JP4790905B2 - 化学ルミネセンス化合物及び方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
発明の分野
本発明は、化学ルミネセンスを生成するためにペルオキシダーゼと過酸化物とに反応する化学ルミネセント組成物に関する。特に、本発明は、ペルオキシダーゼと、励起状態のカルボニル化合物を生じるための過酸化物とを反応させる新規の電子富化アルケンを含む組成物に関する。本発明はさらに、ペルオキシダーゼを検出するための測定方法及び免疫アッセイ、核酸プローブアッセイなどにおいてペルオキシダーゼ−標識化特異的結合パートナーを検出するための測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】
発明の背景
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のようなペルオキシダーゼ酵素は、生物学的な分子及び他の興味ある分析物、例えば医薬、ホルモン、ステロイド及び癌のマーカーのための酵素結合アッセイにおけるマーカー又はラベルとして頻繁に使用される。これら酵素の化学ルミネセント検出は、試料中の酵素の量又は酵素−標識化分析物又は分析物用の標識化特異的結合パートナーの量の定量的な測定を提供するための安全で、利便的且つ高感度の手段を提供する。他の化学ルミネセント反応スキームが、特有のペルオキシダーゼ酵素のレベルを定量するために開発されている。
【０００３】
ａ．化学ルミネセントペルオキシダーゼ基質
周知のルミノールとイソルミノールのようなアミノ置換環式アシルヒドラジドは、光の放射によって塩基性条件下でＨ₂Ｏ₂とペルオキシダーゼ触媒（ホースラディッシュペルオキシダーゼ，ＨＲＰのような）と反応する。この反応は、Ｈ₂Ｏ₂とペルオキシダーゼの検出のための分析方法のための基本として用いられている。（８−アミノ−５−クロロ−７−フェニルピリド［３，４−ｄ−ピリダジン−１，４（２Ｈ，３Ｈ）ジオン（Ｍ．Ｉｉら，Biochem. Biophys. Res. Comm., 193(2), 540-5(1993))；ピリダジノキノキサリノン（米国特許第5,324,835号）及び１，３−二置換ピラゾロ[4',3':5',6']ピリド-[2,3-d]−ピラジンジオン（Y. Tominagaら，Tetrahedron Lett.,36, 8641-4(1995))のようなルミノールの複素環類似物が、化学ルミネセンスを生成するためにペルオキシダーゼと過酸化物と反応することが知られる。ペルオキシダーゼと過酸化物によって酸化される場合に化学ルミネセントがある他のヒドラジド化合物は、ヒドロキシ置換フタルヒドラジド（米国特許第5,552,298号）がある。
【０００４】
本出願人の米国特許第5,491,072号、5,523,212号及び5,593,845号は、ペルオキシダーゼの検出及びアッセイにおいて使用するための過酸化物とペルオキシダーゼとの反応によって光を生じる化学ルミネセントＮ−アルキルアクリダン−カルボン酸エステル、チオエステル及びスルホンイミドを開示する。ＰＣＴ出願（WO 94/02486）は、過酸化水素とスピロアクリダン化合物の化学ルミネセント反応を記載する。該反応は、ホースラディッシュペルオキシダーゼの添加によって増大される。
【０００５】
生物学的起源の、ルシフェリンと総括して称される各種の化合物は、ペルオキシダーゼによって酸化される（L.J. KrickaとG.H.G. Thorpe，Luminescence Immunoassay and Molecular Applications, K. Van Dyke and R. Van Dyke, eds., CRC Press, Boca Raton, 1990, pp. 77-98に要約される）。幾つかの場合において、過酸化水素は、酵素がオキシダーゼとして機能化するケースでは利用できない。
【０００６】
ある種のフェノール化合物は、ペルオキシダーゼによる酸化で化学ルミネセンスを生じる。実例として、ピロガロールＢ−１とプルプロガリンＢ−２は、クマリン型化合物のクマリン、ウンベリフェロン及びエスクリン（D. Slawinska, J. Slowinski, J. Biolumin. Chemilumin., 4, 226-30 (1989))；Phloroglucinol Ｂ−３(M. Halmannら，Photochem. Photobiol., 30, 165-7(1979))；及びアセトアミノフェンＢ−４（K. Schmitt, G. Cilento, Photochem. Photobiol., 51, 719-23 (1990)）と同じく、KrickaとThorpe、同号中に引用される。
【化３２】

【化３３】

【化３４】

【化３５】

【０００７】
酸素又は過酸化物とペルオキシダーゼの存在中で弱い化学ルミネセンスを生じることが報告された他の種々の化合物は、以下の構造Ｂ−５−Ｂ−８を有する、合成シッフベース含有ポリマー（(R. Zoulikら，Coll. Czech. Chem. Commun., 60, 95-103 (1995)）；過酸化水素を含む又は無しのキサンテン染料の存在中でのインドール−３−酢酸（S. Krylov, A. Chebotareva, FEBS, 324(1), 6-8 (1993)；チロシン、トリプトファンとクロルプロマジン（M. Nakano, J. Biolumin. Chemilumin. 4, 231-40 (1989)）及びMCLA B-8 M.(Mitaniら，J. Biolumin. Chemilumin. 9, 355-61 (1994)）である。
【化３６】

【化３７】

【化３８】

【化３９】

【０００８】
ペルオキシダーゼによって現在開示される化合物の化学ルミネセント酸化を開示する先行の参考文献は無い。
【０００９】
ｂ．エノールとＨＲＰの反応。一連の文献が、エノール化可能なアルデヒドのペルオキシダーゼ触媒化空気酸化を記載する（H. Gallardoら，Biochim. Biophys. Acta, 789, 57-62 (1984)；W.J. Baaderら，Biochem. Ed., 14(4), 190-2 (1986)；I. Nantesら，Photochem. Photobiol., 63(6), 702-8(1996)）。その反応基質は、アルデヒドとの平衡において少量のエノール型となるものと思われる。そのアルデヒドの反応は、リン酸エノールによって触媒されるが、そのリン酸エノールそれ自身は消費される。その文献は、リン酸エノールが化学ルミネセンスを生じるためにペルオキシダーゼと反応しないことを教示する。蛍光エネルギーアクセプターに対するエネルギー転移は、光放射を増加した（M.T. Grijalbaら，Photochem. Photobiol., 63(6), 697-701 (1996)）。エノールシリルエーテル（Baader，同号）又は酢酸エノールとしてマスクしたアルデヒドは、化学ルミネセンスを生成するためにペルオキシダーゼと実質上その場で反応したエノールを生成するための第１工程でエノールがマスクされない結合アッセイにおいて使用された（A. Campaら，Photochem. Photobiol., 63(6), 742-5(1996)。
【００１０】
ｃ．ペルオキシダーゼエンハンサー。多くのエンハンサーが、上述したルミノールとアクリダンカルボン酸誘導体を含む周知の化学ルミネセント基質とペルオキシダーゼとの反応から化学ルミネセンスの量と持続時間を増加するために利用されている。これらは、Ｄ−ルシフェリンのようなベンゾチアゾール誘導体、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−フェニルフェノールのような各種のフェノール化合物、G. Thorpe, L. Kricka, Bioluminescence and Chemiluminescence, New Perspectives, J. Scholmerichら，Eds., pp.199-208 (1987)中に挙げられたようなナフトールと芳香族アミンを含む。ペルオキシダーゼによってアミノ置換環式アシルヒドラジドの化学ルミネセント酸化のエンハンサーとして機能する他の化合物は４−（４−ヒドロキシフェニル）−チアゾール（M. Ii，同号）、米国特許第5,171,668号中に開示された化合物の群、２−ヒドロキシ−９−フルオレノン、及び米国特許第5,206,149号中に開示されたようなヒドロキシ−置換ベンゾオキサゾール誘導体及び米国特許第5,629,168号中に記載されたようなある種のフェニルホウ酸化合物を含む。ペルオキシダーゼ単独によって又はエンハンサーの使用を伴う本化合物の化学ルミネセント酸化を開示する先行の参考文献はない。
【００１１】
ｄ．界面活性剤による化学ルミネセントペルオキシダーゼの増加。ポリマーとモノマーの界面活性剤を用いてペルオキシダーゼ触媒化反応において生成した化学ルミネセンスの増加は、従来技術で周知である。増加は、例えば出射光の蛍光光量収率を増加することによって、励起状態にある生成した生成分子のパーセンテージを増加することによって、競合する副反応の抑制を通して化学ルミネセント反応を受けている分子の分画を増加することによって又は酵素触媒の活性を促進することによって、１以上の工程の所産に影響を及ぼすことによって生起できる。化学ルミネセント反応におけるポリマーとモノマーの界面活性剤の作用に関して存在する明確な又は一致するパターンはない。界面活性剤がもしあったとしても、特有のプロセスから化学ルミネセンスを増加し得る且つ実質上実験法によってのみ測定することかできる剤を予想することは不可能である。
【００１２】
カチオン性ポリマーの界面活性剤臭化ポリ−Ｎ−エチル−４−ビニル−ピリジニウムは、陰性に荷電したインスリン−ペルオキシダーゼ接合体とルミノールとの化学ルミネセント反応を完全に抑制し及び自然の酵素を用いた場合により劣る範囲まで化学ルミネセンスを減じる（S.B. Vlasenkoら，J. Biolumin. Chemilumin., 4, 164-176 (1989)）。
【００１３】
日本特許出願公開JP 06,242,111及び文献（R. Iwataら，Anal. Biochem., 231, 170-4 (1995)）は、より低いバックグラウンド放射又は増加した信号／ノイズとなるようにルミノールの化学ルミネセント過酸化において非イオン性界面活性剤とスキムミルクの使用を開示する。
【００１４】
界面活性剤によるペルオキシダーゼ又は化学ルミネセンス増加によって本化合物の化学ルミネセント酸化を開示する先行の参考文献はない。
【００１５】
ｄ．ＨＲＰを用いたアッセイ。酵素ホースラディッシュペルオキシダーゼは、基質としてルミノール又はイソルミノールを用いた化学ルミネセント検出による酵素免疫アッセイとＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイにおいて広範囲に及ぶ使用が見出されている。ＨＲＰ接合体及び増加したルミノール化学ルミネセント検出を用いた商業上利用可能なキットが利用できる。化学ルミネセントペルオキシダーゼアッセイはまた、上述した米国特許第5,491,072号、5,523,212号及び5,593,845号中にも開示される。基質として本化合物を用いた化学ルミネセントペルオキシダーゼを開示する参考文献はない。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
発明の開示
化学ルミネセンスを提供するためにペルオキシダーゼと過酸化物と反応する化合物を含む組成物を提供することが本発明の目的である。
【００１７】
ペルオキシダーゼの検出用の化学ルミネセンスを提供するためにペルオキシダーゼと過酸化物と反応する化合物を含む組成物を提供することが本発明の別な目的である。
【００１８】
また、それぞれが別な基Ｘ又はＲ¹に接合した酸素又はイオウから選択される２つの原子で二重結合の一端が置換され、且つ励起状態生成物Ａ¹Ａ²Ｃ＝Ｏ^★がペルオキシダーゼと過酸化物とＩの反応で生じるように選択した１つの基Ａ¹とＡ²によって二重結合の他端で置換された、炭素−炭素二重結合を含む式Ｉの化合物を含む組成物を提供することが本発明の目的である。
【化４０】

【００１９】
それがヘテロサイクリック又はカルボサイクリック環型に結合されるようにＡ¹とＡ²の炭素原子が合同した式Ｉの化合物を含む組成物を提供することが本発明の更なる目的である。特にその環は、窒素、イオウ又は酸素含有複素環基とすることができる。
【００２０】
Ｚ²がＯである場合、酸素原子に結合した基は、アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、リン酸モノ−、ジ−又はトリエステル基、カルボキシエステル基、硫酸基、糖基又はシリルエステル基の一部であり、Ｚ²がＳである場合、そのイオウ原子に結合した基は当量のチオ基の一部である、式Ｉの化合物を含む組成物を提供することが本発明の更なる目的である。
【００２１】
本組成物を用いてペルオキシダーゼと過酸化物との反応において化学ルミネセンスを生成するための方法を提供することが本発明の更なる目的である。
【００２２】
さらにまた、本発明の化合物とペルオキシダーゼとの反応で生じた化学ルミネセンスを増加するための方法と組成物を提供することが本発明の目的である。
【００２３】
免疫アッセイ、核酸プローブアッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、サザンブロットアッセイ及び分析物の検出用の酵素標識を用いる一般に周知の方法による他のアッセイで、ペルオキシダーゼと接合体の検出において使用するための化学ルミネセント化合物と方法を提供することが本発明の更に別の目的である。該アッセイは、ペルオキシダーゼ又は接合体を検出することによるそのようなアッセイ及び分析物の存在又は量とそれによって生じた化学ルミネセンスを関係付けることにおいて分析物を検出するために有用である。
【００２４】
【発明の実施の形態】
好ましい実施態様の説明
定義：
アルキル− １−２０炭素を含む分枝、直鎖又は環式炭化水素基。ここで用いたような低級アルキルは、８炭素までを含むアルキル基に関する。
【００２５】
アルケニル− 少なくとも１のＣ−Ｃ二重結合と２−２０炭素を含む分枝、直鎖又は環式炭化水素基。ここで用いたような低級アルケニルは、８炭素までを含むアルケニル基に関する。
【００２６】
アルキニル− 少なくとも１のＣ−Ｃ三重結合と２−２０炭素を含む分枝、直鎖又は環式炭化水素基。ここで用いたような低級アルキニルは、８炭素までを含むアルキニル基に関する。
【００２７】
分析物− 測定によって試料中でその存在又は量を測定すべきものである物質。分析物は、特異的結合親和性を有する特異的結合パートナーが存在するような有機及び生物学的分子を含む。分析物の例は、制限なしに、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ複合体、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体フラグメント、抗体ＤＮＡキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、レクチン、アビジン、ストレプタビジンとビオチンを含む。他の分析物の例は、加水分解酵素、加水分解酵素のインヒビター及びジヒドロキシ芳香族化合物をも含む。
【００２８】
アリール− Ｈ以外の一以上の置換体で置換することができる１から５までのカルボサイクリック芳香環を含む芳香環。
【００２９】
生物医学的分析− 興味ある分析物についての生物学的起源の使用の分析。その分析は、免疫アッセイ、ウェスタンブロット、ノーザンブロット、サザンブロッド、ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ、ＤＮＡ配列分析、コロニーハイブリダイゼーション、遺伝子発現分析、高スループット医薬スクリーニング、感染作用物質又は病原体の検出などとすることができる。
【００３０】
グリコシル− ヘキソースとペントースを含む及び１以上の糖単位を含む炭水化物群の残基。実例は、フルクトース、ガラクトース、グルコース、グルクロン酸、マンノース、リボース、Ｎ−アセチルグルコサミンなどを含む。
【００３１】
ハロゲン− フッ素、塩素、臭素又はヨウ素原子。
【００３２】
ヘテロアリール− その環の炭素原子の少なくとも１が窒素、酸素又はイオウ原子で置換され且つＨ以外の１以上の置換体で置換することができる１から５までのカルボサイクリック芳香環を含む芳香環含有基。
【００３３】
ルミネセント− 電子励起状態に励起した時に光を照射することができる。その光は、一重項励起状態から減衰する場合に蛍光として、又は多重項励起状態から減衰する場合にリン光としてのいずれかで放射することができる。
【００３４】
過酸化物− Ｏ−Ｏ結合を含む化合物、好ましくは過酸化水素又は尿素過酸化物のような過酸化水素の複合体、ペルオキソホウ酸塩又はペルオキソ炭酸塩。アルキル
【００３５】
試料− 分析すべき１以上の分析物を含む又は含むことが疑われる流体。化学ルミネセント反応法によって分析される典型的な試料は、血液、血漿、血清、尿、精液、唾液、細胞溶解液、組織抽出液などのような、体液を含む生物学的試料である。試料の他のタイプは、食品試料と、土壌又は水のような環境試料を含む。
【００３６】
特異的結合パートナー− 相互結合親和性を示す２つの物質。実例は、抗原−抗体、ハプテン−抗体又は抗体−抗体対、相補的なオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、アビジン−ビオチン、ストレプタビジン−ビオチン、ホルモン−レセプター、レクチン−炭水化物、ＩｇＧ−プロテインＡ、核酸−核酸結合タンパク質及び核酸−抗核酸抗体を含む。
【００３７】
置換した− 非水素基による基上の少なくとも１の水素原子の置換に関する。置換の多重点が他に明確に示されない限り存在することができることが意図されるその置換基に関して注意すべきである。
【００３８】
以下の式Ｉの化合物が化学ルミネセンスを生成するために過酸化物及びペルオキシダーゼと反応することが予期せずに発見されている。ペルオキシダーゼの存在中で化学ルミネセンスを生成する本発明の化合物は、酸素とイオウ原子から選択される２の原子で二重結合の一端で置換した炭素−炭素２重結合を含み、且つ式Ｉ：
【化４１】

