯にわたって光を発生し、電磁スペクトルの近紫外から可視領域中の波長において最大強度を示す。最大強度の代表的波長λmaxは、３５０〜５００ｎｍの範囲内である。共有結合した発蛍光団を有する式Ｉの化合物が分子内エネルギー転移を引き起こし、その結果、発蛍光団の励起状態からのより長波長における放射が起こると予想される。
【００６８】
ペルオキシダーゼの作用による光の発生方法においては、１個以上の式Ｉの化合物を、同時に用いることが可能である。２個またはそれ以上の式Ｉの化合物とペルオキシダーゼとを同時に反応させることは、一定の場合には有利である。２個またはそれ以上の化合物が異なった発光性または物理的特性を有する場合には、２個の組合せは、任意１個の化合物の使用を通じては容易に達成できない特性を有する発光反応の発生に対して好ましい。複数の化合物Ｉの間で異なっていてもよい発光性および物理的特性の例としては、発光スペクトル、発光の持続時間、酵素の代謝回転、最大値までの発光の増大速度、疎水度／親水度および溶解度等がある。
【００６９】
過酸化物成分は、ペルオキシダーゼと反応しうるいずれかの過酸化物またはアルキルヒドロペルオキシドである。好適な過酸化物には、過酸化水素、尿素過酸化物およびぺルオキソホウ酸塩等がある。
【００７０】
化学ルミネセンス性反応を引き起こすことのできるペルオキシダーゼには、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、例えば、バナジウムブロモペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、枝分れアルトロ菌類（Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｏｓｕｓ）からのリグニンペルオキシダーゼおよびペルオキシダーゼ並びに白腐れ菌類中で生成するＭｎ‐依存性ペルオキシダーゼのようなカビペルオキシダーゼ、並びに、大豆ペルオキシダーゼ等がある。鉄錯体およびＭｎ‐ＴＰＰＳ４（Ｙ．‐Ｘ．Ｃｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｋｒｏｃｈｅｍ．Ｊ．，５２，２５７‐６２（１９９５））等の、酵素ではないがペルオキシダーゼのような活性を有する他のペルオキシダーゼ擬似化合物は、明らかにここで用いられるようなペルオキシダーゼの効力範囲内にあると考えられるルミノールの化学ルミネセンス性酸化を触媒することが知られている。ペルオキシダーゼおよび生物学的分子の複合体または錯体もまた、複合体がペルオキシダーゼ活性を呈することのみを条件として、化学ルミネセンスの発生方法において用いることができる。ペルオキシダーゼの１個またはそれ以上の分子と結合しうる生物学的分子には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、抗体−ＤＮＡキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、ラクチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびビオチン等がある。ペルオキシダーゼを含んでいるかまたは結合している錯体、例えば、リポソーム、ミセル、小胞（ｖｅｓｉｃｌｅｓ）、および、生物学的分子に対する付着物として機能化されたポリマーもまた、本発明の方法において使用することができる。
【００７１】
一定のエンハンサー化合物が反応混合物に結合することにより、酵素の反応性が促進される。これらのエンハンサーの中には、Ｇ．Ｔｈｏｒｐｅ，Ｌ．Ｋｒｉｃｋａ，ｉｎ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，Ｊ．Ｓｃｈｏｌｍｅｒｉｃｈ，ｅｔ ａｌ，Ｅｄｓ．，ｐｐ．１９９‐２０８（１９８７）、Ｍ．Ｉｉ，Ｈ．Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．Ａｒａｍａｋｉ，Ｈ．Ｍａｓｕｙａ，Ｔ．Ｈａｄａ，Ｍ．Ｔｅｒａｄａ，Ｍ．Ｈａｔａｎａｋａ，Ｙ．Ｉｃｈｉｍｏｒｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１９３（２），５４０−５（１９９３）、中、および、参考文献として本明細書中に折り込まれている米国特許第５，１７１，６６８号および５，２０６，１４９号中に記載されているように、他のペルオキシダーゼ反応を促進することが知られている、フェノール化合物および芳香族アミンが含まれる。米国特許第５，５１２，４５１号に開示され、かつ、参考文献により本明細書中に折り込まれているような、置換または無置換のアリールホウ素酸化合物並びにそのエステルおよび無水物誘導体も、本発明においては、エンハンサーの範囲内で有用であると考えられる。好適なエンハンサーには、これらに制限はされないが、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−水酸化桂皮酸、ｐ−イミダゾリルフェノール、アセトアミノフェン、２，４−ジクロロフェノール、２−ナフトールおよび６−ブロモ−２−ナフトール等がある。上記で言及したような種類のものからの１個以上のエンハンサーの混合物もまた、用いることができる。
【００７２】
本発明の化学ルミネセンス反応においては、添加剤としての非イオン界面活性剤の使用は有利である。ペルオキシダーゼを用いた化学ルミネセンス発生反応中に非イオン界面活性剤を加えると、化学ルミネセンスの持続時間を延長することで、ペルオキシダーゼについての分析的感度を改良することとなる。本発明の実施において有用な非イオン界面活性剤には、例として、ポリオキシエチレン化アルキルフェノール、ポリオキシエチレン化アルコール、ポリオキシエチレン化エステルおよびポリオキシエチレン化ソルビトールエステル等がある。
【００７３】
ＣＴＡＢのような第４アンモニウム塩化合物等のカチオン界面活性剤は、本発明の一定の化合物がペルオキシダーゼおよび過酸化物と反応する際に放射される化学ルミネセンスのレベルを増大するために使用することが有利である。例えば、以下に示す化合物４３または４６の本発明による反応からの光の強度は、ＣＴＡＢが反応混合物中に含まれている場合に１０倍以上に増大する。
【００７４】
本発明の反応は、固体担体、例えば、ペルオキシダーゼで被覆された、ビーズ、チューブ、膜またはマイクロウェル板、の表面に接触していてもよい水性緩衝剤のような溶液中で行われる。好適な緩衝剤には、約６〜約９の範囲内のｐＨを維持することが可能な、一般に用いられるいずれの緩衝剤も含まれ、例えば、ホスフェート、ホウ酸エステル、カーボネート、トリス（ヒドロキシメチルアミノ）メタン、グリシン、トリシン、２‐アミノ‐２‐メチル‐１‐プロパノール、ジエタノールアミン等がある。この点について、本発明の好適な実施方法は、個々の使用目的の要求により決定される。
【００７５】
本発明の方法により放射される光は、例えば、ルミノメータ、Ｘ線フィルム、高速写真フィルム、フィルム、ＣＣＤカメラ、シンチレーションカウンター、化学光量計、または、視覚的に、等の、好適な既知の手段のいずれによっても検出することができる。夫々の検出手段は、様々なスペクトル感度を有している。人間の眼は、緑の光に対して最も感度が高く、ＣＣＤカメラは赤の光に対して最大の感度を示し、青の光までのＵＶかまたは緑の光のいずれに対しても最大の感応を有するＸ線フィルムが有効である。検出装置の選択は、実用性と、価格、便利性、および、永久的な記録の作成が必要であるかどうかの考慮とにより決定すべきである。
【００７６】
他の実施形態として、蛍光エネルギー受容体を用いて、極大発光を長波長に移し（赤色シフト）かつ／又は放射されるルミネセンス量を増加させることができる。赤色シフト発光に関する数多の技術が、化学ルミネセンス反応及び検定法についての当業者には既知である。上記の如き共有結合した発蛍光団が一例である。更に、フルオレッサーを分離種として反応溶液に添加することもできる。フルオレッサーを化合物に接近させるためにポリマーと結合させ又はミセル若しくはポリマーと会合させてもよい。蛍光エネルギー移動試薬を使用して、供与体励起反応生成物 Ａ1Ａ2Ｃ＝Ｏ* の固有蛍光効率が低い場合又は励起反応生成物が三重項励起状態である場合に役立たせることができる。前者の場合は、エネルギー移動は、一重項−一重項のタイプであり、後者の場合は三重項−一重項のタイプの可能性がある。好適なエネルギー移動試薬は、励起反応生成物 Ａ1Ａ2Ｃ＝Ｏ* のエネルギーレベルと重複し、励起エネルギーの移動を可能とするエネルギーレベルでの励起状態と、供与体のエネルギーレベルと重複する励起状態と同じかまたは同じでなくてもよい蛍光励起状態とを有する。一重項−一重項のエネルギー移動を実施するのに有用なエネルギー移動試薬は、当業者に既知である。三重項−一重項のエネルギー移動を実施するのに有用なエネルギー移動試薬も、当業者に既知であり、通常少なくとも１個の金属原子又は他の、臭素又はヨウ素のような重い原子を有する。代表的な例は、９，１０−ジブロモアントラセン（ＤＢＡ）、ＤＢＡのスルフォン化誘導体及びＲｕ（ｂｐｙ）3 2+である。蛍光エネルギー移動試薬は、試薬の存在又は不存在下での、ペルオキシダーゼ、過酸化物及び化学式Ｉの化合物の反応において発生する化学ルミネセンスの強度又は波長を比較することによって、経験的に評価される。
【００７７】
本化学ルミネセンス法の重要な用途は、化学ルミネセンス反応による検定法でのアナライトの存在又は量の検出である。該方法は、アナライトを含有すると想定される試料を本発明の化学ルミネセンス化合物及びペルオキシダーゼと接触させ、定性法で発光を検出し、また定量を所望の場合には、発光量とアナライト量とを関係づける工程を包含している。光強度とアナライトの量との関係は、アナライトの既知量で検量線を作成することによって容易に測定できる。化学ルミネセンス化合物は、代表的には、約１０-5Ｍ〜約１０-2Ｍ、好ましくは約１０-4Ｍと約１０-3Ｍとの間の濃度で使用される。ペルオキシダーゼは、溶液にて検出の場合、好ましくは約１０-9Ｍ以下である。化学ルミネセンス反応法によって分析される代表的な試料は、体液例えば血液、血漿、血清、尿、精液、唾液、ＣＳＦなどである。
【００７８】
本方法によって検定できるアナライトには、ペルオキシダーゼがあり、この場合には、ペルオキシダーゼを追加する必要はなく、また、ペルオキシダーゼの阻害剤、及びペルオキシダーゼで標識化できるか又は酵素標識化特異的結合パートナーによって、特異的に検出できる各種の有機及び生物学的分子などがある。酵素は、アナライト結合化合物上に標識として直接含有され得る。更に、アナライト結合化合物を、少なくとも１個の酵素標識化特異的結合物質に結合させ得る。また、アナライト結合化合物を、少なくとも１種の第二特異的結合物質で標識化し得、これは、次いで第二特異的結合物質として酵素標識化結合パートナーに結合する。
【００７９】
本発明はまた、化学式Ｉの化合物及びペルオキシダーゼ酵素との化学ルミネセンス反応において、発光量を存在する過酸化水素の量と関係づけることによる検定法で、過酸化水素を検出する該方法の用途に関する。本方法が、オキシダーゼ酵素とデヒドロゲナーゼ酵素との検出に使用できることは、化学ルミネセンス検定についての当業者には明らかである。これらの酵素は酸素の還元と自生の基質の酸化によって過酸化水素を発生する。従って、これにより生じた過酸化水素を、発生と同時に反応させるか、或はその後の工程で本発明の化合物Ｉ及びペルオキシダーゼと反応させて発光させるかのいずれかとすることができる。次いで、発生した光特性を、オキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼ酵素の量と関係づける。更に、アナライトに対する検定法において、生物学的分子又は特異的結合対の部分に対する複合体としてオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼ酵素を存在させてもよい。
【００８０】
化学式Ｉの化合物とペルオキシダーゼとの、化学ルミネセンスを生じる反応は、ペルオキシダーゼの存在又は量を、迅速かつ高感度で検出する方法となる。従って本方法を、試料と化学式Ｉの化合物との反応による発光量又は強度の測定によって、試料中のペルオキシダーゼの存在又は量の測定の目的に使用できる。かかる測定は、例えば、法医学的調査の証拠物件として哺乳動物の血液のペルオキシダーゼ活性の測定に用途を見いだすことができる。
【００８１】
ペルオキシダーゼ活性の化学ルミネセンス測定での第二の応用分野は、酵素阻害剤の検出と測定とにある。阻害剤は、本発明の化合物の如き二次的基質と競合する基質として働くことによって、可逆的に作用することができる。自殺阻害として知られている阻害作用の別の態様は、酵素を不活性化することによって、不可逆的に作用する。例えば、ペルオキシダーゼ阻害剤にはシアン化物、硫化物および高濃度過酸化水素などがある。さらに、若干の物質はある濃度だけで抑制的で、かつ、部分的に抑制的であることが認められている。
【００８２】
阻害剤の量、または阻害定数Ｋｉあるいは阻害作用の半減期ｔ１／２のような特性の測定は、検出可能な生成物を生ずる基質および若干量の阻害剤の存在において、問題の酵素を含んでいる試料の酵素活性を測定することによってなされる。本発明によって酵素阻害剤を検出する方法においては、化学式Ｉで表される化合物が検出可能な物質として光を生ずる。酵素と化学ルミネセンス化合物の反応は、阻害剤物質の存在下と不存在下でなされ、その結果を比較して阻害剤の存在または量を測定する。阻害剤の効果は、３つの効果、即ち光強度の減少、光の強度上昇速度の低下または発光開始前の遅延時間のうちいずれか１つまたはそれ以上を有する。
【００８３】
酵素検定を遂行する技法はよく知られている。ここで示す例によって得られる手引きを用いて、試料の調製、試薬の適量と比率の決定、反応時間、検量線の作成など操作の変形は、定型的実験の問題として考案すべき当業者の技量の範囲内である。
【００８４】
反応がペルオキシダーゼによる触媒作用を受けるので、極めて少量の酵素でも検出可能な光の量を生じるのに十分である。１アットモル（１×１０-18モル）以下の感度が達成されている。かかる少量のペルオキシダーゼ検出が可能なため、本化学ルミネセンス技法は、酵素結合検定法を用いる多種のアナライト分析に好適である。かかる分析および検定法は、分析すべき試料中のアナライトが少量であるために、または限られた試料量であるために、ペルオキシダーゼの少量を検出できることが要求される。この種の検定法では、ペルオキシダーゼは、特異的結合ペアの一部に複合化している。一例は化学ルミネセンス酵素結合免疫検定法、例えば、所謂酵素結合イムノソルベントアッセイ、即ちエリザである。かかる検定法は、通常マニュアルのフォーマットと共に自動多試験免疫検定システムにも使用される。代表的な免疫検定法において、アナライトのハプテン、抗原または抗体は、該アナライトに対する酵素標識化特異的結合パートナーまたはアナライトの酵素標識化類似物（ｅｎｚｙｍｅ−ｌａｂｅｌｅｄ ａｎａｌｏｇ）の存在または量を検出することによって検定される。多くの検定法のフォーマットと免疫化学的手段遂行のためのプロトコルは業界でよく知られている。これらの検定法は概括的には二つの範疇に分かれる。競合検定法はアナライトおよびアナライト類似物、例えば検出可能な標識化アナライト分子を持った特異的抗体の免疫学的結合を特徴とする。サンドイッチ検定法は、二つの内の一つが検出可能標識化されている当該二つの抗体を、アナライトと順次または同時に結合させることによって得られる。このようにして形成された検出可能標識化結合ペアは、本発明の化合物および方法で検定できる。検出可能な標識がペルオキシダーゼ酵素である場合は、直接検出される。検出可能な標識が、他の特異的結合ペアの一部、例えばハプテンの場合には、その特異的パートナーとペルオキシダーゼとの複合体が第一に反応し、次いでペルオキシダーゼが、本方法に従って検出される。業界で慣用されているようなビーズ、チューブ、ミクロウェル、磁性粒子、試験ストリップ、膜およびフィルターなどの固体表面または支持体に結合した酵素標識化種を用いて測定を行うことができる。検出可能な酵素標識化種は、溶液中に遊離して存在してもよいし、またはリポソームのような組織化集合内に封入されていてもよいが、この場合には、溶解剤を使用してリポソームを溶解し検出可能酵素を遊離させる。
【００８５】
他の例示的使用法は、ウェスタンブロッティングの技術によるタンパク質の検出である。アナライトとして注目されているタンパク質を含有する試料は、電気泳動的分離に供される。分離されたタンパク質は、毛細管作用または電界の助けによってニトロセルロースまたはＰＶＤＦの膜のようなブロッティング膜に移動される。かかる移動したタンパク質は、典型的に特異的一次抗体および認識しかつ一次抗体に結合する酵素標識化二次抗体で検出される。標識の酵素活性の観察は、アナライトタンパク質の存在を反映するものである。ウェスタンブロッティングに対して本発明の方法を適合させるには、二次抗体と複合したＨＲＰを用いることができ、かつ、化学ルミネセンス試薬として、本発明の化合物を使用する化学ルミネセンスで、ペルオキシダーゼ活性を測定すればよい。この技術の変形、例えばビオチン化抗体やアビジン−ＨＲＰの使用は、本発明方法を用いて実施し得る検定法の範囲内と考えられる。
【００８６】
前述の抗原−抗体、ハプテン−抗体若しくは抗体−抗体のペアに加えて、特異的結合ペアには、相補的オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、ホルモン−受容体、レクチン−炭水化物、ＩｇＧ−タンパク質Ａ、核酸−核酸結合タンパク質および核酸−抗核酸抗体などがある。
【００８７】
本発明の検出方法の特に有用な用途は、酵素標識化核酸プローブの使用による核酸の検出である。酵素標識を用いた核酸の分析および化学ルミネセンス検出のための方法、例えば、溶液ハイブリッド形成検定、サザンブロッティングにおけるＤＮＡ検出、ノーザンブロッティングによるＲＮＡ、ＤＮＡアミノ酸配列分析（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ＤＮＡフィンガープリント法、コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）ハイブリッド形成およびプラークリフト法（ｐｌａｑｕｅ ｌｉｆｔｓ）は、全て十分に確立された技術である。酵素標識（例えば、ＨＲＰ）は、プローブオリゴヌクレオチドまたは捕獲（ｃａｐｔｕｒｅ）オリゴヌクレオチドとの直接複合体として存在することができ、または、当業者に公知の方法を用いた間接的な結合手段を通じて一体化させることができる。間接的な結合手段の例には、ハプテン標識化オリゴヌクレオチドおよびアンチハプテンＨＲＰ複合体、または、ビオチニル化オリゴヌクレオチドおよびアビジンＨＲＰ複合体を用いること等がある。かかる核酸検定法は、ブロッティング膜においてまたは溶液中で、当業者に公知であるようなビーズ、チューブ、ミクロウェル、磁性粒子または試験ストリップ等の固体表面に結合したオリゴヌクレオチドを用いて行うことができる。
【００８８】
他面では、本発明は約７と約１０．５との間のｐＨを持つ水性緩衝液、０．０１〜１０ｍＭの濃度での化学式Ｉで表される化合物および０．０１〜１０ｍＭの濃度での過酸化物を含有するペルオキシダーゼとの反応により化学ルミネセンスを生ずる試薬組成物に関する。任意に該組成物は更に、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ／ｍＬの、化学ルミネセンス促進に有効な量で、少なくとも１種のエンハンサーおよび０．０１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度での非イオン界面活性剤を含有してもよい。
【００８９】
ペルオキシダーゼとの反応により化学ルミネセンスを生ずる好ましい試薬組成物は、約７．５〜約９のｐＨを持つ水性緩衝液、０．０１〜１０ｍＭの濃度での化学式ＶまたはVIで表されるアクリダンホスフェート、０．０１〜１０ｍＭの濃度での過酸化物、０．００１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度でのエンハンサーおよび化学ルミネセンス促進に有効な量、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ／ｍＬの非イオン界面活性剤を含有する。この組成物には更にＥＤＴＡのようなキレート剤を０．０１〜１０ｍＭの濃度で含有してもよい。
【００９０】
更に本発明を多岐に渡って充分説明するため、以下に実施例を示すが、本発明の範囲をこれに限定するものではない。
【００９１】
実施例
１．アクリダンホスフェートの合成
下記の化合物を、出願人のＰＣＴ出願ＷＯ９７／２６２４５号公報への記載に従って調製した。
