KR20010062757A - 화학발광 분석법 - Google Patents

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KR20010062757A
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다쯔끼 마쯔노
히로꼬 사루따
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후꾸야마 마사루
후지레비오 가부시끼가이샤
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Abstract

화학발광의 측정이 효과적이고 정확하게 수행될 수 있는 화학발광 측정 방법에 관한 것이다. 이 방법에서 효소 반응을 수행하는 효소, 화학발광 증진제 그리고 추가로 화학발광 강도 조절제의 존재하에 화학발광 기질의 효소 반응이 수행되고, 이어서 반응 산물로부터 얻어진 화학발광이 측정된다.

Description

화학발광 분석법 {Chemiluminescent Assay}
본 발명은 화학발광 분석이 효과적이고 정확하게 수행될 수 있는 화학발광 분석법에 관한 것이다. 화학발광 분석법은 효과 면역분석에 특히 유용하다.
화학발광 분석법에 의해 시험 시료 중의 표적 물질을 신속하면서도 고감도로 검출하고 정량화할 수 있어서, 이 분석법은 HIV 및 HCV와 같은 바이러스, 및 체네의 다른 흔적 성분을 측정하는데 널리 사용된다.
화학발광 화합물중, 1,2-디옥세탄이 화학발광 기질로서 주목을 끌고 있다. 기질로서의 1,2-디옥세탄이 효소 반응되고 방출된 화학발광이 측정되는 화학발광 분석에 대한 감도 또는 취급 용이성이 다각적으로 개선되어 왔다.
1,2-디옥세탄을 화학발광 기질로서 사용하는 화학발광 분석에 대해서, 화학발광 분석의 감도를 증진시키고자 하는 연구가 활발하게 진행되었고 분석 감도를 증진시키기 위해 화학발광의 강도를 증가시키는 각종의 화학발광 증진제가 발견되어 왔다. 이같은 화학발광 증진제의 대표적인 예는 폴리비닐벤질트리부틸암모늄 클로라이드 (이후 "TBQ"로도 칭함) (일본 특허 출원 공개 공보 제4-124185호 참조)이고, 화학발광 증진제로서 TBQ를 사용하는 화학발광 분석에서 화학발광 강도를 증가시키기 위한 다각적인 개선안이 제안되어 왔다.
이같은 화학발광 증진제를 사용하는 분석 시스템에서, 효소 농도가 낮을 때 화학발광 증진 효율이 매우 높은 반면 효소 농도가 일정 수준을 초과할 때 화학발광 증진 효율이 점진적으로 감소하기 때문에, 효소 농도와 방출된 화학발광 강도 간의 관계는 선형이지도 비례하지도 않는다. 따라서, 분석에 검정 곡선을 사용하는 것이 어렵기 때문에 효소 농도 측정이 효과적이고 정확하게 수행될 수 없었다. 검정 곡선의 비례성을 개선시키기 위한 대응책은 제안되지 않고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 효소 농도와 방출된 화학발광 강도간의 비례성이 증가된 화학발광 분석법을 제공하는 것이다.
도 1은 화학발광 강도 조절제가 사용되지 않은 비교예 1에서 얻어진 검정 곡선.
도 2는 화학발광 강도 조절제로서 상이한 농도의 MTAB가 사용된 실시예 1에서 얻어진 검정 곡선.
도 3은 실시예 1 또는 비교예 1에서 얻어진 각 검정 곡선의 AFP 농도와 기울기 간의 관계도.
도 4는 화학발광 강도 조절제로서 DTAB가 사용된 실시예 2에서 얻어진 검정 곡선.
도 5는 화학발광 강도 조절제로서 CTAB가 사용된 실시예 3에서 얻어진 검정 곡선.
도 6은 화학발광 강도 조절제로서 STAB가 사용된 실시예 4에서 얻어진 검정 곡선.
도 7은 화학발광 강도 조절제로서 MTAC가 사용된 실시예 5에서 얻어진 검정 곡선.
도 8은 화학발광 강도 조절제로서 BDMAC가 사용된 실시예 6에서 얻어진 검정 곡선.
도 9는 화학발광 강도 조절제로서 MTAB와 DTAB가 사용된 실시예 7에서 얻어진 검정 곡선.
도 10은 화학발광 강도 조절제로서 MTAB와 CTAB가 사용된 실시예 8에서 얻어진 검정 곡선.
도 11은 화학발광 강도 조절제로서 MTAB와 BDMAC가 사용된 실시예 9에서 얻어진 검정 곡선.
