KR20220010543A - 숙주 세포 단백질 동정 및 정량화 방법 - Google Patents

숙주 세포 단백질 동정 및 정량화 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20220010543A
KR20220010543A KR1020217041357A KR20217041357A KR20220010543A KR 20220010543 A KR20220010543 A KR 20220010543A KR 1020217041357 A KR1020217041357 A KR 1020217041357A KR 20217041357 A KR20217041357 A KR 20217041357A KR 20220010543 A KR20220010543 A KR 20220010543A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
interest
sample
antibody
capillaries
Prior art date
Application number
KR1020217041357A
Other languages
English (en)
Inventor
니샤 팔라칼
쿤 루
에리카 필레
Original Assignee
리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. filed Critical 리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
Publication of KR20220010543A publication Critical patent/KR20220010543A/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G01N33/561—Immunoelectrophoresis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
    • G01N27/44721—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means
    • G01N27/44726—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means using specific dyes, markers or binding molecules
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44743—Introducing samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • G01N27/44795—Isoelectric focusing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
    • G01N2333/918—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
    • G01N2333/918—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • G01N2333/92—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96472—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/978—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • G01N2333/98—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2828—Prion diseases

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

물리적 파라미터에 의해 샘플 내 오염되는 단백질 또는 다수의 오염되는 단백질의 변이체를 검출 및/또는 구분하는 방법으로서, 상기 방법이 모세관 전기영동을 사용하여 하나 이상의 모세관 내 분자량 또는 전하에 의해 샘플의 단백질 성분을 분리하는 단계; 상기 하나 이상의 모세관 내 샘플의 단백질 성분을 고정화하는 단계; 상기 하나 이상의 모세관 내 단백질 성분을, 샘플 내 오염되는 단백질 또는 다수의 오염되는 단백질에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 1차 항체와 접촉시켜서, 샘플 내 변이체를 검출하고/하거나 구분하는 단계를 포함하는 검출 및/또는 구분 방법.

Description

숙주 세포 단백질 동정 및 정량화 방법
본 발명은 생체의약품에 관한 것이며, 숙주 세포 단백질 오염물질을 포함한 생체의약품 제조물 내 오염물질 폴리펩타이드를 검출하기 위한 모세관 전기영동의 용도에 관한 것이다.
단클론 항체 (mAb)는 중요한 부류의 생물치료제이며, 이것들은 많은 생명 위협 및 만성 질환의 치료에서 뛰어난 성공을 이루어왔다. 그러나, mAb는 크기 및 전하 변이체, 상이한 글리코실화 패턴을 포함한 다양한 번역 후 변형, 및 N 및 C 말단 이질성(heterogeneity)을 갖는 생물학적 거대분자의 고도로 복잡한 혼합물로부터 정제된다. 따라서, 각각의 개별적인 단클론 항체 제조물은, 최종 제품의 개발 및 제조 둘 모두 동안 이러한 제품을 평가할 때 고려될 필요가 있는 특징인 독특한 프로파일의 숙주 세포 단백질을 제공할 수 있다. 인간 환자에게 투여하도록 허용되어야 하는 재조합 생체의약품 단백질에 대해서는, 제조 및 정제 공정으로부터 초래되는 잔여 불순물을 최종의 생물학적 제품으로부터 제거하는 것이 중요하다. 이러한 공정 성분은 배지 단백질, 면역글로불린 친화성 리간드, 바이러스, 내독소, DNA, 및 숙주 세포 단백질을 포함한다. 이러한 숙주 세포 불순물은 재조합 DNA 기술로부터 유래한 생물학적 제제 내 공정-관련된 불순물/오염물질인 공정-특이적인 숙주 세포 단백질 (HCP)을 포함한다. HCP는 전형적으로 최종 약물 물질 중에 소량으로 (의도된 재조합 단백질 mg 당 백만분율 또는 나노그램으로) 존재하지만, HCP는 바람직하지 않으며 이것들의 양은 최소화되어야 하는 것으로 인식된다. 예를 들면, 미국 식품의약국 (FDA)은 생체 내 인간 사용을 위해 의도된 생체의약품은 가능한 외부 불순물을 함유하지 않아야 함을 요구하며, 잠재적인 오염물질/불순물, 예컨대 HCP의 검출 및 정량화를 위한 시험을 필요로 한다. 또한, 국제 의약품규제 조화위원회 (the international conference on Harmonization: ICH)는 생명공학/생물학 제품에 대한 시험 절차 및 허용 기준에 대한 가이드라인을 제공한다. 이 가이드라인은, HCP에 대해서는 광범위한 단백질 불순물을 검출할 수 있는 민감한 면역검정이 사용되어야 함을 제안한다.
민감한 분석 방법, LC-MS/MS가 과량의 단백질 성분 중에 존재하는 단일 HCP 종을 동정하고 정량화하는데 사용될 수 있다. 그와 같은 단일 HCP 종을 동정하자 마자, 규제 당국에 의해 승인받을 수 있고 다수의 재조합 단백질 제품을 가로질러 플랫폼으로 사용될 수 있는 충분한 민감도 및 특이성의 대안적인 검정이 개발될 필요가 있다.
전기영동은 전기장 내에서 분자 혼합물의 상이한 이동 속도에 기반하여 이것들을 분리시키는데 사용되어 왔다. 일반적으로, 전기영동은 유체 또는 겔과 접촉하는 하나 이상의 전극 또는 전기 전도성 부재에 적용된 기전력의 작용 하에 유체 또는 겔을 통한 현탁되거나 용해된 분자의 이동을 지칭한다. 일부 공지된 전기영동 분리 방식은 적어도 부분적으로 (전기영동 구역으로 일반적으로 지칭된) 완충 용액에서, (겔 전기영동으로 일반적으로 지칭된) 겔 또는 폴리머 용액에서, 또는 (등전 집초법(isoelectric focusing)으로 일반적으로 지칭된) 수소 전위 (pH) 구배에서 분자의 이동성에서의 차이에 기반하여 분자를 분리하는 것을 포함한다. 모세관 전기영동 기술이 효과적이며, 생체분자 순도 및 전하 이질성을 조사하도록 산업에서 광범위하게 사용되고 있긴 하지만, 이것은 다양한 종의 선택적 검출을 허용하지 않거나 제품 및 공정 불순물의 구분을 허용하지 않는다. 따라서, 숙주 세포 단백질 불순물을 검출하기 위해 mAb 제조물 및 제형을 모니터하는 추가 방법이 필요하다.
발명의 요약
한 측면에서, 본 발명은, 항체 제조물 샘플 내 관심있는 단백질 오염물질을 검출하는 방법으로서, 상기 방법이 모세관 전기영동을 사용하여 하나 이상의 모세관 내 물리적 파라미터에 의해 샘플의 단백질 성분을 분리하는 단계; 상기 하나 이상의 모세관 내 샘플의 단백질 성분을 고정화하는 단계; 상기 하나 이상의 모세관 내 단백질 성분을, 관심있는 단백질 오염물질에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 1차 항체와 접촉시키는 단계; 및 상기 하나 이상의 1차 항체의 결합을 검출하여, 항체 제조물 샘플 내 관심있는 단백질 오염물질을 검출하고 정량화하는 단계를 포함하는 검출 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 물리적 파라미터에 의해 항체 제조물 샘플 내 관심있는 단백질 오염물질의 변이체를 구분하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시양태에서, 상기 하나 이상의 모세관은 분리 매트릭스를 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시양태에서, 상기 분리 매트릭스는 운반체 양쪽성전해질을 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시양태에서, 상기 물리적 파라미터는 전하를 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시양태에서, 상기 분리 매트릭스는 분자량에 의해 단백질을 분리하도록 구성된 체 분리 매트릭스(sieving matrix)를 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시양태에서, 상기 물리적 파라미터는 분자량을 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시양태에서, 상기 하나 이상의 1차 항체는 검출가능한 표지로 표지되고, 상기 하나 이상의 1차 항체의 결합을 검출하는 것이 상기 검출가능한 표지를 검출하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 하나 이상의 1차 항체의 결합을 검출하는 것이, 하나 이상의 1차 항체를, 이 하나 이상의 1차 항체 중 적어도 하나에 특이적으로 결합하며 검출가능한 표지를 갖는 2차 항체와 접촉시키고 상기 검출가능한 표지를 검출하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 관심있는 단백질 오염물질의 전하 또는 크기 변이체를 검출하고/하거나 구분하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 관심있는 단백질 오염물질의 상대 또는 절대 량을 측정하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시양태에서, 상기 검출가능한 표지는 화학발광 표지, 형광 표지 또는 생물발광 표지를 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시양태에서, 상기 샘플은 내부 표준을 포함한다.
일부 실시양태에서, 고정화는 광-고정화, 화학적 고정화, 또는 열 고정화를 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시양태에서, 상기 하나 이상의 1차 항체는 다클론 항체를 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시양태에서, 상기 하나 이상의 1차 항체는 단클론 항체를 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시양태에서, 관심있는 단백질 오염물질은 PLBD2, CTSD, TIMP1, 산성 세라미다제 (ASAH1), 리소좀성 산성 리파제 (LAL), 아넥신, 카텝신 B, 항류코프로테이나제 (ALP), 또는 이것들의 단편을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 물리적 파라미터에 의해 항체 제조물 샘플 내 관심있는 단백질 오염물질을 검출하고/하거나 구분하는 방법으로서, 상기 방법이 모세관 전기영동을 사용하여 하나 이상의 모세관 내에서 물리적 파라미터에 의해 샘플의 단백질 성분을 분리하는 단계; 상기 하나 이상의 모세관 내 샘플의 단백질 성분을 고정화하는 단계; 상기 하나 이상의 모세관 내 단백질 성분을, 관심있는 제1의 단백질 오염물질에 특이적으로 결합하는 제1의 1차 항체와 접촉시키는 단계; 상기 제1의 1차 항체의 결합을 검출하여, 관심있는 제1 항체를 검출하는 단계; 상기 하나 이상의 모세관 내 단백질 성분을, 관심있는 제2의 단백질 오염물질에 특이적으로 결합하는 제2의 1차 항체와 접촉시키는 단계; 및 상기 제2의 1차 항체의 결합을 검출하여, 관심있는 단백질 오염물질을 검출하고 샘플 내 관심있는 단백질 오염물질을 구분하는 단계를 포함하는 검출 및/또는 구분 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은, 하나 이상의 모세관 내 단백질 성분을, 관심있는 제3의 단백질 오염물질에 특이적으로 결합하는 제3의 1차 항체와 접촉시키는 단계; 상기 제3의 1차 항체의 결합을 검출하여, 관심있는 제3의 단백질 오염물질을 검출하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은, 하나 이상의 모세관 내 단백질 성분을, 관심있는 하나 이상의 추가의 단백질 오염물질에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 추가의 1차 항체와 접촉시키는 단계; 상기 하나 이상의 추가의 1차 항체의 결합을 검출하여, 관심있는 하나 이상의 추가의 단백질 오염물질을 검출하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은, 물리적 파라미터에 의해 항체 제조물 샘플 내 관심있는 단백질 오염물질의 변이체를 구분하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시양태에서, 상기 하나 이상의 모세관은 분리 매트릭스를 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시양태에서, 상기 분리 매트릭스는 운반체 양쪽성전해질을 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시양태에서, 상기 물리적 파라미터는 전하를 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시양태에서, 상기 분리 매트릭스는 분자량에 의해 단백질을 분리하도록 구성된 체 분리 매트릭스를 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시양태에서, 상기 물리적 파라미터는 분자량을 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시양태에서, 상기 1차 항체는 검출가능한 표지로 표지되고, 상기 1차 항체의 결합을 검출하는 것은 상기 검출가능한 표지를 검출하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 1차 항체의 결합을 검출하는 것은, 1차 항체를 이 1차 항체에 특이적으로 결합하며 검출가능한 표지를 갖는 2차 항체와 접촉시키고 상기 검출가능한 표지를 검출하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은, 관심있는 하나 이상의 단백질 오염물질의 상대 또는 절대 량을 측정하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시양태에서, 상기 검출가능한 표지는 화학발광 표지, 형광 표지 또는 생물발광 표지를 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시양태에서, 상기 샘플은 내부 표준을 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시양태에서, 상기 하나 이상의 1차 항체는 다클론 항체를 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시양태에서, 상기 하나 이상의 1차 항체는 단클론 항체를 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시양태에서, 상기 고정화는 광-고정화, 화학적 고정화, 또는 열 고정화를 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시양태에서, 상기 관심있는 단백질 오염물질은 PLBD2, CTSD, TIMP1, 산성 세라미다제 (ASAH1), 리소좀성 산성 리파제 (LAL), 아넥신, 카텝신 B, 항류코프로테이나제 (ALP), 또는 이것들의 단편을 포함한다.