Ｒ7−Ｒ14は別段の指示なき場合はＨである。化合物３，４および６は、二重結合の異性体混合物として得られた。これら化合物はいずれも、本発明の反応に於て、化学ルミネセンスを発生する機能を有する。
【００９２】
２．アクリダンビス（シアノエチル）ホスフェート化合物
化合物１〜１３の各々を化学式、
を有する、対応するビス（シアノエチル）基保護のトリエステル化合物１ａ〜１３ａの保護基脱離によって調製した。ビス（シアノエチル）ホスフェート誘導体も、過酸化物およびペルオキシダーゼと反応して化学ルミネセンスを生じる。
【００９３】
３．追加アクリダンリン酸塩及びアクリダンビス（シアノエチル）ホスフェート化合物の合成
更に追加となる、出願人のＰＣＴ出願ＷＯ９７／２６２４５号公報の記載に従って調製したアクリダンリン酸塩１４〜２３及びビス（シアノエチル）エステル１４ａ〜２３ａは、化学式、
を有し、
同様に化合物２４（Ｙ＝Ｎａ）及び２４ａ（Ｙ＝ＣＨ2ＣＨ2ＣＮ）は、化学式、
であり、また化合物２５〜３６（Ｙ＝Ｎａ）及び２５ａ〜３６ａ（Ｙ＝ＣＨ2ＣＨ2ＣＮ）は、化学式、
であり、ここで、Ｕは、ｐ−Ｉ（２５）、ｐ−ＣＨ3（２６）、ｍ−ＯＣＨ3（２７）、ｏ−Ｃｌ（２８）、ｍ−Ｃｌ（２９）、ｏ−Ｂｒ（３０）、ｍ−Ｂｒ（３１）、ｐ−Ｂｒ（３２）及びｐ−ＮＯ2（３３）であり、同様に該化学式の化合物は、３，４−ジクロロ−（３４）、２，５−ジクロロ−（３５）及び２，６−ジクロロフェニル（３６）基を有している。全て、ペルオキシダーゼ及び過酸化物と反応する場合、化学ルミネセンスを生じる。
【００９４】
本方法に従って、下記の例示的化合物を調製し、化学ルミネセンスを生じることを見出した。
【００９５】
７．アクリダン誘導体３７の合成
ＴＨＦ中フェニル１０−メチルアクリダン−９−カルボキシレート（２５０ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）溶液を、−７８℃でＬＤＡにより脱プロトン化した。同時に、（ＥｔＯ）2ＰＯＣｌ（２０５ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）とピリジン（９４ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）をスポイトで添加して、１５分間攪拌を継続した。ドライアイス浴を取り除いて、さらに２時間攪拌を継続した。揮発分を除去して、残渣から２工程のクロマトグラフィで生成物を単離した。３０％酢酸エチル／ヘキサンを用いたカラムクロマトグラフィ精製で、蛍光性不純物を含有する生成物の分離を行った。１０％酢酸エチル／ＣＨ2Ｃｌ2を用いた分取ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィの略、以下同じ）によって最終精製を行った。1Ｈ ＮＭＲ（アセトン−ｄ6）δ１．０８（ｔ，６Ｈ），３．４６（ｓ，３Ｈ），３．７６〜３．９７（ｍ，４Ｈ），６．７９〜７．９１（ｍ，１３Ｈ）．
【００９６】
８．アクリダン誘導体３８の合成
ＴＨＦ中フェニル１０−メチルアクリダン−９−チオカルボキシレート（１．０ｇ、３ｍｍｏｌ）溶液を、−７８℃でＬＤＡにより脱プロトン化した。同時に、（ＥｔＯ）2ＰＯＣｌ（９５８ｍｇ、５ｍｍｏｌ）とピリジン（２．５ｍＬ、３ｍｍｏｌ）をスポイトで添加して、１５分間攪拌を継続した。ドライアイス浴を取り除いて、さらに２時間攪拌を継続した。揮発分を除去して、残渣から２工程のクロマトグラフィで生成物を単離した。３０〜１００％酢酸エチル／ヘキサンを用いたカラムクロマトグラフィ精製で、青及び緑色の蛍光性不純物を含有する生成物の分離を行った。１２％酢酸エチル／ＣＨ2Ｃｌ2を用いる分取ＴＬＣによって最終精製を行った。1Ｈ ＮＭＲ（アセトン−ｄ6）δ １．０１（ｔ，６Ｈ），３．４９（ｓ，３Ｈ），３．７４−３．９６（ｍ，４Ｈ），６．９１−７．４５（ｍ，１１Ｈ）７．７８（ｄ，１Ｈ）７．９９（ｄ，１Ｈ）．
【００９７】
９．アクリダン誘導体３９の合成
ＴＨＦ中フェニル１０−メチルアクリダン−９−カルボキシレート（３１１ｍｇ、１ｍｍｏｌ）溶液を、−７８℃でＬＤＡ溶液に滴下した。−７８℃で３０分後、無水酢酸（１６１．３ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）をスポイトで添加して、ドライアイス浴を取り除いた。１時間後、揮発分を除去して、残渣からクロマトグラフィで生成物を単離した。５％酢酸エチル／ヘキサンを用いたカラムクロマトグラフィ精製で、白色固体としての９０ｍｇの純分の画分および若干の出発物質を含有する第２画分（２５０ｍｇ）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ２．０４（ｓ，３Ｈ），３．４４（ｓ，３Ｈ），６．８２〜７．６５（ｍ，１３Ｈ）．
【００９８】
１０．アクリダン誘導体４０の合成
ＴＨＦ中フェニル１０−メチルアクリダン−９−チオカルボキシレート（１．０５ｇ）溶液を、−７８℃でＬＤＡにより脱プロトン化した。１０ｍＬのＴＨＦ中の無水酢酸（０．４５ｍＬ）を滴下して、ドライアイス浴を取り除き、一夜、攪拌を継続した。揮発分を除去して、残渣からクロマトグラフィで生成物を単離した。５〜２０％酢酸エチル／ヘキサンを用いたカラムクロマトグラフィ精製で、１．１５ｇの化合物４０を灰白色固体として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ １．８９（ｓ，３Ｈ），３．４８（ｓ，３Ｈ），６．９５〜７．０６（ｍ，４Ｈ），７．２０〜７．３４（ｍ，５Ｈ），７．４０〜７．４４（ｍ，２Ｈ），７．６２（ｄ，１Ｈ），７．７９（ｄ，１Ｈ）．
【００９９】
１１．アクリダン誘導体４１の合成
ＴＨＦ中フェニル１０−メチルアクリダン−９−カルボキシレート（３３３．４ｍｇ，１．０６ｍｍｏｌ）溶液を、−７８℃で３０分間ＬＤＡにより脱プロトン化した。濃橙色の溶液を、１０ｍＬの乾燥ＴＨＦ中ｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（２５３．４ｍｇ，１．６８ｍｍｏｌ）で処理した。ドライアイス浴を取り除いて、さらに２時間攪拌を継続した。揮発分を除去して、５％酢酸エチル／ヘキサンを用いたクロマトグラフィで、生成物を油状物質（２１２ｍｇ）として残渣から単離した。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ −０．１２（ｓ，６Ｈ），０．７７（ｓ，９Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），６．７５〜７．３８（ｍ，１２Ｈ），７．７９（ｄｄ，１Ｈ）．
【０１００】
１２．アクリダン誘導体４２の合成
ＴＨＦ中フェニル１０−メチルアクリダン−９−チオカルボキシレート（３２２．３ｍｇ，０．９７ｍｍｏｌ）溶液を、−７８℃でＬＤＡにより脱プロトン化した。５ｍＬの乾燥ＴＨＦ中のｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（２７０ｍｇ，１．８ｍｍｏｌ）を迅速に加えて、ドライアイス浴を取り除き、９０分間攪拌を継続した。揮発分を除去して、５％酢酸エチル／ヘキサンを用いたクロマトグラフィで、３３０ｍｇの生成物を油状物質として残渣から単離し、これを放置して固化させた。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ −０．０９（ｓ，６Ｈ），０．７３（ｓ，９Ｈ），３．４３（ｓ，３Ｈ），６．８４〜７．０１（ｍ，４Ｈ），７．１６〜７．４７（ｍ，７Ｈ），７．７３〜７．７６（ｍ，１Ｈ），７．９０〜７．９３（ｍ，１Ｈ）．
【０１０１】
１３．化合物４３の合成
ここでは例解として、Ｅ異性体を叙述する。実質的には１種の異性体が生成したが、いずれの異性体かは明確ではない。
【０１０２】
（ａ）１００ｍＬの乾燥ＴＨＦ中での２−（６−ヒドロキシ−２−ナフチル）−プロパン酸（１．００ｇ）及びベンゼンチオール（０．６３５ｇ）の混合物を、一夜攪拌することによって１．２ｇのＤＣＣで処理した。混合物を蒸発・乾燥し、残渣をヘキサンで洗浄し、濾過した。残渣をＣＨ2Ｃｌ2と水とで分配し、有機層を乾燥し蒸発した。粗製チオエステルフェニル２−（６−ヒドロキシ−２−ナフチル）−プロパン−チオエートを３０％酢酸エチル／ヘキサンでカラムクロマトグラフィによって精製した。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ １．６６（ｄ，３Ｈ），４．１４（ｑ，１Ｈ），５．３０（ｓ，１Ｈ），７．０９〜７．７４（ｍ，１１Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ １８．６３，５４．０９，１０３．０２，１０９．４２，１１８．３５，１２６．５４，１２６．９７，１２７．０６，１２７．８８，１２８．８８，１２９．１８，１２９．３９，１２９．８２，１３４．０４，１３４．５２，１５３．８６，１９９．７８．
【０１０３】
（ｂ）前工程の生成物（２．５ｇ）を、３ｍＬのトリエチルアミン中で１．１ｍＬのピバロイルクロリドと反応させることによって、フェノール基をピバレートエステルとして保護した。反応完結後、混合物を蒸発・乾燥し、残渣をＣＨ2Ｃｌ2と水とで分配した。有機層を水で、続いて飽和ＮａＣｌで洗浄し、乾燥、蒸発した。粗製チオエステルフェニル２−（６−ピバロイルオキシ−２−ナフチル）−プロパンチオエートを０〜５％酢酸エチル／ヘキサンでカラムクロマトグラフィによって精製した。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ １．４１（ｓ，９Ｈ），１．６６（ｄ，３Ｈ），４．１７（ｑ，１Ｈ），７．１９〜７．８７（ｍ，１１Ｈ）．
【０１０４】
（ｃ）−７８℃において乾燥ＴＨＦ中で、１．５当量のＬＤＡでの２．０ｇのチオエステルの脱プロトン化及びエノラートを、０．７１ｍＬのＰＯＣｌ3と０．６２ｍＬのピリジンと反応させることによって、更に続いて１．２ｍＬのピリジン中での１．０４ｍＬの３−ヒドロキシプロピオニトリルの付加によって、工程（ｂ）からエノールビス（シアノエチル）ホスフェートへのチオエステルの転化を実施した。反応溶液を濾過し、蒸発した。６０％酢酸エチル／ヘキサンを用いてカラムクロマトグラフィにより、また続いて水による洗浄で残留する３−ヒドロキシプロピオニトリルを除去することによって、残渣から生成物を単離した。生成物は、実質的に１種の異性体（４３ａ）であることが明らかであった。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ １．３９（ｓ，９Ｈ），２．３８（ｓ，３Ｈ），２．６７（ｍ，４Ｈ），４．２５（ｍ，４Ｈ），７．２〜７．８（ｍ，１１Ｈ）；31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ −７．４３
【０１０５】
（ｄ）化合物４３ａを、１ｍＬの水に溶解した０．１９８ｇのＮａＯＨを含有する３５ｍＬのアセトン中にて０．７２ｇを反応させることによって脱保護した。沈殿した塩をアセトンで洗浄し、エタノールに溶解しアセトンで沈殿させて４３を製造した。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δ ２．３４（ｓ，３Ｈ），６．８０〜７．４４（ｍ，１１Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δ ２１．２６，１１１．３２，１２４．１５，１２５．１０，１２５．０８，１２７．３８，１２７．９０，１２８．６２，１２９．３５，１２９．４４，１３５．７９，１３６．０６，１３６．１４，１３６．５１，１３９．３１，１３９．４３，１４０．０７，１６４．９９；31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δ ６．２４．
【０１０６】
１４．化合物４４の合成
（ａ）乾燥ＴＨＦ中での２−（６−ヒドロキシ−２−ナフチル）−プロパン酸（７．００ｇ）及び４−クロロベンゼンチオール（６．２２ｇ）の混合物を、一夜攪拌することによって８．８５ｇのＤＣＣで処理した。混合物を濾過し、濾液を蒸発・乾燥した。残渣をＣＨ2Ｃｌ2と水とで分配し、有機層を逐次、水で次いで飽和ＮａＣｌで洗浄した。溶剤を乾燥・蒸発して、チオエステルフェニル２−（６−ヒドロキシ−２−ナフチル）−プロパンチオエートを製造し、これを２０％酢酸エチル／ヘキサンでカラムクロマトグラフィによって精製した。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ １．６５（ｄ，３Ｈ），４．０８〜４．１８（ｍ，１Ｈ），７．１１〜７．７５（ｍ，１０Ｈ）．
【０１０７】
（ｂ）フェノール基をピバレートエステルとして保護した。前工程からのチオエステル（６．１４ｇ）を、ピバロイルクロリド（２．８９ｇ）及び５ｍＬのトリエチルアミンと反応させた。混合物を蒸発・乾燥した後、残渣を水、及び飽和ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した。続いて５％酢酸エチル／ヘキサンでクロマトグラフィによって精製を行った。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１．４１（ｓ，９Ｈ），１．６５〜１．６８（ｄ，３Ｈ），４．１２〜４．１９（ｑ，１Ｈ），７．２０〜７．８７（ｍ，１０Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１８．５７，２７．２２，３９．１８，５４．２１，１０３．０２，１１８．３５，１２１．７８，１２６．５７，１２６．９９，１２８．３３，１２９．３９，１３１．４３，１３３．２５，１３６．７４，１４９．０６，１７７．３２，１９８．５９．
【０１０８】
（ｃ）−７８℃において乾燥ＴＨＦ中で、１．５当量のＬＤＡでの２．２ｇのチオエステルの脱プロトン化及びエノラートを、１．５当量のＰＯＣｌ3と１．５当量のピリジンと反応させることによって、更に続いて１．２ｍＬのピリジン中での１．０４ｍＬの３−ヒドロキシプロピオニトリルの付加によって、保護されたチオエステルのエノールビス（シアノエチル）ホスフェートへの転化を実施した。反応溶液を蒸発し、残渣をＣＨ2Ｃｌ2と水とで分配した。有機層を逐次、水で次いで飽和ＮａＣｌで洗浄し、乾燥し、蒸発した。生成物を６５％酢酸エチル／ヘキサンを用いてクロマトグラフィにより、異性体の混合物（４４ａ Ｅ／Ｚ）として残渣から単離した。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１．４０（ｓ，９Ｈ），２．３６＆２．３６（２ｓ，３Ｈ），２．７２〜２．７６（ｍ，４Ｈ），４．２４〜４．３５（ｍ，４Ｈ），７．１７〜７．８１（ｍ，１０Ｈ）；31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ−７．０７．
【０１０９】
（ｄ）化合物４４ａを、１ｍＬの水に溶解した０．２６ｇのＮａＯＨを含有する６０ｍＬのアセトン中にて０．８０ｇを反応させることによって脱保護した。沈殿した塩をアセトンで洗浄し、乾燥して、異性体の混合物（４４ Ｅ／Ｚ）として化合物４４を製造した。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ２．１９（ｓ，３Ｈ），６．７９〜７．５４（ｍ，１１Ｈ）；31Ｐ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ２．９０．
【０１１０】
１５．化合物４５の合成
（ａ）ジフェニル酢酸（３．１２ｇ）を、５０ｍＬのＳＯＣｌ2中にて２．５時間還流することによって、酸クロリドに転化し、約２ｍＬのＥｔ３Ｎを含有する５０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2中にて１．５２ｇのフェノールで一夜エステル化した。揮発分を真空中で除去し、残渣をヘキサンと水とで分配した。有機層を乾燥し、エステルをそれ以上精製することなく使用した。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ５．２７（ｓ，１Ｈ），７．０５〜７．４４（ｍ，１５Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ５７．０９，１２１．４４，１２５．９９，１２７．５４，１２８．７０，１２８．８２，１２９．４２，１３８．２６，１５０．７９，１７１．０４．
【０１１１】
（ｂ）−７８℃において３０分間、乾燥ＴＨＦ中で１．１当量のＬＤＡでの３．０ｇの脱プロトン化及び反応物を室温に昇温しながらエノラートを、１．１５当量のＰＯＣｌ3と１．１５当量のピリジンと３時間反応させることによって、エステルをエノールビス（シアノエチル）ホスフェートへ転化した。４．８ｍＬのピリジン中の３−ヒドロキシプロピオニトリル（２．０５ｍＬ）を添加し、反応物を一夜攪拌した。反応溶液を蒸発し、残渣をＣＨ2Ｃｌ2と水とで分配した。有機層を逐次、水で次いで飽和ＮａＣｌで洗浄し、乾燥し、蒸発した。生成物を７０％酢酸エチル／ヘキサンを用いてクロマトグラフィにより、残渣から単離した（４５ａ）。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ２．３０〜２．４５（ｍ，４Ｈ），３．６９〜３．８４（ｍ，４Ｈ），７．０８〜７．４５（ｍ，１５Ｈ）．
【０１１２】
（ｃ）化合物４５ａを、１ｍＬの水に溶解した０．１８ｇのＮａＯＨを含有する３０ｍＬのアセトン中にて１．０４ｇを一夜反応させることによって脱保護した。沈殿した塩をアセトンで洗浄し、乾燥して化合物４５（０．５ｇ）を製造した。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ ７．００〜７．５６（ｍ，１５Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ１１０．５１，１１０．６０，１１６．２１，１２２．２９，１２６．６０，１２６．７２，１２８．２６，１２９．５４，１２９．８７，１２９．９６，１３９．０１，１４６．７５，１４６．８７，１５６．５５，２０１．６３；31Ｐ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ ２．１５．
【０１１３】
１５．化合物４６の合成
（ａ）ジフェニル酢酸（６．０ｇ）を、３０ｍＬのＳＯＣｌ2中にて還流することによって酸クロリドに転化し、約１０ｍＬのＥｔ3Ｎを含有する５０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2中にて３．５ｇのチオフェノールで一夜エステル化した。溶液を逐次、水、飽和ＮａＨＣＯ3及びブラインで抽出した。Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥後、揮発分を真空中で除去し、チオエステルをそれ以上精製することなく使用した。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ５．３１（ｓ，１Ｈ），７．２〜７．６（ｍ，１５Ｈ）；
【０１１４】
（ｂ）−７８℃において３０分間、乾燥ＴＨＦ中で１．１当量のＬＤＡでの３．０ｇの脱プロトン化及び反応物を室温に昇温しながらエノラートを、１．１５当量のＰＯＣｌ3と１．１５当量のピリジンと３．５時間反応させることによって、チオエステルをエノールビス（シアノエチル）ホスフェートへ転化した。４．８ｍＬのピリジン中の３−ヒドロキシプロピオニトリル（２．０５ｍＬ）を添加し、反応物を一夜攪拌した。反応溶液を蒸発し、残渣をＣＨ2Ｃｌ2と水とで分配した。有機層を逐次、水で次いで飽和ＮａＣｌで洗浄し、乾燥し、蒸発した。生成物を６５％酢酸エチル／ヘキサンを用いてクロマトグラフィにより、残渣から単離した（４６ａ）。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ２．３〜２．５（ｍ，４Ｈ），３．６２〜３．８２（ｍ，４Ｈ），７．２〜７．４５（ｍ，１５Ｈ）．
【０１１５】
（ｃ）化合物４６ａを、２ｍＬの水に溶解した０．３ｇのＮａＯＨを含有する５０ｍＬのアセトン中にて１．７９ｇを一夜反応させることによって脱保護した。沈殿した塩をアセトンで洗浄し、乾燥して化合物４６（１．５ｇ）を製造した。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ ７．０８〜７．４４（ｍ，１５Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ１２５．７８，１２７．２３，１２７．４１，１２７．６０，１２８．１１，１２８．１７，１２９．１１，１２９．９３，１２９．５４，１３５．５８，１３５．６７，１３９．８６，１４０．７４，１４０．８６，１４１．６２；31Ｐ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ ２．３０．