본 발명자들은 면밀히 연구하여 반응계에 화학발광 강도 조절제를 공존시킴으로써 효소 농도와 방출된 화학발광 강도간의 선형성 또는 비례성이 증가됨을 밝혀내고 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 효소 반응을 수행하는 효소, 화학발광 증진제 및 화학발광 강도 조절제의 존재하에 화학발광 기질을 효소 반응시키고, 반응 산물로부터 얻어진 화학발광을 측정하는 것을 포함하는 화학발광 분석법을 제공한다.
본 발명에 의해, 화학발광 분석에서 효소 농도와 방출된 화학발광의 강도 간의 선형성 또는 비례성이 증가된다. 따라서, 공지된 화학발광 분석법에 비해 보다 효율적이고 보다 정확하게 화학발광 분석이 수행될 수 있다.
<본 발명을 수행하기 위한 최적의 방법>
본 발명의 가장 특징적인 사항은 화학발광 강도 조절제를 사용하는 것이다. 본 발명에 사용될 수 있는 바람직한 화학발광 강도 조절제는 화학식 3으로 나타낸다.
(상기 식에서,
R15는 C8-C22알킬을 나타내고,
R16, R17및 R18은 독립적으로 C1-C6알킬 또는 C7-C12아르알킬을 나타내고,
X는 할로겐을 나타낸다.)
상기 화학식 3에서, R15에 대한 C8-C22알킬 및 R16, R17및 R18에 대한 C1-C6알킬은 선형 또는 분지형일 수 있고, 선형 알킬기가 바람직하다. C8-C22알킬기 중에서 라우릴, 미리스틸, 세틸 및 스테아릴기와 같은 C10-C18알킬기가 바람직하다.C1-C6알킬기 중에서, C1-C3알킬기, 즉 메틸, 에틸 및 프로필기가 바람직하다. C7-C12아르알킬기 중에서, C1-C6알킬, 바람직하게는 직쇄 알킬이 벤질, 페닐에틸 및 페닐프로필과 같은 페닐로 치환된 것이 바람직하다.
본 발명에 사용될 수 있는 화학발광 강도 조절제의 바람직한 구체예로는 미리스틸트리메틸암모늄 브로마이드 (이후 "MTAB"로도 칭함), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 (이후 "CTAB"로도 칭함), 라우릴트리메틸암모늄 브로마이드 (이후 "DTAB"로도 칭함), 스테아릴트리메틸암모늄 브로마이드 (이후 "STAB"로도 칭함), 미리스틸트리메틸암모늄 클로라이드 (이후 "MTAC"로도 칭함) 및 벤질디메틸미리스틸암모늄 클로라이드 (이후 "BDMAC"로도 칭함)를 들 수 있다. 이들 화학발광 강도 조절제가 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
이 중에서, MTAB는 효소 농도와 방출된 화학발광 강도 간의 비례성이 높기 때문에 특히 바람직하다.
사용되는 화학발광 강도 조절제의 양은 화학발광 강도 조절제가 사용되지 않은 경우와 비교해서 효소 농도와 방출된 화학발광의 강도간의 비례성이 현저히 증가되고 화학발광 분석의 감도가 현저히 감소하지 않는 양이다. 화학발광 강도 조절제의 양이 너무 작으면, 효소 농도와 방출된 화학발광 강도 간의 비례성을 향상시키는 효과가 얻어지지 않는다. 한편, 화학발광 강도 조절제의 양이 너무 많으면, 화학발광 증진제에 의해서 야기되는 화학발광 방출의 증진이 저해된다.
일반적으로, 사용된 화학발광 강도 조절제의 양은 TBQ와 같은 사용된 화학발광 증진제의 1/40 내지 동량, 보다 바람직하게는 사용된 화학발광 증진제의 1/5 내지 1/2이다.
본 발명에 따른 화학발광 분석법에서, 통상의 화학발광 분석법에 사용되는 임의의 화학발광 기질이 사용될 수 있다.
바람직한 화학발광 기질 군은 하기 화학식 1로 나타낸다.
(상기 식에서,
R1은 수소 또는 할로겐을 나타내고,
R2는 C1-C6알킬 또는 C3-C6시클로알킬을 나타내고,
Ar1은 페닐렌 또는 나프틸렌을 나타내고,
R3은 화학식 -OPO3 2-·2M+(여기서, M은 나트륨, 칼륨 또는 NH4를 나타낸다)의 기 또는 갈락토실기를 나타낸다.)
상기 화학식 1에서, R1은 수소 원자, 또는 염소, 브롬 또는 요오드 원자와 같은 할로겐 원자이다. R2는 직선형 또는 분지형일 수 있는 메틸, 에틸, 프로필,부틸, 펜틸 또는 헥실기와 같은 C1-C6알킬기; 또는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸 또는 시클로헥실과 같은 C3-C6시클로알킬기이다. Ar1은 페닐렌 또는 나프틸렌과 같은 방향족 탄화수소기이다.