［式中Ｚ¹とＺ²は、ＯとＳ原子から独立して選択され、Ｒ¹は１から約５０までの非水素原子を含む有機基であり、Ｘは１から約５０までの非水素原子を含む基であり、且つＡ¹とＡ²は、以下の反応に従ってペルオキシダーゼとＩの反応で電子励起状態生成物Ａ¹Ａ²Ｃ＝Ｏ^★が生じるように選択される基である］
を有する。
【化４２】

【００３９】
基Ａ¹，Ａ²，Ｚ¹，Ｚ²，Ｘ及びＲ¹は、得られる化合物Ｉが電子富化Ｃ−Ｃ二重結合を有するであろうように選択される。一般に、ＯとＳ原子から選択されるＺ¹とＺ²を有する一般式Ｉの大部分の化合物は、十分に電子富化のＣ−Ｃ二重結合を有する。Ａ¹及び／又はＡ²が強い電子吸引基である化合物は、機能的でなく且つ好適でない。
【００４０】
基Ｒ¹は、光の生成を与えるＣ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ，Ｓｉ及びハロゲンから選択される１から約５０までの非水素原子を含む何れかの有機基とすることができる。後者によって、式Ｉの化合物がペルオキシダーゼ及び過酸化物と反応する際に、光が生じ、１以上の化学ルミネセント中間体の生成を含むことができる。Ｒ¹基として機能することができる基は、制限することなしに、アルキル、置換アルキルアリール、置換アリール、アラルキル及び置換アラルキル基を含む。イオン性基又は極性基のような、Ｈ原子以外の置換基は、各種の数で且つその化合物の特性を変更するため又は合成の利便性を提供するために、Ｒ¹の炭素鎖又は環上の選択した位置に取り込むことができる。そのような特性は、例えば、化学ルミネセンス光量収率、酵素との反応速度、光放射の最大強度、光放射の持続性、光放射の波長、反応媒体中の溶解性を含む。特異的結合パートナーのような別の分子に共有結合することを許す１以上の基もまた、Ｒ¹上の置換基として含めることができる。特異的な置換基及びその作用の例示は、以下の特有の実施例中で説明されるが、しかしながら、本発明の範囲を制限するものではない。
【００４１】
基Ｘは、１−２０炭素原子を有する置換した又は未置換のアルキル、置換した又は未置換のアリール、置換した又は未置換のアラルキル基、１−２０炭素原子を有する置換した又は未置換のアルキル又はアリールカルボニル基、トリ（Ｃ₁−Ｃ₈アルキル）シリル基、ＳＯ₃ ^-基、グリコシル基及び式ＰＯ（ＯＲ′）（ＯＲ”）のホスホリル基（式中Ｒ′とＲ”は、１−２０炭素原子の置換した又は未置換のアルキル、置換した又は未置換のアリール及び置換した又は未置換のアラルキル基、トリアルキルシリル基、アルカリ金属カチオン、アルカリ土類カチオン、アンモニウムとホスホニウムカチオンから独立して選択される）から選択される。置換したアルキル基は、イオン性基又は極性基のような少なくとも１の水素原子以外の基を含むであろうし、その化合物の特性を変更するため又は合成の利便性を提供するために、Ｒ′又はＲ”の炭素鎖又は環上の選択した位置に取り込むことができる。置換したアルキル基の実例は、シアノエチル基又はトリメチルシリルエチル基を含む。
【００４２】
基Ａ¹とＡ²は、制限されることなしに、少なくとも１つが水素でないという条件で、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル及び置換アラルキル基、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルキルチオ及びアリールチオ基を含む、化合物Ｉとペルオキシダーゼ及び過酸化物の反応において電子励起状態生成物Ａ¹Ａ²Ｃ＝Ｏ^★を形成する水素または有機基から独立して選択される。基Ａ¹とＡ²は、Ａ¹とＡ²を分離する炭素原子を含むヘテロサイクリック又はカルボサイクリック環を形成するように一緒に接合することができる。一般に基Ａ¹とＡ²は、Ｃ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ及びハロゲンから選択される１−５０の非水素原子、より通常は１−２０非水素原子を含むであろう。
【００４３】
式Ｉの好適な化合物の第１の群において、Ａ¹とＡ²の一方は、置換した又は未置換のアリール基であり、且つ他方は、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル及び置換アラルキル基、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルキルチオ及びアリールチオ基から選択される。好ましくは少なくとも１のアリール基が、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ及びＯＹ′（ここでＹ′は水素原子又はアルカリ金属イオンである）から選択される少なくとも１の基で置換される。アリール基は、１−４の融合したカルボサイクリック又はヘテロサイクリック５又は６員環を含む。その環の１以上がヘテロサイクリック環である場合、その環中のヘテロ原子はＮ，Ｏ及びＳ原子から選択される。好ましくはアリール基は、何れかが非水素置換基で置換することができる、フェニル、ナフチル、アントリル及びピレニル基である。より好ましくは、フェニルとナフチル基である。
【００４４】
化学ルミネセンスを生成するために本発明の方法に従い反応される式Ｉの化合物の特有の実施態様は、実例として構造：
【化４３】

【化４４】

【化４５】

【化４６】

【化４７】

［式中、Ｙは、水素、アルカリ金属イオン又は置換した又は未置換のアルキル、置換した又は未置換のアリール、置換した又は未置換のアラルキル又はトリアルキルシリル基であり、Ｙ′はアルカリ金属イオン、アルキルカルボキシエステル、アリールカルボキシエステル、置換した又は未置換のアルキル、置換した又は未置換のアリール、置換した又は未置換のアラルキル基又はトリアルキルシリル基であり且つＹ”は水素又はハロゲン、特に塩素原子］を有する化合物を含む。二重結合異性体の一方のみがこれらの構造で表されるとしても、異性体又はその２つの混合物の何れかが本発明に使用できることが示される。上述した制限に従属する他の構造は、本発明の方法に有用であるとして当業者に想到されるであろう。
【００４５】
好適な化合物の第２の群は、式ＩＩを有し、ここでＡ¹とＡ²はＨｅｔと表したヘテロサイクリック環を形成するため一緒に接合される。該ヘテロサイクリック環系は、Ｎ，Ｏ及びＳ原子から選択される少なくとも１のヘテロ原子を含む少なくとも１の５又は６員環を含む。基Ｚ¹，Ｚ²，ＸとＲ¹は、上記定義した通りである。
【化４８】

【００４６】
該ヘテロサイクリック環系は、エキソサイクリック二重結合を生じるよう環炭素と結合される、Ｎ，Ｏ及びＳ原子から選択される少なくとも１のヘテロ原子を含む。好適なヘテロサイクリック化合物は、式ＩＩＩとＩＶの化合物、同じくその二重結合異性体又は該異性体の混合物を含み、式中Ｑは、ＮＲ⁶，ＯとＳから選択され、ＺとＲ¹は上記定義した通りであり、且つＲ²−Ｒ⁶は以下に定義される。
【化４９】

【化５０】

【００４７】
式ＩＩについて、基Ｈｅｔを含むことができる典型的な環構造は、以下の構造を含み、星印はエキソサイクリック二重結合の位置を表す。全ての可能性のある置換パターンを明白に示すことなしに、そのような典型的な環構造において、それぞれの環の位置が水素以外の置換基を含むことができることが理解されるであろう。ここに記載した方法の実践において有用な他のヘテロサイクリック環化合物は、以下の特に挙げてはいないが、しかしなお式ＩＩの範囲内に収まることが熟練した技術者に明らかになるであろう。
【化５１】

【化５２】

【化５３】

【化５４】

【化５５】

【化５６】

【化５７】

【化５８】

【化５９】

【化６０】

【化６１】

【化６２】

【化６３】

【化６４】

【化６５】

【化６６】

【化６７】

【化６８】

【化６９】

【化７０】

【化７１】

【化７２】

【００４８】
式ＩＩＩとＩＶの上記化合物の全てにおいて、それぞれの基Ｒ²−Ｒ⁵は、Ｈ又は生じるべき光を与える置換基から選択され且つ普通はＣ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ及びハロゲン原子から選択される１から５０原子までを含む。存在させることができる代表的な置換基は、制限されることなしに、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲン、アミノ、置換アミノ、カルボキシル、カルボアルコキシ、カルボキシアミド、シアノ、及びスルホン酸基を含む。隣接基の何れか一方又は両方の対、即ちＲ²−Ｒ³又はＲ⁴−Ｒ⁵は、エキソサイクリック二重結合を生じるその環に融合される少なくとも１の５又は６員環を含むカルボサイクリック又はヘテロサイクリック環系を形成するために一緒に接合することができる。そのような融合ヘテロサイクリック環はＮ，Ｏ又はＳ原子を含むことができ、且つ上述したそれらのようなＨ以外の環置換基を含むことができる。
【００４９】
上記化合物の全てにおいて、基Ｒ⁶は、その基におけるその原子の原子価を満たすために要求されるＨ原子の必要な数に加えて、Ｃ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ及びハロゲン原子から選択される１から５０原子までの非水素原子を含む有機基である。より好ましいＲ⁶は、１から２０までの非水素原子を含む。該有機基は、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールとアラルキル基からなる群から好ましくは選択される。Ｒ⁶としてより好ましい基は、置換した又は未置換のＣ₁−Ｃ₄アルキル基、置換した又は非サブ-置換ベンジル基、アルコキシアルキルとカルボキシアルキル基を含む。
【００５０】
置換基は、化合物の特性を変更するために又は最終のリン酸化合物の合成の利便性のために各種の量で且つヘテロサイクリック環において選択した環又は鎖位置で取り込むことができる。そのような特性は、例えば、化学ルミネセンス光量収率、酵素との反応速度、最大光強度、光放射の持続性、光放射の波長及び反応媒体中の溶解性を含む。特異的な置換基及びその作用は、以下の特有の実施例中で説明されるが、しかしながら、何れにおいても本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【００５１】
化合物の好適なクラスは、以下の式Ｖを有し、式中、Ｒ¹は、少なくとも１のカルボサイクリック又はヘテロサイクリック芳香環を含むアリール環基及び更に置換した又は置換した又は未置換のアルキル基とすることができる、であり、Ｚ¹はＯとＳ原子から選択され且つＸとＲ⁶は上記定義した通りである。
【化７３】

【００５２】
同じか又は異なるものとすることができる、基Ｒ⁷からＲ¹⁴のそれぞれは、生じるべき光を与えるＣ，Ｈ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐとハロゲン原子から選択される１から５０までの原子を含むことができ且つ、制限されることなしに、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲン、アミノ、置換アミノ基、カルボキシル、カルボアルコキシ、カルボキシアミド、シアノ、及びスルホン酸基を含む。Ｒ⁷からＲ¹⁴は、水素、ハロゲン及びメトキシ、エトキシ、ｔ−ブチルなどのようなアルコキシ基から選択されることが好ましい。化合物の好適な群は、塩素としてＲ⁸，Ｒ⁹，Ｒ¹²又はＲ¹³の一つを有し、Ｒ⁷からＲ¹⁴の他が水素原子である。より好適には、式ＶＩを有する化合物であり、ここでＺとＲ¹は上記定義した通りであり、Ｘはホスホリル基−ＰＯ（ＯＲ′）（ＯＲ”）（ここで１−２０炭素原子の置換した又は未置換のアルキル、置換した又は未置換のアリール及び置換した又は未置換のアラルキル基、トリアルキルシリル基、アルカリ金属カチオン、アルカリ土類カチオン、アンモニウムとホスホニウムカチオンから独立して選択される）である。
【化７４】