【０１１６】
１６．化合物４７の合成
（ａ）１００ｍＬの乾燥ＴＨＦ中の１−ピレン酢酸（３．００ｇ）とベンゼンチオール（１．２７ｇ）との混合物を、一夜攪拌することによって２．３８ｇのＤＣＣで処理した。混合物を濾過し、濾液を蒸発・乾燥した。残渣をＣＨ2Ｃｌ2と水とで分配し、有機層を逐次、飽和ＮａＨＣＯ3、水次いで飽和ＮａＣｌで洗浄した。乾燥し、溶媒を蒸発して、チオエステル フェニル２−ピレンチオアセテートを製造し、それを１５％酢酸エチル／ヘキサンを用いてクロマトグラフィによって精製した。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ４．６６（ｓ，２Ｈ），７．３５（ｓ，５Ｈ），８．０２〜８．３０（ｍ，９Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ １０９．２３，１２４．９６，１２５．５１，１２７．４５，１２７．６６，１２８．３３，１２９．１５，１２９．３９，１３４．４９，１７０．０１．
【０１１７】
（ｂ）−７８℃において、３０ｍＬの乾燥ＴＨＦ中で１．２当量のＬＤＡでの、０．５ｇのチオエステルの脱プロトン化及びエノラートを、１．２当量のＰＯＣｌ3と１．２当量のピリジンと反応させることによって、更に続いて０．３０ｍＬのピリジン中での０．２５５ｍＬの３−ヒドロキシプロピオニトリルの添加によって、チオエステルのエノールビス（シアノエチル）ホスフェートへの転化を実施した。反応溶液を蒸発し、残渣をＣＨ2Ｃｌ2と水とで分配した。有機層を逐次、水で次いで飽和ＮａＣｌで洗浄し、乾燥し、蒸発した。生成物を残渣から６０％酢酸エチル／ヘキサンを用いるクロマトグラフィにより、異性体の５：２混合物として単離した（４７ａ Ｅ／Ｚ）。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ２．１５〜２．２４（ｍ），２．６３〜２．６７（ｍ），３．６２〜３．７８（ｍ），４．１４〜４．２２（ｍ），７．２４〜８．２６（ｍ）；31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ２７．３９，２８．１６；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ １９．０６，１９．１５，１９．５４，１９．６４，６２．４０，６２．４６，６２．９８，６３．０４，１１６．１６，１１６．４９，１２３．５１，１２３．７５，１２４．３９，１２４．５４，１２４．７１，１２４．８１，１２５．５７，１２５．６３，１２５．７２，１２５．８７，１２６．１８，１２６．３９，１２７．０９，１２７．１５，１２７．３２，１２７．４６，１２７．８８，１２８．０６，１２８．１７，１２８．２７，１２８．３０，１２８．７６，１２９．３３，１２９．４２，１２９．７６，１２９．８２，１３０．６７，１３０．８５，１３１．０３，１３１．２２，１３１．３１，１３１．４０，１３２．９１，１４１．３２，１４２．９６，１４３．１１．
【０１１８】
（ｃ）化合物４７ａを、０．１ｍＬの水に溶解した０．０４ｇのＮａＯＨを含有する６ｍＬのアセトン中にて０．２４７ｇを反応させることによって脱保護した。沈殿した塩をアセトンで洗浄し、乾燥して化合物４７を異性体の混合物として製造した（４７ Ｅ／Ｚ）。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ ６．２２（ｓ），６．７４〜８．１（ｍ），８．４７（ｄ）；31Ｐ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ ０．１２，０．６９，０．７０．
【０１１９】
１７．化合物４８の合成
（ａ）６０ｍＬのベンゼン中でのチオキサントン（１０ｇ）溶液を、１５分間攪拌することによって５．０ｇのＬＡＨで処理した。混合物を加熱し１００ｍＬのエーテルを注意深く添加した。還流を９０分間継続した。冷却した混合物を水で中和した。固形物を濾別し、濾液を蒸発・乾燥した。純粋なチオキサンテン（９．１ｇ、９８％）を２０％酢酸エチル／ヘキサンを用いたクロマトグラフィによって単離した。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ３．８２（ｓ，３Ｈ），７．２１（ｍ，４Ｈ），７．３３（ｍ，２Ｈ），７．４６（ｍ，２Ｈ）．
【０１２０】
（ｂ）チオキサンテン、９．１ｇを１００ｍＬの乾燥ＴＨＦに溶解した。溶液をアイスバスで冷却し、ｎ−ＢｕＬｉ（２．５Ｍ溶液の２４ｍＬ）を滴下した。赤色溶液を室温で１時間攪拌した。粉末ＣＯ2を（約１５０ｇ）添加し、白い沈殿を生じた。更に１時間攪拌した後、混合物を蒸発し、残渣を水に溶解した。水溶液をＣＨ2Ｃｌ2で抽出し、ＨＣｌで中和した。沈降生成物をエーテルに溶解し、乾燥し、蒸発してチオキサンテン−９−カルボン酸を白色固体（８．８ｇ）として製造した。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ ５．２５（ｓ，１Ｈ），７．３０（ｍ，４Ｈ），７．４９（ｍ，４Ｈ），１２．６０（ｓ，１Ｈ）．
【０１２１】
（ｃ）チオキサンテン−９−カルボン酸（５．８ｇ）とチオニルクロリド（３０ｍＬ）とを室温で１時間攪拌した。チオニルクロリドを蒸発し、残渣を１００ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2に溶解した。ピリジン（４ｍＬ）とチオフェノール（４ｇ）とを添加し、反応混合物を室温で５時間攪拌した。混合物を蒸発し、残渣を水で、次いでエーテルで洗浄した。チオエステルを２０％酢酸エチル／ヘキサンを用いてクロマトグラフィによって精製し、６．３ｇの純粋なフェニルチオキサンテン−９−カルボン酸を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ５．１６（ｓ，１Ｈ），７．３２（ｍ，９Ｈ），７．５０（ｍ，４Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ６３．０，１２６．９，１２７．３，１２８．１，１２８．４，１２９．２，１２９．４，１３０．９，１３２．４，１３３．７，１３４．５，１９６．５．
【０１２２】
（ｄ）−７８℃で３０分間、４０ｍＬの乾燥ＴＨＦ中で１．５当量のＬＤＡでチオエステル（４．６ｇ）を脱プロトン化した。エノラートを、１０ｍＬの乾燥ＴＨＦに溶解したＰＯＣｌ3（３．２ｇ）とピリジン（１．６６ｇ）との溶液を反応物に滴下し、それを室温に昇温させた。室温で４５分間、攪拌した後、シアノエタノール（５．６８ｇ）とピリジン（６．３ｇ）との溶液を添加し、一夜攪拌を継続した。混合物を濾過し、濾液を濃厚な残渣となるまで濃縮して、それを７０％酢酸エチル／ヘキサンを用いるクロマトグラフィにかけた。エノールビス（シアノエチル）ホスフェート（４８ａ）を、フォーム（３．１ｇ）として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ２．５２（ｍ，４Ｈ），３．９４（ｍ，４Ｈ），７．２０〜７．４８（ｍ，１０Ｈ），７．５５（ｄｄ，１Ｈ），７．７４（ｄｄ，１Ｈ），７．８５（ｄｄ，１Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ １９．５，６２．５，１１６．６，１２６．２，１２６．３，１２６．７，１２７．０，１２７．１，１２８．０，１２８．１，１２８．２，１２９．１，１２９．５，１２９．７，１３２．５，１３３．０，１３３．３，１３４．２，１３４．３，１３４．６，１３７．７，１３７．８；31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ−１０．３５（ｐ）．
【０１２３】
（ｅ）化合物４８ａを、５．６ｍＬの水に溶解した０．２８ｇのＮａＯＨを含有するアルゴン気流下の４０ｍＬのアセトン中にて１．８ｇを一夜反応させることによって脱保護した。沈殿した塩を１０％のアセトン水溶液で洗浄し、乾燥して化合物４８（１．５７ｇ）を白色固体として製造した。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ ６．９４〜７．２５（ｍ，９Ｈ），７．３８（ｍ，２Ｈ），７．７６（ｄ，１Ｈ），８．０８（ｄ，１Ｈ）；31Ｐ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ ０．７３（ｓ）．
【０１２４】
１８．化合物４９の合成
化合物４９を、前記実施例に記載した反応順序によって、工程（ｃ）におけるチオフェノールをフェノールに置換して調製した。
【０１２５】
（ａ）フェニルチオキサンテン−９−チオカルボキシレート：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ５．２６（ｓ，１Ｈ），６．９４（ｄ，２Ｈ），７．１５（ｔ，１Ｈ），７．２４〜７．３４（ｍ，６Ｈ），７．５１（ｍ，４Ｈ）．
【０１２６】
（ｂ）９−（フェノキシホスホリルオキシメチリデン）チオキサンテン，ビス（シアノエチル）エステル（４９ａ）；1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ２．５０（ｍ，４Ｈ），３．８４（ｍ，２Ｈ），４．０２（ｍ，２Ｈ），７．１６（ｍ，５Ｈ），７．２９〜７．５４（ｍ，７Ｈ），７．８２（ｄ，１Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ １９．５，６３．０，１２４．１，１２６．４，１２６．５，１２６．８，１２７．５，１２７．８，１２８．０，１２９．２，１３０．１，１３１．２，１３１．４，１３３．４，１３４．４，１４２．７，１４２．９，１５５．０；31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ −１０．９２（ｐ）
【０１２７】
（ｃ）９−（フェノキシホスホリルオキシメチリデン）チオキサンテン，二ナトリウム塩（４９）；1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ ６．９２（ｔ，１Ｈ）７．０４（ｔ，２Ｈ），７．０７〜７．３４（ｍ，６Ｈ），７．３８（ｔ，１Ｈ），７．４５（ｄ，１Ｈ），７．７１（ｄ，１Ｈ），８．０５（ｄ，１Ｈ）；31Ｐ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ ０．２２（ｓ）．
【００１２８】
１９．アクリダン誘導体５０の合成
フェニル１０−メチルアクリダン−９−チオカルボキシレート１．０ｇを、−７０℃で６０ｍＬの乾燥ＴＨＦ中ＬＤＡによりエノラートに転化した。温度を−７０℃で１時間維持した後、０．７６ｇのメチルトリフラートを加え、反応混合物を室温まで加温した。この混合物を４日間放置した。ＣＨ2Ｃｌ2（１５０ｍＬ）を添加して、溶液を水で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。ヘキサン：ＣＨ2Ｃｌ2，７０／３０の溶離剤での分取ＴＬＣによって粗製物を精製した。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ３．５３（ｓ，３Ｈ），３．５６（ｓ，３Ｈ），６．９３〜７．４５（ｍ，１１Ｈ），７．７１（ｄ，１Ｈ），７．９３（ｄ，１Ｈ）．
【０１２９】
２０．アクリダンホスフェート５によるＨＲＰの化学ルミネセンス検出
０．０５５ＭのｐＨ８．６トリス緩衝液、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン（Ｔｗｅｅｎ）２０及び３．３×１０-4Ｍのアクリダン５を含有する試薬組成物を、３組の１００μＬのアリコートと１．４×１０-15モル及び１．４×１０-19モルの間の量の酵素を含有する１０μＬのＨＲＰ水溶液とを反応させることによって化学ルミネセンス発生について試験を行った。混合の結果発光が生起し、これを５分、１０分、１５分に測定した。１５分での化学ルミネセンス強度と酵素量との関係を、図１に示す。
【０１３０】
２１．アクリダンホスフェート１３によるＨＲＰの化学ルミネセンス検出
０．０５５ＭのｐＨ８．６トリス緩衝液、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン２０及び３．３×１０-4Ｍのアクリダン１３を含有する試薬組成物を、３組の１００μＬのアリコートと１．４×１０-15モル及び１．４×１０-19モルの間の量の酵素を含有する１０μＬのＨＲＰ水溶液とを反応させることによって化学ルミネセンス発生について試験を行った。混合の結果発光が生起し、１５分に測定した。化学ルミネセンス強度と酵素量との関係を、図２に示す。
【０１３１】
２２．アクリダンホスフェート１〜４及び６〜１２及び１４による化学ルミネセンス検出
実施例２１の方法で、化合物１〜４及び６〜１２及び１４をそれぞれ含有する組成物を、２５℃でＨＲＰと反応させた。いずれも、ＨＲＰの存在なしで測定したバックグラウンドに対して、識別可能で、容易に測定できる化学ルミネセンスを発生した。
【０１３２】
２３．化学ルミネセンス強度の速度論的特性図
ＨＲＰと反応したアクリダンホスフェート５の化学ルミネセンスの特性図を、図３に示す。実施例２０の試薬組成物１００μＬと１．４×１０-15モルのＨＲＰとの２５℃における反応で、直ちに発光が始まり、約５分で極大強度に達した。
【０１３３】
２４．アクリダンジエチルホスフェート３７によるＨＲＰの化学ルミネセンス検 出
０．０１ＭのｐＨ８．０トリス緩衝液、０．５ｍＭの尿素過酸化物、０．１ｍＭのｐ−フェニルフェノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のツィン２０及び５×１０-5Ｍのアクリダン３７を含有する試薬組成物を、３組の１００μＬのアリコートと１．４×１０-14〜１．４×１０-19モルの範囲における１０μＬのＨＲＰとを反応させることによる化学ルミネセンス発生について試験を行った。混合の結果発光が生起し、２分で測定した。化学ルミネセンス強度と酵素量との関係を、図４に示す。
【０１３４】
２５．アクリダンジエチルホスフェート３８によるＨＲＰの化学ルミネセンス検出
０．０１ＭのｐＨ８．０トリス緩衝液、０．５ｍＭの尿素過酸化物、０．１ｍＭのｐ−フェニルフェノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のツィン２０及び５×１０-5Ｍのアクリダン３８を含有する試薬組成物（４０μＬ）を、１．４×１０-15モルのＨＲＰを含有する溶液１μＬと反応させた。混合の結果発光が生起し、１分以内に最大強度に達した。化学ルミネセンス−時間の特性図を、図５に示す。
【０１３５】
２６．アクリダンアセテート３９によるＨＲＰの化学ルミネセンス検出
０．０１ＭのｐＨ８．０トリス緩衝液、０．５ｍＭの尿素過酸化物、０．１ｍＭのｐ−フェニルフェノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のツィン２０及び５×１０-5Ｍのアクリダン３９を含有する試薬組成物を、３組の１００μＬのアリコートと１．４×１０-15〜１．４×１０-20モルの範囲における１０μＬのＨＲＰとを反応させることによる化学ルミネセンス発生について試験を行った。混合の結果発光が生起し、３０分以内に最大強度に達した。化学ルミネセンス強度と酵素量との関係を、図６に示す。
【０１３６】
２７．アクリダンアセテート４０によるＨＲＰの化学ルミネセンス検出
０．０１ＭのｐＨ８．０トリス緩衝液、０．５ｍＭの尿素過酸化物、０．１ｍＭのｐ−フェニルフェノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のツィン２０及び５×１０-5Ｍのアクリダン４０を含有する試薬組成物（１００μＬ）を、１．４×１０-15モルのＨＲＰを含有する溶液１０μＬと反応させた。混合の結果発光が生起し、７分以内に最大強度に達した。
【０１３７】
２８．アクリダン５０によるＨＲＰの化学ルミネセンス検出
０．０１ＭのｐＨ８．０トリス緩衝液、０．５ｍＭの尿素過酸化物、０．１ｍＭのｐ−フェニルフェノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のツィン２０及び５×１０-5Ｍのアクリダン５０を含有する試薬組成物（１００μＬ）を、３．５×１０-16モルのＨＲＰを含有する溶液２．５μＬと反応させた。混合の結果発光が生起し、７分以内に最大強度に達した。化学ルミネセンス−時間の特性図を、図７に示す。
【０１３８】
２９．化合物４３によるＨＲＰの化学ルミネセンス検出
０．０５５ＭのｐＨ８．６トリス緩衝液、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン２０、１ｍＭのＣＡＴＢ及び６．６×１０-4Ｍのアクリダン４３を含有する試薬組成物を、３組の１００μＬのアリコートと１．４×１０-15〜１．４×１０-19モルの範囲のＨＲＰを含有するＨＲＰ溶液１０μＬとを反応させることによる化学ルミネセンス発生について試験を行った。１５分における化学ルミネセンス強度と酵素量との関係を、図８に示す。
【０１３９】
３０．化合物４６によるＨＲＰの化学ルミネセンス検出及びエネルギー転位試薬による化学ルミネセンスの強化
０．０５５ＭのｐＨ８．６トリス緩衝液、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン２０、１ｍＭのＣＡＴＢ及び６．６×１０-4Ｍのアクリダン４６単独又は５０μＭのＤＢＡもともに含有する試薬組成物を、１００μＬのアリコートと３．５×１０-15モルのＨＲＰとを反応させることによる化学ルミネセンス発生について試験を行った。化学ルミネセンス−時間の関係を示す特性図を、図８に示し、三重項エネルギー受容体ＤＢＡによる化学ルミネセンスの強化を実証する。
【０１４０】
３１．化合物４８によるＨＲＰの化学ルミネセンス検出
０．０５５ＭのｐＨ８．６トリス緩衝液、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン２０及び３．３×１０-4Ｍの化合物４８を含有する試薬組成物を、１００μＬのアリコートと３．５×１０-15モルのＨＲＰとを反応させることによる化学ルミネセンス発生について試験を行った。化学ルミネセンス−時間の特性図を、図１０に示す。
【０１４１】
３２．化合物４９によるＨＲＰの化学ルミネセンス検出
０．０５５ＭのｐＨ８．６トリス緩衝液、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン２０及び３．３×１０-4Ｍの化合物４９を含有する試薬組成物を、１００μＬのアリコートと３．３×１０-15モルのＨＲＰとを反応させることによる化学ルミネセンス発生について試験を行った。化学ルミネセンス−時間の特性図を、図１１に示す。
【０１４２】
３３．ＰＶＤＦ膜を用いるウェスタンブロット検定
本発明の組成物を用いてポリビニリデンジフロリド（ＰＶＤＦ）膜上でＨＲＰ標識化抗体によるウェスタンブロットにおけるタンパク質、β−ガラクトシダーゼ（以下β−ｇａｌ）を検出及び定量を行った。それぞれ５０００，１０００，１８０，３０，及び５ｐｇのタンパク質を含有するβ−ｇａｌの希釈液を、電気泳動してＰＶＤＦ膜（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ）ＭＡ）に転移させた。膜をＴ−ＴＢＳ（ＴＢＳ中に０．０５％ツイン２０含有、ＴＢＳは５０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ含有）に入れた無脂乳でブロックし、次いでマウス抗−β−ｇａｌ（ベーリンガー・マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ））の１：１５００希釈液と、またシープ（ｓｈｅｅｐ）抗−マウス−ＨＲＰ複合体（ベーリンガー・マンハイム社）の１：６００希釈液と逐次反応させた。膜をＴ−ＴＢＳ中にて洗浄し、０．６６ｍＭのアクリダンホスフェート５を含有する０．０５５ＭのｐＨ８．６トリス緩衝液、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン２０を含有する試薬に３分間浸漬した。膜を透明プラスチックシートの間に挟み、Ｘ線フィルムに暴露した。図１２に、３０秒暴露して、１４分後のβ−ｇａｌの検出を示す。発光は数時間に渡って作像できる強力な放射を得た。
【０１４３】
３４．ニトロセルローズ膜を用いたウェスタンブロット
前実施例の方法に従うウェスタンブロット検定をニトロセルローズ膜（シュライヘル・シュール社（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）キーン（Ｋｅｅｎｅ）ＮＨ）を固体相として使用して実施した。５０００〜５ｐｇの範囲のβ−ｇａｌ標準を使用した。