화학식 1로 나타내는 바람직한 화학발광 기질의 구체예로는 디소듐 3-[4-메톡시스피로(1,2-디옥세탄-3,2'-트리시클로[3,3,1.13.7]데칸)-4-일]페닐 포스페이트 (이후 "AMPPD"라고도 칭함), 디소듐 7-[4-메톡시스피로(1,2-디옥세탄-3,2'-트리시클로[3,3,1.13.7]데칸-4-일]나프틸-2-일 포스페이트, 3-[4-메톡시스피로(1,2-디옥세탄-3,2'-트리시클로[3,3,1.13.7]데칸)-4-일]페닐 β-D-갈락토피라노즈, 디소듐 3-[4-메톡시스피로[1,2-디옥세탄-3,2'-(5'-클로로)트리시클로[3,3,1.13.7]데칸-4-일]페닐 포스페이트, 및 3-[4-메톡시스피로[1,2-디옥세탄-3,2'-(5'-클로로)트리시클로[3,3,1.13.7]데칸]-4-일]페닐 β-D-갈락토피라노즈를 들 수 있다.
상기 화학발광 기질 중에서, AMPPD가 임상 진단 분야에서 널리 사용된다는 관점에서 특히 바람직하다.
화학발광 기질로서,하기 화학식 2로 나타내는 기질이 또한 바람직하다.
(상기 식에서,
R4, R5및 R6은 독립적으로 C1-C6알킬 또는 C3-C6시클로알킬을 나타내고,
Ar2는 하기 화학식 4a, 4b, 또는 4c의 기를 나타낸다.)
(상기 식에서,
R7은 -OPO3 2-·2M+(여기서, M은 나트륨, 칼륨 또는 NH4를 나타낸다)의 기 또는 갈락토실기를 나타내고,
R8은 수소, 치환될 수 있는 C1-C20알킬, 치환될 수 있는 C3-C20시클로알킬, 5 내지 20원의 아릴, 히드록실, C1-C20알콕시, C2-C20알콕시알콕실, C3-C20알콕시알콕시알콕실, C6-C20아릴옥시 또는 C7-C20아르알킬옥시를 나타내고,
V는 산소 또는 황을 나타낸다.)
(상기 식에서,
R7은 상기 화학식 4a에서 정의된 것과 동일한 의미를 나타내고,
W은 C-R9이고, 여기서, R9는 수소, 치환될 수 있는 C1-C20알킬, 치환될 수 있는 C3-C20시클로알킬, 5 내지 20원의 아릴, C1-C20알콕시, C2-C20알콕시알콕실, C3-C20알콕시알콕시알콕실 또는 C7-C20아르알킬옥시를 나타내고,
X는 산소 또는 황을 나타낸다.)
(상기 식에서,
R7은 상기 화학식 4a에서 정의된 것과 동일한 의미를 나타내고,
Y는 산소, 황 또는 N-R10을 나타내고,
Z는 수소, 치환될 수 있는 C1-C20알킬, 치환될 수 있는 C3-C20시클로알킬, 5내지 20원의 아릴, -OR11, -SR12또는 하기 화학식 4d
의 기를 나타내고,
R10은 수소, 치환될 수 있는 C1-C20알킬, 치환될 수 있는 C3-C20시클로알킬, 5 내지 20원의 아릴, 히드록실, C1-C20알콕실, C2-C20알콕시알콕실, C3-C20알콕시알콕시알콕실을 나타내고,
R11, R12, R13및 R14는 독립적으로 수소, 치환될 수 있는 C1-C20알킬, 치환될 수 있는 C3-C20시클로알킬, 또는 5 내지 20원의 아릴을 나타내고,
단 (i) R10과 R11, (ii) R10과 R12, (iii) R10과 R13, 또는 (iv) R13과 R14는 2개 이상의 헤테로 고리를 함유할 수 있는 고리를 함께 형성할 수 있다.)
상기 화학식 2에 의해 나타내는 1,2-디옥세탄 유도체에서, C1-C6알킬은 직선형 또는 분지형일 수 있는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸 또는 헥실일 수 있고, C3-C6시클로알킬은 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸 또는 시클로헥실일 수 있다.