【００５３】
好ましくは、Ｒ′とＲ”の少なくとも１つは、アルカリ金属カチオンであり、より好ましくは両方である。アルカリ金属の中では、リチウム、ナトリウム及びカリウムが好ましい。
【００５４】
式Ｉの化合物は、各種の方法によって作製することができる。好ましい方法において、Ｚ²基はＯであり、Ｚ¹はＯ又はＳであり、化合物Ｉは、エステル又はチオエステルのエノラート(enolate)と、式Ｘ−ＬＧ（ここでＬＧは以下のスキームに従う脱離基を表す）との反応によって作製することができる。
【化７５】

【００５５】
典型的な脱離基は、ハロゲン、例えば塩素、臭素及びヨウ素のような、スルホン酸、例えばメタンスルホン酸とｐ−トルエンスルホン酸のような、カルボン酸、例えば酢酸及び安息香酸のような特にＸがアシル基である場合にＸ−ＬＧは酸無水物となるであろう、メトスルファートのようなスルファート、及び他の基、例えばイミダゾール、トリアゾールとテトラゾール、マレイミド、スクシンイミドキシ基を含む。
【００５６】
両方のＺ基がＳ原子である場合の式Ｉの化合物を作製するための方法は、以下の２つのスキームに従う適当なカルボニル化合物へのリチオシラン化合物又はリンイリドの求核性の添加を含む（F.A. Carey, A.S. Court, J. Org. Chem., 37, 1926-29,(1972)）。
【化７６】

【００５７】
別の方法において、エステルは、E.J. CoreyとA.P. Kozikowski, Tetrahedron Lett., 925-8 (1975)中に記載されたようなビス（ジアルキルアルミニウム）−ジチオール試薬との反応によって、以下に示すように、ケテンジチオアセタールに変換される。
【化７７】

【００５８】
更に別の方法において、活性メチレン基のアニオンは、ＣＳ₂と反応し、該ジチオカルボキシラートは、ジチオエステルを形成するようにＲ₁基を含む試薬Ｒ₁−ＬＧと反応させる。後者の方法論の実例は、I. ShahakとY. Sasson, Tetrahedron Lett., 4207-10 (1973)中に開示される。該ジチオエステルは、エノラートに変換され、且つ式Ｘ−ＬＧの試薬と反応させる。
【００５９】
本発明の別の態様は、ペルオキシダーゼとの反応によって化学ルミネセンスを生成するための方法において、式Ｉ−ＶＩの何れかの化合物の使用である。緩衝水溶液中での式Ｉ−ＶＩの化合物とペルオキシダーゼ及び過酸化物の反応は容易に検出される化学ルミネセンスを生じる。光強度は、その反応がアルカリ性ｐＨで誘導される場合、室温で瞬時のうちに最大レベルに達する。該反応は任意にエンハンサーの存在中で誘導される。
【化７８】

【００６０】
我々はこの時点でこの発見のための特別の機構的な説明を公表することを望むものでない一方、その光がＶＩＩの電子的に励起した状態から放射されるものと確信する。光の生成のために必要な条件は、その反応がＶＩＩの励起状態を形成するために十分なエネルギーを生成することである。もしＶＩＩ^★がルミネセントであるならば、化学ルミネセンスはＶＩＩの励起状態からの放射を経ての反応から生じる。もし組成物ＶＩＩ^★が有意のルミネセントでないならば、化学ルミネセンスはルミネセントエネルギー受容体の包含によって生じることができる。
【００６１】
化学ルミネセンスの好適な方法において、化合物Ｉは、酵素と化合物Ｉの反応が開始される連続した化学ルミネセンス信号を生じるため約８と１０の間のｐＨを持ったアルカリ性緩衝液中、ペルオキシダーゼ、過酸化物及びエンハンサーと反応させる。分析的な感度は、以下のより詳細に記載されるであろうように、非イオン性界面活性剤の混入によって増加することができる。
【化７９】

【００６２】
化合物Ｖとペルオキシダーゼの反応から光を生成するための好適な方法において、その反応は７と１０．５の間、好ましくは８．５から１０の間のｐＨの緩衝水溶液中で、５℃と５０℃の間の、好ましくは２０℃と４０℃の間の温度で実行される。化合物Ｖは、１μＭと２０ｍＭの間、好ましくは１０μＭと１ｍＭの間の濃度で用いられる。酵素は、遊離ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ接合体とすることができる。光は、ＶＩＩＩの励起状態から放射される。
【００６３】
本発明の化合物は、典型的に、近紫外から電磁スペクトルの可視領域における波長で最大強度を示す、放射の１００−２００ｎｍ幅帯にわたる光を生じる。典型的には３００−５００ｎｍの範囲内の最大強度λ_maxの波長である。それは、共有結合した蛍光団を産生する式Ｉの化合物が、蛍光団の励起状態からより長い波長の放射に帰結する分子内エネルギー転移を受けることができることが意図される。
【００６４】
１以上の式Ｉの化合物は、ペルオキシダーゼの作用によって光を生成する方法において共同して用いることができる。それは、２以上の式Ｉの化合物とペルオキシダーゼが同時に反応する何れかの場合において有効とすることができる。２以上の化合物が異なるルミネセント又は物理的特性を有している場合、その２つの組合せは、何れか１の化合物の使用を通して容易に達し得ない特性によって光放射反応を生成するために望ましいであろう。化合物Ｉ間で異なることができるルミネセント及び物理的特性の実例は、放射スペクトル、光放射の持続性、酵素ターンオーバー、最大値までの放射の上昇の速度、疎水性／親水性および溶解性を含む。
【００６５】
過酸化物成分は、ペルオキシダーゼと反応することができる何れかの過酸化物又はアルキルヒドロ過酸化物である。好ましい過酸化物は、過酸化水素、尿素過酸化物、及びペルオキソホウ酸塩を含む。
【００６６】
化学ルミネセント反応を経ることができるペルオキシダーゼは、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ例えばバナジウムブロモペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ及びArthromyces ramosusからのペルオキシダーゼ及びホワイトロットカビ中で生産されるＭｎ依存ペルオキシダーゼのような真菌ペルオキシダーゼ、及びダイズペルオキシダーゼを含む。鉄錯体とＭｎ-ＴＰＰＳ₄（Y. -X. Ciら，Mikrochem. J., 52, 257-62 (1995)）を含む、酵素ではないがペルオキシダーゼ様の活性を所有する他のペルオキシダーゼ模擬化合物は、ここで使用されるペルオキシダーゼの意味の範囲内として明らかに意図されるルミノールの化学ルミネセント酸化を触媒することが知られる。ペルオキシダーゼの接合体又は複合体と生物学的分子もまた、その接合体がペルオキシダーゼ活性を示すという唯一の条件で、化学ルミネセンスを生成するための方法において使用することもできる。ペルオキシダーゼの１以上の分子に接合することができる生物学的分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体フラグメント、抗体−ＤＮＡキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン及びビオチンを含む。リポソーム、ミセル、ベシクル及び生物学的分子への付着のために官能化したポリマーのようなペルオキシダーゼを包含する又は取り込む複合体もまた、本発明の方法において使用することができる。
【００６７】
反応混合物へのある種のエンハンサー化合物の混入は、その酵素の反応性を促進する。含まれるこれらの化合物の中には、参考によりここに取り込まれる、G. Thorpe, L. Kricka, Bioluminescence and Chemiluminescence, New Perspectives,J. Scholmerichら，Eds., pp.199-208 (1987)，M. Ii, H. Yoshida, Y. Aramaki, H. Masuya, T. Hada, M. Terada, M. Hatanaka, Y. Ichimori, Biochem. Biophys. Res. Comm., 193(2), 540-5 (1993)の中に、及び米国特許第5,171,668号と5,206,149号中に記載されたような他のペルオキシダーゼ反応を増すことが知られるフェノール化合物と芳香族アミンである。米国特許第5,512,451号中に記載され且つ参考によりここに組み込まれる置換した又は未置換のアリールホウ酸化合物とそのエステル及び無水物誘導体もまた、本発明において有用なエンハンサーの範囲内とすることが意図される。好ましいエンハンサーは、制限されることなしに：ｐ−フェニルフェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、ｐ−イミダゾリルフェノール、アセトアミノフェン、２，４−ジクロロフェノール、２−ナフトールと６−ブロモ−２−ナフトールを含む。上述したクラスのそれらからの１以上のエンハンサーの混合物もまた、利用できる。
【００６８】
本化学ルミネセント反応における添加剤としての非イオン界面活性剤の使用は、有効である。ペルオキシダーゼの使用によって化学ルミネセンスを生成するための反応への非イオン性界面活性剤の混入は、化学ルミネセンスの持続性を延長することによってペルオキシダーゼに関しての分析感度における改善に至る。本発明の実践において有用な非イオン性界面活性剤は、例えばポリオキシエチレン化アルキルフェノール、ポリオキシエチレン化アルコール、ポリオキシエチレン化エーテル及びポリオキシエチレン化ソルビトールエステルを含む。
【００６９】
ＣＴＡＢのような第四級アンモニウム塩化合物を含むカチオン性界面活性剤は、本発明のある種の化合物をペルオキシダーゼ及び過酸化物と反応させる場合に、放射される化学ルミネセンスのレベルの増加における使用のために有効である。例えば、本発明に従う後述する化合物４３又は４６の反応からの光強度は、ＣＴＡＢがその反応混合物中に含まれた場合に１０倍以上増加した。
【００７０】
本発明の反応は、ビーズ、チューブ、ペルオキシダーゼでコートした膜又はミクロウェルプレートのような固体支持層の表面と接触させ得る緩衝水溶液のような溶液中で実行される。適当な緩衝液は、約６から約９の範囲内にｐＨを維持することができる通常使用される緩衝液の何れか、例えばリン酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩、トリス（ヒドロキシメチル−アミノ）メタン、グリシン、トリシン、２−アミノ−２−メチル−１−プロ−パノール、ジエタノールアミンなどを含む。この関係で本発明を実施する好適な方法は、特に意図した使用の要求によって決定される。
【００７１】
本発明によって放射される光は、ルミノメーター、Ｘ線フィルム、高速度写真フィルム、ＣＣＤカメラ、シンチレーションカウンター、化学アクチノメーター又は視覚的のような何れかの適切な周知の手段によって検出することができるそれぞれの検出方法は、異なる分光感度を有する。ヒトの目は、緑色光に光学的に感受性であり、ＣＣＤカメラは赤色光に最大の感受性を示し、ＵＶから青色又は緑色光の何れかに最大応答を持つＸ線フィルムが利用可能である。検出用装置の選択は、コスト、利便性、及び永久的な記録の創製が要求されるかどうかの適用と考慮によって決定されるであろう。
【００７２】
更なる実施態様において、ルミネセントエネルギー受容体が、最大の放射をより長い波長にシフトするため（赤方シフト化）及び／又は放射されるルミネセント量の増大のために利用することができる。赤方シフト化放射のための各種の技術が、化学ルミネセント反応とアッセイの技術分野において周知である。上述したような共有結合した蛍光団は、一つの実例である。フルオレッサー(Fluorescers)は、分離種として反応溶液に代替的に添加することができる。フルオレッサーは、ポリマーに結合することができ又は化合物へのフルオレッサーの密接をもたらすためにミセル又はポリマーと結合される。蛍光エネルギー転移剤は、供与体励起化反応生成物Ａ¹Ａ²Ｃ＝Ｏ^★の固有の蛍光効率が低い場合又はその励起した反応生成物が三重項励起状態である場合に有効に利用することができる。第１のケースにおいて、エネルギー転移は、一重項−一重項タイプであり、後者のケースにおいてそれは三重項−一重項タイプであろう。適切なエネルギー転移剤は、励起エネルギーの転移を与えるために励起反応生成物Ａ¹Ａ²Ｃ＝Ｏ^★のそれと重複するエネルギーレベルでの励起状態、及び供与体のそれに重複する励起状態と同じにできる又はできない平衡励起状態を有する。一重項−一重項エネルギー転移をもたらすために有用なエネルギー転移剤は、当該分野で周知である。三重項−一重項エネルギー転移をもたらすために有用なエネルギー転移剤もまた、当該分野で周知であり、且つ普通は少なくとも１の金属原子又は臭素又はヨウ素原子のような他の重い原子を所有する。典型例は、９，１０−ジブロモアントラセン（ＤＢＡ）、ＤＢＡのスルホン化誘導体及びＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺である。蛍光エネルギー転移剤は、該試薬の存在及び不在中でのペルオキシダーゼ、過酸化物及び式Ｉの化合物の反応で生成される化学ルミネセンスの強度と波長を比較することによって経験的に評価される。
【００７３】
本化学ルミネセント方法の重要な使用は、化学ルミネセント反応によってアッセイ法における分析物の存在又は量を検出するためである。該方法は、分析物の含有が予想される試料を本発明の化学ルミネセント化合物及びペルオキシダーゼと接触させること、定性的な方法において生じた光を検出すること、もし定量分析が望まれるなら、分析物の量に生じた光の量を関係付けること、の工程を含む。光強度と分析物の量との間の相関関係は、既知の量の分析物によって検量線を構築することによって認識することができる。該化学ルミネセント化合物は、約１０^-5Ｍから約１０^-2Ｍ、好ましくは１０^-4Ｍと１０^-3Ｍの間で典型的に用いられる。ペルオキシダーゼは、溶液中で測定される場合、約１０^-9Ｍより低いことが好ましい。化学ルミネセント反応方法によって分析される典型的なサンプルは、血液、血漿、血清、尿、精液、唾液、ＣＳＦなどのような体液である。
【００７４】
本方法によって分析することができる分析物は、ペルオキシダーゼ、そのケースでは付加のペルオキシダーゼを添加することが不要とされるであろう、ペルオキシダーゼのインヒビター、及びペルオキシダーゼで標識することができる又は酵素標識化特異的結合パートナーを経て特異的に検出することができる各種クラスの有機及び生物学的分子を含む。該酵素は、分析物結合化合物上の標識として直接取り込むことができる。代替的に該分析物結合化合物は、分析物結合化合物のための少なくとも１の酵素標識化特異的結合物質に結合することができる。代替的に該分析物結合化合物は、第２の特異的結合物質のための酵素標識化結合パートナーに結合される、少なくとも１の第２の特異的結合物質で標識することができる。
【００７５】
本発明はまた、式Ｉの化合物及びペルオキシダーゼ酵素との化学ルミネセント反応によってアッセイ法において過酸化水素を検出するためのこの方法の使用に関し、ここで生じた光の量は存在する過酸化物の量に関係付けられる。本方法がオキシダーゼ酵素とデヒドロゲナーゼ酵素を検出するために使用することができることは、化学ルミネセントアッセイの分野における当業者には明らかとなるであろう。これらの酵素は、酸素の還元とそれら固有基質の酸化を通して過酸化水素を生成する。それによって生成される過酸化水素は、それが生成されるように共同して、或いは光を生成するため本発明の化合物Ｉとペルオキシダーゼと共に続行する工程においてのいずれかで更に反応させることができる。生じた光の特性は、そのオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼ酵素の量に関係付けられる。さらにそのオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼ酵素は、分析物のためのアッセイにおいて特異的結合パートナーの生物学的分子又はメンバーへの接合体として存在させ得る。
【００７６】
化学ルミネセンスを生成するための式Ｉの化合物とペルオキシダーゼとの反応は、ペルオキシダーゼの存在又は量を検出するための迅速且つ高感度の方法を構成する。本方法の使用は、従って、その試料と式Ｉの化合物との反応によって生じる光の量又は強度を測定することによって試料中のペルオキシダーゼの存在又は量を測定する目的のために行うことができる。そのような測定は、例えば、法医学試験での証拠のような哺乳動物血液のペルオキシダーゼ活性の検出においての使用を見出すことができる。
【００７７】
ペルオキシダーゼ活性の化学ルミネセント測定のための適用の第２の分野は、酵素インヒビターの検出と測定においてである。インヒビターは、本発明の化合物のような第２の基質との競合において基質として作用することによって可逆的に作用することができる。自殺抑制として知られる抑制の別な形態は、その酵素を不活性化することによって不可逆的に作用する。例えば、ペルオキシダーゼインヒビターは、シアニド、スルフィド及び高濃度の過酸化水素を含む。更にそれは、何らかの物質が一定の濃度でのみの阻害であり且つ特別な阻害のみが可能であることを認識させる。
【００７８】
抑制定数Ｋ_i、又は抑制の半減期、ｔ_1/2のような抑制の量又は特徴の測定は、検出可能な生成物を生じる基質の存在とそのインヒビターの量における当該の酵素を含む資料の酵素活性を測定することによって行われる。本発明に従い酵素インヒビターを検出する方法において、式Ｉの化合物は検出可能な生成物として光を生成する。その酵素と化学ルミネセント化合物の反応は、インヒビター物質の存在及び不在において行われ、且つその結果は、インヒビターの存在又は量を測定するために比較される。そのインヒビターの作用は、光強度の減少、光強度上昇の緩速化または光放射開始前の期間の遅延、の３つの作用の何れか１つ以上を有することができる。
【００７９】
酵素アッセイを実行するための技術は周知である。ここに教示したような実施例により提供したガイダンスに関し、試料の調製、試薬の適切な量と比率の決定、反応時間、検量線の構築などの変動を、ルーチンの実験の事項として工夫することは、当業者の能力の範囲内であろう。
【００８０】
その反応がペルオキシダーゼによって触媒されることから、非常に少量が光の検出可能な量の酵素は、光を生成するために十分である。１アトモル（１ｘ１０^-18モル）以下の感度が達成されている。そのような少量のペルオキシダーゼを検出するための能力は、酵素結合アッセイを用いた分析物の多くのタイプの分析のために好適な本化学ルミネセント技術を作る。そのような分析とアッセイは、分析すべき試料中の分析物の低い量のため又は試料の量が制限されるため少量のペルオキシダーゼを検出できる能力が要求される。このタイプのアッセイにおいて、ペルオキシダーゼは特異的結合パートナーの一員に接合される。試料は、酵素結合免疫吸着アッセイ又はＥＬＩＳＡと称されるような、化学ルミネセント酵素結合免疫アッセイである。そのようなアッセイは、マニュアルフォーマット中で、同じく自動化多重試験免疫アッセイ系において普通に使用される。典型的な免疫アッセイにおいてその分析物ハプテン、抗原又は抗体は、分析物の酵素標識した特異的結合パートナー又は分析物の酵素標識類似体の存在又は量を測定することによって測定される。免疫化学工程を実行するための各種のアッセイフォーマットとプロトコルは、当該分野で周知である。これらのアッセイは２つのカテゴリーに広く分けられる。競合アッセイは、特異的抗体と分析物及び分析物類似体、例えば検出可能に標識した分析物分子、の免疫学的結合を特徴付ける。サンドウィッチアッセイは、２の抗体、一方が検出可能に標識される、と分析物の連続的な又は同時結合によって生じる。そのように形成した検出可能に標識した結合パートナーは、本発明の化合物と方法によって測定することができる。検出可能な標識がペルオキシダーゼ酵素である場合、それは直接検出される。検出可能な標識が別な特異的結合パートナーのメンバー、例えばハプテンである場合、ペルオキシダーゼとその結合パートナーの接合体が、最初に反応され、次いでそのペルオキシダーゼが本方法に従い検出される。測定は、ビーズ、チューブ、ミクロウェル、磁性粒子、試験ストリップ、当該分野で普通に使用されるような膜とフィルターを含む、固体表面又は支持体に付着した酵素標識種により実行することができる。検出可能な酵素標識種はまた、溶液中の存在をなしとして又は溶解剤がリポソームを溶解するために利用されるケースにおけるリポソーム及び検出可能な酵素なしのように構成した構築物の中に内包させることもできる。
【００８１】
別の典型的な使用は、ウェスタンブロット法の技術によるタンパク質の検出である。分析物のような興味あるタンパク質を含む資料は、電気泳動分離を受けさせる。分離されたタンパク質は、毛管作用によって又は電場によってニトロセルロース膜又はＰＶＤＦ膜のようなブロッティング膜に転移させる。そのように転移したタンパク質は、特異的な第１の抗体と、該第１の抗体を認識し且つ結合する酵素標識した第２の抗体によって典型的に検出される。標識酵素活性の視覚化は、分析物タンパク質の存在を映し出す。ウェスタンブロット法に本発明の方法を適合させるために、ＨＲＰ接合第２抗体が用いられ、ペルオキシダーゼ活性は化学ルミネセント試薬として本発明の化合物を用いた化学ルミネセンスによって測定される。用いたビオチン化抗体とアビジン−ＨＲＰのようなこの技術における変更は、本発明方法を用いて実行可能なアッセイの範囲内であると考慮される。
【００８２】
上述した抗原−抗体、ハプテン−抗体又は抗体−抗体対、特異的結合対に加えて、競合オリゴヌクレオチド、又はポリヌクレオチド、アビジン−ビオチン、ストレプタビジン−ビオチン、ホルモン−レセプター、レクチン−炭水化物、ＩｇＧ−プロテインＡ、核酸−核酸結合タンパク質及び核酸−抗−核酸抗体もまた含むことができる。
【００８３】
本検出方法の特に有用な適用は、酵素標識核酸プローブの使用による核酸の検出である。酵素標識を用いた核酸の分析及び化学ルミネセント検出のための方法は、例えば、溶液ハイブリダイゼーションアッセイ、サザンブロット法におけるＤＮＡ検出、ノーザンブロット法によるＲＮＡ、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡフィンガープリンティング、コロニーハイブリダイゼーション及びプラークリフトは、全て十分に確立された技術である。その酵素標識（例えばＨＲＰ）は、プローブオリゴヌクレオチド又は捕捉オリゴヌクレオチドへの直接接合体として存在させることができ、又は当該分野で周知の方法を用いて間接結合手段を経て取り込むことができる。間接結合手段の実例は、ハプテン−標識化オリゴヌクレオチドと抗−ハプテン−ＨＲＰ接合体又はビオチン化オリゴヌクレオチドとアビジン−ＨＲＰ接合体を用いることを含む。そのような核酸アッセイは、ビーズ、チューブ、ミクロウェル、磁性粒子又は当該分野で周知とされるような試験ストリップを含む固相表面に付着したオリゴヌクレオチドを用いて、ブロッティング膜上又は溶液中で実行することができる。
【００８４】
別な態様において、本発明は、約７と約１０．５の間のｐＨを持つ緩衝水溶液、０．０１−１０ｍＭの濃度で式Ｉの化合物、及び０．０１−１０ｍＭの濃度で過酸化物を含む、ペルオキシダーゼとの反応によって化学ルミネセンスを生成するための試薬組成物に関する。任意に、該組成物は化学ルミネセンスを増大するための有効量の、好ましくは０．００１と１０ｍｇ／ｍＬの間で、少なくとも１のエンハンサーと、０．０１と１０ｍｇ／ｍＬの濃度で非イオン性界面活性剤とを更に含み得る。
【００８５】
ペルオキシダーゼとの反応によって化学ルミネセンスを生成するための好ましい試薬組成物は、約７．５と約９の間のｐＨを持った緩衝水溶液０．０１−１０ｍＭの濃度での式Ｖ又はＶＩのリン酸アクリダン、０．０１−１０ｍＭの濃度での過酸化物、０．００１と１０ｍｇ／ｍＬの濃度でのエンハンサー及び化学ルミネセンスを増加するための有効量、好ましくは０．００１と１０ｍｇ／ｍＬの間の非イオン性界面活性剤を含む。該調合物は、０．０１−１０ｍＭの濃度でＥＤＴＡのようなキレート剤を更に含むことができる。
【００８６】
本発明の各種の態様をより完全に記載するため、何れの手法において本発明の範囲を制限することなく、以下の実施例が提供される。
【００８７】
【実施例】
１．リン酸アクリダンの合成。以下の化合物は、本出願人のＰＣＴ出願公開ＷＯ９７／２６２４５号に記載の通り作製した。
【化８０】