前実施例の検出試薬で数時間に渡って検出させた。図１３は、５分暴露して１０分後のβ−ｇａｌの検出を示す。
【０１４４】
３５．本発明の他の化学ルミネセンス試薬を使用したウェスタンブロット
ＰＶＤＦとニトロセルローズ膜との両方について、β−ガラクトシダーゼの同様なウェスタンブロット検定を、化合物５の代わりに化合物１，１２及び１３をそれぞれ含有する検出試薬を用いて行い、定性的に同様の結果を得た。
【０１４５】
３５．本発明の化学ルミネセンス試薬を使用したサザンブロット
サザンブロット検定を、出願人の米国特許第５５９３８４５号明細書に従い、そこに記載の検出試薬の代わりに本発明の実施例２０又は３３による試薬組成物に置換えて実施できた。
【０１４６】
上記の説明並びに実施例は、本発明の説明に資するためのものであって、本発明の技術的範囲を限定するものではない。特別な化合物や方法が開示されていないものでも本発明の技術思想、技術範囲から外れるものではない。本発明の範囲は、特許請求の範囲から判断されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 室温で誘発したアクリダンホスフェート５を含有する実施例２０に記載された試薬１００μＬによって１５分に発生した化学ルミネセンス強度とＨＲＰの量との関係を示すグラフである。ブラックミクロプレート（ｂｌａｃｋ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）のウェル（ｗｅｌｌ）の中で１．４×１０-15モル及び１．４×１０-19モルの間の酵素を含有するＨＲＰの溶液１０μＬを、０．０５５ＭのｐＨ８．６トリス緩衝液、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン２０及び３．３×１０-4Ｍのアクリダン５を含有する試薬１００μＬに添加することによって化学ルミネセンス放射を開始せしめた。用語のＳ−Ｂとは、ＨＲＰ存在下での相対光度単位（ＲＬＵ）での化学ルミネセンスのシグナル（Ｓ）を、ＨＲＰ不存在下でのバックグラウンドの化学ルミネセンス（Ｂ）に対して補正したものを指す。
【図２】 室温で誘発したアクリダンホスフェート１３を含有する実施例２１に記載された試薬１００μＬによって１５分に発生した化学ルミネセンス強度とＨＲＰの量との関係を示すグラフである。ブラックミクロプレートの中で１．４×１０-15モル及び１．４×１０-19モルの間の酵素を含有するＨＲＰの溶液１０μＬを、０．０５５ＭのｐＨ８．６トリス緩衝液、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン２０及び３．３×１０-4Ｍのアクリダン１３を含有する試薬１００μＬに添加することによって化学ルミネセンス放射を開始せしめた。
【図３】 ２５℃で１．４×１０-15モルのＨＲＰと実施例２０に記載のアクリダン５を含有する試薬１００μＬとの反応の結果生じた化学ルミネセンスの経時特性を示すグラフである。
【図４】 室温で誘発したアクリダン３７を含有する試薬１００μＬによって２分に放射された化学ルミネセンス最大強度とＨＲＰの量との関係を示すグラフである。１．４×１０-14モル〜１．４×１０-19モルの間を含有するＨＲＰの溶液１０μＬを、０．０１ＭのｐＨ８．０トリス緩衝液、０．５ｍＭの尿素過酸化物、０．１ｍＭのｐ−フェニルフェノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のツィン２０及び５×１０-5Ｍのアクリダン３７を含有する試薬組成物１００μＬに添加することによって化学ルミネセンス放射を開始せしめた。
【図５】 １．４×１０-15モルのＨＲＰと０．０１ＭのｐＨ８．０トリス緩衝液、０．５ｍＭの尿素過酸化物、０．１ｍＭのｐ−フェニルフェノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のツィン２０及び５×１０-5Ｍのアクリダン３８を含有する４０μＬの試薬と、２５℃で反応した結果生じた化学ルミネセンスの経時特性を示すグラフである。混合の結果発光が生起し、１分以内に最大強度に達した。
【図６】 室温で誘発したアクリダン３９を含有する試薬１００μＬによって３０分に放射された化学ルミネセンス最大強度とＨＲＰの量との関係を示すグラフである。１．４×１０-15モル〜１．４×１０-20モルの間を含有するＨＲＰの溶液１０μＬを、０．０１ＭのｐＨ８．０トリス緩衝液、０．５ｍＭの尿素過酸化物、０．１ｍＭのｐ−フェニルフェノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のツィン２０及び５×１０-5Ｍのアクリダン３９を含有する試薬組成物１００μＬに添加させることによって化学ルミネセンス放射を開始せしめた。
【図７】 ３．５×１０-16モルのＨＲＰと０．０１ＭのｐＨ８．０トリス緩衝液、０．５ｍＭの尿素過酸化物、０．１ｍＭのｐ−フェニルフェノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のツィン２０及び５×１０-5Ｍのアクリダン５０を含有する１００μＬの試薬と、２５℃で反応した結果生じた化学ルミネセンスの経時特性を示すグラフである。混合の結果発光が生起し、７分以内に最大強度に達した。
【図８】 室温で誘発したアクリダン４３を含有する試薬１００μＬによって１５分に放射された化学ルミネセンス最大強度とＨＲＰの量との関係を示すグラフである。１．４×１０-15モル〜１．４×１０-19モルの間を含有するＨＲＰの溶液１０μＬを、０．０５５ＭのｐＨ８．６トリス緩衝液、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン２０、１ｍＭのＣＴＡＶ及び６．６×１０-4Ｍのアクリダン４３を含有する試薬組成物１００μＬに添加することによって化学ルミネセンス放射を開始せしめた。
【図９】 蛍光性エネルギー移動試薬の使用による化学ルミネセンスの強化を実証するグラフである。０．０５５ＭのｐＨ８．６トリス緩衝液、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン２０、１ｍＭのＣＴＡＶ及び３．３×１０-4Ｍの化合物４６単独又は５０μＭのＤＢＡとともに含有する試薬組成物を、１００μＬアリコートと３．５×１０-15モルのＨＲＰとを反応させることによる化学ルミネセンスの発生について試験を行った。
【図１０】 ３．５×１０-15モルのＨＲＰと０．０５５ＭのｐＨ８．６トリス緩衝液、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン２０及び３．３×１０-4Ｍの化合物４８を含有する１００μＬの試薬と、２５℃で反応した結果生じた化学ルミネセンスの経時特性を示すグラフである。
【図１１】 ３．３×１０-15モルのＨＲＰと０．０５５ＭのｐＨ８．６トリス緩衝液、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン２０及び３．３×１０-4Ｍの化合物４９を含有する１００μＬの試薬と、２５℃で反応した結果生じた化学ルミネセンスの経時特性を示すグラフである。
【図１２】 化学ルミネセンス試薬組成物を用いてＰＶＤＦ膜上のＨＲＰ標識化抗体によるβ−ガラクトシダーゼのウェスタンブロット検定からのＸ線フィルムの映像である。それぞれタンパク質の５０００，１０００，１８０，３０，及び５ｐｇを含有するβ−ガラクトシダーゼのの希釈液を、０．６６ｍＭのアクリダンホスフェート５を含有する０．０５５ＭのｐＨ８．６トリス緩衝液、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン２０を含有する試薬を用い、１４分のインキュベーション後膜をＸ線フィルムに３０秒曝露することによって検出した。
【図１３】 ニトロセルローズの膜を用いた同様なウェスタンブロット実験からのＸ線フィルムの映像である。該映像を、１０分のインキュベーション時間後５分間Ｘ線フィルムに膜を曝露することによって得た。
技術分野
本発明は、ペルオキシドおよび過酸化物と反応して化学ルミネセンスを発生させる、化学ルミネセンス組成物に関する。特には、本発明は、ペルオキシドおよび過酸化物と反応して励起状態カルボニル化合物を生成する、新規な電子過剰（リッチ）アルケンを含む組成物に関する。本発明は、さらに、免疫検定、核酸プローブ検定等において、ペルオキシダーゼを検出するため、および、ペルオキシダーゼ標識化（標識されている）特異的結合パートナーを検出するための検定法に関する。
【０００２】
従来技術
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のようなペルオキシダーゼ酵素は、生物学的分子および他の重要なアナライト、例えば、薬物、ホルモン、ステロイドおよび癌のマーカー、についての酵素結合検定法において、マーカーまたは標識としてしばしば用いられる。これらの酵素の化学ルミネセンス検出は、サンプル中の酵素の量または酵素標識化アナライト若しくはアナライトに対する標識化特異的結合パートナーの量の定量的尺度を規定する、安全で、便利かつ高感度の手段を提供する。他の化学ルミネセンス反応スキムは、特定のペルオキシダーゼ酵素の標識の定量のために発展してきた。
【０００３】
ａ．化学ルミネセンスペルオキシダーゼ基質
よく知られたルミノールやイソルミノールのようなアミノ置換環式アシルヒドラジドは、発光のための基本条件の下で、Ｈ2Ｏ2およびペルオキシダーゼ触媒（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ＨＲＰ）と反応する。この反応は、Ｈ2Ｏ2の検出およびペルオキシダーゼについての分析法に関する基礎として用いられている。ルミノール、例えば、（８−アミノ−５−クロロ−７−フェニルピリド［３，４−ｄ−ピリダジン−１，４（２Ｈ，３Ｈ）ジオン（Ｍ．Ｉｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１９３（２），５４０−５（１９９３））；ピリダジノキノキサリノン（米国特許第５，３２４，８３５号）および１，３−２置換ピラゾロ［４’，３’：５’，６’］ピリド−［２，３−ｄ］−ピラジンジオン（Ｙ．Ｔｏｍｉｎａｇａ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６，８６４１−４（１９９５））のヘテロ環式類似体は、ペルオキシダーゼおよび過酸化物と反応して化学ルミネセンスを発生させることが知られている。ペルオキシダーゼおよび過酸化物により酸化されると化学ルミネセンス性となる他のヒドラジド化合物には、ヒドロキシ置換フタルヒドラジドがある（米国特許第５，５５２，２９８号）。
【０００４】
出願人は、米国特許第５，４９１，０７２号、第５，５２３，２１２号および第５，５９３，８４５号において、ペルオキシダーゼの検出中および検定法中における使用に関し、過酸化物およびペルオキシダーゼとの反応時に光を発生させる化学ルミネセンス性Ｎ−アルキルアクリダン−カルボン酸エステル、チオエステル、および、スルホンアミドを開示している。ＰＣＴ出願（ＷＯ９４／０２４８６）には、スピロアクリダン化合物と過酸化水素との化学ルミネセンス性反応が記載されている。反応は、ホースラディッシュペルオキシダーゼの付加により促進される。
【０００５】
ルシフェリンと総称される、生物学的起源を有する種々の化合物は、ペルオキシダーゼにより酸化される（Ｌ．Ｊ Ｋｒｉｃｋａ ａｎｄ Ｇ．Ｈ．Ｇ．Ｔｈｏｒｐｅ，ｉｎ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｋ．Ｖａｎ Ｄｙｋｅ ａｎｄ Ｒ．Ｖａｎ Ｄｙｋｅ，ｅｄｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９０，ｐｐ．７７−９８中に要約されている）。一定の場合には、過酸化水素は酵素がオキシダーゼとして作用する場合には利用できない。
【０００６】
一定のフェノール化合物は、ペルオキシダーゼによる酸化時に化学ルミネセンスを発生させる。その例としての、ピロガロールＢ−１およびプルプロガリンＢ−２は、クマリン型化合物クマリン、アンベリフェロンおよびエスカリン（Ｄ．Ｓｌａｗｉｎｓｋａ，Ｊ．Ｓｌｏｗｉｎｓｋｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．，４，２２６−３０（１９８９））と同様に、Ｋｒｉｃｋａ ａｎｄ Ｔｈｏｒｐｅの同文献中に列挙されており、また；フロログルシノールＢ−３（Ｍ．Ｈａｌｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，３０，１６５−７（１９７９））；およびアセトアミノフェンＢ−４（Ｋ．Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｇ．Ｃｉｌｅｎｔｏ，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，５１，７１９−２３（１９９０））がある。
酸素または過酸化物およびペルオキシダーゼの存在下で弱い化学ルミネセンスを発生させることが報告されている他の種々の化合物としては、合成シッフ塩基含有ポリマー（（Ｒ．Ｚｏｕｌｉｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｌ．Ｃｚｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，６０，９５−１０３（１９９５））；キサンテン染料の存在下で、過酸化水素を用いて、または用いずに、インドール−３−酢酸（Ｓ．Ｋｒｙｌｏｖ，Ａ．Ｃｈｅｂｏｔａｒｅｖａ，ＦＥＢＳ，３２４（１），６−８（１９９３）；チロシン、トリプトファンおよびクロールプロマジン（Ｍ．Ｎａｋａｎｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．４，２３１−４０（１９８９））およびＭＣＬＡ Ｂ−８ Ｍ．（Ｍｉｔａｎｉ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．９，３５５−６１（１９９４））があり，これらは夫々以下に示すＢ−５〜Ｂ−８のような構造を有している。
【０００８】
ｂ．エノールとＨＲＰとの反応
一連の論文には、エノール化可能なアルデヒドのペルオキシダーゼ触媒化空気酸化が記載されている（Ｈ．Ｇａｌｌａｒｄｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７８９，５７−６２（１９８４）；Ｗ．Ｊ．Ｂａａｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｄ．，１４（４），１９０−２（１９８６）；Ｉ．Ｎａｎｔｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，６３（６），７０２−８（１９９６））。反応基質は、アルデヒドとの平衡時においてはエノール形態は少量であると考えられる。アルデヒドの反応はエノールホスフェートにより触媒されるが、エノールホスフェートそのものは消費されない。参考文献によれば、エノールホスフェートはペルオキシダーゼと反応して化学ルミネセンスを発生させることはないことがわかる。蛍光エネルギー受容体へのエネルギー移動は、発光を増大させる（Ｍ．Ｔ．Ｇｒｉｊａｌｂａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，６３（６），６９７−７０１（１９９６））。エノールシリルエーテル（Ｂａａｄｅｒ，ｉｂｉｄ）またはエノールアセテートのようにマスクされたアルデヒドは共役検定法において用いられ、この方法では、エノールは最初の段階でマスクを外されてもとの位置にエノールを生成し、続いてペルオキシダーゼと反応して化学ルミネセンスを発生させる（Ａ．Ｃａｍｐａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，６３（６），７４２−５（１９９６））。
【０００９】
ｃ．ペルオキシダーゼエンハンサー
非常に多くのエンハンサーが、ペルオキシダーゼと前述のルミノールやアクリダンカルボン酸誘導体等の既知の化学ルミネセンス性基質との反応からの、化学ルミネセンスの量および持続時間を増大させるために用いられている。これらには、Ｄ−ルシフェリンのようなベンゾチアゾール誘導体、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−フェニルフェノール、ナフチルのような種々のフェノール化合物、および、Ｇ．Ｔｈｏｒｐｅ，Ｌ．Ｋｒｉｃｋａ，ｉｎ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｎｅｗ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，Ｊ．Ｓｃｈｏｌｍｅｒｉｃｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，ｐｐ．１９９−２０８（１９８７）中に列挙されているような芳香族アミン等がある。アミノ置換環式アシルヒドラジドのペルオキシダーゼによる化学ルミネセンス性酸化におけるエンハンサーとして作用する他の化合物には、４−（４−ヒドロキシフェニル）−チアゾール（Ｍ．Ｉｉ，ｉｂｉｄ）、米国特許第５，１７１，６６８号中に開示された一群の化合物、２−ヒドロキシ−９−フルオレノン、および、米国特許第５，２０６，１４９号中に開示されているような一群のヒドロキシ置換ベンゾキサゾール誘導体、並びに、米国特許第５，６２９，１６８号中に記載されているような一定のフェニルホウ素酸化合物等がある。上述の参考文献中には、ペルオキシダーゼ単独による、または、エンハンサーを伴った、本発明の化合物の、化学ルミネセンス性酸化が開示されているものはない。
【００１０】
ｄ．界面活性剤による化学ルミネセンス性ペルオキシダーゼ反応の促進
重合体および単量体界面活性剤を用いたペルオキシダーゼ触媒化反応において発生する化学ルミネセンスの促進は、当該技術分野において既知である。促進は、例えば、エミッターの蛍光量子収率を増大させることにより、励起状態で生成する生成物分子のパーセンテージを増大させることにより、競合する副反応の阻害を通じて化学ルミネセンス性反応を引き起こす分子の部分を増加させることにより、または、酵素触媒の作用を促進することにより、１またはそれ以上の段階の結果に影響を及ぼすことで引き起こすことができる。化学ルミネセンス反応における重合体および単量体界面活性剤の作用に関して、明確なまたは矛盾のないパターンは存在しない。界面活性剤化合物があるとしても、特定の過程からの化学ルミネセンスを促進し、かつ、実際の実験によってのみ決定することができることを予想することは不可能である。
【００１１】
カチオンポリマー界面活性剤ポリ−Ｎ−エチル−４−ビニル−ピリジニウムブロミドは、ルミノールの負帯電インシュリン−ペルオキシダーゼ複合体による化学ルミネセンス性反応を完全に阻害し、化学ルミネセンスを天然の酵素を用いた場合の最低限度まで減少させる（Ｓ．Ｂ．Ｖｌａｓｅｎｋｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．４，１６４−１７６（１９８９））。
【００１２】
発行済みの日本国特許出願番号０６，２４２，１１１号および文献（Ｒ．Ｉｗａｔａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３１，１７０−４（１９９５））には、バックグラウンド放射または高められた信号若しくはノイズを低下させるための、ルミノールの化学ルミネセンス性過酸化における非イオン界面活性剤および脱脂乳の使用が開示されている。
【００１３】
上述の参考文献には、本発明の化合物のペルオキシダーゼによる化学ルミネセンス性酸化または界面活性剤を用いた化学ルミネセンスの促進が開示されているものはない。
【００１４】
ｄ．ＨＲＰを用いた検定法 酵素ホースラディッシュペルオキシダーゼは、ルミノールまたはイソルミノールを基質として用いた化学ルミネセンス性検出を伴う酵素免疫検定およびＤＮＡハイブリッド形成検定法において、広く使用されていることが知られている。ＨＲＰ複合体および促進されたルミノール化学ルミネセンス性検出を用いた市場で入手しうるキットは有用である。化学ルミネセンス性ペルオキシダーゼ検定法は、また、前述の米国特許第５，４９１，０７２号、５，５２３，２１２号、および、５，５９３，８４５号中にも開示されている。本発明の化合物を基質として用いた化学ルミネセンス性ペルオキシダーゼ検定法が開示されている参考文献はない。
【００１５】
発明の概要
本発明の目的は、ペルオキシダーゼおよび過酸化物と反応して化学ルミネセンスを発生させる化合物を含む組成物を提供することにある。