상기 화학식 4a, 4b, 4c 및 4d 중의 상기 치환될 수 있는 C1-C20알킬이 직선형 또는 분지형의 치환되지 않은 C1-C20알킬, 즉 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실, 트리데실, 테트라데실, 펜타데실, 헥사데실, 헵타데실, 옥타데실, 노나데실 또는 에이코사닐기이거나, 또는 히드록실기 1 내지 5개, C1-C20알콕실기 1 내지 5개, C2-C20알콕시알콕시기 1 내지 5개, C3-C20알콕시알콕시알콕실기 1 내지 5개, 및(또는) 5 내지 20원의 아릴기 1 내지 5개에 의해 치환된 상기한 바와 같은 직선형 또는 분지형 C1-C20알킬이다. 여기서, C1-C20알콕실기, C2-C20알콕시알콕실기, 및 C3-C20알콕시알콕시알콕실기가 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, 펜틸옥시, 헥실옥시, 메톡시에톡시, 메톡시프로폭시, 에톡시에톡시, 에톡시프로폭시, 메톡시에톡시에톡시와 같은 직선형 또는 분지형의 알콕시 함유기일 수 있다. 알킬기 상에 치환된 5 내지 20원의 아릴기가 페닐 또는 나프틸과 같은 C6-C20방향족 탄화수소기이거나, 또는 질소, 산소 및 황 원자로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로 원자 1 내지 5개를 고리 중에 함유하는 5 내지 20원의 헤테로아릴기, 예를 들어 푸릴, 티에닐 또는 피리딜일 수 있다.
상기 화학식 4a, 4b, 4c 및 4d 중의 치환될 수 있는 C3-C20시클로알킬이 치환되지 않은 C3-C20시클로알킬, 즉 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 시클로노닐, 시클로데실, 시클로운데실, 시클로도데실, 시클로트리데실, 시클로테트라데실, 시클로펜타데실, 시클로헥사데실, 시클로헵타데실, 시클로옥타데실, 시클로노나데실 또는 시클로에이코사닐기이거나, 또는 히드록실기 1 내지 5개, C1-C20알콕실기 1 내지 5개, C2-C20알콕시알콕실기 1 내지 5개, C3-C20알콕시알콕시알콕실기 1 내지 5개, 및(또는) 5 내지 20원의 아릴기 1 내지 5개에 의해 치환된 C3-C20시클로알킬기일 수 있다. 알킬기 상의 치환체에 대한 상기 설명이 이들 시클로알킬기 상의 치환체에도 동일하게 적용된다.
상기 화학식 4a, 4b, 4c 및 4d 중의 C1-C20알콕실, C2-C20알콕시알콕실 또는 C3-C20알콕시알콕시알콕실 및 아릴에 대해서, 알킬기 상의 치환체에 대한 상기 설명이 동일하게 적용된다.
상기 화학식 4a, 4b, 4c 및 4d 중의 C6-C20아릴옥시는 예를 들어 페녹시, 나프톡시 등일 수 있고, C7-C20아랄킬옥시는 예를 들어 벤질옥시, 페네틸옥시 등일 수 있다.
상기 화학식 2 중의 Ar2가 화학식 3으로 나타내는 경우, 화학식 3 중의 Y는 바람직하게는 산소이고, Z 중의 R13과 R14는 바람직하게는 3 내지 7원의 고리를 함께 형성하고, 보다 바람직하게는 Z는 화학식의 기이다.
상기 화학식 2 중의 Ar2가 화학식 3으로 나타내는 경우, Y는 또한 바람직하게는 N-R10이고, Z는 바람직하게는 -OR11이고, R10과 R11은 바람직하게는 3 내지 7원의 고리를 함께 형성할 수 있다. 이 경우, 보다 바람직하게는, R10과 R11은 화학식의 기이다.
상기한 화학발광 기질은 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
사용되는 화학발광 기질의 양은 제한되지 않고 화학발광 기질이 화학발광 분석되는 용액 중에 용해될 수 있는 범위에서 사용될 수 있다. 일반적으로, 화학발광 기질은 반응 용액 중에 0.2 내지 0.8 mg/ml의 농도로 사용된다.