【表１】

【００８８】
Ｒ⁷−Ｒ¹⁴は、他に指定のない限りはＨである。化合物３，４及び６は、二重結合異性体の混合物として得られた。これら化合物のそれぞれは、化学ルミネセンスを生成するために本発明の反応中で作用する。
【００８９】
２．ビス（シアノエチル）リン酸アクリダン化合物。化合物１−１３のそれぞれは、式：
【化８１】

を有する、相当するビス（シアノエチル）−保護化リン酸トリエステル化合物１ａ−１３ａの脱保護によって作製した。該ビス（シアノエチル）リン酸誘導体もまた、化学ルミネセンスを生じるように過酸化物及びペルオキシダーゼと反応した。
【００９０】
３．付加のリン酸アクリダン塩とビス（シアノエチル）リン酸アクリダン化合物の合成。本出願人のＰＣＴ出願公開ＷＯ９７／２６２４５中に記載の通り作製した更なるリン酸アクリダン塩１４−２３とビス（シアノエチル）エステル１４ａ−２３ａは、式
【化８２】

化合物 Ｖ
１４ −Ｃ（ＣＨ₃）₃
１５ ＣＨ₃
１６ ＯＣＨ₃
１７ Ｆ
１８ Ｃｌ
１９ Ｂｒ
２０ Ｉ
２１ ＣＯＣＨ₃
２２ ＣＮ
２３ ＮＯ₂
を有し、同じく化合物２４（Ｙ＝Ｎａ）と２４ａ（Ｙ＝ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＮ）は式：
【化８３】

を有し、且つ化合物２５−３６（Ｙ＝Ｎａ）と２５ａ−３６ａ（Ｙ＝ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＮ）は式：
【化８４】

［式中Ｕはｐ−Ｉ（２５）、ｐ−ＣＨ₃（２６）、ｍ−ＯＣＨ₃（２７）、ｏ−Ｃｌ（２８）、ｍ−Ｃｌ（２９）、ｏ−Ｂｒ（３０）、ｍ−Ｂｒ（３１）、ｐ−Ｂｒ（３２）とｐ−ＮＯ₂（３３）であり、同じくこの式の化合物は３，４−ジクロロ−（３４）、２，５−ジクロロ−（３５）及び２，６−ジクロロフェニル（３６）基を有する］を有する。
【００９１】
以下の典型的な化合物を作製し、本発明に従い化学ルミネセンスを生じることを見出した。
【００９２】
７．アクリダン誘導体３７の合成。
【化８５】

ＴＨＦ中のフェニル１０−メチルアクリダン−９−カルボキシラート（２５０ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）の溶液を、−７８℃でＬＤＡにより脱プロトン化した。同時に、（ＥｔＯ）₂ＰＯＣｌ（２０５ｍｇ，１．２ｍｍｏｌ）とピリジン（９４ｍｇ，１．２ｍｍｏｌ）をシリンジを通して加え、撹拌を１５分間継続した。ドライアイス浴に移し、撹拌を２時間継続した。揮発分を留去し、その生成物を２工程でのクロマトグラフィーで残分から分離した。３０％酢酸エチル／ヘキサンを用いたカラムクロマトグラフィー精製は、蛍光性不純物を含む生成物の分離を与えた。最終精製は調整的に達成した。１０％酢酸エチル／ＣＨ₂Ｃｌ₂を用いたＴＬＣ；¹Ｈ ＮＭＲ（アセトン−ｄ₆）δ１．０８（ｔ，６Ｈ），３．４６（ｓ，３Ｈ），３．７６−３．９７（ｍ，４Ｈ），６．７９−７．９１（ｍ，１３Ｈ）。
【００９３】
８．アクリダン誘導体３８の合成。
【化８６】