【００１６】
本発明の他の目的は、ペルオキシダーゼおよび過酸化物との反応によりペルオキシダーゼの検出のための化学ルミネセンスが得られる化合物を含む組成物を提供することにある。
【００１７】
本発明の目的はまた、二重結合の一端が、異なる基Ｘ若しくはＲ1と夫々結合している、酸素原子または硫黄原子から選択される２個の原子により置換され、かつ、二重結合の他端が、励起状態生成物Ａ1Ａ2Ｃ＝Ｏ*が下記式Ｉの化合物とペルオキシダーゼおよび過酸化物との反応において生ずるように選択される基Ａ1およびＡ2により置換されている、炭素−炭素二重結合を有する下記式Ｉ、
【００１８】
本発明のさらなる目的は、式Ｉ（式中、Ａ1およびＡ2は炭素原子と共に結合してヘテロ環式または炭素環式環を形成する）で表される化合物を含む組成物を提供することにある。特には、環は、窒素原子、硫黄原子または酸素原子含有ヘテロ環式環の基とすることができる。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、式Ｉ（式中、Ｚ2がＯである場合には、酸素原子と結合している基は、アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、ホスフェートモノ−、ジ−、若しくはトリエステル基、カルボキシルエステル基、スルフェート基、糖基またはシリルエステル基の一部であり、また、Ｚ2がＳである場合には、硫黄原子と結合している基は、等価なチオ基の一部である）で表される化合物を含む組成物を提供することにある。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、本発明の組成物を用いた、ペルオキシダーゼおよび過酸化物との反応における化学ルミネセンスの発生方法を提供することにある。
【００２１】
さらにまた、本発明の目的は、本発明の化合物とペルオキシダーゼとの反応において発生させる化学ルミネセンスの促進のための方法および組成物を提供することにある。
【００２２】
本発明のさらにまた他の目的は、免疫検定、拡散プローブ検定、ウェスタンブロット検定法、サザンブロット検定法、および、アナライトの検出のための酵素標識を付与する一般によく知られた方法を用いた他の検定法において、ペルオキシダーゼおよび複合体の検出において使用するための化学ルミネセンス性組成物および方法を提供することにある。従って、検定法は、ペルオキシダーゼまたは複合体の検出によるかかる検定法においてアナライトを検出し、かつ、アナライトの存在または量とそれによって発生させる化学ルミネセンスとを関係づけるために有用である。
【００２３】
発明を実施するための最良の形態
定義
アルキル基 − 分枝か、直鎖又は環状の、１〜２０個の炭素原子を有する炭化水素基。ここで使用する低級アルキル基とは、８個以下の炭素原子を有するアルキル基を称する。
【００２４】
アルケニル基 − 分枝か、直鎖又は環状の、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を有し、２〜２０個の炭素原子を有する炭化水素基。ここで使用する低級アルケニル基とは、８個以下の炭素原子を有するアルケニル基を称する。
【００２５】
アルキニル基 − 分枝又は直鎖の、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を有し、２〜２０個の炭素原子を有する炭化水素基。ここで使用する低級アルキニル基とは、８個以下の炭素原子を含有するアルキニル基を称する。
【００２６】
アナライト − 検定によって試料中からその存在又はその量が測定される物質。アナライトには、特異的な結合親和力を持つ特異的結合パートナーが存在する有機及び生物学的分子などがある。アナライトを例示すれば、以下のものに限定するものではないが、一本鎖、又は二本鎖ＤＮＡやＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ複合体、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体フラグメント、抗体−ＤＮＡキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン及びビオチンなどがある。その他のアナライトの例には、加水分解酵素、加水分解酵素阻害剤およびジヒドロキシ芳香族化合物などがある。
【００２７】
アリール基 − 水素原子以外の１個以上の置換基で置換し得る１〜５個の芳香環を有する芳香環含有の基。
【００２８】
生物医学的分析 − 注目するアナライトの生物学的起源サンプルの分析。かかる分析とは、免疫検定、ウェスタンブロット、ノーザンブロット、サザンブロット、ＤＮＡハイブリッド形成検定、ＤＮＡ配列分析、コロニーハイブリッド形成法、遺伝子発現分析、高処理量医薬物質スクリーニング、伝染病薬剤又は病原体の検出などである。
【００２９】
グリコシル − 六単糖及び五単糖を包含する炭水化物の残基で、１個以上の糖単位を有する。例としては、果糖、ガラクトース、葡萄糖、グルクロネート、マンノース、リボース、Ｎ−アセチルグルコサミンなどである。
【００３０】
ハロゲン − フッ素、塩素、臭素又はヨウ素原子。
【００３１】
ヘテロアリール基 − 少なくとも１個の環の炭素原子が窒素、酸素又はイオウ原子で置換され、また水素原子以外の１個以上の置換基で置換され得る１〜５個の炭素環状芳香環を有する芳香環含有の基。
【００３２】
ルミネセンス − 電子的励起状態に励起した場合に、発光できる能力。励起１重項状態からの壊変の場合は蛍光として、励起３重項状態からの壊変の場合はリン光として、いずれも発光できる。
【００３３】
過酸化物 − Ｏ−Ｏ結合を有する化合物で、好ましくは過酸化水素又は過酸化水素の複合体、例えば、尿素過酸化物（ｕｒｅａ ｐｅｒｏｘｉｄｅ）、過ホウ酸又は過炭酸。
【００３４】
サンプル − 検定すべき１個以上のアナライトを含有するか、又は含有すると思われる液体。化学ルミネセンス反応法によって分析される代表的なサンプルは、生物学的サンプルで、体液、例えば血液、血漿、血清、尿、精液、唾液、セルリゼート（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅｓ）、組織抽出物などである。別の種類のサンプルとしては、食品のサンプル及び土壌あるいは水のような環境関連のサンプルなどがある。
【００３５】
特異的結合対 − 相互に結合親和力を示す二つの物質。その例は、抗原−抗体、ハプテン−抗体又は抗体−抗体対、相補的オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、ホルモン−受容体、レクチン−炭水化物、ＩｐＧ−タンパク質Ａ、核酸−核酸結合タンパク質及び核酸−抗核酸抗体などである。
【００３６】
置換 − 基における、少なくとも１個の水素原子を、非水素原子基により置き換えることをいう。置換基に関しては、特に明示しない限り複数の置換位置が存在し得ることに留意を要する。
【００３７】
下記に示す式Ｉの化合物が過酸化物およびペルオキシダーゼと反応して化学ルミネセンスを発生させることが期せずして見出された。ペルオキシダーゼの存在下で化学ルミネセンスを発生させる本発明の化合物は、二重結合の一端で、酸素原子または硫黄原子から選択される２個の原子にて置換された炭素−炭素二重結合を有し、かつ、下記式Ｉ、
【００３８】
基Ａ1、Ａ2、Ｚ1、Ｚ2、ＸおよびＲ1は、得られる化合物Ｉが電子過剰（リッチ）炭素−炭素二重結合を有するように選択される。一般に、酸素原子および硫黄原子から選択されるＺ1およびＺ2を有する、一般式Ｉで表されるほとんどの化合物は、十分に電子過剰（リッチ）の炭素−炭素二重結合を有する。Ａ1および／またはＡ2が強く電子求引性基である化合物は、作用せず、好ましくない。
【００３９】
基Ｒ1は、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子、ケイ素原子またはハロゲン原子から選択される１〜約５０個の非水素原子を有するいかなる有機基であってもよく、発光を生ぜしめる。このことは、式Ｉの化合物がペルオキシダーゼおよび過酸化物と反応した場合には光が発生し、またこれには１個またはそれ以上の化学ルミネセンス性中間体の生成を伴い得ることを意味する。Ｒ1基として作用しうる基には、限定はされないが、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基および置換アラルキル基等がある。水素原子以外の置換基、例えば、イオン性基または極性基が、様々な個数で、かつ、Ｒ1の炭素鎖または環上の選択された位置において、化合物の特性を改質するため、または、合成の便宜のために、結合していてもよい。かかる特性には、例えば、化学ルミネセンス量子収率、酵素との反応速度、最大発光強度、発光の持続時間、発光波長、反応媒体中での溶解度等がある。特異的結合パートナーのような他の分子との共有カップリングが可能な１またはそれ以上の基も、Ｒ1における置換基とすることができる。特異的置換基およびその作用の具体例は以下の特異例中で図示するが、本発明の範囲はこれにより制限されるものではない。
【００４０】
基Ｘは、１〜２０個の炭素原子を有する置換または無置換のアルキル基、置換または無置換のアリール基、置換または無置換のアラルキル基、１〜２０個の炭素原子を有する置換または無置換のアルキル若しくはアリールカルボニル基、トリ（Ｃ1〜Ｃ8アルキル）シリル基、ＳＯ3 -基、グリコシル基、および、式ＰＯ（ＯＲ’）（ＯＲ’’）（式中、Ｒ’およびＲ’’は、相互に無関係に、１〜２０個の炭素原子を有する置換または無置換のアルキル基、置換または無置換のアリール基および置換または無置換のアラルキル基、トリアルキルシリル基、アルカリ金属カチオン、アルカリ土類カチオン、アンモニウムおよびホスホニウムカチオンから選択される）で表されるホスホリル基から選択される。置換アルキル基は、水素原子以外の基、例えば、イオン性基または極性基を少なくとも１個有し、かつ、化合物Ｉの特性を改質するため、または、合成の便宜のために、Ｒ’またはＲ’’の炭素鎖または環上の選択された位置において結合していてもよい。置換アルキル基の具体例としては、シアノエチル基またはトリメチルシリルエチル基等がある。
【００４１】
基Ａ1およびＡ2は、相互に無関係に水素原子または有機基から選択されて、化合物Ｉと過酸化物およびペルオキシダーゼとの反応において電子的励起状態生成物Ａ1Ａ2Ｃ＝Ｏ*を生成するものであり、制限されるものではないが、少なくとも１個が水素原子でないとの条件で、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基および置換アラルキル基、ヘテロアリール基、置換へテロアリール基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルアミノ基、アリールアミノ基、アルキルチオおよびアリールチオ基等である。基Ａ1およびＡ2は、共に結合して、Ａ1およびＡ2を引き離している炭素原子を含むヘテロ環式または炭素環式環を形成してもよい。一般に、基Ａ1およびＡ2は、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子およびハロゲン原子から選択される１〜５０個の非水素原子と、さらに、通常は１〜２０個の非水素原子を有する。
【００４２】
式Ｉで表される好適化合物の最初の群においては、Ａ1およびＡ2のうちの１個が、置換または無置換のアリール基であり、もう１個が、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基、置換アラルキル基、ヘテロアリール基、置換へテロアリール基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルアミノ基、アリールアミノ基、アルキルチオおよびアリールチオ基から選択される。好ましくは、アリール基の少なくとも１個がアミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、および、ＯＹ’（式中、Ｙ’はハロゲン原子またはアルカリ金属イオンである）から選択される少なくとも１個の基で置換されている。アリール基は、１−４縮合炭素環式またはヘテロ環式５または６員環を有する。１またはそれ以上の環がヘテロ環式環である場合、環中のヘテロ原子は窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選択される。好適なアリール基は、フェニル基、ナフチル基、アンスリル基およびピレニル基であり、これらのうちのいずれかが、非水素置換基により置換されていてもよい。より好適なものは、フェニル基およびナフチル基である。
【００４３】
本発明の方法により反応して化学ルミネセンスを発生させる式Ｉの化合物の特定具体例としては、下記構造式
【００４４】
好適化合物の２番目の群は、下記式II、
【００４５】
ヘテロ環式環系は、環外二重結合を有する環の炭素原子と共に複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）中に存在する、窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を有する。好適なヘテロ環式化合物には、下記式IIIおよびIV、
【００４６】
戻って式IIを参照すると、基Ｈｅｔを有してもよい環構造の具体例としては下記の構造等があり、環外二重結合の位置にアステリスクが記されている。すべての可能な置換パターンを明確に示さなくても、かかる環構造の具体例において、夫々の環の位置に水素以外の置換基が存在してもよい。本明細書中で述べる方法の実施に際して有用な他のヘテロ環式環化合物は、特に以下に列挙したものだけではなく、式IIの範囲内に入っていればよいことは、熟練の技術者には明らかであるだろう。
【００４７】
式IIIおよびIVで表される上記の化合物のすべてにおいて、基Ｒ2〜Ｒ5は夫々相互に無関係に水素原子または光を発生させる置換基であり、一般に、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子およびハロゲン原子から選択される１〜５０個の原子を有する。存在し得る代表的な置換基には、制限はされないが、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、置換アミノ基、カルボキシル基、カルボアルコキシ基、カルボキシアミド基（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、シアノ基およびスルホネート基等がある。隣接する基のどちらか一方または双方の対、すなわち、Ｒ2−Ｒ3またはＲ4−Ｒ5は、共に結合して、環外二重結合を有する環と縮合している、少なくとも１個の５または６員環を有する炭素環式またはヘテロ環式環系を形成してもよい。かかる縮合ヘテロ環式環は、窒素原子、酸素原子または硫黄原子を有していてもよく、また、上記で言及したもののような、水素原子以外の環の置換基を有していてもよい。
【００５０】
上述の化合物のすべてにおいて、基Ｒ6は、基内の原子の結合価を満足するために要求される必要な数の水素原子に加えて、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子およびハロゲン原子から選択される１〜５０個の非水素原子を有する有機基である。より好適には、Ｒ6は、１〜２０個の非水素原子を有する。有機基は、好適にはアルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基およびアラルキル基を含む基から選択される。Ｒ6に関してより好適な基には、置換または無置換のＣ1〜Ｃ4アルキル基、置換または無置換のベンジル基、アルコキシアルキル基およびカルボキシアルキル基等がある。
【００５１】
置換基は、様々な個数で、かつ、ヘテロ環式環上の選択された環または鎖の位置において、化合物の特性を改質するため、または、最終的なホスフェート化合物の合成の便宜のために、導入することができる。かかる特性には、例えば、化学ルミネセンス量子収率、酵素との反応速度、最大光強度、発光の持続時間、発光波長および反応媒体中での溶解度等がある。特異的置換基およびその作用は、以下の特異例中で図示するが、これは、いかなる点においても本発明の範囲をこれにより制限するものではない。
【００５２】
好ましい種類の化合物は、下記式Ｖ、
【００５３】
基Ｒ7〜Ｒ14は、同一であっても異なっていてもよく、夫々、炭素原子、水素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子およびハロゲン原子から選択される１〜５０個の原子を有してもよく、かつ、光の発生をもたらす置換基であり、制限はされないが、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、置換アミノ基、カルボキシル基、カルボアルコキシ基、カルボキシアミド基（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、シアノ基およびスルホネート基等とすることができる。Ｒ7〜Ｒ14は、好適には、水素原子、ハロゲン原子およびアルコキシ基、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｔ−ブトキシ基等から選択される。化合物の好適な基は、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ12またはＲ13のうちの１個を塩素原子として有し、また、Ｒ7〜Ｒ14のうちの他の１個がハロゲン原子である。
【００５４】
より好適には、下記式VI、
【００５５】
好ましくはＲ’およびＲ’’のうちの少なくとも１個がアルカリ金属カチオンであり、より好ましくは双方である。アルカリ金属の中では、リチウム、ナトリウムおよびカリウムが好ましい。
【００５６】
式Ｉの化合物は、様々な方法で製造することができる。好適な方法においては、Ｚ2基が酸素原子であり、かつ、Ｚ1が酸素原子または硫黄原子である場合には、化合物Ｉは、エステルまたはチオエステルのエノラートと式Ｘ−ＬＧ（式中、ＬＧは下記スキムに従う離脱基である）で表される試薬との反応により製造することができる。
【００５７】
【００５８】
双方のＺ基が硫黄原子である場合の式Ｉの化合物の製造方法には、下記の２つのスキムに従う、好適なカルボニル化合物に対するリチオシラン化合物またはリンイリドの求核付加がある（Ｆ．Ａ．Ｃａｒｅｙ，Ａ．Ｓ．Ｃｏｕｒｔ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，３７，１９２６〜２９，（１９７２））。
【００５９】
他の方法においては、Ｅ．Ｊ．Ｃｏｒｅｙ ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｋｏｚｉｋｏｗｓｋｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，９２５‐８（１９７５）中に開示されており、かつ、以下に示すように、エステルが、ビス（ジアルキルアルミニウム）−ジチオール試薬との反応により、ケテンジチオアセタールに転化する。
【００６１】
さらにまた他の方法においては、活性メチレン基のアニオンがＣＳ2と反応し、かつ、ジチオカルボキシレートがＲ1基を有する試薬Ｒ1‐ＬＧと反応して、ジチオエステルを形成する。後者の方法論の例は、Ｉ．Ｓｈａｈａｋ ａｎｄ Ｙ．Ｓａｓｓｏｎ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，４２０７‐１０（１９７３）中に開示されている。ジチオエステルは、エノラートに転化して、式Ｘ−ＬＧで表される試薬と反応する。
【００６３】
本発明のもう一つの面は、ペルオキシダーゼとの反応による化学ルミネセンスの発生方法における、式Ｉ〜VIのいずれかの化合物の使用にある。水性緩衝溶液中における式Ｉ〜VIの化合物とペルオキシダーゼおよび過酸化物との反応は、検出される化学ルミネセンスを容易に発生させる。反応がアルカリ性ｐＨで行われた場合、光の強度は、数分以内に室温において最大レベルに達する。反応は、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）の存在下で、自由選択的に行われる。
本発明者らはこの点におけるこの発見に関する特異的なメカニズムの説明をすることはないが、光は、上記式VIIで表される電子的励起状態から放射されると考えられている。発光の必要条件は、反応が式VIIの励起状態を形成するために十分なエネルギーを生成することである。VII*が発光性であれば、そのとき化学ルミネセンスは、式VIIの励起状態からの放射を介しての反応から発生する。組成物VII*が有意に発光性でないならば、そのときは化学ルミネセンスは発光エネルギー受容体を含めることにより発生させることができる。