화학발광 분석에 사용되는 임의의 공지된 화학발광 증진제가 본 발명의 방법에 화학발광 증진제로서 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 화학발광 증진제의 바람직한 예로는 TBQ, 폴리비닐벤질트리메틸암모늄 클로라이드, 폴리비닐벤질벤질디메틸암모늄 클로라이드, 벤질디메틸세틸암모늄 클로라이드, 폴리메타크릴아미드프로필렌메틸암모늄 클로라이드, 폴리비닐피롤리돈, 1,5-디메틸-1,5-디아조-운데카메틸렌폴리메토 브로마이드, 폴리메틸렌 이민, 폴리-L-리신 및 폴리디알릴디메틸암모늄 클로라이드를 들 수 있다. 이들 화학발광 증진제 중에서, 폴리비닐 중합체, 폴리메타크릴산 중합체, 폴리메틸렌 이민 및 폴리-L-리신과 같은 중합체는 일반적으로 약 10,000 내지 1,000,000의 분자량을 가질 수 있으나, 이런 중합체의 분자량에 제한되지 않는다. 상기한 화학발광 증진제 중에서, TBQ는 매우 강한 화학발광 증진성을 갖고 1,2-디옥세탄 화합물에 대한 화학발광 증진제로서 널리 사용되기 때문에 특히 바람직하다. 이런 화학발광 증진제는 개별적으로 또는 조합되어 사용될 수 있다.
사용되는 화학발광 증진제의 양은 제한되지 않으나, 화학발광 증진제가 화학발광 분석될 용액 중에 용해될 수 있는 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로, 화학발광 증진제는 반응 용액 중에서 0.4 내지 1.6 mg/ml의 농도로 사용된다.
효소로서, 산 포스파타제, 알칼리 포스파타제 또는 갈락토시다제가 바람직하게 사용될 수 있다. 이들 효소는 공지된 방법에 의해 동물 및 식물로부터 정제될 수 있고, 또한 시판된다. 시판되는 효소가 본 발명에 용이하게 사용될 수 있다.
효소는 유리된 상태이거나, 항원, 항체, 합텐(hapten) 등과 같은 다른 물질에 결합된 상태일 수 있다.
본 발명에 따른 화학발광 분석은 상기한 화학발광 강도 조절제가 반응계에 공존하는 것을 제외하고는 당업계에 공지된 통상의 화학발광 분석과 동일한 방법에 의해 수행될 수 있다. 즉, 화학발광 분석은 바람직하게는 실온 내지 약 40℃, 보다 바람직하게는 사용된 효소의 최적 온도 부근에서 사용될 수 있다. 반응 시간은 제한되지 않고, 일반적으로 1분 내지 60분, 바람직하게는 3분 내지 20분일 수 있다. 반응 매질은 통상의 화학발광 분석에서 효소 반응에 적합한 PBS와 같은 완충액일 수 있고, 이의 pH는 바람직하게는 사용된 효소의 최적 pH 근처일 수 있다. 반응 산물로부터의 화학발광은 통상의 화학발광 분석에서와 같이 공지되고 시판되는 광계수기를 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명에 따른 화학발광 분석에서, 상기한 화학발광 강도 조절제의 존재하에 화학발광 분석을 수행할 필요가 있다. 화학발광 강도 조절제에 의해, 화학발광 증진제에 의한 화학발광 강도 증진 효율은 효소 농도에 상관없이 실질적으로 동일하게 되어 효소 농도와 방출된 화학발광 강도 간의 관계는 거의 비례 또는 선형 관계이다. 주목할 점은 화학발광 강도 조절제는 화학발광 강도를 다소 감소시킴으로써 효소 농도와 방출된 화학발광 강도 간의 관계가 비례 관계에 보다 근접해지도록 하고, 화학발광 강도를 증가시키지 않는다는 것이다.
본 발명에 따른 화학발광 분석은 통상의 화학발광 분석이 적용되는 임의의 분야에 적용될 수 있다. 적용되는 분야 중에서, 효소 면역 분석이 중요한 분야이다. 효소 면역분석 자체는 당업계에 공지되어 있다. 효소 면역분석에서, 효소는 항원, 항체, 합텐 등에 결합된 라벨 또는 마커로서 사용되고, 효소는 화학발광 기질이 화학발광을 방출하게 되거나 화학발광의 강도를 변화시키게 되는 효소 반응을 사용하여 검출되거나 정량화된다. 효소 면역분석에 화학발광 분석을 사용하는 것이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 효소 면역분석의 대표적인 예인 전형적인 샌드위치 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay: 효소 결합된 면역흡수 분석)에서, 제1 항체가 고상에 고정되고 제1 항체에 특이적인 정량화된 항원이 제1 항체와 반응한다. 세척후, 효소에 의해 분류되고 항원에 대해 특이적인 제2 항체가, 포획된 항원과 반응한다. 세척후, 포획된 제2 항체, 즉 포획된 효소가 화학발광 분석에 의해 정량화된다. 주목할 점은 상기한 샌드위치 ELISA는 단지 일예이고 샌드위치 ELISA 또는 효소 면역분석이 이 예에 제한되지 않는다는 것이다.