ＴＨＦ中のフェニル１０−メチルアクリダン−９−チオカルボキシラート（１．０ｇ，３ｍｍｏｌ）の溶液を、−７８℃でＬＤＡにより脱プロトン化した。同時に、（ＥｔＯ）₂ＰＯＣｌ（９５８ｍｇ，５ｍｍｏｌ）とピリジン（２．５ｍＬ，３ｍｍｏｌ）をシリンジを通して加え、撹拌を１５分間継続した。ドライアイス浴に移し、撹拌を２時間継続した。揮発分を留去し、その生成物を２工程でのクロマトグラフィーで残分から分離した。３０−１００％酢酸エチル／ヘキサンを用いたカラムクロマトグラフィー精製は、青と緑色の蛍光性不純物を含む生成物の分離を与えた。最終精製は調整的に達成した。１２％酢酸エチル／ＣＨ₂Ｃｌ₂を用いたＴＬＣ；¹Ｈ ＮＭＲ（アセトン−ｄ₆）δ１．０１（ｔ，６Ｈ），３．４９（ｓ，３Ｈ），３．７４−３．９６（ｍ，４Ｈ），６．９１−７．４５（ｍ，１１Ｈ），７．７８（ｄ，１Ｈ），７．９９（ｄ，１Ｈ）。
【００９４】
９．アクリダン誘導体３９の合成。
【化８７】

ＴＨＦ中のフェニル１０−メチルアクリダン−９−カルボキシラート（３１１ｍｇ，１ｍｍｏｌ）の溶液を、−７８℃でＬＤＡの溶液に滴下して加えた。−７８℃で３０分後、無水酢酸（１６１．３ｍｇ，１．６ｍｍｏｌ）をシリンジを経て加え、ドライアイス浴に移した。１時間後、揮発分を留去し、その生成物をクロマトグラフィーで残分から分離した。５％酢酸エチル／ヘキサンを用いたカラムクロマトグラフィー精製は、白色固体として９０ｍｇ精製分画と、幾らかの出発材料を含む第２分画（２５０ｍｇ）を提供した；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ２．０４（ｓ，３Ｈ），３．４４（ｓ，３Ｈ），６．８２−７．６５（ｍ，１３Ｈ）。
【００９５】
１０．アクリダン誘導体４０の合成。
【化８８】

ＴＨＦ中のフェニル１０−メチルアクリダン−９−チオカルボキシラート（１．０５ｇ）の溶液を、−７８℃でＬＤＡによって脱プロトン化した。ＴＨＦ１０ｍＬ中の無水酢酸（０．４５ｍｌ）を滴下して加え、ドライアイス浴に移し、一晩撹拌を継続した。揮発分を留去し、その生成物をクロマトグラフィーで残分から分離した。５−２０％酢酸エチル／ヘキサンを用いたカラムクロマトグラフィー精製は、オフホワイト固体として化合物４０の１．１５ｇを提供した；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ１．８９（ｓ，３Ｈ），３．４８（ｓ，３Ｈ），６．９５−７．０６（ｍ，４Ｈ），７．２０−７．３４（ｍ，５Ｈ），７．４０−７．４４（ｍ，２Ｈ），７．６２（ｄ，１Ｈ），７．７９（ｄ，１Ｈ）。
【００９６】
１１．アクリダン誘導体４１の合成。
【化８９】

ＴＨＦ中のフェニル１０−メチルアクリダン−９−カルボキシラート（３３３．４ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ）の溶液を、−７８℃、３０分間ＬＤＡで脱プロトン化した。その濃橙色溶液を乾燥ＴＨＦ１０ｍＬ中の塩化ｔ−ブチルジメチルシリル（２５３．４ｍｇ，１．６８ｍｍｏｌ）で処理した。ドライアイス浴に移し、２時間撹拌を継続した。揮発分を留去し、５％酢酸エチル／ヘキサンを用いたクロマトグラフィーで残分から油状（２１２ｍｇ）として生成物を単離した；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ−０．１２（ｓ，６Ｈ），０．７７（ｓ，９Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），６．７５−７．３８（ｍ，１２Ｈ），７．７９（ｄｄ，１Ｈ）。
【００９７】
１２．アクリダン誘導体４２の合成。
【化９０】

ＴＨＦ中のフェニル１０−メチルアクリダン−９−チオカルボキシラート（３２２．３ｍｇ，０．９７ｍｍｏｌ）の溶液を、−７８℃でＬＤＡによって脱プロトン化した。乾燥ＴＨＦ５ｍＬ中の塩化ｔ−ブチルジメチルシリル（２７０ｍｇ，１．８ｍｍｏｌ）を迅速に加え、ドライアイス浴に移し、９０分間撹拌を継続した。揮発分を留去し、５％酢酸エチル／ヘキサンを用いたクロマトグラフィーで、放置により固体化した油状として残分から生成物を単離した；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ−０．０９（ｓ，６Ｈ），０．７３（ｓ，９Ｈ），３．４３（ｓ，３Ｈ），６．８４−７．０１（ｍ，４Ｈ），７．１６−７．４７（ｍ，７Ｈ），７．７３−７．７６（ｍ，１Ｈ），７．９０−７．９３（ｍ，１Ｈ）。
【００９８】
１３．化合物４３の合成。
【化９１】

Ｅ異性体を説明のためここに表した。実質上一つの異性体を形成したとしても、それはどの異性体か確実に知られていない。
【００９９】
（ａ）乾燥ＴＨＦの１００ｍＬ中の２−（６−ヒドロキシ−２−ナフチル）−プロパン酸（１．００ｇ）とベンゼンチオール（０．６３５ｇ）の混合物を、ＤＣＣの１．２ｇと一晩撹拌することにより処理した。その混合物は乾固するまで濃縮し、その残分をヘキサンで洗浄し濾過した。その残分をＣＨ₂Ｃｌ₂と水の間で分配し、その有機相を乾燥、濃縮した。粗チオエステル、フェニル２−（６−ヒドロキシ−２−ナフチル）−プロパン−チオアートを３０％酢酸エチル／ヘキサンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製した；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ１．６６（ｄ，３Ｈ），４．１４（ｑ，１Ｈ），５．３０（ｓ，１Ｈ），７．０９−７．７４（ｍ，１１Ｈ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ１８．６３，５４．０９，１０３．０２，１０９．４２，１１８．３５，１２６．５４，１２６．９７，１２７．０６，１２７．８８，１２８．８８，１２９．１８，１２９．３９，１２９．８２，１３４．０４，１３４．５２，１５３．８６，１９９．７８。
【０１００】
（ｂ）フェニル基を、トリエチルアミンの３ｍＬ中の塩化ピバロイルの１．１ｍＬと最初の工程の生成物（２．５ｇ）との反応によりピバラートエステルとして保護した。該反応の完了時に、その混合物を乾固するまで濃縮し、その残分をＣＨ₂Ｃｌ₂と水の間で分配した。その有機相を水、続いて飽和食塩水で洗浄し、乾燥、濃縮した。粗チオエステル、フェニル２−（６−ピバロイルオキシ−２−ナフチル）−プロパンチオアートを０−５％酢酸エチル／ヘキサンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製した；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ１．４１（ｓ，９Ｈ），１．６６（ｄ，３Ｈ），４．１７（ｑ，１Ｈ），７．１９−７．８７（ｍ，１１Ｈ）。
【０１０１】
（ｃ）工程（ｂ）からのチオエステルのエノールビス（シアノエチル）ホスファートへの変換は、−７８℃で乾燥ＴＨＦ中ＬＤＡの１．５当量による該チオエステルの２．０ｇの脱プロトン化、及びＰＯＣｌ₃の０．７１ｍＬとピリジンの０．６２ｍＬ、続いてピリジンの１．２ｍＬ中３−ヒドロキシプロピオニトリルの１．０４ｍＬの添加による該エノラートの反応によって行った。その生成物は、６０％酢酸エチル／ヘキサンを用いたカラムクロマトグラフィーで残分から単離し、残りの３−ヒドロキシプロピオニトリルを除去するために、水で更に洗浄した。その生成物は、実質上一つの異性体（４３ａ）であることが明らかになった；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ１．３９（ｓ，９Ｈ），２．３８（ｓ，３Ｈ），２．６７（ｍ，４Ｈ），４．２５（ｍ，４Ｈ），７．２−７．８（ｍ，１１Ｈ）；³¹Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ−７．４３。
【０１０２】
（ｄ）化合物４３ａは、１ｍＬの水に溶かしたＮａＯＨの０．１９８ｇを含むアセトンの３５ｍＬ中で０．７２ｇを反応させることによって脱保護化した。沈殿した塩は、アセトンで洗浄し、エタノール中に溶かし、４３が生成するようにアセトンで沈殿した；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）δ２．３４（ｓ，３Ｈ），６．８０−７．４４（ｍ，１１Ｈ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）δ２１．２６，１１１．３２，１２４．１５，１２５．１０，１２５．０８，１２７．３８，１２７．９０，１２８．６２，１２９．３５，１２９．４４，１３５．７９，１３６．０６，１３６．１４，１３６．５１，１３９．３１，１３９．４３，１４０．０７，１６４．９９；³¹Ｐ ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）δ６．２４。
【０１０３】
１４．化合物４４の合成。
【化９２】

（ａ）乾燥ＴＨＦ中、２−（６−ヒドロキシ−２−ナフチル）−プロパン酸（７．００ｇ）と４−クロロベンゼンチオール（６．２２ｇ）の混合物を、ＤＣＣの８．８５ｇと一晩撹拌することにより処理した。その混合物を濾過し、その濾液を乾固するまで濃縮した。その残分をＣＨ₂Ｃｌ₂と水の間で分配し、その有機相を水及び飽和食塩水で連続して洗浄した。乾燥し、溶媒を留去し、２０％酢酸エチル／ヘキサンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製したそのチオエステル、フェニル２−（６−ヒドロキシ−２−ナフチル）−プロパンチオアートを生成した；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ１．６５（ｄ，３Ｈ），４．０８−４．１８（ｍ，１Ｈ），７．１１−７．７５（ｍ，１０Ｈ）。
【０１０４】
（ｂ）フェニル基をピバラートエステルとして保護した。最初の工程からのチオエステル（６．１４ｇ）を塩化ピバロイル（２．８９ｇ）とトリエチルアミンの５ｍＬと反応させた。その混合物を乾固するまで濃縮した後、その残分を水と飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄を通して乾燥した。更なる精製を５％酢酸エチル／ヘキサンを用いたクロマトグラフィーで実行した；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ１．４１（ｓ，９Ｈ），１．６５−１．６８（ｄ，３Ｈ），４．１２−４．１９（ｑ，１Ｈ），７．２０−７．８７（ｍ，１０Ｈ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ１８．５７，２７．２２，３９．１８，５４．２１，１０３．０２，１１８．３５，１２１．７８，１２６．５７，１２６．９９，１２８．３３，１２９．３９，１３１．４３，１３３．２５，１３６．７４，１４９．０６，１７７．３２，１９８．５９。
【０１０５】
（ｃ）保護化チオエステルのエノールビス（シアノエチル）ホスファートへの変換は、−７８℃で乾燥ＴＨＦ中ＬＤＡの１．５当量による該チオエステルの２．２ｇの脱プロトン化、及びＰＯＣｌ₃の１．５当量とピリジンの１．５当量と該エノラートとの反応、続いてピリジンの１．２ｍＬ中３−ヒドロキシプロピオニトリルの１．０４ｍＬの添加によって行った。その反応溶液を濃縮し、その残分をＣＨ₂Ｃｌ₂と水の間で分配した。その有機相を水及び飽和食塩水で連続して洗浄し、乾燥、濃縮した。該生成物は６５％酢酸エチル／ヘキサンを用いたクロマトグラフィーで残分から、異性体混合物として単離した（４４ａ，Ｅ／Ｚ）；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ１．４０（ｓ，９Ｈ），２．３６＆２．３６（２ｓ，３Ｈ），２．７２−２．７６（ｍ，４Ｈ），４．２４−４．３５（ｍ，４Ｈ），７．１７−７．８１（ｍ，１０Ｈ）；³¹Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ−７．０７。
【０１０６】
（ｄ）化合物４４ａは、１ｍＬの水に溶かしたＮａＯＨの０．２６ｇを含むアセトンの６０ｍＬ中で０．８０ｇを反応させることによって脱保護化した。沈殿した塩は、アセトンで洗浄、乾燥し、異性体の混合物（４４Ｅ／Ｚ）として化合物４４を生成した；¹Ｈ ＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ２．１９（ｓ，３Ｈ），６．７９−７．５４（ｍ，１１Ｈ）；³¹Ｐ ＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ２．９０。
【０１０７】
１５．化合物４５の合成。
【化９３】

（ａ）ジフェニル酢酸（３．１２ｇ）をＳＯＣｌ₂の５０ｍＬ中で２．５時間還流することによって酸塩化物に変換し、次いでＥｔ₃Ｎの約２ｍＬを含むＣＨ₂Ｃｌ₂の５０ｍＬ中フェノールの１．５２ｇと一晩エステル化した。揮発分を真空中で除去し、残分をヘキサンと水の間で分配した。その有機相を乾燥し、そのエステルを更に精製することなしに用いた；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ５．２７（ｓ，１Ｈ），７．０５−７．４４（ｍ，１５Ｈ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ５７．０９，１２１．４４，１２５．９９，１２７．５４，１２８．７０，１２８．８２，１２９．４２，１３８．２６，１５０．７９，１７１．０４。
【０１０８】
（ｂ）そのエステルを、−７８℃で乾燥ＴＨＦ中ＬＤＡの１．１当量による３．０ｇの脱プロトン化、及びＰＯＣｌ₃の１．１５当量とピリジンの１．１５当量との室温まで暖めての反応によってエノールビス（シアノエチル）ホスファートに変換した。ピリジン４．８ｍＬ中の３−ヒドロキシプロピオニトリル（２．０５ｍＬ）を加え、その反応液を一晩撹拌した。その反応溶液を濃縮し、その残分をＣＨ₂Ｃｌ₂と水の間で分配した。その有機相を水及び飽和食塩水で連続して洗浄し、乾燥、濃縮した。該生成物は７０％酢酸エチル／ヘキサンを用いたクロマトグラフィーで残分から単離した（４５ａ）；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ２．３０−２．４５（ｍ，４Ｈ），３．６９−３．８４（ｍ，４Ｈ），７．０８−７．４５（ｍ，１５Ｈ）。
【０１０９】
（ｃ）化合物４５ａは、１ｍＬの水に溶かしたＮａＯＨの０．１８ｇを含むアセトンの３０ｍＬ中で１．０４ｇを反応させることによって脱保護化した。沈殿した塩は、アセトンで洗浄、乾燥し、化合物４５（０．５ｇ）を生成した；¹Ｈ ＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ７．００−７．５６（ｍ，１５Ｈ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ１１０．５１，１１０．６０，１１６．２１，１２２．２９，１２６．６０，１２６．７２，１２８．２６，１２９．５４，１２９．８７，１２９．９６，１３９．０１，１４６．７５，１４６．８７，１５６．５５，２０１．６３；³¹Ｐ ＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ２．１５。
【０１１０】
１５．化合物４６の合成。
【化９４】