【００６５】
好適な化学ルミネセンスの発生方法においては、化合物Ｉを、約８〜１０の間のｐＨを有するアルカリ性緩衝液中で、ペルオキシダーゼ、過酸化物およびエンハンサーと反応させて、酵素および化合物Ｉの反応において開始する、連続的な化学ルミネセンス信号を発生させる。分析精度は、以下に、より詳細に述べるように、非イオン界面活性剤の混合により増大しうる。
式Ｖの化合物とペルオキシダーゼとの反応からの好適な光の発生方法においては、反応は、５℃〜５０℃の間、好ましくは２０℃〜４０℃の間の温度で、水性緩衝溶液中にて、７〜１０．５の間、好ましくは８．５〜１０の間のｐＨにおいて行われる。化合物Ｖは、１μＭ〜２０ｍＭの間、好ましくは１０μＭ〜１ｍＭの間の濃度で用いられる。酵素は、遊離ペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ複合体であってもよい。光は式VIIIの励起状態から放射される。
【００６７】
本発明の化合物は、代表的には、１００〜２００ｎｍの広い発光波長帯にわたって光を発生し、電磁スペクトルの近紫外から可視領域中の波長において最大強度を示す。最大強度の代表的波長λmaxは、３５０〜５００ｎｍの範囲内である。共有結合した発蛍光団を有する式Ｉの化合物が分子内エネルギー転移を引き起こし、その結果、発蛍光団の励起状態からのより長波長における放射が起こると予想される。
【００６８】
ペルオキシダーゼの作用による光の発生方法においては、１個以上の式Ｉの化合物を、同時に用いることが可能である。２個またはそれ以上の式Ｉの化合物とペルオキシダーゼとを同時に反応させることは、一定の場合には有利である。２個またはそれ以上の化合物が異なった発光性または物理的特性を有する場合には、２個の組合せは、任意１個の化合物の使用を通じては容易に達成できない特性を有する発光反応の発生に対して好ましい。複数の化合物Ｉの間で異なっていてもよい発光性および物理的特性の例としては、発光スペクトル、発光の持続時間、酵素の代謝回転、最大値までの発光の増大速度、疎水度／親水度および溶解度等がある。
【００６９】
過酸化物成分は、ペルオキシダーゼと反応しうるいずれかの過酸化物またはアルキルヒドロペルオキシドである。好適な過酸化物には、過酸化水素、尿素過酸化物およびぺルオキソホウ酸塩等がある。
【００７０】
化学ルミネセンス性反応を引き起こすことのできるペルオキシダーゼには、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、例えば、バナジウムブロモペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、枝分れアルトロ菌類（Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｏｓｕｓ）からのリグニンペルオキシダーゼおよびペルオキシダーゼ並びに白腐れ菌類中で生成するＭｎ‐依存性ペルオキシダーゼのようなカビペルオキシダーゼ、並びに、大豆ペルオキシダーゼ等がある。鉄錯体およびＭｎ‐ＴＰＰＳ４（Ｙ．‐Ｘ．Ｃｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｋｒｏｃｈｅｍ．Ｊ．，５２，２５７‐６２（１９９５））等の、酵素ではないがペルオキシダーゼのような活性を有する他のペルオキシダーゼ擬似化合物は、明らかにここで用いられるようなペルオキシダーゼの効力範囲内にあると考えられるルミノールの化学ルミネセンス性酸化を触媒することが知られている。ペルオキシダーゼおよび生物学的分子の複合体または錯体もまた、複合体がペルオキシダーゼ活性を呈することのみを条件として、化学ルミネセンスの発生方法において用いることができる。ペルオキシダーゼの１個またはそれ以上の分子と結合しうる生物学的分子には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、抗体−ＤＮＡキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、ラクチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびビオチン等がある。ペルオキシダーゼを含んでいるかまたは結合している錯体、例えば、リポソーム、ミセル、小胞（ｖｅｓｉｃｌｅｓ）、および、生物学的分子に対する付着物として機能化されたポリマーもまた、本発明の方法において使用することができる。
【００７１】
一定のエンハンサー化合物が反応混合物に結合することにより、酵素の反応性が促進される。これらのエンハンサーの中には、Ｇ．Ｔｈｏｒｐｅ，Ｌ．Ｋｒｉｃｋａ，ｉｎ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，Ｊ．Ｓｃｈｏｌｍｅｒｉｃｈ，ｅｔ ａｌ，Ｅｄｓ．，ｐｐ．１９９‐２０８（１９８７）、Ｍ．Ｉｉ，Ｈ．Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．Ａｒａｍａｋｉ，Ｈ．Ｍａｓｕｙａ，Ｔ．Ｈａｄａ，Ｍ．Ｔｅｒａｄａ，Ｍ．Ｈａｔａｎａｋａ，Ｙ．Ｉｃｈｉｍｏｒｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１９３（２），５４０−５（１９９３）、中、および、参考文献として本明細書中に折り込まれている米国特許第５，１７１，６６８号および５，２０６，１４９号中に記載されているように、他のペルオキシダーゼ反応を促進することが知られている、フェノール化合物および芳香族アミンが含まれる。米国特許第５，５１２，４５１号に開示され、かつ、参考文献により本明細書中に折り込まれているような、置換または無置換のアリールホウ素酸化合物並びにそのエステルおよび無水物誘導体も、本発明においては、エンハンサーの範囲内で有用であると考えられる。好適なエンハンサーには、これらに制限はされないが、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−水酸化桂皮酸、ｐ−イミダゾリルフェノール、アセトアミノフェン、２，４−ジクロロフェノール、２−ナフトールおよび６−ブロモ−２−ナフトール等がある。上記で言及したような種類のものからの１個以上のエンハンサーの混合物もまた、用いることができる。
【００７２】
本発明の化学ルミネセンス反応においては、添加剤としての非イオン界面活性剤の使用は有利である。ペルオキシダーゼを用いた化学ルミネセンス発生反応中に非イオン界面活性剤を加えると、化学ルミネセンスの持続時間を延長することで、ペルオキシダーゼについての分析的感度を改良することとなる。本発明の実施において有用な非イオン界面活性剤には、例として、ポリオキシエチレン化アルキルフェノール、ポリオキシエチレン化アルコール、ポリオキシエチレン化エステルおよびポリオキシエチレン化ソルビトールエステル等がある。
【００７３】
ＣＴＡＢのような第４アンモニウム塩化合物等のカチオン界面活性剤は、本発明の一定の化合物がペルオキシダーゼおよび過酸化物と反応する際に放射される化学ルミネセンスのレベルを増大するために使用することが有利である。例えば、以下に示す化合物４３または４６の本発明による反応からの光の強度は、ＣＴＡＢが反応混合物中に含まれている場合に１０倍以上に増大する。
【００７４】
本発明の反応は、固体担体、例えば、ペルオキシダーゼで被覆された、ビーズ、チューブ、膜またはマイクロウェル板、の表面に接触していてもよい水性緩衝剤のような溶液中で行われる。好適な緩衝剤には、約６〜約９の範囲内のｐＨを維持することが可能な、一般に用いられるいずれの緩衝剤も含まれ、例えば、ホスフェート、ホウ酸エステル、カーボネート、トリス（ヒドロキシメチルアミノ）メタン、グリシン、トリシン、２‐アミノ‐２‐メチル‐１‐プロパノール、ジエタノールアミン等がある。この点について、本発明の好適な実施方法は、個々の使用目的の要求により決定される。
【００７５】
本発明の方法により放射される光は、例えば、ルミノメータ、Ｘ線フィルム、高速写真フィルム、フィルム、ＣＣＤカメラ、シンチレーションカウンター、化学光量計、または、視覚的に、等の、好適な既知の手段のいずれによっても検出することができる。夫々の検出手段は、様々なスペクトル感度を有している。人間の眼は、緑の光に対して最も感度が高く、ＣＣＤカメラは赤の光に対して最大の感度を示し、青の光までのＵＶかまたは緑の光のいずれに対しても最大の感応を有するＸ線フィルムが有効である。検出装置の選択は、実用性と、価格、便利性、および、永久的な記録の作成が必要であるかどうかの考慮とにより決定すべきである。
【００７６】
他の実施形態として、蛍光エネルギー受容体を用いて、極大発光を長波長に移し（赤色シフト）かつ／又は放射されるルミネセンス量を増加させることができる。赤色シフト発光に関する数多の技術が、化学ルミネセンス反応及び検定法についての当業者には既知である。上記の如き共有結合した発蛍光団が一例である。更に、フルオレッサーを分離種として反応溶液に添加することもできる。フルオレッサーを化合物に接近させるためにポリマーと結合させ又はミセル若しくはポリマーと会合させてもよい。蛍光エネルギー移動試薬を使用して、供与体励起反応生成物 Ａ1Ａ2Ｃ＝Ｏ* の固有蛍光効率が低い場合又は励起反応生成物が三重項励起状態である場合に役立たせることができる。前者の場合は、エネルギー移動は、一重項−一重項のタイプであり、後者の場合は三重項−一重項のタイプの可能性がある。好適なエネルギー移動試薬は、励起反応生成物 Ａ1Ａ2Ｃ＝Ｏ* のエネルギーレベルと重複し、励起エネルギーの移動を可能とするエネルギーレベルでの励起状態と、供与体のエネルギーレベルと重複する励起状態と同じかまたは同じでなくてもよい蛍光励起状態とを有する。一重項−一重項のエネルギー移動を実施するのに有用なエネルギー移動試薬は、当業者に既知である。三重項−一重項のエネルギー移動を実施するのに有用なエネルギー移動試薬も、当業者に既知であり、通常少なくとも１個の金属原子又は他の、臭素又はヨウ素のような重い原子を有する。代表的な例は、９，１０−ジブロモアントラセン（ＤＢＡ）、ＤＢＡのスルフォン化誘導体及びＲｕ（ｂｐｙ）3 2+である。蛍光エネルギー移動試薬は、試薬の存在又は不存在下での、ペルオキシダーゼ、過酸化物及び化学式Ｉの化合物の反応において発生する化学ルミネセンスの強度又は波長を比較することによって、経験的に評価される。
【００７７】
本化学ルミネセンス法の重要な用途は、化学ルミネセンス反応による検定法でのアナライトの存在又は量の検出である。該方法は、アナライトを含有すると想定される試料を本発明の化学ルミネセンス化合物及びペルオキシダーゼと接触させ、定性法で発光を検出し、また定量を所望の場合には、発光量とアナライト量とを関係づける工程を包含している。光強度とアナライトの量との関係は、アナライトの既知量で検量線を作成することによって容易に測定できる。化学ルミネセンス化合物は、代表的には、約１０-5Ｍ〜約１０-2Ｍ、好ましくは約１０-4Ｍと約１０-3Ｍとの間の濃度で使用される。ペルオキシダーゼは、溶液にて検出の場合、好ましくは約１０-9Ｍ以下である。化学ルミネセンス反応法によって分析される代表的な試料は、体液例えば血液、血漿、血清、尿、精液、唾液、ＣＳＦなどである。
【００７８】
本方法によって検定できるアナライトには、ペルオキシダーゼがあり、この場合には、ペルオキシダーゼを追加する必要はなく、また、ペルオキシダーゼの阻害剤、及びペルオキシダーゼで標識化できるか又は酵素標識化特異的結合パートナーによって、特異的に検出できる各種の有機及び生物学的分子などがある。酵素は、アナライト結合化合物上に標識として直接含有され得る。更に、アナライト結合化合物を、少なくとも１個の酵素標識化特異的結合物質に結合させ得る。また、アナライト結合化合物を、少なくとも１種の第二特異的結合物質で標識化し得、これは、次いで第二特異的結合物質として酵素標識化結合パートナーに結合する。
【００７９】
本発明はまた、化学式Ｉの化合物及びペルオキシダーゼ酵素との化学ルミネセンス反応において、発光量を存在する過酸化水素の量と関係づけることによる検定法で、過酸化水素を検出する該方法の用途に関する。本方法が、オキシダーゼ酵素とデヒドロゲナーゼ酵素との検出に使用できることは、化学ルミネセンス検定についての当業者には明らかである。これらの酵素は酸素の還元と自生の基質の酸化によって過酸化水素を発生する。従って、これにより生じた過酸化水素を、発生と同時に反応させるか、或はその後の工程で本発明の化合物Ｉ及びペルオキシダーゼと反応させて発光させるかのいずれかとすることができる。次いで、発生した光特性を、オキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼ酵素の量と関係づける。更に、アナライトに対する検定法において、生物学的分子又は特異的結合対の部分に対する複合体としてオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼ酵素を存在させてもよい。
【００８０】
化学式Ｉの化合物とペルオキシダーゼとの、化学ルミネセンスを生じる反応は、ペルオキシダーゼの存在又は量を、迅速かつ高感度で検出する方法となる。従って本方法を、試料と化学式Ｉの化合物との反応による発光量又は強度の測定によって、試料中のペルオキシダーゼの存在又は量の測定の目的に使用できる。かかる測定は、例えば、法医学的調査の証拠物件として哺乳動物の血液のペルオキシダーゼ活性の測定に用途を見いだすことができる。
【００８１】
ペルオキシダーゼ活性の化学ルミネセンス測定での第二の応用分野は、酵素阻害剤の検出と測定とにある。阻害剤は、本発明の化合物の如き二次的基質と競合する基質として働くことによって、可逆的に作用することができる。自殺阻害として知られている阻害作用の別の態様は、酵素を不活性化することによって、不可逆的に作用する。例えば、ペルオキシダーゼ阻害剤にはシアン化物、硫化物および高濃度過酸化水素などがある。さらに、若干の物質はある濃度だけで抑制的で、かつ、部分的に抑制的であることが認められている。
【００８２】
阻害剤の量、または阻害定数Ｋｉあるいは阻害作用の半減期ｔ１／２のような特性の測定は、検出可能な生成物を生ずる基質および若干量の阻害剤の存在において、問題の酵素を含んでいる試料の酵素活性を測定することによってなされる。本発明によって酵素阻害剤を検出する方法においては、化学式Ｉで表される化合物が検出可能な物質として光を生ずる。酵素と化学ルミネセンス化合物の反応は、阻害剤物質の存在下と不存在下でなされ、その結果を比較して阻害剤の存在または量を測定する。阻害剤の効果は、３つの効果、即ち光強度の減少、光の強度上昇速度の低下または発光開始前の遅延時間のうちいずれか１つまたはそれ以上を有する。
【００８３】
酵素検定を遂行する技法はよく知られている。ここで示す例によって得られる手引きを用いて、試料の調製、試薬の適量と比率の決定、反応時間、検量線の作成など操作の変形は、定型的実験の問題として考案すべき当業者の技量の範囲内である。
【００８４】
反応がペルオキシダーゼによる触媒作用を受けるので、極めて少量の酵素でも検出可能な光の量を生じるのに十分である。１アットモル（１×１０-18モル）以下の感度が達成されている。かかる少量のペルオキシダーゼ検出が可能なため、本化学ルミネセンス技法は、酵素結合検定法を用いる多種のアナライト分析に好適である。かかる分析および検定法は、分析すべき試料中のアナライトが少量であるために、または限られた試料量であるために、ペルオキシダーゼの少量を検出できることが要求される。この種の検定法では、ペルオキシダーゼは、特異的結合ペアの一部に複合化している。一例は化学ルミネセンス酵素結合免疫検定法、例えば、所謂酵素結合イムノソルベントアッセイ、即ちエリザである。かかる検定法は、通常マニュアルのフォーマットと共に自動多試験免疫検定システムにも使用される。代表的な免疫検定法において、アナライトのハプテン、抗原または抗体は、該アナライトに対する酵素標識化特異的結合パートナーまたはアナライトの酵素標識化類似物（ｅｎｚｙｍｅ−ｌａｂｅｌｅｄ ａｎａｌｏｇ）の存在または量を検出することによって検定される。多くの検定法のフォーマットと免疫化学的手段遂行のためのプロトコルは業界でよく知られている。これらの検定法は概括的には二つの範疇に分かれる。競合検定法はアナライトおよびアナライト類似物、例えば検出可能な標識化アナライト分子を持った特異的抗体の免疫学的結合を特徴とする。サンドイッチ検定法は、二つの内の一つが検出可能標識化されている当該二つの抗体を、アナライトと順次または同時に結合させることによって得られる。このようにして形成された検出可能標識化結合ペアは、本発明の化合物および方法で検定できる。検出可能な標識がペルオキシダーゼ酵素である場合は、直接検出される。検出可能な標識が、他の特異的結合ペアの一部、例えばハプテンの場合には、その特異的パートナーとペルオキシダーゼとの複合体が第一に反応し、次いでペルオキシダーゼが、本方法に従って検出される。業界で慣用されているようなビーズ、チューブ、ミクロウェル、磁性粒子、試験ストリップ、膜およびフィルターなどの固体表面または支持体に結合した酵素標識化種を用いて測定を行うことができる。検出可能な酵素標識化種は、溶液中に遊離して存在してもよいし、またはリポソームのような組織化集合内に封入されていてもよいが、この場合には、溶解剤を使用してリポソームを溶解し検出可能酵素を遊離させる。
【００８５】
他の例示的使用法は、ウェスタンブロッティングの技術によるタンパク質の検出である。アナライトとして注目されているタンパク質を含有する試料は、電気泳動的分離に供される。分離されたタンパク質は、毛細管作用または電界の助けによってニトロセルロースまたはＰＶＤＦの膜のようなブロッティング膜に移動される。かかる移動したタンパク質は、典型的に特異的一次抗体および認識しかつ一次抗体に結合する酵素標識化二次抗体で検出される。標識の酵素活性の観察は、アナライトタンパク質の存在を反映するものである。ウェスタンブロッティングに対して本発明の方法を適合させるには、二次抗体と複合したＨＲＰを用いることができ、かつ、化学ルミネセンス試薬として、本発明の化合物を使用する化学ルミネセンスで、ペルオキシダーゼ活性を測定すればよい。この技術の変形、例えばビオチン化抗体やアビジン−ＨＲＰの使用は、本発明方法を用いて実施し得る検定法の範囲内と考えられる。
【００８６】
前述の抗原−抗体、ハプテン−抗体若しくは抗体−抗体のペアに加えて、特異的結合ペアには、相補的オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、ホルモン−受容体、レクチン−炭水化物、ＩｇＧ−タンパク質Ａ、核酸−核酸結合タンパク質および核酸−抗核酸抗体などがある。
【００８７】
本発明の検出方法の特に有用な用途は、酵素標識化核酸プローブの使用による核酸の検出である。酵素標識を用いた核酸の分析および化学ルミネセンス検出のための方法、例えば、溶液ハイブリッド形成検定、サザンブロッティングにおけるＤＮＡ検出、ノーザンブロッティングによるＲＮＡ、ＤＮＡアミノ酸配列分析（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ＤＮＡフィンガープリント法、コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）ハイブリッド形成およびプラークリフト法（ｐｌａｑｕｅ ｌｉｆｔｓ）は、全て十分に確立された技術である。酵素標識（例えば、ＨＲＰ）は、プローブオリゴヌクレオチドまたは捕獲（ｃａｐｔｕｒｅ）オリゴヌクレオチドとの直接複合体として存在することができ、または、当業者に公知の方法を用いた間接的な結合手段を通じて一体化させることができる。間接的な結合手段の例には、ハプテン標識化オリゴヌクレオチドおよびアンチハプテンＨＲＰ複合体、または、ビオチニル化オリゴヌクレオチドおよびアビジンＨＲＰ複合体を用いること等がある。かかる核酸検定法は、ブロッティング膜においてまたは溶液中で、当業者に公知であるようなビーズ、チューブ、ミクロウェル、磁性粒子または試験ストリップ等の固体表面に結合したオリゴヌクレオチドを用いて行うことができる。
【００８８】
他面では、本発明は約７と約１０．５との間のｐＨを持つ水性緩衝液、０．０１〜１０ｍＭの濃度での化学式Ｉで表される化合物および０．０１〜１０ｍＭの濃度での過酸化物を含有するペルオキシダーゼとの反応により化学ルミネセンスを生ずる試薬組成物に関する。任意に該組成物は更に、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ／ｍＬの、化学ルミネセンス促進に有効な量で、少なくとも１種のエンハンサーおよび０．０１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度での非イオン界面活性剤を含有してもよい。