다양한 실시양태에서, 위에 또는 본 명세서에서 논의된 실시양태의 특성 또는 구성요소 중 임의의 것은 조합될 수 있고, 그와 같은 조합은 본 개시내용의 범위 내에 포함된다. 위에 또는 본 명세서에서 논의된 임의의 특정한 값은, 범위의 하한 및 상한을 나타내는 값을 갖는 범위를 상술하도록 조합될 수 있고, 그와 같은 범위는 본 개시내용의 범위 내에 포함된다.
도 1a는 폴리펩타이드 PLBD2 제조물의 형태를 보여주는 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯의 디지털 이미지이다.
도 1b는 제안된 형태의 PLBD2를 보여주는 그림이다.
도 2는 선택된 항-PLBD2 항체 제조물을 사용한 웨스턴 블롯의 디지털 이미지 세트이다. 마우스를 재조합 PLBD2 또는 HIC 스트립을 사용하여 면역화시켜서 항-PLBD2 mAb를 생성시켰다. 하이브리도마를 웨스턴 블롯에 의해 특이성에 대하여 스크리닝하였고, 10개를 정제 및 비오틴화를 위해 선택하였다. 성숙 PLBD2 단백질 (~42 kDa)은 임의의 하이브리도마에서는 검출되지 않았다. N-말단을 표적화하는 항체를 동정하였다.
도 3은 항-PLBD2 항체의 활성을 보여주는 막대 그래프이다. 이 연구로부터, 최종의 샌드위치 ELISA 형식에 대하여 mAb09 코팅 및 비오티닐화 염소 pAb 검출을 선택하였다.
도 4는 선택된 항-PLBD2 항체를 사용한 샌드위치 ELISA의 개략적인 대표도이다.
도 5는 선택된 쌍의 항-PLBD2 항체에 대하여 생성된 표준 곡선이다.
도 6은 근사적인 분자량을 사용한 모세관 전기영동에 의한 폴리펩타이드 오염물질의 분리 및 검출에 대한 예시적인 작업 흐름이다.
도 7은 환원 및 비-환원 조건에서 PLBD2의 농도 의존적 분석을 실증하는 도면 세트를 도시한다. 이 결과는 항체 샘플에서 PLBD2의 정량화를 보여준다.
도 8은 전하를 사용한 모세관 전기영동에 의한 폴리펩타이드의 분리 및 검출을 위한 예시적인 작업 흐름 그림이다.
도 9는 이미지화된 cIEF-웨스턴 (icIEF-웨스턴) 전하 검정 결과를 도시한다. PLBD2는 항-PLBD2 pAb를 사용하여 검출된다. PLBD2는 C2P2 공정에는 존재하지 않으며, 샘플의 포함은 CE-웨스턴이 5-6 구역에서 PLBD2 피크를 특이적으로 찾아냄(picking up)을 확증한다.
도 10은 이미지화된 cIEF-웨스턴 (icIEF-웨스턴) 전하 검정의 결과를 보여준다. 천연(native) PLBD2가 도면 우측 5-6의 pH 범위에서 보여질 수 있다. 이것은 mAb 공정으로부터 검출되었는데, 이는 공정 샘플로부터 PLBD2를 선택적으로 검출하는 이 방법의 능력을 실증한다. 이 전하 모드에서는, PLBD2에 대하여 특이적인 다클론 및 또는 단클론 항체가 공정 샘플 내 불순물을 검출하는데 사용될 수 있다.
본 발명을 설명하기에 앞서, 본 발명은 설명된 특정한 방법 및 실험 조건이 가변될 수 있기 때문에 그와 같은 방법 및 실험 조건으로 제한되지 않음이 이해되어야 한다. 본 발명의 범위가 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 본 명세서에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 설명하기 위한 것이며 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 임의의 실시양태 또는 실시양태의 특성은 서로 조합될 수 있고, 그와 같은 조합은 본 발명의 범위 내에 명백히 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 사용된 용어 "약"은 특정하게 열거된 수치 값과 관련하여 사용된 경우에, 열거된 값으로부터 1% 이하까지 가변될 수 있음을 의미한다. 예를 들면, 본 명세서에 사용된 표현 "약 100"은 99 및 101, 및 그 사이의 모든 값 (예를 들면, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)을 포함한다.
본 명세서에 설명된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질은 지금부터 설명된다. 이 명세서에서 언급된 모든 특허, 출원, 및 비-특허 간행물은 이것들의 전문이 본 명세서에 참고로 편입된다.
본 명세서에 사용된 약어
mAb: 단클론 항체
biAb: 이중특이적 항체
CE: 모세관 전기영동
SDS: 황산도데실나트륨
icIEF: 이미지화 CIEF
icIEF-웨스턴; 전하 기반 CE-웨스턴
IEC: 이온 교환 크로마토그래피
QC: 품질 제어
HRP: 양 고추냉이 과산화효소
HCP: 숙주 세포 단백질
정의
본 명세서에 사용된 용어 "항체"는, 디설파이드 결합에 의해 서로 연결된 4개의 폴리펩타이드 쇄, 2개의 중 (H) 쇄 및 2개의 경 (L) 쇄를 포함한 면역글로불린 분자 (즉, "전체 항체 분자") 뿐만 아니라 이것의 다량체 (예를 들면, IgM) 또는 이것의 항원-결합 단편을 지칭한다. 각각의 중 쇄는 중 쇄 가변 구역 ("HCVR" 또는 "VH") 및 중 쇄 불변 구역 (도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함함)을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 중 쇄는 IgG 이소타입(isotype)일 수 있다. 일부 경우에, 중 쇄는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 중 쇄는 이소타입 IgG1/IgG2 또는 IgG4/IgG2의 키메라 힌지 구역(chimeric hinge region)을 선택적으로 포함하는 이소타입 IgG1 또는 IgG4의 것이다. 각각의 경 쇄는 경 쇄 가변 구역 ("LCVR 또는 "VL") 및 경 쇄 불변 구역 (CL)을 포함한다. VH 및 VL 구역은, 프레임워크 구역 (FR)으로 불리는 더욱 보존되는 구역이 산재된 상보성 결정 구역 (CDR)으로 불리는 초가변성 구역으로 추가로 하위분할될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은, 다음의 순서로 아미노 말단에서부터 카복시 말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 용어 "항체"는 임의의 이소타입 또는 하위부류의 글리코실화 및 비-글리코실화 면역글로불린 둘 모두에 대한 언급을 포함한다. 용어 "항체"는 재조합 수단에 의해 제조되고, 발현되고, 형성되거나 단리된 항체 분자, 예컨대 항체를 발현하도록 형질감염된 숙주 세포로부터 단리된 항체를 포함한다. 항체 구조에 대한 재검토에 대해서는 Lefranc et al., IMGT unique numbering for Immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains, 27(1) Dev. Comp. Immunol. 55-77 (2003); 및 M. Potter, Structural correlates of immunoglobulin diversity, 2(1) Surv. Immunol. Res. 27-42 (1983)을 참고한다.
용어 항체는 또한 하나 초과의 에피토프에 결합할 수 있는 이종사량체 면역글로불린을 포함하는 "이중특이적 항체"를 포함한다. 단일 중 쇄 및 단일 경 쇄, 및 6개의 CDR을 포함하는 이중특이적 항체의 한 절반은 하나의 항원 또는 에피토프에 결합하고, 상기 항체의 나머지 절반은 상이한 항원 또는 에피토프에 결합한다. 일부 경우에, 이중특이적 항체는 동일한 항원 그러나 상이한 에피토프 또는 비-중첩되는 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 이중특이적 항체의 두 개의 절반들은 이중 특이성을 유지하면서 동일한 경 쇄를 갖는다. 이중특이적 항체는 일반적으로 미국 특허 출원 공개 2010/0331527 (2010년 12월 30일)에 설명되어 있다.
용어 항체의 "항원-결합 부분" (또는 "항체 단편")은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포함된 결합하는 단편의 예는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 구역에서 디설파이드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 단편; (iv) 단일 아암 항체의 VL 및 VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 구성되는 dAb 단편 (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), (vi) 단리된 CDR, 및 (vii) 합성 링커에 의해 연결되어, VL 및 VH 구역이 짝지어져 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄를 형성하는 Fv 단편의 2개 도메인, VL 및 VH로 구성되는 scFv를 포함한다. 다른 형태의 단일 쇄 항체, 예컨대 디아바디(diabody)가 또한 용어 "항체"에 포함된다 (예를 들면, Holliger et at. (1993) 90 PNAS U.S.A. 6444-6448; 및 Poljak et at. (1994) 2 Structure 1121-1123을 참고한다).
더욱이, 항체 및 이것의 항원-결합 단편은 당해 분야에 일반적으로 공지된 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 얻어질 수 있다 (Sambrook et al., 1989을 참고한다).