（ａ）ジフェニル酢酸（６．０ｇ）をＳＯＣｌ₂の３０ｍＬ中で還流することによって酸塩化物に変換し、次いでＥｔ₃Ｎの約１０ｍＬを含むＣＨ₂Ｃｌ₂の５０ｍＬ中チオフェノールの３．５ｇと一晩エステル化した。その溶液を水、飽和ＮａＨＣＯ₃と塩水とで連続的に抽出した。Ｎａ₂ＳＯ₄を通して乾燥後、揮発分を真空中で除去し、そのチオエステルを更に精製することなしに用いた；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ５．３１（ｓ，１Ｈ），７．２−７．６（ｍ，１５Ｈ）；
【０１１１】
（ｂ）そのチオエステルを、−７８℃で３０分間、乾燥ＴＨＦ中ＬＤＡの１．１当量による３．０ｇの脱プロトン化、及びそのエノラートと、ＰＯＣｌ₃の１．１５当量とピリジンの１．１５当量との室温まで暖めての３．５時間の反応によってエノールビス（シアノエチル）ホスファートに変換した。ピリジン４．８ｍＬ中の３−ヒドロキシプロピオニトリル（２．０５ｍＬ）を加え、その反応液を一晩撹拌した。その反応溶液を濃縮し、その残分をＣＨ₂Ｃｌ₂と水の間で分配した。その有機相を水及び飽和食塩水で連続して洗浄し、乾燥、濃縮した。該生成物は６５％酢酸エチル／ヘキサンを用いたクロマトグラフィーで残分から単離した（４６ａ）；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ２．３−２．５（ｍ，４Ｈ），３．６２−３．８２（ｍ，４Ｈ），７．２−７．４５（ｍ，１５Ｈ）。
【０１１２】
（ｃ）化合物４５ａは、２ｍＬの水に溶かしたＮａＯＨの０．３ｇを含むアセトンの５０ｍＬ中で１．７９ｇを反応させることによって脱保護化した。沈殿した塩は、アセトンで洗浄、乾燥し、化合物４６（１．５ｇ）を生成した；¹Ｈ ＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ７．０８−７．４４（ｍ，１５Ｈ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ１２５．７８，１２７．２３，１２７．４１，１２７．６０，１２８．１１，１２８．１７，１２９．１１，１２９．９３，１２９．５４，１３５．５８，１３５．６７，１３９．８６，１４０．７４，１４０．８６，１４１．６２；³¹Ｐ ＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ２．３０。
【０１１３】
１６．化合物４７の合成。
【化９５】

（ａ）乾燥ＴＨＦの１００ｍＬ中、１−ピレン酢酸（３．００ｇ）とベンゼンチオール（１．２７ｇ）の混合物をＤＣＣの２．３８ｇで一晩撹拌することによって処理した。その混合物を濾過し、濾液を乾固するまで濃縮した。その残分をＣＨ₂Ｃｌ₂と水の間で分配し、その有機相をＮａＨＣＯ₃飽和水溶液、水及び飽和食塩水で連続して洗浄した。乾燥し溶媒を留去し、１５％酢酸エチル／ヘキサンを用いたクロマトグラフィーで精製し、チオエステル、フェニル２−ピレンチオアセタートを生成した；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ４．６６（ｓ，２Ｈ），７．３５（ｓ，５Ｈ），８．０２−８．３０（ｍ，９Ｈ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ１０９．２３，１２４．９６，１２５．５１，１２７．４５，１２７．６６，１２８．３３，１２９．１５，１２９．３９，１３４．４９，１７０．０１。
【０１１４】
（ｂ）そのチオエステルのエノールビス（シアノエチル）ホスファートへの変換は、−７８℃で乾燥ＴＨＦ中ＬＤＡの１．２当量による該チオエステルの０．５ｇの脱プロトン化、及びそのエノラートと、ＰＯＣｌ₃の１．２当量とピリジンの１．２当量との反応、続いてピリジン０．３０ｍＬ中３−ヒドロキシプロピオニトリルの０．２５５ｍＬの添加によって達成した。その反応溶液を濃縮し、その残分をＣＨ₂Ｃｌ₂と水の間で分配した。その有機相を水及び飽和食塩水で連続して洗浄し、乾燥、濃縮した。該生成物は６０％酢酸エチル／ヘキサンを用いたクロマトグラフィーで残分から、異性体の５：２混合物として単離した（４７ａＥ／Ｚ）；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ２．１５−２．２４（ｍ），２．６３−２．６７（ｍ），３．６２−３．７８（ｍ），４．１４−４．２２（ｍ），７．２４−８．２６（ｍ）；³¹Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ２７．３９，２８．１６；¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ１９．０６，１９．１５，１９．５４，１９．６４，６２．４０，６２．４６，６２．９８，６３．０４，１１６．１６，１１６．４９，１２３．５１，１２３．７５，１２４．３９，１２４．５４，１２４．７１，１２４．８１，１２５．５７，１２５．６３，１２５．７２，１２５．８７，１２６．１８，１２６．３９，１２７．０９，１２７．１５，１２７．３２，１２７．４６，１２７．８８，１２８．０６，１２８．１７，１２８．２７，１２８．３０，１２８．７６，１２９．３３，１２９．４２，１２９．７６，１２９．８２，１３０．６７，１３０．８５，１３１．０３，１３１．２２，１３１．３１，１３１．４０，１３２．９１，１４１．３２，１４２．９６，１４３．１１。
【０１１５】
（ｃ）化合物４７ａは、０．１ｍＬの水に溶かしたＮａＯＨの０．０４ｇを含むアセトンの６ｍＬ中で０．２４７ｇを反応させることによって脱保護化した。沈殿した塩は、アセトンで洗浄、乾燥し、異性体の混合物（４７Ｅ／Ｚ）として化合物４７を生成した；¹Ｈ ＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ６．２２（ｓ），６．７４−８．１（ｍ），８．４７（ｄ）；³¹Ｐ ＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ０．１２，０．６９，０．７０。
【０１１６】
１７．化合物４８の合成。
【化９６】

（ａ）ベンゼンの６０ｍＬ中チオキサントン（１０ｇ）の溶液を、ＬＡＨの５．０ｇと１５分間撹拌することにより処理した。その混合物を加熱し、エーテル１００ｍＬを慎重に加えた。還流を９０分間継続した。冷やした混合物を水によって中和化した。その固体を濾別し、濾液を乾固するまで濃縮した。純粋なチオキサンテン（９．１ｇ，９８％）を２０％酢酸エチル／ヘキサンを用いたクロマトグラフィーによって単離した；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ３．８２（ｓ，３Ｈ），７．２１（ｍ，４Ｈ），７．３３（ｍ，２Ｈ），７．４６（ｍ，２Ｈ）。
【０１１７】
（ｂ）チオキサンテン、９．１ｇを乾燥ＴＨＦの１００ｍＬ中に溶解した。その溶液は、氷浴中で冷やし、ｎ−ＢｕＬｉ（２．５Ｍ溶液の２４ｍＬ）を滴下により加えた。その赤色溶液を室温で１時間撹拌した。粉末ＣＯ₂を（約１５０ｇ）白色沈殿の生成をもたらすように加えた。付加の時間撹拌した後、その混合物を濃縮し、その残分を水に溶かした。その水溶液をＣＨ₂Ｃｌ₂で抽出し、ＨＣｌで中性化した。沈殿した生成物をエーテル中で溶かし、乾燥し、濃縮し、白色固体（８．８ｇ）としてチオキサンテン−９−カルボン酸を生成した；¹Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ５．２５（ｓ，１Ｈ），７．３０（ｍ，４Ｈ），７．４９（ｍ，４Ｈ），１２．６０（ｓ，１Ｈ）。
【０１１８】
（ｃ）チオキサンテン−９−カルボン酸（５．８ｇ）と塩化チオニル（３０ｍＬ）とを室温で１時間撹拌した。塩化チオニルを留去し、残分をＣＨ₂Ｃｌ₂の１００ｍＬに溶かした。ピリジン（４ｍＬ）とチオフェノール（４ｇ）を加え、その反応混合物を室温で５時間撹拌した。その混合物を濃縮し、残分を水で、次いでエーテルで洗浄した。そのチオエステルを２０％酢酸エチル／ヘキサンを用いたクロマトグラフィーによって精製し、純粋なフェニルチオキサンテン−９−チオカルボキシラート６．３ｇを得た；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ５．１６（ｓ，１Ｈ），７．３２（ｍ，９Ｈ），７．５０（ｍ，４Ｈ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ６３．０，１２６．９，１２７．３，１２８．１，１２８．４，１２９．２，１２９．４，１３０．９，１３２．４，１３３．７，１３４．５，１９６．５。
【０１１９】
（ｄ）該チオエステル（４．６ｇ）を−７８℃で３０分間、乾燥ＴＨＦの４０ｍＬ中ＬＤＡ１．５当量によって脱プロトン化した。乾燥ＴＨＦの１０ｍＬ中、ＰＯＣｌ₃（３．２ｇ）とピリジン（１．６６ｇ）の溶液を、室温まで暖めつつ滴下して加えた。室温で４５分間撹拌した後、シアノエタノール（５．６８ｇ）とピリジン（６．３ｇ）の溶液を加え、一晩撹拌を続けた。その混合物を濾過し、その濾液を濃厚な残分となるまで濃縮し、７０％酢酸エチル／ヘキサンを用いてクロマトグラフィーした。エノールビス（シアノエチル）ホスファート（４８ａ）が泡状として得られた；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ２．５２（ｍ，４Ｈ），３．９４（ｍ，４Ｈ），７．２０−７．４８（ｍ，１０Ｈ），７．５５（ｄｄ，１Ｈ），７．７４（ｄｄ，１Ｈ），７．８５（ｄｄ，１Ｈ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ１９．５，６２．５，１１６．６，１２６．２，１２６．３，１２６．７，１２７．０，１２７．１，１２８．０，１２８．１，１２８．２，１２９．１，１２９．５，１２９．７，１３２．５，１３３．０，１３３．３，１３４．２，１３４．３，１３４．６，１３７．７，１３７．８；³¹Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ−１０．３５（ｐ）。
【０１２０】
（ｅ）化合物４８ａは、水５．６ｍＬに溶かしたＮａＯＨの０．２８ｇを含むアルゴン−パージしたアセトンの４０ｍＬ中で１．８ｇを一晩反応することによって脱保護化した。沈殿した塩を１０％アセトン水溶液で洗浄し、乾燥して白色固体として化合物４８（１．５７ｇ）を生成した；¹Ｈ ＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ６．９４−７．２５（ｍ，９Ｈ），７．３８（ｍ，２Ｈ），７．７６（ｄ，１Ｈ），８．０８（ｄ，１Ｈ）；³¹Ｐ ＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ０．７３（ｓ）。
【０１２１】
１８．化合物４９の合成。
【化９７】

化合物４９は、工程（ｃ）でのチオフェノールをフェノールに代えることで先の実施例で記載した反応の連続によって調製した。
【０１２２】
（ａ）フェニルチオキサンテン−９−チオカルボキシラート：¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ５．２６（ｓ，１Ｈ），６．９４（ｄ，２Ｈ），７．１５（ｔ，１Ｈ），７．２４−７．３４（ｍ，６Ｈ），７．５１（ｍ，４Ｈ）。
【０１２３】
（ｂ）９−（フェノキシホスホリルオキシメチリデン）チオキサンテン、ビス（シアノエチル）エステル（４９ａ）；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ２．５０（ｍ，４Ｈ），３．８４（ｍ，２Ｈ），４．０２（ｍ，２Ｈ），７．１６（ｍ，５Ｈ），７．２９−７．５４（ｍ，７Ｈ），７．８２（ｄ，１Ｈ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ１９．５，６３．０，１２４．１，１２６．４，１２６．５，１２６．８，１２７．５，１２７．８，１２８．０，１２９．２，１３０．１，１３１．２，１３１．４，１３３．４，１３４．４，１４２．７，１４２．９，１５５．０；³¹Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ−１０．９２（ｐ）
【０１２４】
（ｃ）９−（フェノキシホスホリルオキシメチリデン）チオキサンテン、二ナトリウム塩（４９）；¹Ｈ ＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ６．９２（ｔ，１Ｈ），７．０４（ｔ，２Ｈ），７．０７−７．３４（ｍ，６Ｈ），７．３８（ｔ，１Ｈ），７．４５（ｄ，１Ｈ），７．７１（ｄ，１Ｈ），８．０５（ｄ，１Ｈ）；³¹Ｐ ＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ０．２２（ｓ）。
【０１２５】
１９．化合物５０の合成。
【化９８】