【００８９】
ペルオキシダーゼとの反応により化学ルミネセンスを生ずる好ましい試薬組成物は、約７．５〜約９のｐＨを持つ水性緩衝液、０．０１〜１０ｍＭの濃度での化学式ＶまたはVIで表されるアクリダンホスフェート、０．０１〜１０ｍＭの濃度での過酸化物、０．００１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度でのエンハンサーおよび化学ルミネセンス促進に有効な量、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ／ｍＬの非イオン界面活性剤を含有する。この組成物には更にＥＤＴＡのようなキレート剤を０．０１〜１０ｍＭの濃度で含有してもよい。
【００９０】
更に本発明を多岐に渡って充分説明するため、以下に実施例を示すが、本発明の範囲をこれに限定するものではない。
【００９１】
実施例
１．アクリダンホスフェートの合成
下記の化合物を、出願人のＰＣＴ出願ＷＯ９７／２６２４５号公報への記載に従って調製した。
【００９２】
２．アクリダンビス（シアノエチル）ホスフェート化合物
化合物１〜１３の各々を化学式、
【００９３】
３．追加アクリダンリン酸塩及びアクリダンビス（シアノエチル）ホスフェート化合物の合成
更に追加となる、出願人のＰＣＴ出願ＷＯ９７／２６２４５号公報の記載に従って調製したアクリダンリン酸塩１４〜２３及びビス（シアノエチル）エステル１４ａ〜２３ａは、化学式、
【００９４】
本方法に従って、下記の例示的化合物を調製し、化学ルミネセンスを生じることを見出した。
【００９５】
７．アクリダン誘導体３７の合成
【００９６】
８．アクリダン誘導体３８の合成
【００９７】
９．アクリダン誘導体３９の合成
【００９８】
１０．アクリダン誘導体４０の合成
【００９９】
１１．アクリダン誘導体４１の合成
【０１００】
１２．アクリダン誘導体４２の合成
【０１０１】
１３．化合物４３の合成
【０１０２】
（ａ）１００ｍＬの乾燥ＴＨＦ中での２−（６−ヒドロキシ−２−ナフチル）−プロパン酸（１．００ｇ）及びベンゼンチオール（０．６３５ｇ）の混合物を、一夜攪拌することによって１．２ｇのＤＣＣで処理した。混合物を蒸発・乾燥し、残渣をヘキサンで洗浄し、濾過した。残渣をＣＨ2Ｃｌ2と水とで分配し、有機層を乾燥し蒸発した。粗製チオエステルフェニル２−（６−ヒドロキシ−２−ナフチル）−プロパン−チオエートを３０％酢酸エチル／ヘキサンでカラムクロマトグラフィによって精製した。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ １．６６（ｄ，３Ｈ），４．１４（ｑ，１Ｈ），５．３０（ｓ，１Ｈ），７．０９〜７．７４（ｍ，１１Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ １８．６３，５４．０９，１０３．０２，１０９．４２，１１８．３５，１２６．５４，１２６．９７，１２７．０６，１２７．８８，１２８．８８，１２９．１８，１２９．３９，１２９．８２，１３４．０４，１３４．５２，１５３．８６，１９９．７８．
【０１０３】
（ｂ）前工程の生成物（２．５ｇ）を、３ｍＬのトリエチルアミン中で１．１ｍＬのピバロイルクロリドと反応させることによって、フェノール基をピバレートエステルとして保護した。反応完結後、混合物を蒸発・乾燥し、残渣をＣＨ2Ｃｌ2と水とで分配した。有機層を水で、続いて飽和ＮａＣｌで洗浄し、乾燥、蒸発した。粗製チオエステルフェニル２−（６−ピバロイルオキシ−２−ナフチル）−プロパンチオエートを０〜５％酢酸エチル／ヘキサンでカラムクロマトグラフィによって精製した。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ １．４１（ｓ，９Ｈ），１．６６（ｄ，３Ｈ），４．１７（ｑ，１Ｈ），７．１９〜７．８７（ｍ，１１Ｈ）．
【０１０４】
（ｃ）−７８℃において乾燥ＴＨＦ中で、１．５当量のＬＤＡでの２．０ｇのチオエステルの脱プロトン化及びエノラートを、０．７１ｍＬのＰＯＣｌ3と０．６２ｍＬのピリジンと反応させることによって、更に続いて１．２ｍＬのピリジン中での１．０４ｍＬの３−ヒドロキシプロピオニトリルの付加によって、工程（ｂ）からエノールビス（シアノエチル）ホスフェートへのチオエステルの転化を実施した。反応溶液を濾過し、蒸発した。６０％酢酸エチル／ヘキサンを用いてカラムクロマトグラフィにより、また続いて水による洗浄で残留する３−ヒドロキシプロピオニトリルを除去することによって、残渣から生成物を単離した。生成物は、実質的に１種の異性体（４３ａ）であることが明らかであった。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ １．３９（ｓ，９Ｈ），２．３８（ｓ，３Ｈ），２．６７（ｍ，４Ｈ），４．２５（ｍ，４Ｈ），７．２〜７．８（ｍ，１１Ｈ）；31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ −７．４３
【０１０５】
（ｄ）化合物４３ａを、１ｍＬの水に溶解した０．１９８ｇのＮａＯＨを含有する３５ｍＬのアセトン中にて０．７２ｇを反応させることによって脱保護した。沈殿した塩をアセトンで洗浄し、エタノールに溶解しアセトンで沈殿させて４３を製造した。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δ ２．３４（ｓ，３Ｈ），６．８０〜７．４４（ｍ，１１Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δ ２１．２６，１１１．３２，１２４．１５，１２５．１０，１２５．０８，１２７．３８，１２７．９０，１２８．６２，１２９．３５，１２９．４４，１３５．７９，１３６．０６，１３６．１４，１３６．５１，１３９．３１，１３９．４３，１４０．０７，１６４．９９；31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δ ６．２４．
【０１０６】
１４．化合物４４の合成
【０１０７】
（ｂ）フェノール基をピバレートエステルとして保護した。前工程からのチオエステル（６．１４ｇ）を、ピバロイルクロリド（２．８９ｇ）及び５ｍＬのトリエチルアミンと反応させた。混合物を蒸発・乾燥した後、残渣を水、及び飽和ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した。続いて５％酢酸エチル／ヘキサンでクロマトグラフィによって精製を行った。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１．４１（ｓ，９Ｈ），１．６５〜１．６８（ｄ，３Ｈ），４．１２〜４．１９（ｑ，１Ｈ），７．２０〜７．８７（ｍ，１０Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１８．５７，２７．２２，３９．１８，５４．２１，１０３．０２，１１８．３５，１２１．７８，１２６．５７，１２６．９９，１２８．３３，１２９．３９，１３１．４３，１３３．２５，１３６．７４，１４９．０６，１７７．３２，１９８．５９．
【０１０８】
（ｃ）−７８℃において乾燥ＴＨＦ中で、１．５当量のＬＤＡでの２．２ｇのチオエステルの脱プロトン化及びエノラートを、１．５当量のＰＯＣｌ3と１．５当量のピリジンと反応させることによって、更に続いて１．２ｍＬのピリジン中での１．０４ｍＬの３−ヒドロキシプロピオニトリルの付加によって、保護されたチオエステルのエノールビス（シアノエチル）ホスフェートへの転化を実施した。反応溶液を蒸発し、残渣をＣＨ2Ｃｌ2と水とで分配した。有機層を逐次、水で次いで飽和ＮａＣｌで洗浄し、乾燥し、蒸発した。生成物を６５％酢酸エチル／ヘキサンを用いてクロマトグラフィにより、異性体の混合物（４４ａ Ｅ／Ｚ）として残渣から単離した。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１．４０（ｓ，９Ｈ），２．３６＆２．３６（２ｓ，３Ｈ），２．７２〜２．７６（ｍ，４Ｈ），４．２４〜４．３５（ｍ，４Ｈ），７．１７〜７．８１（ｍ，１０Ｈ）；31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ−７．０７．
【０１０９】
（ｄ）化合物４４ａを、１ｍＬの水に溶解した０．２６ｇのＮａＯＨを含有する６０ｍＬのアセトン中にて０．８０ｇを反応させることによって脱保護した。沈殿した塩をアセトンで洗浄し、乾燥して、異性体の混合物（４４ Ｅ／Ｚ）として化合物４４を製造した。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ２．１９（ｓ，３Ｈ），６．７９〜７．５４（ｍ，１１Ｈ）；31Ｐ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ２．９０．
【０１１０】
１５．化合物４５の合成
【０１１１】
（ｂ）−７８℃において３０分間、乾燥ＴＨＦ中で１．１当量のＬＤＡでの３．０ｇの脱プロトン化及び反応物を室温に昇温しながらエノラートを、１．１５当量のＰＯＣｌ3と１．１５当量のピリジンと３時間反応させることによって、エステルをエノールビス（シアノエチル）ホスフェートへ転化した。４．８ｍＬのピリジン中の３−ヒドロキシプロピオニトリル（２．０５ｍＬ）を添加し、反応物を一夜攪拌した。反応溶液を蒸発し、残渣をＣＨ2Ｃｌ2と水とで分配した。有機層を逐次、水で次いで飽和ＮａＣｌで洗浄し、乾燥し、蒸発した。生成物を７０％酢酸エチル／ヘキサンを用いてクロマトグラフィにより、残渣から単離した（４５ａ）。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ２．３０〜２．４５（ｍ，４Ｈ），３．６９〜３．８４（ｍ，４Ｈ），７．０８〜７．４５（ｍ，１５Ｈ）．
【０１１２】
（ｃ）化合物４５ａを、１ｍＬの水に溶解した０．１８ｇのＮａＯＨを含有する３０ｍＬのアセトン中にて１．０４ｇを一夜反応させることによって脱保護した。沈殿した塩をアセトンで洗浄し、乾燥して化合物４５（０．５ｇ）を製造した。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ ７．００〜７．５６（ｍ，１５Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ１１０．５１，１１０．６０，１１６．２１，１２２．２９，１２６．６０，１２６．７２，１２８．２６，１２９．５４，１２９．８７，１２９．９６，１３９．０１，１４６．７５，１４６．８７，１５６．５５，２０１．６３；31Ｐ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ ２．１５．
【０１１３】
１５．化合物４６の合成
【０１１４】
（ｂ）−７８℃において３０分間、乾燥ＴＨＦ中で１．１当量のＬＤＡでの３．０ｇの脱プロトン化及び反応物を室温に昇温しながらエノラートを、１．１５当量のＰＯＣｌ3と１．１５当量のピリジンと３．５時間反応させることによって、チオエステルをエノールビス（シアノエチル）ホスフェートへ転化した。４．８ｍＬのピリジン中の３−ヒドロキシプロピオニトリル（２．０５ｍＬ）を添加し、反応物を一夜攪拌した。反応溶液を蒸発し、残渣をＣＨ2Ｃｌ2と水とで分配した。有機層を逐次、水で次いで飽和ＮａＣｌで洗浄し、乾燥し、蒸発した。生成物を６５％酢酸エチル／ヘキサンを用いてクロマトグラフィにより、残渣から単離した（４６ａ）。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ２．３〜２．５（ｍ，４Ｈ），３．６２〜３．８２（ｍ，４Ｈ），７．２〜７．４５（ｍ，１５Ｈ）．
【０１１５】
（ｃ）化合物４６ａを、２ｍＬの水に溶解した０．３ｇのＮａＯＨを含有する５０ｍＬのアセトン中にて１．７９ｇを一夜反応させることによって脱保護した。沈殿した塩をアセトンで洗浄し、乾燥して化合物４６（１．５ｇ）を製造した。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ ７．０８〜７．４４（ｍ，１５Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ１２５．７８，１２７．２３，１２７．４１，１２７．６０，１２８．１１，１２８．１７，１２９．１１，１２９．９３，１２９．５４，１３５．５８，１３５．６７，１３９．８６，１４０．７４，１４０．８６，１４１．６２；31Ｐ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ ２．３０．
【０１１６】
１６．化合物４７の合成
【０１１７】
（ｂ）−７８℃において、３０ｍＬの乾燥ＴＨＦ中で１．２当量のＬＤＡでの、０．５ｇのチオエステルの脱プロトン化及びエノラートを、１．２当量のＰＯＣｌ3と１．２当量のピリジンと反応させることによって、更に続いて０．３０ｍＬのピリジン中での０．２５５ｍＬの３−ヒドロキシプロピオニトリルの添加によって、チオエステルのエノールビス（シアノエチル）ホスフェートへの転化を実施した。反応溶液を蒸発し、残渣をＣＨ2Ｃｌ2と水とで分配した。有機層を逐次、水で次いで飽和ＮａＣｌで洗浄し、乾燥し、蒸発した。生成物を残渣から６０％酢酸エチル／ヘキサンを用いるクロマトグラフィにより、異性体の５：２混合物として単離した（４７ａ Ｅ／Ｚ）。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ２．１５〜２．２４（ｍ），２．６３〜２．６７（ｍ），３．６２〜３．７８（ｍ），４．１４〜４．２２（ｍ），７．２４〜８．２６（ｍ）；31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ２７．３９，２８．１６；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ １９．０６，１９．１５，１９．５４，１９．６４，６２．４０，６２．４６，６２．９８，６３．０４，１１６．１６，１１６．４９，１２３．５１，１２３．７５，１２４．３９，１２４．５４，１２４．７１，１２４．８１，１２５．５７，１２５．６３，１２５．７２，１２５．８７，１２６．１８，１２６．３９，１２７．０９，１２７．１５，１２７．３２，１２７．４６，１２７．８８，１２８．０６，１２８．１７，１２８．２７，１２８．３０，１２８．７６，１２９．３３，１２９．４２，１２９．７６，１２９．８２，１３０．６７，１３０．８５，１３１．０３，１３１．２２，１３１．３１，１３１．４０，１３２．９１，１４１．３２，１４２．９６，１４３．１１．
【０１１８】
（ｃ）化合物４７ａを、０．１ｍＬの水に溶解した０．０４ｇのＮａＯＨを含有する６ｍＬのアセトン中にて０．２４７ｇを反応させることによって脱保護した。沈殿した塩をアセトンで洗浄し、乾燥して化合物４７を異性体の混合物として製造した（４７ Ｅ／Ｚ）。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ ６．２２（ｓ），６．７４〜８．１（ｍ），８．４７（ｄ）；31Ｐ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ ０．１２，０．６９，０．７０．
【０１１９】
１７．化合物４８の合成
【０１２０】
（ｂ）チオキサンテン、９．１ｇを１００ｍＬの乾燥ＴＨＦに溶解した。溶液をアイスバスで冷却し、ｎ−ＢｕＬｉ（２．５Ｍ溶液の２４ｍＬ）を滴下した。赤色溶液を室温で１時間攪拌した。粉末ＣＯ2を（約１５０ｇ）添加し、白い沈殿を生じた。更に１時間攪拌した後、混合物を蒸発し、残渣を水に溶解した。水溶液をＣＨ2Ｃｌ2で抽出し、ＨＣｌで中和した。沈降生成物をエーテルに溶解し、乾燥し、蒸発してチオキサンテン−９−カルボン酸を白色固体（８．８ｇ）として製造した。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ ５．２５（ｓ，１Ｈ），７．３０（ｍ，４Ｈ），７．４９（ｍ，４Ｈ），１２．６０（ｓ，１Ｈ）．
【０１２１】
（ｃ）チオキサンテン−９−カルボン酸（５．８ｇ）とチオニルクロリド（３０ｍＬ）とを室温で１時間攪拌した。チオニルクロリドを蒸発し、残渣を１００ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2に溶解した。ピリジン（４ｍＬ）とチオフェノール（４ｇ）とを添加し、反応混合物を室温で５時間攪拌した。混合物を蒸発し、残渣を水で、次いでエーテルで洗浄した。チオエステルを２０％酢酸エチル／ヘキサンを用いてクロマトグラフィによって精製し、６．３ｇの純粋なフェニルチオキサンテン−９−カルボン酸を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ５．１６（ｓ，１Ｈ），７．３２（ｍ，９Ｈ），７．５０（ｍ，４Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ６３．０，１２６．９，１２７．３，１２８．１，１２８．４，１２９．２，１２９．４，１３０．９，１３２．４，１３３．７，１３４．５，１９６．５．
【０１２２】
（ｄ）−７８℃で３０分間、４０ｍＬの乾燥ＴＨＦ中で１．５当量のＬＤＡでチオエステル（４．６ｇ）を脱プロトン化した。エノラートを、１０ｍＬの乾燥ＴＨＦに溶解したＰＯＣｌ3（３．２ｇ）とピリジン（１．６６ｇ）との溶液を反応物に滴下し、それを室温に昇温させた。室温で４５分間、攪拌した後、シアノエタノール（５．６８ｇ）とピリジン（６．３ｇ）との溶液を添加し、一夜攪拌を継続した。混合物を濾過し、濾液を濃厚な残渣となるまで濃縮して、それを７０％酢酸エチル／ヘキサンを用いるクロマトグラフィにかけた。エノールビス（シアノエチル）ホスフェート（４８ａ）を、フォーム（３．１ｇ）として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ２．５２（ｍ，４Ｈ），３．９４（ｍ，４Ｈ），７．２０〜７．４８（ｍ，１０Ｈ），７．５５（ｄｄ，１Ｈ），７．７４（ｄｄ，１Ｈ），７．８５（ｄｄ，１Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ １９．５，６２．５，１１６．６，１２６．２，１２６．３，１２６．７，１２７．０，１２７．１，１２８．０，１２８．１，１２８．２，１２９．１，１２９．５，１２９．７，１３２．５，１３３．０，１３３．３，１３４．２，１３４．３，１３４．６，１３７．７，１３７．８；31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ−１０．３５（ｐ）．
【０１２３】
（ｅ）化合物４８ａを、５．６ｍＬの水に溶解した０．２８ｇのＮａＯＨを含有するアルゴン気流下の４０ｍＬのアセトン中にて１．８ｇを一夜反応させることによって脱保護した。沈殿した塩を１０％のアセトン水溶液で洗浄し、乾燥して化合物４８（１．５７ｇ）を白色固体として製造した。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ ６．９４〜７．２５（ｍ，９Ｈ），７．３８（ｍ，２Ｈ），７．７６（ｄ，１Ｈ），８．０８（ｄ，１Ｈ）；31Ｐ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ ０．７３（ｓ）．
【０１２４】
１８．化合物４９の合成
【０１２５】
（ａ）フェニルチオキサンテン−９−チオカルボキシレート：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ５．２６（ｓ，１Ｈ），６．９４（ｄ，２Ｈ），７．１５（ｔ，１Ｈ），７．２４〜７．３４（ｍ，６Ｈ），７．５１（ｍ，４Ｈ）．
【０１２６】
（ｂ）９−（フェノキシホスホリルオキシメチリデン）チオキサンテン，ビス（シアノエチル）エステル（４９ａ）；1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ２．５０（ｍ，４Ｈ），３．８４（ｍ，２Ｈ），４．０２（ｍ，２Ｈ），７．１６（ｍ，５Ｈ），７．２９〜７．５４（ｍ，７Ｈ），７．８２（ｄ，１Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ １９．５，６３．０，１２４．１，１２６．４，１２６．５，１２６．８，１２７．５，１２７．８，１２８．０，１２９．２，１３０．１，１３１．２，１３１．４，１３３．４，１３４．４，１４２．７，１４２．９，１５５．０；31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ −１０．９２（ｐ）
【０１２７】