용어 "인간 항체"는, 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래한 가변 및 불변 구역을 갖는 항체를 포함하도록 의도된다. 본 발명의 인간 mAb는, 예를 들면, CDR 및 특히 CDR3 중에, 인간 생식선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기 (예를 들면, 시험관 내에서 무작위적 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체 내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본 명세서에 사용된 용어 "인간 항체"는, 또 다른 포유동물 종 (예를 들면, 마우스)의 생식선으로부터 유래한 CDR 서열이 인간 FR 서열 위로 그래프트된 mAb를 포함하도록 의도되지는 않는다. 상기 용어는 비-인간 포유동물에서, 또는 비-인간 포유동물의 세포에서 재조합에 의해 생성된 항체를 포함한다. 상기 용어는 인간 대상체로부터 단리되거나 여기에서 생성된 항체를 포함하도록 의도되지 않는다.
본 명세서에 사용된 용어 "샘플"은, 관심있는 적어도 하나의 폴리펩타이드를 포함하는 분자의 혼합물, 예컨대 단클론 항체, 이중특이적 항체 및/또는 하나 이상의 숙주 세포 단백질 (HCP) 오염물질을 지칭하는데, 여기에 예를 들면, 분리, 분석, 추출, 농축 또는 프로파일링을 포함한 본 발명의 방법에 따른 조작이 실시된다.
본 명세서에 사용된 용어 "분석" 또는 "분석하는"은 상호교환가능하게 사용되며, 생체의약품 제조물, 예컨대 항체 제조물 내 관심있는 분자 (예를 들면, 폴리펩타이드, 예컨대 항체 및 HCP 오염물질)를 분리하고, 검출하고, 단리시키고, 정제하고, 용해시키고, 검출하고/하거나 특성규명하는 다양한 방법 중 임의의 것을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 "크로마토그래피"는, 혼합물, 예를 들면, 펩타이드, 단백질, 폴리펩타이드 및/또는 항체, 예컨대 단클론 항체를 함유하는 혼합물을 분리하는 공정을 지칭한다. 이것은 혼합물을 정지 상으로 통과시키는 것을 포함하는데, 이것으로 혼합물 내 다른 분자로부터 관심있는 분자가 분리되고, 관심있는 하나 이상의 분자가 단리될 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법에서, 크로마토그래피는 크기 기반 모세관 전기영동 및 등전 집초법 또는 전하 기반 모세관 전기영동을 포함한 모세관 전기영동을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 "접촉시키는"은, 용액 또는 고체 상 내 적어도 두 개의 물질을 함께 모으는 것, 예를 들면, 샘플을 항체, 예컨대 관심있는 분자, 예컨대 HCP 오염물질에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키는 것을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "단리된"은, 성분이 자연적으로 발생하거나 유전자변형에 의해 발현되는 유기체의 세포 내 다른 생물학적 성분, 즉, 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 단백질, 지질, 및 대사산물로부터 실질적으로 분리, 이것들로부터 별도로 생성되거나 이것들로부터 정제된 생물학적 성분 (예컨대, 항체, 예를 들면, 단클론 항체)을 지칭한다. 이렇게 "단리된" 핵산, 펩타이드, 단백질, 지질 및 대사산물은 표준 및 비-표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산, 펩타이드, 단백질, 지질, 및 대사산물을 포함한다. 상기 용어는 또한 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산, 펩타이드, 단백질, 지질, 및 대사산물 뿐만 아니라, 화학적으로 합성된 펩타이드, 지질, 대사산물, 및 핵산을 포함한다.
용어 "펩타이드," "단백질" 및 "폴리펩타이드"는, 펩타이드 결합 또는 펩타이드 결합 모방체에 의해 결합되는 아미노산 및/또는 아미노산 유사물의 폴리머를 상호교환가능하게 지칭한다. 20개의 자연 발생 아미노산, 및 이것들의 한 문자 및 세 문자 명칭은 다음과 같다: 알라닌 A Ala; 시스테인 C Cys; 아스파르트산 D Asp; 글루탐산 E Glu; 페닐알라닌 F Phe; 글리신 G Gly; 히스티딘 H His; 이소류신 I He; 라이신 K Lys; 류신 L Leu; 메티오닌 M Met; 아스파라긴 N Asn; 프롤린 P Pro; 글루타민 Q Gln; 아르기닌 R Arg; 세린 S Ser; 트레오닌 T Thr; 발린 V Val; 트립토판 w Trp; 및 티로신 Y Tyr. 하나의 실시양태에서, 펩타이드는 항체 또는 이것의 단편 또는 부분, 예를 들면, 위에 나열된 단편 또는 항체 쇄 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 펩타이드는 번역 후 변형될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 펩타이드는 HCP 오염물질이다.
"검출하다" 및 "검출"은 이것들의 표준 의미를 가지며, 관심있는 단백질, 예컨대 오염물질 폴리펩타이드, 예를 들면, HCP의 존재 또는 부재, 측정, 및/또는 특성규명을 포함한 검출을 포함하도록 의도된다.
본 명세서에 사용된 용어 "관심있는 단백질" 및/또는 "관심있는 표적 단백질"은, 본 명세서에 제공된 방법을 사용하여 분리되고/되거나 검출될 수 있는 임의의 단백질을 지칭한다. 관심있는 적합한 단백질은 항체 제조물 내 오염되는 단백질, 예컨대 HCP를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "표준" 및/또는 "내부 표준"은, 분자량 또는 전기영동에 의한 등전점을 기반으로 샘플에, 그리고 샘플 내 표준 및 분자 둘 모두에 첨가될 수 있는 공지된 양 및/또는 독자성(identity) (예를 들면, 공지된 분자량, 전기영동 이동성 프로파일)의 잘-특성규명된 물질을 지칭한다. 그 후, 표준의 비교는 분석물, 예컨대 샘플 중에 존재하는 오염물질 단백질, 예를 들면, HCP 양의 정량적 또는 반-정량적 척도를 제공한다.
일반적인 설명
오염되는 숙주 세포 단백질 변이체의 특성규명은, 잠재적 또는 실현된 치료 항체의 정제에 대한 이것들의 잠재적인 영향을 확인하기 위해 중요하다. mAb의 특성규명에 추가하여, 단백질 오염물질의 성질을 이해하는 것은 mAb 치료제의 개발에서의 또 다른 중요한 인자이다. 예를 들면, 잔여 단백질 A, HCP, 잔여 DNA 및 다른 잠재적 배양물 또는 정제 잔여물의 조절은 약물 물질 규격의 전형적인 일부이다. 또한, 그와 같은 조절은 공정 일관성 및 성능에 대하여 중요한 정보를 제공한다. 따라서, 예를 들면, 항체, 예컨대 HCP, 예를 들면, 관심있는 오염되는 단백질에 대하여 특이적인 단클론 또는 다클론 항체를 사용한 숙주 세포 단백질 (HCP)에 대한 크기 및/또는 전하 기반 검출 방법이 본 명세서에 개시된다. 개시된 방법은 문제가 되는 HCP, 및 공정 샘플 내 이것들의 다양한 종의 검출 및 시각화를 가능케 한다 (예를 들면, CHO 세포로부터 정제된 샘플 내 공통의 오염물질, 햄스터 단백질 PLBD2에서 이질성을 보여주는 도 1a 및 1b를 참고한다). 본 명세서에 사용된 PLBD2는 유전자 또는 유전자 산물, 예를 들면, PLBD2 유전자에 의해 생성된 PLBL2 단백질을 지칭한다. 따라서, PLBD2는 PLBL2 단백질과 동의어인 유전자 또는 유전자 산물을 지칭할 수 있다. 이러한 방법은 다양한 종의 주어진 HCP 불순물을 낮은 ppm 수준에서 검출하고 보여주는 능력을 가능케 한다. 따라서, 이 개시내용의 측면은 단클론 항체 제조물 샘플 내 관심있는 단백질 오염물질 검출 방법을 포함한다. 생물학적 샘플 내 관심있는 더욱 오염되는 숙주 세포 단백질 또는 이것의 단편을 구분하는 능력은, 단백질 및/또는 단편의 활성이 활성제, 예컨대 치료 항체의 활성에 대하여 상이한 효과를 가질 수 있기 때문에 점점 더 중요해지고 있다. 따라서, 상기 방법은 잠재적 치료 mAb 및 mAb 제조물의 잠재적 오염물질을 특성규명해야 한다. 본 명세서에 개시된 방법이 그러한 요구를 충족한다.
물리적 파라미터, 예컨대 오염되는 숙주 세포 단백질의 분자량 또는 등전점에 의해 생물학적 샘플, 예컨대 단클론 항체 (mAb) 제조물 내 오염되는 숙주 세포 단백질의 변이체를 검출 및/또는 구분하는 방법이 본 명세서에 개시된다. 개시된 방법은 항체 제조물의 QC 평가에 사용될 수 있다. 상기 방법의 실시양태에서, 관심있는 오염되는 숙주 세포 단백질 또는 다수의 오염되는 숙주 세포 단백질을 포함하는 샘플이 예를 들면, CE-시스템의 하나 이상의 모세관 위에서 모세관 전기영동을 사용하여 분석되거나 분리된다. 특정의 실시양태에서, 상기 샘플은 분자량에 의해 분석되거나 분리된다. 분자량에 의한 분석으로 오염되는 숙주 세포 단백질의 어떤 단편 또는 종이 샘플 중에 존재하는 지를 측정할 수 있다. 특정의 실시양태에서, 상기 샘플은 전하에 의해, 예를 들면, 등전 집초법에 의해 분석되거나 분리된다. 전하에 의한 오염되는 숙주 세포 단백질의 분리는, 오염되는 숙주 세포 단백질의 동질성, 예를 들면, 분자량에 의한 분리에서 용이하게 관찰될 수 없는 오염되는 숙주 세포 단백질의 표면 전하에서의 변화를 측정할 수 있는 부가된 이점을 갖는다. 특정의 실시양태에서, 상기 샘플은 단일의 모세관 내에서 분석되거나 분리된다. 특정의 실시양태에서, 상기 샘플은 다수의 모세관 내에서, 예를 들면 병렬적으로 분석되거나 분리된다.