フェニル１０−メチルアクリダン−９−チオカルボキシラート、１．０ｇを、−７８℃で乾燥ＴＨＦの６０ｍＬ中ＬＤＡによってエノラートに変換した。−７０℃で一時間その温度を維持した後、メチルトリフラート０．７６ｇを加え、その反応混合物を室温まで暖めた。その混合物を四日間放置した。ＣＨ₂Ｃｌ₂（１５０ｍＬ）を加え、溶液を水で抽出し、Ｎａ₂ＳＯ₄を通して乾燥した。粗生成物は調整ＴＬＣで７０／３０ヘキサン：ＣＨ₂Ｃｌ₂ 溶離液で精製した。¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ３．５３（ｓ，３Ｈ），３．５６（ｓ，３Ｈ），６．９３−７．４５（ｍ，１１Ｈ），７．７１（ｄ，１Ｈ），７．９３（ｄ，１Ｈ）。
【０１２６】
２０．リン酸アクリダン５によるＨＲＰの化学ルミネセント検出。０．０５５Ｍトリス緩衝液,ｐＨ８．６、０．２５ｍＭ尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のＴｗｅｅｎ２０及び３．３ｘ１０^-4Ｍのアクリダン５を含む試薬組成物を、酵素の１．４ｘ１０^-15と１．４ｘ１０^-19モルの間を含むＨＲＰ水溶液の１０μＬと、三つ組の１００μＬアリコートで反応することによって化学ルミネセンスの生成について試験した。光生成はミキシングで開始し、５，１０及び１５分で測定した。１５分での化学ルミネセンス強度と酵素の量との間の相関関係を図１に示した。
【０１２７】
２１．リン酸アクリダン１３によるＨＲＰの化学ルミネセント検出。０．０５５Ｍトリス緩衝液,ｐＨ８．６、０．２５ｍＭ尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のＴｗｅｅｎ２０及び３．３ｘ１０^-4Ｍのアクリダン１３を含む試薬組成物を、酵素の１．４ｘ１０^-15と１．４ｘ１０^-19モルの間を含むＨＲＰ水溶液の１０μＬと、三つ組の１００μＬアリコートで反応することによって化学ルミネセンスの生成について試験した。光生成はミキシングで開始し、５，１０及び１５分で測定した。１５分での化学ルミネセンス強度と酵素の量との間の相関関係を図２に示した。
【０１２８】
２２．リン酸アクリダン１−４及び６−１２及び１４による化学ルミネセント検出。実施例２１の方法において、化合物１−４及び６−１２及び１４をそれぞれ含む組成物を、２５℃でＨＲＰと反応させた。それぞれがＨＲＰの不在において測定したバックグラウンドを上回る明瞭に識別でき容易に測定可能な化学ルミネセンスを生じた。
【０１２９】
２３．化学ルミネセンス強度の動態プロフィール。ＨＲＰと反応したリン酸アクリダンの化学ルミネセンスプロフィールを図３に示した。２５℃でＨＲＰの１．４ｘ１０^-15と実施例２０の試薬組成物の１００μＬとの反応は、約５分で最大放射強度に達した光放射における瞬時の上昇をもたらす。
【０１３０】
２４．ジエチルリン酸アクリダン３７によるＨＲＰの化学ルミネセント検出。０．０１Ｍトリス緩衝液,ｐＨ８．０、０．５ｍＭ尿素過酸化物、０．１ｍＭのｐ−フェニルフェノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のＴｗｅｅｎ２０及び５ｘ１０^-5Ｍのアクリダン３７を含む試薬組成物を、酵素の１．４ｘ１０^-14と１．４ｘ１０^-19モルの間を含むＨＲＰ水溶液１０μＬと、三つ組の１００μＬアリコートで反応することによって化学ルミネセンスの生成について試験した。光生成はミキシングで開始し、２分で測定した。化学ルミネセンス強度と酵素の量との間の相関関係を図４に示した。
【０１３１】
２５．ジエチルリン酸アクリダン３８によるＨＲＰの化学ルミネセント検出。０．０１Ｍトリス緩衝液,ｐＨ８．０、０．５ｍＭ尿素過酸化物、０．１ｍＭのｐ−フェニルフェノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のＴｗｅｅｎ２０及び５ｘ１０^-5Ｍのアクリダン３８を含む試薬組成物（４０μＬ）を、ＨＲＰの１．４ｘ１０^-15モルを含む溶液の１μＬと反応させた。光生成はミキシングで開始され、１分のうちに最大強度に達した。化学ルミネセンス時間プロフィールを図５に示した。
【０１３２】
２６．酢酸アクリダン３９によるＨＲＰの化学ルミネセント検出。０．０１Ｍトリス緩衝液，ｐＨ８．０、０．５ｍＭ尿素過酸化物、０．１ｍＭのｐ−フェニルフェノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のＴｗｅｅｎ２０及び５ｘ１０^-5Ｍのアクリダン３９を含む試薬組成物を、酵素の１．４ｘ１０^-15と１．４ｘ１０^-20モルの間を含むＨＲＰ水溶液の１０μＬと、三つ組の１００μＬアリコートで反応することによって化学ルミネセンスの生成について試験した。光生成はミキシングで開始し、３０分のうちに最大強度に達した。化学ルミネセンス強度と酵素の量との間の相関関係を図６に示した。
【０１３３】
２７．酢酸アクリダン４０によるＨＲＰの化学ルミネセント検出。０．０１Ｍトリス緩衝液,ｐＨ８．０、０．５ｍＭ尿素過酸化物、０．１ｍＭのｐ−フェニルフェノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のＴｗｅｅｎ２０及び５ｘ１０^-5Ｍのアクリダン４０を含む試薬組成物（１００μＬ）を、ＨＲＰの１．４ｘ１０^-15モルを含む溶液の１０μＬと反応させた。光生成はミキシングで開始し、７分のうちに最大強度に達した。
【０１３４】
２８．アクリダン５０によるＨＲＰの化学ルミネセント検出。０．０１Ｍトリス緩衝液,ｐＨ８．０、０．５ｍＭ尿素過酸化物、０．１ｍＭのｐ−フェニルフェノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のＴｗｅｅｎ２０及び５ｘ１０^-5Ｍのアクリダン５０を含む試薬組成物（１００μＬ）を、ＨＲＰの３．５ｘ１０^-16モルを含む溶液の２．５μＬと反応させた。光生成はミキシングで開始し、７分のうちに最大強度に達した。化学ルミネセンス時間プロフィールを図７に示した。
【０１３５】
２９．化合物４３によるＨＲＰの化学ルミネセント検出。０．０５５Ｍトリス緩衝液,ｐＨ８．６、０．２５ｍＭ尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のＴｗｅｅｎ２０、１ｍＭのＣＴＡＢ及び６．６ｘ１０^-4Ｍのアクリダン４３を含む試薬組成物を、酵素の１．４ｘ１０^-15と１．４ｘ１０^-19モルの間を含むＨＲＰの溶液の１０μＬと、三つ組の１００μＬアリコートで反応することによって化学ルミネセンスの生成について試験した。１５分での化学ルミネセンス強度と酵素の量との間の相関関係を図８に示した。
【０１３６】
３０．化合物４６によるＨＲＰの化学ルミネセント検出とエネルギー転移剤による化学ルミネセンスの増加。０．０５５Ｍトリス緩衝液,ｐＨ８．６、０．２５ｍＭ尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のＴｗｅｅｎ２０、１ｍＭのＣＴＡＢ及び６．６ｘ１０^-4Ｍのアクリダン４６を含む試薬組成物単独又は５０μＭのＤＢＡの添加したものを、ＨＲＰの３．５ｘ１０^-15モルと１００μＬアリコートを反応することによって化学ルミネセンスの生成について試験した。相対的な化学ルミネセント時間プロフィールを図９に示し且つ三重項エネルギーアクセプターＤＢＡによる化学ルミネセンスの増加を示す。
【０１３７】
３１．化合物４８によるＨＲＰの化学ルミネセント検出。０．０５５Ｍトリス緩衝液,ｐＨ８．６、０．２５ｍＭ尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のＴｗｅｅｎ２０及び３．３ｘ１０^-4Ｍの化合物４８を含む試薬組成物を、ＨＲＰの３．５ｘ１０^-15と１００μＬアリコートで反応することによって化学ルミネセンスの生成について試験した。化学ルミネセンス時間プロフィールを図１０に示した。
【０１３８】
３２．化合物４９によるＨＲＰの化学ルミネセント検出。０．０５５Ｍトリス緩衝液,ｐＨ８．６、０．２５ｍＭ尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のＴｗｅｅｎ２０及び３．３ｘ１０^-4Ｍの化合物４９を含む試薬組成物を、ＨＲＰの３．３ｘ１０^-15と１００μＬアリコートで反応することによって化学ルミネセンスの生成について試験した。化学ルミネセンス時間プロフィールを図１１に示した。
【０１３９】
３３．ＰＶＤＦ膜を用いたウェスタンブロットアッセイ。本発明の組成物を、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜上のＨＲＰ標識化抗体によるウェスタンブロットにおいて、タンパク質、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）を検出し且つ定量するために用いた。それぞれタンパク質の５０００，１０００，１８０，３０及び５ｐｇを含むβ−ｇａｌの希釈物を、電気泳動し、ＰＶＤＦ膜(Millipore,Bedford,MA)に転移した。その膜は、Ｔ−ＴＢＳ（ＴＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０；ＴＢＳは５０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸、ｐＨ７．４，０．１５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ）中の１％脱脂乳によってブロック化し、次いでマウス抗−β−ｇａｌ（Boehringer-Mannheim,Indianapolis）の１：１５００希釈液とヒツジ抗−マウス−ＨＲＰ接合体（Boehringer-Mannheim）の１：６００希釈液と連続的に反応させた。その膜はＴ−ＴＢＳ中で洗浄し、０．６６ｍＭのリン酸アクリダン５、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．２５ｍＭ尿素過酸化物、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のＴｗｅｅｎ２０を含む０．０５５Ｍトリス緩衝液,ｐＨ８．６を含む試薬に３分間浸漬した。その膜は、透明プラスチックシート間に配し、Ｘ線フィルムに露光させた。図１２は、３０秒露光と共に１４分後のβ−ｇａｌの検出を示す。生じた光は、数時間の間、画像化できる放射強度に至る。
【０１４０】
３４．ニトロセルロース膜を用いたウェスタンブロット。先の実施例の方法に従うウェスタンブロットアッセイを、固相としてニトロセルロース膜（Schleicher & Schuell, Keene, NH)を用いて実行した。５０００−５ｐｇの範囲内のβ−Ｇａｌ標準品を用いた。先の実施例の検出試薬は、数時間にわたり実行すべき検出を与えた。図１３は、５分間露光による１０分後のβ−ｇａｌの検出を示す。
【０１４１】
３５．本発明の他の化学ルミネセント試薬を用いたウェスタンブロット。化合物５に代えて化合物１，１２と１３をそれぞれ含む検出試薬を用いてＰＶＤＦとニトロセルロース膜上でのβ−ガラクトシダーゼの類似のウェスタンブロットアッセイは定性的に同じ結果であった。
【０１４２】
３５．本発明の化学ルミネセント試薬を用いたサザンブロット。サザンブロットアッセイは、本出願人の米国特許第5,593,845号に記載された方法に従って、そこに記載された検出試薬に代えて、本発明の実施例２０又は３３に従う試薬組成物によって実行することができる。
【０１４３】
上述の説明と実施例は単に説明のためのものであり制限として考慮されるものでない。特に記載していない特有の化合物と方法の変更が本発明の精神と範囲から逸脱することなしに行うことができる。本発明の範囲は、添えられた特許請求の範囲によってのみ制限される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、室温で誘発したリン酸アクリダン５を含む実施例２０に記載した試薬の１００μＬによって放射した１５分での化学ルミネセンス強度に対するＨＲＰの量を関係付けるグラフである。化学ルミネセンス放射は、黒色ミクロプレートのウェル中で、0.055Mのトリス緩衝液,pH8.6、0.25mMの尿素過酸化物、0.05mMのｐ−フェニルフェノール、0.5mMのＥＤＴＡ、0.0125%のTween 20及び3.3x10^-4Mのアクリダン５を含む試薬の１００μＬに、酵素の1.4x10^-15と1.4x10^-19モルの間で含むＨＲＰの溶液の１０μＬの添加によって開始した。用語Ｓ−Ｂは、ＨＲＰの不在中のバックグラウンド化学ルミネセンス（Ｂ）で補正したＨＲＰの存在中の相対光単位（ＲＬＵ）における化学ルミネセンス信号（Ｓ）に関する。
【図２】 図２は、室温で誘発したリン酸アクリダン１３を含む実施例２１に記載した試薬の１００μＬによって放射した１５分での化学ルミネセンス強度に対するＨＲＰの量を関係付けるグラフである。化学ルミネセンス放射は、黒色ミクロプレートのウェル中で、0.055Mのトリス緩衝液,pH8.6、0.25mMの尿素過酸化物、0.05mMのｐ−フェニルフェノール、0.5mMのＥＤＴＡ、0.0125%のTween 20及び3.3x10^-4Mのアクリダン１３を含む試薬の１００μＬに、酵素の1.4x10^-15と1.4x10^-19モルの間で含むＨＲＰの溶液の１０μＬの添加によって開始した。
【図３】 図３は、実施例２０に記載したアクリダン５を含む試薬の１００μＬと２５℃でＨＲＰの1.4x10^-15モルの反応で生じた化学ルミネセンスの時間プロフィールを示すグラフである。
【図４】 図４は、室温で誘発したリン酸アクリダン３７を含む試薬の１００μＬによって放射した２分での最大化学ルミネセンス強度に対するＨＲＰの量を関係付けるグラフである。化学ルミネセンス放射は、0.01Mのトリス緩衝液、pH8.0、0.5mMの尿素過酸化物、0.1mMのｐ−フェニルフェノール、1mMのＥＤＴＡ、0.025%のTween 20及び5x10^-5Mのアクリダン３７を含む試薬組成物の１００μＬに、1.4x10^-15と1.4x10^-19モルの間で含むＨＲＰの溶液の１０μＬの添加によって開始した。
【図５】 図５は、0.01Mのトリス緩衝液,pH8.0、0.5mMの尿素過酸化物、0.1mMのｐ−フェニルフェノール、1mMのＥＤＴＡ、0.025%のTween 20及び5x10^-5Mのアクリダン３８を含む試薬組成物の４０μＬと２５℃でＨＲＰの1.4x10^-15モルの反応で生じた化学ルミネセンスの時間プロフィールを示すグラフである。光生成は混合に続発し、１分間で最大強度に到達した。
【図６】 図６は、室温で誘発したアクリダン３９を含む試薬の１００μＬによって放射した３０分での最大化学ルミネセンス強度に対するＨＲＰの量を関係付けるグラフである。化学ルミネセンス放射は、0.01Mのトリス緩衝液,pH8.0、0.5mMの尿素過酸化物、0.1mMのｐ−フェニルフェノール、1mMのＥＤＴＡ、0.025%のTween 20及び5x10^-5Mのアクリダン３９を含む試薬組成物の１００μＬに、1.4x10^-15と1.4x10^-20モルの間で含むＨＲＰの溶液の１０μＬの添加によって開始した。
【図７】 図７は、0.01Mのトリス緩衝液,pH8.0、0.5mMの尿素過酸化物、0.1mMのｐ−フェニルフェノール、1mMのＥＤＴＡ、0.025%のTween 20及び5x10^-5Mのアクリダン５０を含む試薬組成物の１００μＬと２５℃でＨＲＰの3.5x10^-16モルの反応で生じた化学ルミネセンスの時間プロフィールを示すグラフである。光生成は混合に続発し、７分間で最大強度に到達した。
【図８】 図８は、室温で誘発したアクリダン４３を含む試薬の１００μＬによって放射した１５分での最大化学ルミネセンス強度に対するＨＲＰの量を関係付けるグラフである。化学ルミネセンス放射は、0.055Mのトリス緩衝液,pH8.6、0.25mMの尿素過酸化物、0.05mMのｐ−フェニルフェノール、0.5mMのＥＤＴＡ、0.0125%のTween 20、1mMのＣＴＡＢ及び6.6x10^-4Mのアクリダン４３を含む試薬組成物の１００μＬに、1.4x10^-15と1.4x10^-19モルの間で含むＨＲＰの溶液の１０μＬの添加によって開始した。
【図９】 図９は、蛍光エネルギー転移剤の使用による化学ルミネセンスの増加を示すグラフである。0.055Mのトリス緩衝液,pH8.6、0.25mMの尿素過酸化物、0.05mMのｐ−フェニルフェノール、0.5mMのＥＤＴＡ、0.0125%のTween 20、1mMのＣＴＡＢ及び3.3x10^-4Mの化合物４６を単独で又は50μMのＤＢＡと共に含む試薬組成物と、ＨＲＰの3.5x10^-15と１００μＬアリコートとを反応することによって化学ルミネセンスの生成を試験した。
【図１０】 図１０は、0.055Mのトリス緩衝液,pH8.6、0.25mMの尿素過酸化物、0.05mMのｐ−フェニルフェノール、0.5mMのＥＤＴＡ、0.0125%のTween 20及び3.3x10^-4Mの化合物４８を含む試薬の１００μＬと２５℃でＨＲＰの3.5x10^-15モルの反応で生じた化学ルミネセンスの時間プロフィールを示すグラフである。
【図１１】 図１１は、0.055Mのトリス緩衝液,pH8.6、0.25mMの尿素過酸化物、0.05mMのｐ−フェニルフェノール、0.5mMのＥＤＴＡ、0.0125%のTween 20及び3.3x10^-4Mの化合物４９を含む試薬の１００μＬと２５℃でＨＲＰの3.5x10^-15モルの反応で生じた化学ルミネセンスの時間プロフィールを示すグラフである。
【図１２】 図１２は、化学ルミネセント試薬組成物によるＰＶＤＦ膜上でのＨＲＰ標識化抗体を経てのβ−ガラクトシダーゼのウェスタンブロットアッセイからのＸ線フィルムの像である。タンパク質の、それぞれ５０００，１０００，１８０，３０及び５ｐｇを含むβ−ガラクトシダーゼの希釈液は、１４分間のインキュベーション後に３０秒間、Ｘ線フィルムにその膜を感光することによって、0.66mMのリン酸アクリダン５、0.05mMのｐ−フェニルフェノール、0.25mMの尿素過酸化物、0.5mMのＥＤＴＡ、0.0125%のTween 20を含む0.055Mのトリス緩衝液pH8.6を含む試薬で検出した。
【図１３】 図１３は、ニトロセルロース膜を用いた同様のウェスタンブロット実験からのＸ線フィルムの像である。その像は、インキュベーション時間１０分の後で５分間Ｘ線フィルムに膜を感光することによって得られた。