（ｃ）９−（フェノキシホスホリルオキシメチリデン）チオキサンテン，二ナトリウム塩（４９）；1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ ６．９２（ｔ，１Ｈ）７．０４（ｔ，２Ｈ），７．０７〜７．３４（ｍ，６Ｈ），７．３８（ｔ，１Ｈ），７．４５（ｄ，１Ｈ），７．７１（ｄ，１Ｈ），８．０５（ｄ，１Ｈ）；31Ｐ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ ０．２２（ｓ）．
【００１２８】
１９．アクリダン誘導体５０の合成
【０１２９】
２０．アクリダンホスフェート５によるＨＲＰの化学ルミネセンス検出
０．０５５ＭのｐＨ８．６トリス緩衝液、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン（Ｔｗｅｅｎ）２０及び３．３×１０-4Ｍのアクリダン５を含有する試薬組成物を、３組の１００μＬのアリコートと１．４×１０-15モル及び１．４×１０-19モルの間の量の酵素を含有する１０μＬのＨＲＰ水溶液とを反応させることによって化学ルミネセンス発生について試験を行った。混合の結果発光が生起し、これを５分、１０分、１５分に測定した。１５分での化学ルミネセンス強度と酵素量との関係を、図１に示す。
【０１３０】
２１．アクリダンホスフェート１３によるＨＲＰの化学ルミネセンス検出
０．０５５ＭのｐＨ８．６トリス緩衝液、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン２０及び３．３×１０-4Ｍのアクリダン１３を含有する試薬組成物を、３組の１００μＬのアリコートと１．４×１０-15モル及び１．４×１０-19モルの間の量の酵素を含有する１０μＬのＨＲＰ水溶液とを反応させることによって化学ルミネセンス発生について試験を行った。混合の結果発光が生起し、１５分に測定した。化学ルミネセンス強度と酵素量との関係を、図２に示す。
【０１３１】
２２．アクリダンホスフェート１〜４及び６〜１２及び１４による化学ルミネセンス検出
実施例２１の方法で、化合物１〜４及び６〜１２及び１４をそれぞれ含有する組成物を、２５℃でＨＲＰと反応させた。いずれも、ＨＲＰの存在なしで測定したバックグラウンドに対して、識別可能で、容易に測定できる化学ルミネセンスを発生した。
【０１３２】
２３．化学ルミネセンス強度の速度論的特性図
ＨＲＰと反応したアクリダンホスフェート５の化学ルミネセンスの特性図を、図３に示す。実施例２０の試薬組成物１００μＬと１．４×１０-15モルのＨＲＰとの２５℃における反応で、直ちに発光が始まり、約５分で極大強度に達した。
【０１３３】
２４．アクリダンジエチルホスフェート３７によるＨＲＰの化学ルミネセンス検 出
０．０１ＭのｐＨ８．０トリス緩衝液、０．５ｍＭの尿素過酸化物、０．１ｍＭのｐ−フェニルフェノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のツィン２０及び５×１０-5Ｍのアクリダン３７を含有する試薬組成物を、３組の１００μＬのアリコートと１．４×１０-14〜１．４×１０-19モルの範囲における１０μＬのＨＲＰとを反応させることによる化学ルミネセンス発生について試験を行った。混合の結果発光が生起し、２分で測定した。化学ルミネセンス強度と酵素量との関係を、図４に示す。
【０１３４】
２５．アクリダンジエチルホスフェート３８によるＨＲＰの化学ルミネセンス検出
０．０１ＭのｐＨ８．０トリス緩衝液、０．５ｍＭの尿素過酸化物、０．１ｍＭのｐ−フェニルフェノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のツィン２０及び５×１０-5Ｍのアクリダン３８を含有する試薬組成物（４０μＬ）を、１．４×１０-15モルのＨＲＰを含有する溶液１μＬと反応させた。混合の結果発光が生起し、１分以内に最大強度に達した。化学ルミネセンス−時間の特性図を、図５に示す。
【０１３５】
２６．アクリダンアセテート３９によるＨＲＰの化学ルミネセンス検出
０．０１ＭのｐＨ８．０トリス緩衝液、０．５ｍＭの尿素過酸化物、０．１ｍＭのｐ−フェニルフェノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のツィン２０及び５×１０-5Ｍのアクリダン３９を含有する試薬組成物を、３組の１００μＬのアリコートと１．４×１０-15〜１．４×１０-20モルの範囲における１０μＬのＨＲＰとを反応させることによる化学ルミネセンス発生について試験を行った。混合の結果発光が生起し、３０分以内に最大強度に達した。化学ルミネセンス強度と酵素量との関係を、図６に示す。
【０１３６】
２７．アクリダンアセテート４０によるＨＲＰの化学ルミネセンス検出
０．０１ＭのｐＨ８．０トリス緩衝液、０．５ｍＭの尿素過酸化物、０．１ｍＭのｐ−フェニルフェノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のツィン２０及び５×１０-5Ｍのアクリダン４０を含有する試薬組成物（１００μＬ）を、１．４×１０-15モルのＨＲＰを含有する溶液１０μＬと反応させた。混合の結果発光が生起し、７分以内に最大強度に達した。
【０１３７】
２８．アクリダン５０によるＨＲＰの化学ルミネセンス検出
０．０１ＭのｐＨ８．０トリス緩衝液、０．５ｍＭの尿素過酸化物、０．１ｍＭのｐ−フェニルフェノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のツィン２０及び５×１０-5Ｍのアクリダン５０を含有する試薬組成物（１００μＬ）を、３．５×１０-16モルのＨＲＰを含有する溶液２．５μＬと反応させた。混合の結果発光が生起し、７分以内に最大強度に達した。化学ルミネセンス−時間の特性図を、図７に示す。
【０１３８】
２９．化合物４３によるＨＲＰの化学ルミネセンス検出
０．０５５ＭのｐＨ８．６トリス緩衝液、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン２０、１ｍＭのＣＡＴＢ及び６．６×１０-4Ｍのアクリダン４３を含有する試薬組成物を、３組の１００μＬのアリコートと１．４×１０-15〜１．４×１０-19モルの範囲のＨＲＰを含有するＨＲＰ溶液１０μＬとを反応させることによる化学ルミネセンス発生について試験を行った。１５分における化学ルミネセンス強度と酵素量との関係を、図８に示す。
【０１３９】
３０．化合物４６によるＨＲＰの化学ルミネセンス検出及びエネルギー転位試薬による化学ルミネセンスの強化
０．０５５ＭのｐＨ８．６トリス緩衝液、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン２０、１ｍＭのＣＡＴＢ及び６．６×１０-4Ｍのアクリダン４６単独又は５０μＭのＤＢＡもともに含有する試薬組成物を、１００μＬのアリコートと３．５×１０-15モルのＨＲＰとを反応させることによる化学ルミネセンス発生について試験を行った。化学ルミネセンス−時間の関係を示す特性図を、図８に示し、三重項エネルギー受容体ＤＢＡによる化学ルミネセンスの強化を実証する。
【０１４０】
３１．化合物４８によるＨＲＰの化学ルミネセンス検出
０．０５５ＭのｐＨ８．６トリス緩衝液、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン２０及び３．３×１０-4Ｍの化合物４８を含有する試薬組成物を、１００μＬのアリコートと３．５×１０-15モルのＨＲＰとを反応させることによる化学ルミネセンス発生について試験を行った。化学ルミネセンス−時間の特性図を、図１０に示す。
【０１４１】
３２．化合物４９によるＨＲＰの化学ルミネセンス検出
０．０５５ＭのｐＨ８．６トリス緩衝液、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン２０及び３．３×１０-4Ｍの化合物４９を含有する試薬組成物を、１００μＬのアリコートと３．３×１０-15モルのＨＲＰとを反応させることによる化学ルミネセンス発生について試験を行った。化学ルミネセンス−時間の特性図を、図１１に示す。
【０１４２】
３３．ＰＶＤＦ膜を用いるウェスタンブロット検定
本発明の組成物を用いてポリビニリデンジフロリド（ＰＶＤＦ）膜上でＨＲＰ標識化抗体によるウェスタンブロットにおけるタンパク質、β−ガラクトシダーゼ（以下β−ｇａｌ）を検出及び定量を行った。それぞれ５０００，１０００，１８０，３０，及び５ｐｇのタンパク質を含有するβ−ｇａｌの希釈液を、電気泳動してＰＶＤＦ膜（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ）ＭＡ）に転移させた。膜をＴ−ＴＢＳ（ＴＢＳ中に０．０５％ツイン２０含有、ＴＢＳは５０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ含有）に入れた無脂乳でブロックし、次いでマウス抗−β−ｇａｌ（ベーリンガー・マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ））の１：１５００希釈液と、またシープ（ｓｈｅｅｐ）抗−マウス−ＨＲＰ複合体（ベーリンガー・マンハイム社）の１：６００希釈液と逐次反応させた。膜をＴ−ＴＢＳ中にて洗浄し、０．６６ｍＭのアクリダンホスフェート５を含有する０．０５５ＭのｐＨ８．６トリス緩衝液、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン２０を含有する試薬に３分間浸漬した。膜を透明プラスチックシートの間に挟み、Ｘ線フィルムに暴露した。図１２に、３０秒暴露して、１４分後のβ−ｇａｌの検出を示す。発光は数時間に渡って作像できる強力な放射を得た。
【０１４３】
３４．ニトロセルローズ膜を用いたウェスタンブロット
前実施例の方法に従うウェスタンブロット検定をニトロセルローズ膜（シュライヘル・シュール社（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）キーン（Ｋｅｅｎｅ）ＮＨ）を固体相として使用して実施した。５０００〜５ｐｇの範囲のβ−ｇａｌ標準を使用した。
前実施例の検出試薬で数時間に渡って検出させた。図１３は、５分暴露して１０分後のβ−ｇａｌの検出を示す。
【０１４４】
３５．本発明の他の化学ルミネセンス試薬を使用したウェスタンブロット
ＰＶＤＦとニトロセルローズ膜との両方について、β−ガラクトシダーゼの同様なウェスタンブロット検定を、化合物５の代わりに化合物１，１２及び１３をそれぞれ含有する検出試薬を用いて行い、定性的に同様の結果を得た。
【０１４５】
３５．本発明の化学ルミネセンス試薬を使用したサザンブロット
サザンブロット検定を、出願人の米国特許第５５９３８４５号明細書に従い、そこに記載の検出試薬の代わりに本発明の実施例２０又は３３による試薬組成物に置換えて実施できた。
【０１４６】
上記の説明並びに実施例は、本発明の説明に資するためのものであって、本発明の技術的範囲を限定するものではない。特別な化合物や方法が開示されていないものでも本発明の技術思想、技術範囲から外れるものではない。本発明の範囲は、特許請求の範囲から判断されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 室温で誘発したアクリダンホスフェート５を含有する実施例２０に記載された試薬１００μＬによって１５分に発生した化学ルミネセンス強度とＨＲＰの量との関係を示すグラフである。ブラックミクロプレート（ｂｌａｃｋ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）のウェル（ｗｅｌｌ）の中で１．４×１０-15モル及び１．４×１０-19モルの間の酵素を含有するＨＲＰの溶液１０μＬを、０．０５５ＭのｐＨ８．６トリス緩衝液、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン２０及び３．３×１０-4Ｍのアクリダン５を含有する試薬１００μＬに添加することによって化学ルミネセンス放射を開始せしめた。用語のＳ−Ｂとは、ＨＲＰ存在下での相対光度単位（ＲＬＵ）での化学ルミネセンスのシグナル（Ｓ）を、ＨＲＰ不存在下でのバックグラウンドの化学ルミネセンス（Ｂ）に対して補正したものを指す。
【図２】 室温で誘発したアクリダンホスフェート１３を含有する実施例２１に記載された試薬１００μＬによって１５分に発生した化学ルミネセンス強度とＨＲＰの量との関係を示すグラフである。ブラックミクロプレートの中で１．４×１０-15モル及び１．４×１０-19モルの間の酵素を含有するＨＲＰの溶液１０μＬを、０．０５５ＭのｐＨ８．６トリス緩衝液、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン２０及び３．３×１０-4Ｍのアクリダン１３を含有する試薬１００μＬに添加することによって化学ルミネセンス放射を開始せしめた。
【図３】 ２５℃で１．４×１０-15モルのＨＲＰと実施例２０に記載のアクリダン５を含有する試薬１００μＬとの反応の結果生じた化学ルミネセンスの経時特性を示すグラフである。
【図４】 室温で誘発したアクリダン３７を含有する試薬１００μＬによって２分に放射された化学ルミネセンス最大強度とＨＲＰの量との関係を示すグラフである。１．４×１０-14モル〜１．４×１０-19モルの間を含有するＨＲＰの溶液１０μＬを、０．０１ＭのｐＨ８．０トリス緩衝液、０．５ｍＭの尿素過酸化物、０．１ｍＭのｐ−フェニルフェノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のツィン２０及び５×１０-5Ｍのアクリダン３７を含有する試薬組成物１００μＬに添加することによって化学ルミネセンス放射を開始せしめた。
【図５】 １．４×１０-15モルのＨＲＰと０．０１ＭのｐＨ８．０トリス緩衝液、０．５ｍＭの尿素過酸化物、０．１ｍＭのｐ−フェニルフェノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のツィン２０及び５×１０-5Ｍのアクリダン３８を含有する４０μＬの試薬と、２５℃で反応した結果生じた化学ルミネセンスの経時特性を示すグラフである。混合の結果発光が生起し、１分以内に最大強度に達した。
【図６】 室温で誘発したアクリダン３９を含有する試薬１００μＬによって３０分に放射された化学ルミネセンス最大強度とＨＲＰの量との関係を示すグラフである。１．４×１０-15モル〜１．４×１０-20モルの間を含有するＨＲＰの溶液１０μＬを、０．０１ＭのｐＨ８．０トリス緩衝液、０．５ｍＭの尿素過酸化物、０．１ｍＭのｐ−フェニルフェノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のツィン２０及び５×１０-5Ｍのアクリダン３９を含有する試薬組成物１００μＬに添加させることによって化学ルミネセンス放射を開始せしめた。
【図７】 ３．５×１０-16モルのＨＲＰと０．０１ＭのｐＨ８．０トリス緩衝液、０．５ｍＭの尿素過酸化物、０．１ｍＭのｐ−フェニルフェノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のツィン２０及び５×１０-5Ｍのアクリダン５０を含有する１００μＬの試薬と、２５℃で反応した結果生じた化学ルミネセンスの経時特性を示すグラフである。混合の結果発光が生起し、７分以内に最大強度に達した。
【図８】 室温で誘発したアクリダン４３を含有する試薬１００μＬによって１５分に放射された化学ルミネセンス最大強度とＨＲＰの量との関係を示すグラフである。１．４×１０-15モル〜１．４×１０-19モルの間を含有するＨＲＰの溶液１０μＬを、０．０５５ＭのｐＨ８．６トリス緩衝液、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン２０、１ｍＭのＣＴＡＶ及び６．６×１０-4Ｍのアクリダン４３を含有する試薬組成物１００μＬに添加することによって化学ルミネセンス放射を開始せしめた。
【図９】 蛍光性エネルギー移動試薬の使用による化学ルミネセンスの強化を実証するグラフである。０．０５５ＭのｐＨ８．６トリス緩衝液、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン２０、１ｍＭのＣＴＡＶ及び３．３×１０-4Ｍの化合物４６単独又は５０μＭのＤＢＡとともに含有する試薬組成物を、１００μＬアリコートと３．５×１０-15モルのＨＲＰとを反応させることによる化学ルミネセンスの発生について試験を行った。
【図１０】 ３．５×１０-15モルのＨＲＰと０．０５５ＭのｐＨ８．６トリス緩衝液、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン２０及び３．３×１０-4Ｍの化合物４８を含有する１００μＬの試薬と、２５℃で反応した結果生じた化学ルミネセンスの経時特性を示すグラフである。
【図１１】 ３．３×１０-15モルのＨＲＰと０．０５５ＭのｐＨ８．６トリス緩衝液、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン２０及び３．３×１０-4Ｍの化合物４９を含有する１００μＬの試薬と、２５℃で反応した結果生じた化学ルミネセンスの経時特性を示すグラフである。
【図１２】 化学ルミネセンス試薬組成物を用いてＰＶＤＦ膜上のＨＲＰ標識化抗体によるβ−ガラクトシダーゼのウェスタンブロット検定からのＸ線フィルムの映像である。それぞれタンパク質の５０００，１０００，１８０，３０，及び５ｐｇを含有するβ−ガラクトシダーゼのの希釈液を、０．６６ｍＭのアクリダンホスフェート５を含有する０．０５５ＭのｐＨ８．６トリス緩衝液、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン２０を含有する試薬を用い、１４分のインキュベーション後膜をＸ線フィルムに３０秒曝露することによって検出した。
【図１３】 ニトロセルローズの膜を用いた同様なウェスタンブロット実験からのＸ線フィルムの映像である。該映像を、１０分のインキュベーション時間後５分間Ｘ線フィルムに膜を曝露することによって得た。
Claims (7)
- 化学式ＩＩＩ、
（式中、Ｘは１〜２０個の炭素原子を有する、シアノ基置換アルキル基、トリメチルシリル基置換アルキル基、カルボニル基置換アルキル基又は無置換のアルキル基、アリール基、アラルキル基、１〜２０個の炭素原子を有する、アルキル若しくはアリールカルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３ −基及びアルキルカルボニル基から選択される基であり、Ｘが化学式―ＰＯ（ＯＲ’）（ＯＲ’’）で表されるホスホリル基であることはなく、ＱはＮＲ ６ 及びＳ原子から選択される基であり、Ｒ２〜Ｒ５ はＣ，Ｈ，Ｎ，Ｏ及びハロゲン原子から選択される１〜５０個の原子を有し、かつ隣接した基の対が相互に結合して１または２個の５又は６員環を有する炭素環式の環系を形成し、またＲ６はＣ １ 〜Ｃ ４ アルキル、ベンジル、１〜２０個の非水素原子を有するアルコキシアルキルおよび１〜２０個の非水素原子を有するカルボキシアルキルから選択され、Ｚ１及びＺ２は相互に無関係にＯ及びＳ原子から選択される原子であり、Ｒ１はアルキル、フルオロアルキル、アリール、ハロゲン化アリール、メチル置換アリール、ジメチル置換アリール、ブチル置換アリール、メトキシ置換アリール、アセチル置換アリール、シアノ置換アリール、ニトロ置換アリール、メトキシカルボニル置換アリール、アラルキル基から選択される１〜５０個の非水素原子を有する基であり、Ｒ１が化学式―ＰＯ（ＯＲ’）（ＯＲ’’）で表されるホスホリル基であることはない）で表される化合物。 - 化学式ＩＩＩの化合物においてＺ２が酸素原子、ＱがＮＲ６基であって、化学式、
で表され、ここでＲ７〜Ｒ１４は各々、相互に無関係に水素原子、ハロゲン原子、メトキシ基、エトキシ基およびｔ−ブトキシ基から選択される請求項１記載の化合物。 - Ｒ７〜Ｒ１４のうち少なくとも１個がハロゲン原子、メトキシ基、エトキシ基またはｔ−ブトキシ基であり、Ｒ７〜Ｒ１４の残余が水素原子である請求項２記載の化合物。
- Ｒ６がＣ１〜Ｃ４のアルキル基、ベンジル基、１〜２０個の非水素原子を有するアルコキシアルキル基及び１〜２０個の非水素原子を有するカルボキシアルキル基から選択される請求項３記載の化合物。
- 化学式、
で表され、Ｒ１５が１〜２０個の炭素原子を有するアルキル基又はアリール基である請求項２記載の化合物。 - Ｒ７〜Ｒ１４がいずれも水素原子であり、Ｒ１５がメチル基である請求項５記載の化合物。
- 化学式ＩＩＩの化合物において、ＱがＳ原子であり、かつ、化学式
で表される請求項１記載の化合物。
Applications Claiming Priority (3)
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