일단 단백질 성분이 하나 이상의 모세관 내에서 분석되거나 분리되었으면, 단백질 성분, 예를 들면, 관심있는 오염되는 숙주 세포 단백질은 하나 이상의 모세관 내 관심있는 오염되는 숙주 세포 단백질의 상대적 위치가 유지되도록 모세관 내에 고정화된다. 실시양태에서, 관심있는 오염되는 숙주 세포 단백질은, 하나 이상의 모세관 내 관심있는 오염되는 숙주 세포 단백질을 포함하는 단백질 성분을, 관심있는 오염되는 숙주 세포 단백질 또는 이것의 단편에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 1차 항체와 접촉시켜서, 오염되는 숙주 세포 단백질 또는 이것의 단편의 존재를 검출함에 의해 검출된다. 실시양태에서, 상기 방법은 모세관 내에서 하나 이상의 1차 항체의 이동성이 이것의 단편의 고정화에 의해 손상되기 때문에 상기 1차 항체의 결합을 검출하는 것을 포함한다. 예를 들면, 모세관 길이를 따른 1차 항체의 결합의 검출은, 샘플에 각각 질량 또는 전하에 의한 분리가 실시되는 지에 따라, 샘플 내 관심있는 오염되는 숙주 세포 단백질 또는 이것의 단편의 변이체의 크기 및/또는 전하 변이체의 검출 및/또는 구분을 가능케 한다. 분자량에 의한 분리에 관한 예로, 단편이 작을수록 이것이 모세관 내에서 더 멀리 이동할 것으로 예상될 것이다. 실시양태에서, 상기 샘플은 다수의, 예컨대 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5 또는 그 초과의, 관심있는 오염되는 숙주 세포 단백질 또는 이것의 단편을 포함할 수 있고, 이것들의 각각은 관심있는 개별의 오염되는 숙주 세포 단백질(들) 또는 이것의 단편에 특이적으로 결합하는 1차 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 예를 들면, 피크 높이 또는 면적을 측정함에 의해 샘플 내 관심있는 오염되는 숙주 세포 단백질 변이체의 상대 또는 절대 량을 측정하는 것을 추가로 포함하며, 상기 량은 검출된 표지된 1차 항체의 양, 및 따라서 얼마나 많은 오염되는 숙주 세포 단백질 또는 이것의 단편이 표지된 1차 항체에 결합되도록 이용될 수 있는 지에 상응한다. 일부 실시양태에서, 관심있는 오염되는 숙주 세포 단백질은 PLBD2, CTSD, TIMP1, 산성 세라미다제 (ASAH1), 리소좀성 산성 리파제 (LAL), 아넥신, 카텝신 B, 항류코프로테이나제 (ALP), 또는 이것들의 단편 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심있는 단백질 오염물질은 PLBD2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 샘플은 하나 이상의 내부 표준, 예를 들면, 분자량 표준의 래더(ladder), 등전점 표준의 래더, 또는 심지어는 샘플 내 관심있는 오염되는 숙주 세포 단백질 또는 이것의 단편의 양을 측정하기 위한 기준선 또는 벤치마크로 사용된 표준을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 관심있는 단백질 오염물질의 전하 또는 크기 변이체를 검출하고/하거나 구분하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심있는 단백질 오염물질의 상대 또는 절대 량이 측정될 수 있다. 상기 방법의 다양한 실시양태에서, 상기 하나 이상의 1차 항체는 다클론 항체를 포함한다. 상기 방법의 다양한 실시양태에서, 상기 하나 이상의 1차 항체는 단클론 항체를 포함한다.
실시양태에서, 상기 방법은, 모세관 전기영동을 사용하여 하나 이상의 모세관 내 분자량에 의해, 관심있는 오염되는 숙주 세포 단백질의 2개 이상의 크기 변이체, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 심지어는 그보다 많은 관심있는 오염되는 숙주 세포 단백질(들)을 갖는 샘플의 단백질 성분을 분리하는 것을 포함한다. 예시적인 흐름이 도 6에 주어져 있다. 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 모세관 내 샘플의 단백질 성분을 고정화하는 것을 포함한다. 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 모세관 내 단백질 성분을, 관심있는 제1 단클론 항체에 특이적으로 결합하는 제1의 1차 항체와 접촉시키는 것을 포함한다. 실시양태에서, 상기 방법은 상기 제1의 1차 항체의 결합을 검출하여, 관심있는 제1 단클론 항체를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 분자량 기반의 오염되는 숙주 세포 단백질의 프로파일 또는 지문(fingerprint)은, 혼합물 내 오염되는 숙주 세포 단백질의 분자량 기반의 프로파일 또는 지문과의 비교를 위해 예를 들면, 관심있는 오염되는 숙주 세포 단백질로부터 단독으로 생성될 수 있다. 그 후, 이 비교는 관심있는 오염되는 숙주 세포 단백질이 예를 들면, 시간 경과에 따라 또는 제조물을 가로질러 혼합물 중에서 변화되는 지를 측정하는데 사용될 수 있다. 이것은 제조물에 대한 조건을 최적화하도록, 예를 들면, 주어진 치료 mAb의 제조물 중에 존재할 수 있는 오염되는 숙주 세포 단백질의 효과 또는 활성을 최소화하도록 실시될 수 있다. 이러한 프로파일 또는 지문 비교는, 혼합물 내 관심있는 오염되는 숙주 세포 단백질 중 임의의 것 또는 모두에 대하여 실시될 수 있다. 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 모세관 내 단백질 성분을, 관심있는 제2의 단클론 항체에 특이적으로 결합하는 제2의 1차 항체와 접촉시키는 것을 포함한다. 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 제2의 1차 항체의 결합을 검출하여, 샘플 내 관심있는 제2의 단클론 항체를 검출하고 오염되는 숙주 세포 단백질을 구분하는 것을 포함한다. 이것은 샘플 내 다수의 상이한 오염되는 숙주 세포 단백질에 대하여 계속될 수 있다. 예를 들면, 실시양태에서, 상기 방법은, 하나 이상의 모세관 내 단백질 성분을, 관심있는 제3의 오염되는 숙주 세포 단백질에 특이적으로 결합하는 제3의 1차 항체와 접촉시키고, 이 제3의 1차 항체의 결합을 검출하여 관심있는 오염되는 숙주 세포 단백질을 검출하는 것을 포함할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 상기 방법은, 하나 이상의 모세관 내 단백질 성분을, 관심있는 하나 이상의 추가의 오염되는 숙주 세포 단백질(들), 예를 들면, 관심있는 제4, 제5, 제6, 제7 등의 추가의 오염되는 숙주 세포 단백질(들)에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 추가의 1차 항체, 예를 들면, 제4, 제5, 제6, 제7 등의 1차 항체와 접촉시키고, 상기 하나 이상의 추가의 1차 항체의 결합을 검출하여 관심있는 오염되는 숙주 세포 단백질(들)을 검출하는 것을 포함할 수 있다. 실시양태에서, 상기 샘플은 다수의 모세관 내로 분배되고, 이러한 모세관의 각각은 상이한 1차 항체 또는 항체들과 접촉되고 검출된다. 얻어진 신호는 나중에 조합될 수 있다. 특정의 실시양태에서, 상기 검출은 단일 모세관에서, 예를 들면, 멀티플렉스(multiplex)에서 수행될 수 있다.
실시양태에서, 상기 방법은, 모세관 전기영동을 사용하여 하나 이상의 모세관 내 전하에 의해, 예를 들면, 등전 집초법에 의해, 관심있는 오염되는 숙주 세포 단백질의 둘 이상의 전하 변이체, 예컨대 관심있는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 심지어는 그 초과의 오염되는 숙주 세포 단백질(들)을 갖는 샘플의 단백질 성분을 분리하는 것을 포함한다. 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 모세관 내 샘플의 단백질 성분을 고정화하는 것을 포함한다. 예시적인 흐름이 도 8에 주어져 있다. 실시양태에서, 상기 방법은, 하나 이상의 모세관 내 단백질 성분을, 관심있는 제1 단클론 항체에 특이적으로 결합하는 제1의 1차 항체와 접촉시키는 것을 포함한다. 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 제1의 1차 항체의 결합을 검출하여, 관심있는 제1의 단클론 항체를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 오염되는 숙주 세포 단백질의 전하 기반 프로파일 또는 지문은, 혼합물 내 오염되는 숙주 세포 단백질의 전하 기반 프로파일 또는 지문과의 비교를 위해 예를 들면, 관심있는 오염되는 숙주 세포 단백질로부터 단독으로 생성될 수 있다. 그 후, 이 비교는 관심있는 오염되는 숙주 세포 단백질이 예를 들면, 시간 경과에 따라 또는 제조물을 가로질러 혼합물 중에서 변화되는 지를 측정하는데 사용될 수 있다. 이것은 제조물에 대한 조건을 최적화하도록 예를 들면, 주어진 치료 mAb의 제조물 중에 존재할 수 있는 오염되는 숙주 세포 단백질의 효과 또는 활성을 최소화하도록 실시될 수 있다. 이러한 프로파일 또는 지문 비교는, 혼합물 내 관심있는 오염되는 숙주 세포 단백질 중 임의의 것 또는 모두에 대하여 실시될 수 있다. 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 모세관 내 단백질 성분을, 관심있는 제2의 단클론 항체에 특이적으로 결합하는 제2의 1차 항체와 접촉시키는 것을 포함한다. 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 제2의 1차 항체의 결합을 검출하여, 샘플 내 관심있는 제2의 단클론 항체를 검출하고 오염되는 숙주 세포 단백질을 구분하는 것을 포함한다. 이것은 샘플 내 다수의 상이한 오염되는 숙주 세포 단백질에 대하여 계속될 수 있다. 예를 들면, 실시양태에서, 상기 방법은, 하나 이상의 모세관 내 단백질 성분을, 관심있는 제3의 오염되는 숙주 세포 단백질에 특이적으로 결합하는 제3의 1차 항체와 접촉시키고, 이 제3의 1차 항체의 결합을 검출하여 관심있는 오염되는 숙주 세포 단백질을 검출하는 것을 포함할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 상기 방법은, 하나 이상의 모세관 내 단백질 성분을, 관심있는 하나 이상의 추가의 오염되는 숙주 세포 단백질(들), 예를 들면, 관심있는 제4, 제5, 제6, 제7 등의 추가의 오염되는 숙주 세포 단백질(들)에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 추가의 1차 항체, 예를 들면, 제4, 제5, 제6, 제7 등의 1차 항체와 접촉시키고, 상기 하나 이상의 추가의 1차 항체의 결합을 검출하여 관심있는 오염되는 숙주 세포 단백질(들)을 검출하는 것을 포함할 수 있다. 실시양태에서, 상기 샘플은 다수의 모세관 내로 분배되고, 이러한 모세관의 각각은 상이한 1차 항체 또는 항체들과 접촉되고 검출된다. 얻어진 신호는 나중에 조합될 수 있다. 특정의 실시양태에서, 상기 검출은 단일 모세관에서, 예를 들면, 멀티플렉스에서 수행될 수 있다.