Claims (34)

1. ペルオキシダーゼ酵素と、過酸化物及び、式Ｖで表される少なくとも１の化合物とを反応させることを含む、化学ルミネセンス生成方法。
   

   

   ［式中、Ｒ ^６ は、置換した又は未置換のＣ _１ −Ｃ _４ アルキル基、置換した又は未置換のベンジル基、アルコキシアルキル基及びカルボキシアルキル基から選択され、
   Ｒ^７からＲ^１４は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、メトキシ基、エトキシ基およびｔ−ブチル基からなる群から選択され、
   Ｚ ^１ は、ＯおよびＳ原子から選択され、
   Ｘは、１−２０炭素原子の置換した又は未置換のアルキル基、置換した又は未置換のアリール基、置換した又は未置換のアラルキル基、１−２０炭素原子を有する置換した又は未置換のアルキル基又はアリールカルボキシル基、トリ（Ｃ _１ −Ｃ _８ アルキル）シリル基、ＳＯ _３ ⁻ 基、グリコシル基及び式−ＰＯ（ＯＲ′）（ＯＲ”）（式中Ｒ′とＲ”は、１−２０炭素原子の置換した又は未置換のアルキル基、置換した又は未置換のアリール基及び置換した又は未置換のアラルキル基、トリアルキルシリル基及びアルカリ金属カチオンから独立して選択される）のホスホリル基から選択され、
   Ｒ ^１ は、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基および置換アラルキル基からなる群から選ばれ、化学ルミネセンスを生じるためのＣ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ，Ｓｉ及びハロゲン原子から選択される１から５０までの非水素原子を有する有機基である］。
2. Ｒ^７からＲ^１４の少なくとも１つがハロゲン原子、メトキシ基またはエトキシ基であり、Ｒ^７からＲ^１４の残りが水素である請求項１記載の方法。
3. 式Ｖの化合物が、式：
   

   

   ［式中、Ｒ′とＲ”は、１−２０炭素原子の置換した又は未置換のアルキル基、置換した又は未置換のアリール基、置換した又は未置換のアラルキル基、トリアルキルシリル基、及びアルカリ金属カチオンから独立して選択される。］で表される請求項１または２記載の方法。
4. Ｒ′とＲ”がアルカリ金属カチオンである請求項３記載の方法。
5. 式Ｖの化合物が、
   

   

   

   

   

   から選択される請求項１記載の方法。
6. ペルオキシダーゼ酵素と、過酸化物及び、下記式で表される少なくとも１の化合物とを反応させることを含む、化学ルミネセンス生成方法。
   

   

   ［式中、Ｒ^１５は１−２０炭素原子を有する置換した又は未置換のアルキル基又は置換した又は未置換のアリール基であり、
   Ｒ ^６ は、置換した又は未置換のＣ _１ −Ｃ _４ アルキル基、置換した又は未置換のベンジル基、アルコキシアルキル基及びカルボキシアルキル基から選択され、
   Ｒ^７からＲ^１４は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、メトキシ基、エトキシ基およびｔ−ブチル基からなる群から選択され、
   Ｚ ^１ は、ＯおよびＳ原子から選択され、
   Ｒ ^１ は、１から５０までの非水素原子を有する、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基および置換アラルキル基からなる群から選ばれ、化学ルミネセンスを生じるためのＣ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ，Ｓｉ及びハロゲン原子から選択される１から５０までの非水素原子を有する有機基である］。
7. Ｒ^７からＲ^１４のそれぞれが水素原子である請求項６記載の方法。
8. ペルオキシダーゼ酵素と、過酸化物及び、下記式で表される少なくとも１の化合物とを反応させることを含む、化学ルミネセンス生成方法。
   

   

   ［式中、Ｒ′とＲ”は、１−２０炭素原子の置換した又は未置換のアルキル基、置換した又は未置換のアリール基、置換した又は未置換のアラルキル基、トリアルキルシリル基、及びアルカリ金属カチオンから独立して選択され、
   Ｚ ^１ は、ＯおよびＳ原子から選択される］。
9. ペルオキシダーゼ酵素と、過酸化物及び式Ｉで表される少なくとも１の化合物とを反応させることを含む、化学ルミネセンス生成方法。
   

   

   ［式中、Ｘは、１−２０炭素原子の置換した又は未置換のアリール基、及び式−ＰＯ（ＯＲ′）（ＯＲ”）（式中Ｒ′とＲ”は、１−２０炭素原子の置換した又は未置換のアルキル基、置換した又は未置換のアリール基、及びアルカリ金属カチオンから独立して選択される）のホスホリル基から選択され、
   Ｚ^１とＺ^２は、ＯとＳ原子から独立して選択され、
   Ａ^１とＡ^２は、水素原子、アルキル基、置換したアルキル基、アリール基、及び置換したアリール基から独立して選択され、Ａ^１とＡ^２の少なくとも１つが、カルボサイクリック５又は６員環が１〜４個縮合した環を含むアリール基であり、
   Ｒ^１は、１から５０までの非水素原子を有する、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基および置換アラルキル基からなる群から選ばれ、化学ルミネセンス及び式Ａ^１Ａ^２Ｃ＝Ｏ^★を有する電子励起状態化合物を生じるためのＣ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ，Ｓｉ及びハロゲン原子から選択される１から５０までの非水素原子を有する有機基である］
10. 前記Ａ ^１ およびＡ ^２ がとりうるアリール基が、非水素置換体によって置換できるフェニル基、ナフチル基、アントリル基及びピレニル基から選択される請求項９記載の方法。
11. 前記置換が、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基及びＯＹ^１（ここでＹ^１は水素原子又はアルカリ金属イオンである）から選択される置換基による置換である請求項１０記載の方法。
12. 式Ｉの化合物が、構造
    

    

    又は
    

    

    ［式中、Ｙは、水素原子、アルカリ金属イオン又は置換した又は未置換のアルキル基、置換した又は未置換のアリール基、置換した又は未置換のアラルキル基及びトリアルキルシリル基から選択され、Ｙ′は水素原子、アルカリ金属イオン、アルキルカルボキシエステル基、アリールカルボキシエステル基、置換した又は未置換のアルキル基、置換した又は未置換のアリール基、置換した又は未置換のアラルキル基及びトリアルキルシリル基から選択され且つＹ”が水素原子とハロゲン原子から選択される］
    を有する請求項９から１１のいずれかに記載の方法。
13. Ｙが水素原子又はアルカリ金属イオンである請求項１２記載の方法。
14. Ｙ”が塩素原子である請求項１２または１３記載の方法。
15. ペルオキシダーゼ酵素が、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、バナジウムブロモペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、真菌ペルオキシダーゼ、ダイズペルオキシダーゼ、鉄錯体とＭｎ−ＴＰＰＳ_４及びペルオキシダーゼ接合体から選択される請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
16. ペルオキシダーゼ酵素がホースラディッシュペルオキシダーゼである請求項１５の方法。
17. ペルオキシダーゼ接合体が、ハプテン、抗体、タンパク質、核酸及びオリゴヌクレオチドからなる群から選択される生物学的分子に結合したペルオキシダーゼを含む請求項１５記載の方法。
18. 過酸化物が、過酸化水素、尿素過酸化物、ペルオキソホウ酸塩及びアルキルヒドロペルオキシドから選択される請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
19. 化学ルミネセンスを増大する有効量で少なくとも１のエンハンサー化合物を更に含み、エンハンサー化合物が、好ましくは、フェノール化合物、芳香族アミン及びアリールホウ酸化合物から選択される請求項１から１８のいずれかに記載の方法。
20. 非イオン性又はカチオン性界面活性剤を更に含む請求項１から１９のいずれかに記載の方法。
21. ルミネセントエネルギー受容体を更に含む請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
22. （ａ）過酸化物及びペルオキシダーゼ酵素と、少なくとも１つの請求項１から１４のいずれかに記載の化合物とを反応させること；及び
    （ｂ）過酸化物又はペルオキシダーゼのいずれか一方である分析物の存在又は量に、生成した化学ルミネセンスの量を関係付けること、
    を含む、請求項１から１４のいずれかに記載の化学ルミネセンス反応による測定方法中の分析物の存在又は量の検出方法。
23. 分析物が過酸化物またはペルオキシダーゼ酵素である請求項２２記載の方法。
24. （ａ）過酸化物及び特異的結合パートナーに結合したペルオキシダーゼ酵素を含むペルオキシダーゼ接合体と、少なくとも１つの請求項１から１４のいずれかに記載の化合物とを反応させること；及び
    （ｂ）過酸化物又はペルオキシダーゼのいずれか一方である分析物の存在又は量に、生成した化学ルミネセンスの量を関係付けること、
    を含む、請求項１から１４のいずれかに記載の化学ルミネセンス反応による測定方法中の分析物の存在又は量の検出方法。
25. 特異的結合パートナーが、ハプテン、抗原、抗体、核酸及びオリゴヌクレオチドからなる群から選択される請求項２４記載の方法。
26. 免疫アッセイ、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、サザンブロットアッセイおよびノーザンブロットアッセイからなる群から選ばれるアッセイにおいて使用される請求項２４記載の方法。
27. 前記免疫アッセイがサンドイッチアッセイ又は競合アッセイである、請求項２６記載の方法。
28. （ａ）オキシダーゼ酵素とそれによって過酸化水素を生成するための基質とを反応させること；
    （ｂ）該過酸化水素と、ペルオキシダーゼ酵素及び請求項１から１４のいずれかに記載の化合物とを反応させること；及び
    （ｃ）分析物の存在又は量に生成した化学ルミネセンスの量を関係付けること、
    を含む、請求項１から１４のいずれかに記載の化学ルミネセント反応による測定法におけるオキシダーゼ酵素又は該オキシダーゼ酵素の基質から選択される分析物の測定方法。
29. 水溶液中に：
    ａ）請求項１から１４のいずれかに記載の化合物、及び
    ｂ）過酸化物、
    を含む、ペルオキシダーゼ酵素の存在中で請求項１から１４のいずれかに記載の化学ルミネセンスを生じる試薬組成物。
30. フェノール化合物、芳香族アミン及びアリールホウ酸化合物から選択される少なくとも１のエンハンサーを、化学ルミネセンスを増大するための有効量で更に含む請求項２９記載の組成物。
31. 少なくとも１のエンハンサーが、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、ｐ−イミダゾリルフェノール、アセトアミノフェン、２，４−ジクロロフェノール、２−ナフトール及び６−ブロモ−２−ナフトールから選択される請求項３０記載の組成物。
32. ポリオキシエチレン化アルキルフェノール、ポリオキシエチレン化アルコール、ポリオキシエチレン化エーテル及びポリオキシエチレン化ソルビトールエステルから選択される少なくとも１の非イオン性界面活性剤を更に含む請求項３０記載の組成物。
33. カチオン性界面活性剤を更に含む請求項３０から３２のいずれかに記載の組成物。
34. ルミネセンスエネルギー受容体を更に含む請求項３０から３３のいずれかに記載の組成物。

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