효소 면역분석에서, 검출되거나 정량화되는 표적 물질은 전혀 제한되지 않고, 예를 들어 호르몬, 효소, 단백질, 시토킨, 세균성 세포, 바이러스 등 뿐만 아니라 이들 항원에 대한 항체일 수 있다. 효소 면역분석될 시료가 또한 제한되지 않고, 예를 들어 혈액, 플라즈마, 유액, 소변 및 조직액과 같은 체액, 및 음식물일 수 있다.
면역분석에서, 항체가 다클론 항체 또는 단클론 항체일 수 있고, 단클론 항체가 특이성의 관점에서 바람직하다. 단클론 항체는 콜러(Kohler)와 밀스테인(Milstein)에 따른 통상의 방법에 의해 제조될 수 있다 ([Nature, 256, 495 (1975)] 참조). 제조된 항체가 통상의 방법에 의해 정제될 수 있다. 정제된 항체는 그 자체로 또는 Fab 프레그먼트 또는 F(ab')2프레그먼트와 같은 항원 결합 프레그먼트로 분열된 후 사용될 수 있다.
이제는 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.
비교예 1
항원으로서의 α-페토프로틴(AFP)은, 자성 입자를 사용하고 이 자성 입자에 단클론 항-AFP 항체가 고상으로서 결합되고, 알칼리 포스파타제 (이후 "ALP"라고도 함)-결합된 단클론 항-AFP 항체가 분류된 항체로서 결합되는 다음과 같은 2단계 샌드위치 효소 면역분석에 의해 정량화되었다:
화학발광 기질로서 AMPPD 0.2 mg/㎖, 화학발광 증진제로서 TBQ 0.4 mg/㎖, 0.1M 디에탄올아민 (DEA), 1mM 염화마그네슘 및 0.05% 소듐 아지드 (NaN3) (pH 10.0)를 함유하는 수성 기질 용액을 제조하였다.
각각 AFP 0, 10, 100, 800 및 2000 ng/㎖를 함유하는 시료를 BSA 용액 10배 부피로 희석하였다. 이들 용액 각각의 20 ㎕ 부분 표본을 항-AFP 항체-결합된 자성 입자의 0.015 중량% 현탁액 250 ㎕에 첨가하고, 교반후 각 반응 혼합물을 반응 용기에서 37 ℃에서 10분 동안 반응시켰다. 이어서, 반응 용기를 자석과 접촉시켜서 자성 입자를 수집하고, 수집된 자성 입자를 세척하였다. 이어서, 0.1 μg/㎖ ALP-결합된 항-AFP 항체 용액 250 ㎕를 입자에 첨가하고, 얻어진 혼합물을 37 ℃에서 10분 동안 반응시켰다. 이어서, 반응 용기를 자석과 접촉시켜 자성 입자를 수집하고, 수집된 자성 입자를 세척하였다. 세척된 입자에 상기한 기질 용액 200 ㎕를 첨가하고 혼합하였다. 반응 혼합물을 37 ℃에서 5분 동안 반응시키고, 방출된 화학발광 강도를 광계수기로 측정하였다. 얻어진 검정 곡선을 도 1에 나타낸다.
실시예 1
기질 용액이 화학발광 강도 조절제로서 MTAB 0.08 mg/㎖ 또는 0.16 mg/㎖을 함유한 것을 제외하고는 비교예 1과 동일한 절차를 반복하였다.
얻어진 검정 곡선을 도 2에 나타낸다. AFP 농도와 각 검정 곡선의 기울기 간의 관계를 도 3에 나타낸다. 도 3에, 비교예 1의 결과를 또한 나타낸다.
도 3에 나타낸 바와 같이, MTAB가 화학발광 강도 조절제로서 사용된 실시예 1에서 얻어진 검정 곡선의 기울기가 거의 동일한 반면, 비교예 1에서 얻어진 기울기는 AFP 농도에 따라 명백히 변한다. 이는 본 발명에 따라 효소 농도와 방출된 화학발광 강도 간의 관계가 비례 관계에 가까운 반면, 화학발광 강도 조절제를 사용하지 않는 통상의 방법에 의해 얻어진 관계는 그렇지 않았다.
실시예 2
기질 용액이 화학발광 강도 조절제로서 MTAB 대신에 DTAB 0.01 mg/㎖를 함유하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 절차를 반복하였다. 결과를 도 4에 나타낸다.
실시예 3
기질 용액이 화학발광 강도 조절제로서 MTAB 대신에 CTAB 0.01 mg/㎖를 함유하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 절차를 반복하였다. 결과를 도 5에 나타낸다.
실시예 4
기질 용액이 화학발광 강도 조절제로서 MTAB 대신에 STAB 0.04 mg/㎖를 함유하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 절차를 반복하였다. 결과를 도 6에 나타낸다.