개시된 방법에 사용하기 위한 샘플은 다양한 성분, 즉 상이한 단백질을 함유하는 이종성일 수 있다. 대안적으로, 상기 샘플은 다수의 전하 또는 분자량 종의 한 성분 또는 본질적으로 한 성분을 함유하는 동종성일 수 있다. 관심있는 단백질, 예컨대 오염되는 단백질을 검출하기 전에 사전-분석 처리가 샘플에 대하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 샘플에 용해(lysing) 단계, 변성 단계, 가열 단계, 정제 단계, 침전 단계, 면역침전 단계, 컬럼 크로마토그래피 단계, 원심분리 단계 등이 실시될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플의 분리 및 고정화가 천연 기질(native substrate)에 대하여 수행될 수 있다. 다른 실시양태에서, 샘플에 변성, 예를 들면, 열 및/또는 변성제와의 접촉이 가해질 수 있다. 변성제는 당해 분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 샘플에는 비-환원 조건이 가해질 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플에는 환원 조건이 가해질 수 있는데, 예를 들면, 하나 이상의 환원제와 접촉될 수 있다. 환원제는 당해 분야에 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 상기 1차 항체는 검출가능한 표지로 표지되고, 상기 하나 이상의 1차 항체의 결합을 검출하는 것은 상기 검출가능한 표지를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 하나 이상의 1차 항체의 결합을 검출하는 것은, 하나 이상의 1차 항체를, 이 하나 이상의 1차 항체 중 적어도 하나와 특이적으로 결합하는 2차 항체와 접촉시키고, 상기 2차 항체의 결합을 검출하는 것을 포함한다. 실시양태에서, 상기 2차 항체는 검출가능한 표지를 가지며 상기 검출가능한 표지가 검출된다.
일부 실시양태에서, 상기 1차 항체 및/또는 2차 항체는 하나 이상의 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 검출가능한 표지는 화학발광 표지, 형광 표지 또는 생물발광 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 검출가능한 표지는 화학발광 표지를 포함한다. 상기 화학발광 표지는 광 신호를 제공하며 본 명세서에 개시된 방법에 따라 사용될 수 있는 임의의 실재물(entity)을 포함할 수 있다. 다양한 그와 같은 화학발광 표지는 당해 분야에 공지되어 있는데, 예를 들면, 미국 특허 6,689,576, 6,395,503, 6,087,188, 6,287,767, 6,165,800, 및 6,126,870을 참고한다. 적합한 표지는, 화학발광에 의한 광자 방출이 유도되는 그와 같은 방식으로 화학발광 기질과 반응할 수 있는 효소를 포함한다. 그와 같은 효소는 효소 활성을 통하여 다른 분자 내에서 화학발광을 유도한다. 그와 같은 효소는 과산화효소, 예컨대 양 고추냉이 과산화효소 (HRP), 베타-갈락토시다제, 포스파타제, 또는 화학발광 기질이 이용될 수 있는 기타 것들을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 화학발광 표지는 다양한 부류의 루미놀 표지, 이소루미놀 표지 등 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 항체는 화학발광 표지된 항체를 포함한다. 화학발광 기질, 예컨대 캘리포니아 포스터 시티의 Applied Biosystems로부터 입수가능한 Galacton 기질 또는 일리노이 록포드의 Pierce Biotechnology, Inc.로부터 입수가능한 SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity 기질 또는 다른 적합한 기질이 당해 분야에 잘 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 상기 검출가능한 표지는 생물발광 화합물을 포함한다. 생물발광은, 촉매 단백질이 화학발광 반응의 효율을 증가시키는 생물학적 시스템에서 발견된 화학발광의 한 유형이다. 생물발광 화합물의 존재는 발광의 존재를 검출함에 의해 측정된다. 적합한 생물발광 화합물은 루시페린, 루시퍼라제 및 애쿼린을 포함하지만, 이것들로 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 상기 검출가능한 표지는 형광 표지, 예컨대 형광 염료를 포함한다. 형광 염료는 형광 신호를 제공하며 본 명세서에 설명된 방법 및 장치에 따라 사용될 수 있는 임의의 실재물을 포함할 수 있다. 전형적으로, 상기 형광 염료는 제1 파장에서 빛을 흡수하고 흡수 사건에 반응하여 제2 파장에서 형광 빛을 방출하는 공명-비편재화 시스템 또는 방향족 링 시스템을 포함한다. 다양한 그와 같은 형광 염료 분자가 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 형광 염료는 다양한 부류의 형광 화합물 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있고, 비제한적인 예는 크산텐, 로다민, 플루오레세인, 시아닌, 프탈로시아닌, 스쿠아레인, 보디피(bodipy) 염료, 쿠마린, 옥사진, 및 카보피로닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 예를 들면, 1차 및/또는 2차 항체가 형광단, 예컨대 형광 염료를 함유하는 경우에, 형광 염료의 형광은 이것들을 적합한 광원을 사용하여 여기시키고, 이것들의 특징적인 형광 방출 파장에 민감한 검출기에 의해 이것들의 형광을 모니터링함에 의해 검출된다. 일부 실시양태에서, 1차 항체는 형광 염료 표지된 항체를 포함한다.
실시양태에서, 관심있는 상이한 단백질, 예컨대 관심있는 상이한 오염물질 단백질에 결합하거나 이것과 상호작용하는 둘 이상의 상이한 1차 또는 2차 항체를 사용하여, 관심있는 상이한 유형의 단백질이 예를 들면, 상이하거나 심지어는 동일한 검출가능한 표지를 사용하여 동일하거나 단일의 모세관 내 예를 들면, 멀티플렉스에서 동시에 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다수의 1차 및/또는 2차 항체는 다수의 기질과 함께 사용되어 색상 다중화를 제공할 수 있다. 예를 들면, 사용된 상이한 화학발광 기질은, 이것들이 상이한 색상의 광자를 방출하도록 선택될 것이다. 상이한 색상의 선택적인 검출은 회절 격자, 프리즘, 일련의 컬러 필터, 또는 다른 수단을 사용함에 의해 성취될 수 있다.
실시양태에서, 모세관은 장치 및/또는 시스템에 의해 자동화된 방식으로 첨가될 수 있는 분리 매트릭스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 분리 전에 스태커(stacker) 매트릭스 위로 로딩된다. 분리 매트릭스는 하나의 실시양태에서 크기 분리 매트릭스이고, 통상적인 전기영동 기술에 사용된 폴리머 겔과 유사하거나 실질적으로 동일한 특성을 갖는다. 분리 매트릭스에서의 모세관 전기영동은 폴리머 겔, 예컨대 폴리아크릴아미드 겔 또는 아가로스 겔에서의 분리와 유사한 데, 상기 폴리머 겔에서 분자는, 분자가 이동할 수 있는 다공성 통로를 제공함에 의해 샘플 내 분자의 크기를 기반으로 분리된다. 분리 매트릭스는, 더욱 큰 분자가 더욱 작은 분자보다 상기 매트릭스를 통하여 더욱 천천히 이동할 것이기 때문에 분자 크기에 의한 분자의 분리를 허용한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 모세관은 분리 매트릭스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심있는 단백질을 함유하는 샘플은 분자량을 기반으로 분리되거나 분석된다. 일부 실시양태에서, 분리 매트릭스는 분자량에 의해 단백질을 분리하도록 구성된 체 분리 매트릭스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플의 단백질 성분은 분자량에 의해 분리되고, 상기 방법은 관심있는 단클론 항체의 크기 변이체를 검출하고/하거나 구분하는 방법이다. 일부 실시양태에서, 샘플의 단백질 성분은 분자량에 의해 분리되고, 상기 방법은 관심있는 오염되는 단백질의 크기 변이체를 검출하고/하거나 구분하는 방법이다.
다양한 고체 상 기질, 예를 들면, 겔, 예컨대 폴리아크릴아미드 겔이 당해 분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 관심있는 하나 이상의 단백질을 분석하는 것은 폴리머 겔 내에서 샘플의 전기영동을 포함한다. 폴리머 겔, 예컨대 폴리아크릴아미드 겔 또는 아가로스 겔 내에서의 전기 영동은 분자의 크기를 기반으로 분자를 분리한다. 폴리머 겔은 분자가 이동할 수 있는 다공성 통로를 제공한다. 폴리머 겔은, 더욱 큰 분자가 더욱 작은 분자보다 겔을 통하여 더욱 천천히 이동할 것이기 때문에 분자 크기에 의한 분자의 분리를 허용한다.
일부 실시양태에서, 관심있는 단백질을 함유하는 샘플은 이 샘플 성분의 전하를 기반으로 분리되거나 분석된다. 일부 실시양태에서, 샘플의 단백질 성분은 전하에 의해 분리되고, 상기 방법은 관심있는 단클론 항체의 전하 변이체를 검출하고/하거나 구분하는 방법이다. 일부 실시양태에서, 샘플의 단백질 성분은 전하에 의해 분리되고, 상기 방법은 관심있는 오염되는 단백질의 전하 변이체를 검출하고/하거나 구분하는 방법이다. 일부 실시양태에서, 분리 매트릭스는 운반체 양쪽성전해질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전하에 의해 샘플을 분리하는 것은 샘플의 등전 집초법 (IEF)을 포함한다. 예를 들면, 전기장에서, 분자는 이 분자에 의해 보유된 순 전하에 반대되는 전하를 보유하는 극 (양극 또는 음극) 쪽으로 이동할 것이다. 이 순 전하는 부분적으로 분자가 이동하는 매체의 pH에 따른다. 하나의 공통적인 전기영동 절차는, 사이에 있는 pH의 구배 범위를 사용하여 전기장의 각각의 말단에서 상이한 pH 값을 갖는 용액을 확립하는 것이다. 특정의 pH에서, 분자의 등전점이 얻어지고, 분자는 순 전하를 보유하지 않는다. 분자가 pH 구배를 가로지름에 따라, 분자는 이것의 순 전하가 0인 지점 (즉, 이것의 등전점)에 도달하고 이것은 그 후에 전기장에서 고정화된다. 따라서, 이 전기영동 절차는 이것들의 상이한 등전점에 따라 분자를 분리한다.
일부 실시양태에서, 예를 들면, 분석이 등전 집초법에 의한 경우에, 양쪽성전해질 시약은 모세관 전기영동 장치의 하나 이상의 모세관 내로 로딩될 수 있다. 양쪽성전해질 시약은 상이한 등전점 범위를 갖는 분자의 혼합물이다. 전형적인 양쪽성전해질 시약은 영국 버킹엄셔의 Amersham Biosciences로부터 입수가능한 Pharmalyte™ 및 Ampholine™이다.
실시양태에서, 일단 분리가 완료되면, (예를 들면, 관심있는 단백질, 예컨대 관심있는 오염되는 단백질을 포함하는) 분리된 샘플의 성분은, 화학적, 광화학적 및 열 처리를 포함하지만 이것들로 제한되지 않는 임의의 적합한 방법을 사용하여 하나 이상의 모세관의 벽(들)에 고정화된다. 일부 실시양태에서, 분리된 샘플의 성분은, 분자가 예를 들면, 크기 또는 전하에 의한 전기영동에 의해 분리된 후에 CE-시스템의 하나 이상의 모세관 내에 고정화된다. 일부 실시양태에서, 상기 고정화는 광-고정화, 화학적 고정화, 또는 열 고정화를 포함한다. 고정화는 공유 결합 또는 비-공유 수단을 통하여, 예컨대 소수성 또는 이온성 상호작용에 의해 이뤄질 수 있다. 특정의 실시양태에서, 관심있는 단백질(들)은 하나 이상의 반응성 모이어티를 사용하여 고정화된다. 상기 반응성 모이어티는 샘플의 개별 분자의 상응하는 반응성 기와 함께 공유 결합을 형성할 수 있는 임의의 반응성 기를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 반응성 모이어티는, 이것이 본 명세서에 개시된 방법과 친화성(compatible)이기만 하면 당해 분야에 공지된 임의의 반응성 기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 반응성 모이어티는 관심있는 단백질, 예컨대 관심있는 오염되는 단백질의 상응하는 반응성 기와 함께 공유 결합을 형성할 수 있는 반응성 기를 포함한다.
상기 반응성 모이어티는 모세관에 직접적으로, 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 반응성 모이어티는 용액 또는 현탁액으로 공급될 수 있고, 활성화 시에 샘플 내 분자와 모세관 벽 사이에 가교를 형성할 수 있다. 예를 들면, 하나의 실시양태에서, 고정화는, 분리된 샘플 및 모세관을 자외선 (UV) 광에 노출시킴에 의해 나타나는데, 이것은 샘플 내 관심있는 단백질(들) (샘플 내에 존재하는 경우에) 및 분자를 모세관 벽에 고정화시키는 작용을 한다. 고정화는 공유 결합 또는 비-공유 수단을 통하여, 예컨대 소수성 또는 이온성 상호작용에 의해 이뤄질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 반응성 모이어티는 모세관 내 분석된 관심있는 단백질 또는 관심있는 단백질들을 공유적으로 고정화시키는데 사용될 수 있다. 반응성 모이어티는 모세관에 (예를 들면, 모세관의 벽(들) 위에) 직접적으로 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 반응성 모이어티는 용액 또는 현탁액으로 공급될 수 있고, 활성화 시에 샘플 내 분자와 모세관 벽 사이에 가교를 형성하도록 구성될 수 있다. 반응성 모이어티는 모세관을 라이닝할 수 있거나, 활성화 전 및/또는 후에 모세관 벽에 연결될 수 있거나 연결되지 않을 수 있는 모세관 내의 선형 또는 가교결합된 폴리머 위에 존재할 수 있다. 반응성 모이어티는 예를 들면, 상술된 것들과 같은 샘플의 개별 분자의 상응하는 반응성 기와 공유 결합을 형성할 수 있는 임의의 반응성 기일 수 있고/있거나, 이것을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 반응성 모이어티는 소수성 상호작용, 이온성 상호작용, 수소 결합 등을 통하여 관심있는 단백질에 부착되는 작용기로 전환될 수 있는 작용기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 그와 같은 반응성 모이어티는 관심있는 단백질을 모세관의 표면 위에 및/또는 모세관의 표면에 부착된 입자의 표면 위에 고정시키기 위해 UV 광, 레이저, 온도, 또는 임의의 다른 에너지 원을 사용하여 활성화된다. 일부 실시양태에서, 모세관의 표면은, 온도 변화 시에 표면의 소수성에서의 변화를 가능케하는 열 반응성 폴리머로 작용화된다. 일부 실시양태에서, 관심있는 단백질은, 모세관 내에서 특정 온도에 도달될 때 온도에 반응하는 폴리머의 소수성을 증가시킴에 의해 그와 같은 표면 위에 고정화된다.
2개의 분자를 함께 공유 결합시키기에 적합한 다양한 반응성 모이어티가 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 반응성 모이어티는 단백질의 탄소-수소 (C-H) 결합에 결합할 수 있다. 많은 분리 매체가 또한 C-H 결합을 갖는 성분을 함유하기 때문에, 설프히드릴 (S-H) 기가 대부분의 분리 매체 성분과 비교하여 단백질 위에서 독특하게 발견된다는 점에서 S-H 기와 반응하는 화학물질이 유리할 수 있다. 적합한 반응성 모이어티는 광반응성 기, 화학 반응성 기, 및 열반응성 기를 포함하지만, 이것들로 제한되지 않는다. 모세관 시스템 내에서의 광 고정화는 하나 이상의 광반응성 기의 활성화에 의해 수행될 수 있다. 광반응성 기는 외부 에너지원에 의한 활성화 시에 다른 분자와 공유 결합을 형성하는 하나 이상의 잠재적(latent) 광반응성 기를 포함한다. 예를 들면, 미국 특허 5,002,582 및 6,254,634를 참고한다. 광반응성 기는 전자기 에너지의 흡수 시에 활성 종, 예컨대 유리 라디칼, 및 구체적으로는 니트렌, 카르벤 및 여기된 상태의 케톤을 발생시킨다. 전자기적 스펙트럼의 다양한 부분에 대하여 반응하는 광반응성 기, 예컨대 스펙트럼의 자외선, 적외선 및 가시광에 반응하는 것들이 선택될 수 있다. 예를 들면, 광원으로의 노출 시에, 광반응성 기는 인접한 분자와 공유 결합을 형성하도록 활성화될 수 있다. 적합한 광반응성 기는 아릴 케톤, 아지드, 디아조스, 디아지린 및 퀴논을 포함하지만, 이것들로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 샘플의 분석된 관심있는 단백질은 등전 집초법에 의해 CE-시스템의 모세관 내에 고정화된다.
검출가능한 표지를 검출하는 것은, 이것이 본 명세서에 설명된 방법과 친화성이기만 하면, 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 실시될 수 있다. 표지 검출은 통상적인 방법 및 장비를 사용하여 신호를 모니터함에 의해 수행될 수 있으며, 비제한적인 예는 광검출기, 광검출기 배열, 전하 결합 소자 (charged coupled device: CCD) 배열 등을 포함한다. 전형적으로, 검출가능한 표지를 검출하는 것은 모세관을 이미지화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 모세관의 전장(entire length)이 이미지화될 수 있다. 대안적으로, 모세관의 별개의 부분이 이미지화될 수 있다.
본 명세서에 설명된 방법 단계의 순서 변경은 당업자에게 용이하게 일어날 것이다. 예를 들면, 샘플이 분리된 다음, 관심있는 단백질(들)은 이 관심있는 단백질(들)을 1차 항체와 접촉시키기 전에 모내관 내 이것들의 분석된 위치에 고정화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 항체가 관심있는 단백질(들)과 접촉되어 복합체를 형성한 다음, 이 복합체가 CE-시스템의 모세관 내에서 분석된다. 일부 실시양태에서, 1차 항체는 샘플 내로 사전로딩된 후에, 상기 시스템 내로 로딩될 수 있었다. 또 다른 예로, 분석 단계, 예컨대 등전 집초법은 화학발광 시약이 공급된 후에 적용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 샘플은 내부 표준을 포함한다. 내부 표준은 등전점 또는 분자량에 관한 분리를 보정하도록 작용한다. IEF에 대한 내부 표준은 당해 분야에 잘 공지되어 있는데, 예를 들면 Shimura, K., Kamiya, K., Matsumoto, H., and K. Kasai (2002) Fluorescence-Labeled Peptide pI Markers for Capillary Isoelectric Focusing, Analytical Chemistry v74: 1046-1053, 및 미국 특허 5,866,683을 참고한다. 형광에 의해 검출될 표준은 화학발광 전 또는 후에 조명될 수 있었지만, 일반적으로는 화학발광과 동시에는 아니다. 일부 실시양태에서, 관심있는 단백질 및 표준은 형광에 의해 검출된다. 관심있는 단백질 및 표준은, 각각 별개의 방출 파장에서 검출될 수 있는 형광 염료로 표지될 수 있어서, 관심있는 단백질 및 표준은 독립적으로 검출가능하다.
일부 실시양태에서, 내부 표준은 어떤 식으로든 관심있는 단백질과 구분가능하게 일반적으로 제조되는 정제된 형태의 관심있는 단백질 자체일 수 있다. 정제된 형태의 관심있는 단백질을 얻는 방법은 자연으로부터의 정제, (예를 들어, 화학적 합성을 통한) 실험실에서 성장한 유기체로부터의 정제 및/또는 등을 포함할 수 있지만, 이것들로 제한되지 않는다. 내부 표준의 구분되는 특징은 염료 표지, 방사선표지, 또는 관심있는 단백질로부터 분리되도록 전기영동에 의한 분리 동안 표준의 이동성을 변경시키는 것을 포함할 수 있지만, 이것들로 제한되지 않는다. 예를 들면, 표준은 관심있는 단백질에 대한 표준의 (예를 들면, 삭제, 융합, 및/또는 화학적 개질을 통한) 전하, 질량, 및/또는 길이를 변화시키는 관심있는 단백질의 변경을 포함할 수 있다. 따라서, 관심있는 단백질 및 내부 표준은 각각 별개의 방출 파장에서 각각 검출될 수 있는 형광 염료로 표지될 수 있어서, 상기 관심있는 단백질 및 표준은 독립적으로 검출될 수 있다. 일부 경우에, 내부 표준은 관심있는 단백질과 상이하지만 관심있는 단백질과 유사하거나 동일한 방식으로 행동하여, 관련된 비교 측정이 가능하다. 일부 실시양태에서, 사용하기에 적합한 표준은, 전문이 본 명세서에 참고로 편입되는 미국 특허 출원 공개 2007/0062813에 설명된 것들 중 임의의 것일 수 있다.
당업자에게 이해되는 바와 같이, 실제적으로 모세관 내 샘플을 로딩하는 임의의 방법이 수행될 수 있다. 예를 들면, 샘플은 모세관의 한 말단 내로 로딩될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 유체역학적 흐름에 의해 모세관의 한 말단 내로 로딩된다. 예를 들면, 유체 경로가 모세관인 실시양태에서, 샘플은 유체역학적 흐름에 의해 모세관의 한 말단 내로 로딩될 수 있어서, 모세관이 마이크로피펫으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 모세관이 겔로 채워져서 유체역학적 흐름에 대하여 더욱 저항성이면, 샘플은 전기영동에 의해 모세관 내로 로딩될 수 있다.
모세관은 액체 또는 용해된 분자가 흐를 수 있게 하는 임의의 구조를 포함할 수 있다. 따라서, 모세관은, 이것이 방법과 친화성이기만 하면 당해 분야에 공지된 임의의 구조를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 모세관은 액체 또는 용해된 분자가 흐를 수 있는 구멍 또는 채널이다. 일부 실시양태에서, 모세관은 액체 또는 용해된 분자가 흐를 수 있는 투과성 물질 내 통로이다.