실시예 5
기질 용액이 화학발광 강도 조절제로서 MTAB 대신에 MTAC 0.08 mg/㎖를 함유하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 절차를 반복하였다. 결과를 도 7에 나타낸다.
실시예 6
기질 용액이 화학발광 강도 조절제로서 MTAB 대신에 BDMAC 0.08 mg/㎖를 함유하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 절차를 반복하였다. 결과를 도 8에 나타낸다.
실시예 7
기질 용액이 화학발광 강도 조절제로서 MTAB 0.04 mg/㎖ 및 DTAB 0.04 mg/㎖를 함유하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 절차를 반복하였다. 결과를 도 9에 나타낸다.
실시예 8
기질 용액이 화학발광 강도 조절제로서 MTAB 0.04 mg/㎖ 및 CTAB 0.04 mg/㎖를 함유하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 절차를 반복하였다. 결과를 도 10에 나타낸다.
실시예 9
기질 용액이 화학발광 강도 조절제로서 MTAB 0.04 mg/㎖ 및 BDMAC 0.04 mg/㎖를 함유하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 절차를 반복하였다. 결과를 도 11에 나타낸다.
본 발명에 의해 효소 농도와 방출된 화학발광 강도간의 비례성이 증가되어, 효소 농도 측정이 효과적이고 정확하게 수행될 수 있다.

Claims (19)

  1. 효소 반응을 수행하는 효소, 화학발광 증진제 및 화학발광 강도 조절제의 존재하에 화학발광 기질을 효소 반응시키고, 반응 산물로부터 얻어진 화학발광을 측정하는 것을 포함하는(comprising) 화학발광 분석법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화학발광 강도 조절제가 하기 화학식 3으로 나타내는 것인 분석법.
    <화학식 3>
    (상기 식에서,
    R15는 C8-C22알킬을 나타내고,
    R16, R17및 R18은 독립적으로 C1-C6알킬 또는 C7-C12아르알킬을 나타내고,
    X는 할로겐을 나타낸다.)
  3. 제2항에 있어서, 상기 화학발광 강도 조절제가 미리스틸트리메틸암모늄 브로마이드, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, 라우릴트리메틸암모늄 브로마이드, 스테아릴트리메틸암모늄 브로마이드, 미리스틸트리메틸암모늄 클로라이드 및 벤질디메틸미리스틸암모늄 클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것인 분석법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 화학발광 강도 조절제가 미리스틸트리메틸암모늄 브로마이드인 분석법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학발광 기질의 농도가 0.2 내지 0.8 mg/ml이고, 상기 화학발광 증진제의 농도가 0.4 내지 1.6 mg/ml이고, 상기 화학발광 강도 조절제의 중량이 상기 화학발광 증진제 중량의 1/40 내지 동량인 분석법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 화학발광 강도 조절제의 중량이 상기 화학발광 증진제 중량의 1/5 내지 1/2인 분석법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학발광 기질이 하기 화학식 1의 1,2-디옥세탄 유도체인 분석법.
    <화학식 1>
    (상기 식에서,
    R1은 수소 또는 할로겐을 나타내고,
    R2는 C1-C6알킬 또는 C3-C6시클로알킬을 나타내고,
    Ar1은 페닐렌 또는 나프틸렌을 나타내고,
    R3은 화학식 -OPO3 2-·2M+(여기서, M은 나트륨, 칼륨 또는 NH4를 나타낸다)의 기 또는 갈락토실기를 나타낸다.)
  8. 제7항에 있어서, R1이 수소이고 Ar3이 3-페닐렌기인 분석법.
  9. 제8항에 있어서, R2가 메틸이고 R3이 -OPO3 2-·2Na+인 분석법.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학발광 기질이 하기 화학식 2로 나타내는 것인 분석법.
    <화학식 2>
    (상기 식에서,
    R4, R5및 R6은 독립적으로 C1-C6알킬 또는 C3-C6시클로알킬을 나타내고,
    Ar2는 하기 화학식 4a, 4b, 또는 4c의 기를 나타낸다.)
    <화학식 4a>
    (상기 식에서,
    R7은 -OPO3 2-·2M+(여기서, M은 나트륨, 칼륨 또는 NH4를 나타낸다)의 기 또는 갈락토실기를 나타내고,
    R8은 수소, 치환될 수 있는 C1-C20알킬, 치환될 수 있는 C3-C20시클로알킬, 5 내지 20원의 아릴, 히드록실, C1-C20알콕시, C2-C20알콕시알콕실, C3-C20알콕시알콕시알콕실, C6-C20아릴옥시 또는 C7-C20아르알킬옥시를 나타내고,
    V는 산소 또는 황을 나타낸다.)