모세관은, 모세관 내 관심있는 단백질의 검출을 허용하는 임의의 물질을 포함한다. 모세관은 임의의 편리한 물질, 예컨대 유리, 플라스틱, 실리콘, 용융 실리카, 겔 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 복수의 모세관을 사용한다. 복수의 모세관은 다수의 샘플이 동시에 분석될 수 있게 한다.
모세관은 치수, 폭, 깊이 및 단면 뿐만 아니라, 예를 들면, 원형, 사다리꼴, 직사각형 등인 형상에 대하여 가변될 수 있다. 모세관은 직선, 원형, S자 형(serpentine) 등일 수 있다. 아래에 설명된 대로, 유체 경로의 길이는 부분적으로 인자, 예컨대 샘플 크기 및 관심있는 단백질을 분석하는데 필요한 샘플 분리 정도에 따른다.
일부 실시양태에서, 모세관은 구멍이 있는 관을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 복수의 모세관을 사용한다. 적합한 크기는 약 10 내지 약 1000 μm의 내부 직경을 갖는 모세관을 포함하지만 이것으로 제한되지 않으며, 더욱 전형적으로는 약 25 내지 약 400 μm의 내부 직경을 갖는 모세관이 사용될 수도 있다. 더욱 작은 직경의 모세관에서는 비교적 적은 샘플 로딩이 사용되는 반면, 비교적 큰 구멍의 모세관을 사용하면 비교적 많은 샘플 로딩이 가능하고 개선된 신호 검출이 얻어질 수 있다.
모세관은 가변되는 길이를 가질 수 있다. 적합한 길이는 길이 약 2 내지 20 cm의 모세관을 포함하지만 이것으로 제한되지 않으며, 어느 정도 더욱 짧고 더욱 긴 모세관이 사용될 수도 있다. 일부 실시양태에서, 모세관의 길이는 약 3, 4, 5, 또는 6 cm이다. 더욱 긴 모세관은 전형적으로 복잡한 혼합물의 더 나은 분리 및 개선된 분석이 얻어지게 한다. 더욱 긴 모세관이, 덜 풍부한 관심있는 단백질을 분석하는데 특별히 사용될 수 있다.
일반적으로, 모세관은, 플라스틱 모세관 및 PYREX (즉, 무정형 유리)가 사용될 수 있지만 용융 실리카로 구성된다. 위에서 언급했듯이, 모세관은 둥글거나 관 형상을 가질 필요는 없다. 본 명세서에 설명된 방법과 친화성이기만 하면 다른 형상이 또한 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 모세관은 채널일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 복수의 채널을 사용한다. 일부 실시양태에서, 모세관은 미세유체 장치 내 채널일 수 있다. 미세유체학에서는 기판 내 채널을 사용하여 다양한 조작을 수행한다. 미세유체 장치는 기판의 표면 내로 윤곽형성된(contoured) 하나의 또는 복수의 채널을 포함할 수 있다. 미세유체 장치는 고체의 불활성 기판으로부터 얻어질 수 있고, 일부 실시양태에서는 칩 형태일 수 있다. 미세유체 장치의 치수는 중요하지 않지만, 일부 실시양태에서 상기 치수는 약 100 μm 내지 약 5 mm 두께, 및 한 면 위에서 대략 약 1 cm 내지 약 20 cm 정도이다. 적합한 크기는 약 5 μm 내지 약 200 μm의 깊이를 갖는 채널을 포함하지만 이것으로 제한되지 않으며, 더욱 전형적으로는 약 20 μm 내지 약 50 μm의 깊이를 갖는 채널이 사용될 수 있다. 더욱 작은 채널, 예컨대 마이크로 또는 나노채널이 방법과 친화성이기만 하면, 이것들이 또한 사용될 수 있다.
특정한 실시양태가 위에서 상세히 설명되었지만, 상기 설명은 단지 예시를 위한 것이다. 따라서, 달리 명시되지 않는 한, 상술된 다수의 측면들은 요구되거나 필수적인 요소로 의도되지 않음이 이해되어야 한다. 상술된 것들에 추가하여, 예시적인 실시양태의 개시된 측면에 상응하는 등가의 성분 또는 작용의 변경이, 다음의 청구범위에서 규정된 실시양태의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않고 본 개시내용의 이익을 갖는 당업자에 의해 행해질 수 있으며, 청구범위의 범위는 그와 같은 변경 및 동등한 구조를 포함하도록 가장 광범위한 해석과 조화되어야 한다.
다음의 실시예는 특정 실시양태의 구체적인 특성을 예시하기 위해 제공된다. 그러나, 아래에 설명된 구체적인 특성은 본 발명의 범위에 대한 제한으로 간주되지 않아야 하고 오히려 예로 간주되어야 하며, 이 실시예로부터의 등가물은 당업자에 의해 인식될 것이다.
실시예
실시예 1
CE-웨스턴용 HCP에 대한 항체의 개발
염소 및 마우스를 재조합 PLBD2 또는 HIC 스트립을 사용하여 면역화시켜서 각각 항-PLBD2 pAb 및 mAb를 생성시켰다. 하이브리도마를 웨스턴 블롯에 의한 특이성에 대하여 스크리닝하고, 정제 및 비오틴화를 위해 10개를 선택하였다. 하이브리도마 중 어느 것에서도 성숙 PLBD2 단백질 (~42 kDa)이 검출되지 않았다. N-말단을 표적화하는 항체를 동정하였다. 도 2는 선택된 항 PLBD2 항체 제조물을 사용한 웨스턴 블롯의 디지털 이미지 세트이다. 도 3은 상이한 조합의 항-PLBD2 항체를 갖는 항체 제조물 샘플에서 측정된 PLBD2 수준을 보여주는 막대 그래프이다. ELISA 측정된 양을 LC-MS 데이터와 비교한다. 이러한 연구로부터, mAb09 코팅 및 비오티닐화 염소 pAb 검출을, 최종의 샌드위치 ELISA 형식을 위하여 선택하였다. 도 4는 선택된 항-PLBD2 항체를 사용한 샌드위치 ELISA의 개략적인 대표도이다. 도 5는 ELISA 방법을 사용하여 선택된 항-PLBD2 항체에 대하여 생성된 표준 곡선이다.
실시예 2
크기 기반 CE-웨스턴을 사용한 분리 및 검출
오염물질 PLBD2를 포함한 항체 제조물을 환원 및 비-환원 조건 하에서 크기 기반 CE-웨스턴에 의해 분석하였다 (도 7 참고). 그래프는 PLBD2의 농도 의존적인 분석을 보여주는데, 이것은 크기 기반 CE-웨스턴이 mAb 제조물 오염물질의 검출 및 정량화를 위한 ELISA 측정에 비교될 수 있음을 실증한다. 또한, ELISA와는 달리, 오염되는 단백질이 분자량에 의해서 분석될 수 있기 때문에, 전체 오염에 기여하는 개별 종이 검출될 수 있다.
실시예 3
전하 기반 CE-웨스턴을 사용한 분리 및 검출
오염물질 PLBD2를 포함한 항체 제조물을 전하 기반 CE-웨스턴에 의해 분석하였다 (도 9 및 10 참고). 도 9는 이미지화된 cIEF-웨스턴 (icIEF) 전하 검정의 결과를 보여준다. PLBD2를 항-PLBD2 pAb를 사용하여 검출한다. PLBD2는 C2P2 공정에서는 존재하지 않고, 샘플의 포함은 CE-웨스턴이 5-6 구역에서 PLBD2 피크를 특이적으로 찾아냄을 확증한다. 도 10은 이미지화된 cIEF-웨스턴 (icIEF) 전하 검정의 결과를 보여준다. 천연 PLBD2가 도면 우측의 5-6의 pH 범위에서 보여질 수 있다. 이것은 공정 샘플로부터 PLBD2를 선택적으로 검출하는 이 방법의 능력을 실증하는 mAb 공정으로부터 검출되었다. 이 전하 모드에서, PLBD2에 대하여 특이적인 단클론 항체가 공정 샘플을 검출하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 본 명세서에 설명된 특정한 실시양태에 의해 범위가 제한되지 않아야 한다. 게다가, 본 명세서에 설명된 것들에 추가하여 본 발명의 다양한 변경이 전술된 설명 및 동반되는 도면으로부터 당업자에게 자명해질 것이다. 그와 같은 변경은 첨부된 청구범위의 범위에 속하는 것으로 의도된다.

Claims (32)

  1. 항체 제조물 샘플 내 관심있는 단백질 오염물질을 검출하는 방법으로서,
    모세관 전기영동을 사용하여 하나 이상의 모세관 내 물리적 파라미터에 의해 샘플의 단백질 성분을 분리하는 단계;
    상기 하나 이상의 모세관 내 샘플의 단백질 성분을 고정화하는 단계;
    상기 하나 이상의 모세관 내 단백질 성분을, 관심있는 단백질 오염물질에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 1차 항체와 접촉시키는 단계; 및
    상기 하나 이상의 1차 항체의 결합을 검출하여, 항체 제조물 샘플 내 관심있는 단백질 오염물질을 검출하는 단계를 포함하는 검출 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 물리적 파라미터에 의해 항체 제조물 샘플 내 관심있는 단백질 오염물질의 변이체를 구분하는 단계를 추가로 포함하는 검출 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 하나 이상의 모세관이 분리 매트릭스를 포함하는 검출 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 분리 매트릭스가 운반체 양쪽성전해질을 포함하는 검출 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 물리적 파라미터가 전하를 포함하는 검출 방법.
  6. 청구항 3에 있어서, 상기 분리 매트릭스가 분자량에 의해 단백질을 분리하도록 구성된 체 분리 매트릭스(sieving matrix)를 포함하는 검출 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 물리적 파라미터가 분자량을 포함하는 검출 방법.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 1차 항체가 검출가능한 표지로 표지되고, 상기 하나 이상의 1차 항체의 결합을 검출하는 것이 상기 검출가능한 표지를 검출하는 것을 포함하는 검출 방법.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 1차 항체의 결합을 검출하는 것이
    하나 이상의 1차 항체를, 이 하나 이상의 1차 항체 중 적어도 하나에 특이적으로 결합하며 검출가능한 표지를 갖는 2차 항체와 접촉시키는 것; 및
    상기 검출가능한 표지를 검출하는 것을 포함하는 검출 방법.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 관심있는 단백질 오염물질의 전하 또는 크기 변이체를 검출하고/하거나 구분하는 단계를 추가로 포함하는 검출 방법.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 관심있는 단백질 오염물질의 상대 또는 절대 량을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 검출 방법.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출가능한 표지가 화학발광 표지, 형광 표지 또는 생물발광 표지를 포함하는 검출 방법.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 내부 표준을 포함하는 검출 방법.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정화가 광-고정화, 화학적 고정화, 또는 열 고정화를 포함하는 검출 방법.
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 1차 항체가 다클론 항체를 포함하는 검출 방법.
  16. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심있는 단백질 오염물질이 PLBD2, CTSD, TIMP1, 산성 세라미다제 (ASAH1), 리소좀성 산성 리파제 (LAL), 아넥신, 카텝신 B, 항류코프로테이나제 (ALP), 또는 이것들의 단편을 포함하는 검출 방법.
  17. 물리적 파라미터에 의해 항체 제조물 샘플 내 관심있는 단백질 오염물질을 검출 및/또는 구분하는 방법으로서,
    모세관 전기영동을 사용하여 하나 이상의 모세관 내 물리적 파라미터에 의해 샘플의 단백질 성분을 분리하는 단계;
    상기 하나 이상의 모세관 내 샘플의 단백질 성분을 고정화시키는 단계;
    상기 하나 이상의 모세관 내 단백질 성분을, 관심있는 제1 단백질 오염물질에 특이적으로 결합하는 제1의 1차 항체와 접촉시키는 단계;
    상기 1차 항체의 결합을 검출하여, 관심있는 제1 항체를 검출하는 단계;
    상기 하나 이상의 모세관 내 단백질 성분을, 관심있는 제2 단백질 오염물질에 특이적으로 결합하는 제2의 1차 항체와 접촉시키는 단계; 및
    상기 제2의 1차 항체의 결합을 검출하여, 관심있는 단백질 오염물질을 검출하고 샘플 내 항체를 구분하는 단계를 포함하는 검출 및/또는 구분 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 하나 이상의 모세관 내 단백질 성분을, 관심있는 단백질 오염물질에 특이적으로 결합하는 제3의 1차 항체와 접촉시키는 단계; 및
    상기 제3의 1차 항체의 결합을 검출하여, 관심있는 제3의 단백질 오염물질을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 검출 및/또는 구분 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 하나 이상의 모세관 내 단백질 성분을, 관심있는 하나 이상의 추가의 단백질 오염물질에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 추가의 1차 항체와 접촉시키는 단계; 및
    상기 하나 이상의 추가의 1차 항체의 결합을 검출하여, 관심있는 추가의 단백질 오염물질을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 검출 및/또는 구분 방법.
  20. 청구항 17 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 물리적 파라미터에 의해 항체 제조물 샘플 내 관심있는 단백질 오염물질의 변이체를 구분하는 단계를 추가로 포함하는 검출 및/또는 구분 방법.
  21. 청구항 17 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 모세관이 분리 매트릭스를 포함하는 검출 및/또는 구분 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 분리 매트릭스가 운반체 양쪽성전해질을 포함하는 검출 및/또는 구분 방법.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 물리적 파라미터가 전하를 포함하는 검출 및/또는 구분 방법.
  24. 청구항 21에 있어서, 상기 분리 매트릭스가 분자량에 의해 단백질을 분리하도록 구성된 체 분리 매트릭스를 포함하는 검출 및/또는 구분 방법.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 물리적 파라미터가 분자량을 포함하는 검출 및/또는 구분 방법.
  26. 청구항 17 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 항체가 검출가능한 표지로 표지되며, 상기 1차 항체의 결합을 검출하는 것이 상기 검출가능한 표지를 검출하는 것을 포함하는 검출 및/또는 구분 방법.
  27. 청구항 17 내지 26 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 항체의 결합을 검출하는 것이
    1차 항체를, 이 1차 항체에 특이적으로 결합하고 검출가능한 표지를 갖는 2차 항체와 접촉시키는 것, 및
    상기 검출가능한 표지를 검출하는 것을 포함하는 검출 및/또는 구분 방법.
  28. 청구항 17 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 관심있는 단백질 오염물질 중 하나 이상의 상대 또는 절대 량을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 검출 및/또는 구분 방법.
  29. 청구항 17 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출가능한 표지가 화학발광 표지, 형광 표지 또는 생물발광 표지를 포함하는 검출 및/또는 구분 방법.
  30. 청구항 17 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 내부 표준을 포함하는 검출 및/또는 구분 방법.
  31. 청구항 17 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정화가 광-고정화, 화학적 고정화, 또는 열 고정화를 포함하는 검출 및/또는 구분 방법.
  32. 청구항 17 내지 31 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심있는 단백질 오염물질이 PLBD2, CTSD, TIMP1, 산성 세라미다제 (ASAH1), 리소좀성 산성 리파제 (LAL), 아넥신, 카텝신 B, 항류코프로테이나제 (ALP), 또는 이것들의 단편을 포함하는 검출 및/또는 구분 방법.
KR1020217041357A 2019-05-21 2020-05-21 숙주 세포 단백질 동정 및 정량화 방법 KR20220010543A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962850999P 2019-05-21 2019-05-21
US62/850,999 2019-05-21
PCT/US2020/034088 WO2020237095A1 (en) 2019-05-21 2020-05-21 Methods for identifying and quantitating host cell protein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220010543A true KR20220010543A (ko) 2022-01-25

Family

ID=71016717

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217041357A KR20220010543A (ko) 2019-05-21 2020-05-21 숙주 세포 단백질 동정 및 정량화 방법

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20200393455A1 (ko)
EP (1) EP3973291A1 (ko)
JP (1) JP2022532795A (ko)
KR (1) KR20220010543A (ko)
CN (1) CN113841051A (ko)
AU (1) AU2020279380A1 (ko)
BR (1) BR112021023206A2 (ko)
CA (1) CA3140713A1 (ko)
EA (1) EA202193198A1 (ko)
IL (1) IL288127A (ko)
MX (1) MX2021014171A (ko)
SG (1) SG11202112349UA (ko)
WO (1) WO2020237095A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022125555A1 (en) * 2020-12-07 2022-06-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method and composition for quantifying protein using tagged standards

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5002582A (en) 1982-09-29 1991-03-26 Bio-Metric Systems, Inc. Preparation of polymeric surfaces via covalently attaching polymers
US6087188A (en) 1992-11-13 2000-07-11 Alk A/S Two-site immunoassay for an antibody with chemiluminescent label and biotin bound ligand
AU1518195A (en) 1993-12-23 1995-07-10 Tropix, Inc. Chemiluminescent energy transfer assays
DE69605712T2 (de) 1995-03-31 2000-04-27 Lab Molecular Biophotonics Anwendung von isoelektrischen Punkt Markern bei der isoelektrischen Fokussierung mit Fluoreszenzdetektierung
US6165800A (en) 1997-05-30 2000-12-26 Bayer Corporation Chemiluminescent energy transfer conjugates and their uses as labels in binding assays
US6126870A (en) 1997-09-12 2000-10-03 Lumigen, Inc. Chemiluminescent labeling compounds
US6254634B1 (en) 1998-06-10 2001-07-03 Surmodics, Inc. Coating compositions
US6395503B1 (en) 1998-08-14 2002-05-28 Dainichiseika Color & Chemicals Mfg. Co., Ltd. Chemiluminescent reagents and chemiluminescence analysis methods with the use of the same
JP2001249079A (ja) 1999-12-28 2001-09-14 Fujirebio Inc 発光量調節剤を用いた化学発光測定方法及び酵素免疫測定方法
WO2007035864A2 (en) 2005-09-20 2007-03-29 Cell Biosciences, Inc. Electrophoresis standards, methods and kits
US20090023156A1 (en) * 2007-07-20 2009-01-22 Voss Karl O Methods and reagents for quantifying analytes
PL2975051T3 (pl) 2009-06-26 2021-09-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Wyizolowane z łatwością dwuswoiste przeciwciała o formacie natywnej immunoglobuliny
AU2013243948A1 (en) * 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
RU2016107435A (ru) * 2013-09-13 2017-10-18 Дженентек, Инк. Композиции и способы обнаружения и количественного определения белка клеток-хозяев в клеточных линиях и рекомбинантные полипептидные продукты
WO2018039499A1 (en) * 2016-08-24 2018-03-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Host cell protein modification
RU2771330C2 (ru) * 2016-10-06 2022-04-29 Глаксосмитклайн Интеллекчуал Проперти Дивелопмент Лимитед Антитела со сниженным связыванием с технологическими примесями
US11782023B2 (en) * 2018-12-19 2023-10-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ce-western applications for antibody development

Also Published As

Publication number Publication date
SG11202112349UA (en) 2021-12-30
EP3973291A1 (en) 2022-03-30
CN113841051A (zh) 2021-12-24
CA3140713A1 (en) 2020-11-26
WO2020237095A1 (en) 2020-11-26
BR112021023206A2 (pt) 2022-01-04
US20200393455A1 (en) 2020-12-17
AU2020279380A1 (en) 2021-12-09
IL288127A (en) 2022-01-01
MX2021014171A (es) 2022-01-04
JP2022532795A (ja) 2022-07-19
EA202193198A1 (ru) 2022-02-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230417701A1 (en) Ce-western applications for antibody development
US20050266507A1 (en) Antibody pair screening methods
US10520511B2 (en) Multimeric protein purity determination
US20090023156A1 (en) Methods and reagents for quantifying analytes
AU2018211064A1 (en) Idiotypic antibodies against anti-PD-L1 antibodies and uses thereof
Wu et al. Imaged capillary isoelectric focusing: applications in the pharmaceutical industry and recent innovations of the technology
Yüce et al. Fractionated charge variants of biosimilars: A review of separation methods, structural and functional analysis
US20200393455A1 (en) Methods for identifying and quantitating host cell protein
Janini et al. Element of a validation method for MU‐B3 monoclonal antibody using an imaging capillary isoelectric focusing system
BR112021013716A2 (pt) Análise microfluídica nativa ce-ms de heterogeneidade de carga de anticorpo
AU2002359796B2 (en) Methods for detecting half-antibodies using chip-based gel electrophoresis
US7153701B1 (en) Method for quantitatively detecting antigen
JP2010085375A (ja) 細胞増殖を伴う糖尿病合併症の検査のための方法、組成物およびキット
JP7482853B2 (ja) アフィニティキャピラリ電気泳動のシステム及び方法
US20150276674A1 (en) Immunoassays using colloidal crystals
CN112654639A (zh) 用于亲和毛细管电泳的系统和方法
Kanakis et al. Screening of cerebrospinal fluid and blood sera of multiple sclerosis patients for oligoclonal immunoglobulins by capillary electrophoresis
WO2018039047A1 (en) Lateral flow assay for assessing recombinant protein expression or reporter gene expression
JP2010085363A (ja) 糖尿病性末梢血管障害の検査のための方法、組成物およびキット
JP2010085364A (ja) コラーゲン線維の萎縮による組織障害の検査のための方法、組成物およびキット
AU2007203524A1 (en) Depletion of plasma proteins
JP2013518257A (ja) 複合生体液中のタンパク質の高速特性評価