    <화학식 4b>
    (상기 식에서,
    R7은 상기 화학식 4a에서 정의된 것과 동일한 의미를 나타내고,
    W은 C-R9이고, 여기서, R9는 수소, 치환될 수 있는 C1-C20알킬, 치환될 수 있는 C3-C20시클로알킬, 5 내지 20원의 아릴, C1-C20알콕시, C2-C20알콕시알콕실, C3-C20알콕시알콕시알콕실 또는 C7-C20아르알킬옥시를 나타내고,
    X는 산소 또는 황을 나타낸다.)
    <화학식 4c>
    (상기 식에서,
    R7은 상기 화학식 4a에서 정의된 것과 동일한 의미를 나타내고,
    Y는 산소, 황 또는 N-R10을 나타내고,
    Z는 수소, 치환될 수 있는 C1-C20알킬, 치환될 수 있는 C3-C20시클로알킬, 5내지 20원의 아릴, -OR11, -SR12또는 하기 화학식 4d
    <화학식 4d>
    의 기를 나타내고,
    R10은 수소, 치환될 수 있는 C1-C20알킬, 치환될 수 있는 C3-C20시클로알킬, 5 내지 20원의 아릴, 히드록실, C1-C20알콕실, C2-C20알콕시알콕실, C3-C20알콕시알콕시알콕실을 나타내고,
    R11, R12, R13및 R14는 독립적으로 수소, 치환될 수 있는 C1-C20알킬, 치환될 수 있는 C3-C20시클로알킬, 또는 5 내지 20원의 아릴을 나타내고,
    단 (i) R10과 R11, (ii) R10과 R12, (iii) R10과 R13, 또는 (iv) R13과 R14는 2개 이상의 헤테로 고리를 함유할 수 있는 고리를 함께 형성할 수 있다.)
  11. 제10항에 있어서, 상기 화학식 4c 중의 Y가 산소이고, Z 중의 R13과 R14가 3 내지 7원의 고리를 함께 형성하는 것인 분석법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 화학식 4c 중의 Z가 화학식의 기인 분석법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 화학식 4c 중의 Y가 N-R10이고, Z가 -OR11이고, R10과 R11이 3 내지 7원의 고리를 함께 형성하는 것인 분석법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 화학식 4c 중의 R10과 R11에 의해 함께 형성된 고리가 화학식의 기인 분석법.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 4a, 4b, 4c 및 4d 중의 상기 치환될 수 있는 C1-C20알킬이 치환되지 않은 C1-C20알킬기이거나, 또는 히드록실기 1 내지 5개, C1-C20알콕실기 1 내지 5개, C2-C20알콕시알콕시기 1 내지 5개, C3-C20알콕시알콕시알콕실기 1 내지 5개, 및(또는) 5 내지 20원의 아릴기 1 내지 5개에 의해 치환된 C1-C20알킬기이고,
    상기 치환될 수 있는 C3-C20시클로알킬이 치환되지 않은 C3-C20시클로알킬기이거나, 또는 히드록실기 1 내지 5개, C1-C20알콕실기 1 내지 5개, C2-C20알콕시알콕시기 1 내지 5개, C3-C20알콕시알콕시알콕실기 1 내지 5개, 및(또는) 5 내지 20원의 아릴기 1 내지 5개에 의해 치환된 C3-C20시클로알킬기이고,
    상기 화학식 4a, 4b, 4c 및 4d 중의 상기 5 내지 20원의 아릴기가 C6-C20방향족 탄화수소기이거나, 또는 질소, 산소 및 황 원자로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로 원자 1 내지 5개를 고리 중에 함유하는 5 내지 20원의 헤테로아릴기이다.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학발광 증진제가 폴리비닐벤질트리부틸암모늄 클로라이드, 폴리비닐벤질트리메틸암모늄 클로라이드, 폴리비닐벤질벤질디메틸암모늄 클로라이드, 벤질디메틸세틸암모늄 클로라이드, 폴리메타크릴아미드프로필렌메틸암모늄 클로라이드, 폴리비닐피롤리돈, 1,5-디메틸-1,5-디아조-운데카메틸렌폴리메토 브로마이드, 폴리메틸렌 이민, 폴리-L-리신 및 폴리디알릴디메틸암모늄 클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것인 분석법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 화학발광 증진제가 폴리비닐벤질트리부틸암모늄 클로라이드인 분석법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소가 산 포스파타제, 알칼리 포스파타제 또는 갈락토시다제인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 면역분석에 사용되는 분석법.
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