BR112021013716A2 - Análise microfluídica nativa ce-ms de heterogeneidade de carga de anticorpo - Google Patents
Análise microfluídica nativa ce-ms de heterogeneidade de carga de anticorpo Download PDFInfo
- Publication number
- BR112021013716A2 BR112021013716A2 BR112021013716-5A BR112021013716A BR112021013716A2 BR 112021013716 A2 BR112021013716 A2 BR 112021013716A2 BR 112021013716 A BR112021013716 A BR 112021013716A BR 112021013716 A2 BR112021013716 A2 BR 112021013716A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- antibody
- interest
- sample
- post
- antibody fragments
- Prior art date
Links
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000738 capillary electrophoresis-mass spectrometry Methods 0.000 title description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 130
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims abstract description 54
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 claims abstract description 39
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 22
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 21
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 14
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 40
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 35
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 15
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 13
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 11
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 claims description 11
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 11
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 claims description 9
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 claims description 7
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 claims description 5
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 5
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 5
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 claims description 4
- 230000036252 glycation Effects 0.000 claims description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 229940043131 pyroglutamate Drugs 0.000 claims description 4
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical group OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 claims description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 claims description 3
- 238000007873 sieving Methods 0.000 claims description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 abstract description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 36
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 33
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 32
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 18
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 13
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 13
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 11
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 11
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 9
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 7
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 6
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 6
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 6
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 238000012531 mass spectrometric analysis of intact mass Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 5
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000001360 collision-induced dissociation Methods 0.000 description 4
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 238000004252 FT/ICR mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 3
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000005040 ion trap Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 3
- 238000012437 strong cation exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000002305 strong-anion-exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000012494 forced degradation Methods 0.000 description 2
- 238000012495 forced degradation study Methods 0.000 description 2
- 239000005350 fused silica glass Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical compound O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000672 surface-enhanced laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 2
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- YVOOPGWEIRIUOX-UHFFFAOYSA-N 2-azanyl-3-sulfanyl-propanoic acid Chemical compound SCC(N)C(O)=O.SCC(N)C(O)=O YVOOPGWEIRIUOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-carboxyethyl)phosphanyl]propanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- 108091092566 Extrachromosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101000935587 Homo sapiens Flavin reductase (NADPH) Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001018085 Lysobacter enzymogenes Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 108010053229 Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- WYTGDNHDOZPMIW-RCBQFDQVSA-N alstonine Natural products C1=CC2=C3C=CC=CC3=NC2=C2N1C[C@H]1[C@H](C)OC=C(C(=O)OC)[C@H]1C2 WYTGDNHDOZPMIW-RCBQFDQVSA-N 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000000533 capillary isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000451 chemical ionisation Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000008642 heat stress Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 150000002669 lysines Chemical group 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001906 matrix-assisted laser desorption--ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002090 nanochannel Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005297 pyrex Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000001920 surface-enhanced laser desorption--ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940126622 therapeutic monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/40—Concentrating samples
- G01N1/4044—Concentrating samples by chemical techniques; Digestion; Chemical decomposition
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
análise microfluídica nativa ce-ms de heterogeneidade de carga de anticorpo. a presente invenção refere-se a métodos para detectar e/ou discriminar entre variantes de modificação pós-tradução de um anticorpo de interesse em uma amostra. os métodos incluem: colocar uma amostra compreendendo um ou mais anticorpos de interesse em contato com uma protease para digerir a amostra em fragmentos de anticorpo; separar fragmentos de anticorpos por peso molecular e/ou carga em um ou mais capilares usando eletroforese capilar; eluir fragmentos de anticorpo separados de um ou mais capilares; e determinar a massa dos fragmentos de anticorpo eluídos por análise de espectrometria de massa, detectando assim e/ou discriminando entre variantes de modificação pós-tradução do anticorpo de interesse.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANÁLISE MICROFLUÍDICA NATIVA CE-MS DE HETEROGENEIDADE DE CARGA DE ANTICORPO".
[001] Este aplicativo incorpora por referência a Listagem de Sequência enviada em formato legível por computador como arquivo 10553P2-US_Sequence.txt, criado em 22 de maio de 2019 e contendo 487 bytes.
[002] A presente invenção refere-se a biofármacos e se refere ao uso de eletroforese capilar e análise espectral de massa para detectar modificações pós-tradução in vitro e/ou in vivo de anticorpos terapêuticos.
[003] Os anticorpos monoclonais (mAbs) são uma classe significativa de produtos bioterapêuticos e têm alcançado um sucesso notável no tratamento de muitas doenças crônicas e com risco de vida. No entanto, em certas circunstâncias os anticorpos monoclonais terapêuticos (mAbs) são moléculas heterogêneas produzidas em células de mamíferos com muitas variantes do produto, incluindo variantes resultantes de modificações pós-tradução (PTMs). As variantes produzidas por meio de PTMs podem ocorrer ao longo da vida útil de um mAb durante a produção, purificação, armazenamento e pós- administração. Essas variantes ou modificações relacionadas ao produto também são chamadas de atributos de qualidade do produto (PQAs). O controle de PQAs dentro de critérios de aceitação predefinidos é vital para a indústria biofarmacêutica porque garante uma qualidade consistente do produto e reduz os impactos potenciais na segurança e eficácia do fármaco.
[004] Cada anticorpo monoclonal individual pode, portanto,
apresentar um perfil único, característica que deve ser levada em consideração na avaliação desses produtos, tanto no desenvolvimento quanto na fabricação do produto final. Uma orientação da Food and Drug Administration para a indústria recomenda que os patrocinadores avaliem a suscetibilidade das proteínas terapêuticas às modificações no meio in vivo (ver, Guidance for Industry, Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products. 2014). Como resultado, o comportamento in vitro e/ou in vivo de muitos PQAs, incluindo desamidação (ver, por exemplo, Huang et al., Analytical chemistry 2005; 77:1432-9; Ouellette et al., mAbs 2013; 5:432-44; Yin et al., Pharmaceutical research 2013; 30:167-78; Li et al., mAbs 2016:0; Li et al., mAbs 2016:0), oxidação (ver, por exemplo, Yin et al., Pharmaceutical research 2013; 30:167-78; Li et al., mAbs 2016:0; Li et al., mAbs 2016:0), glicação (ver, por exemplo, Goetze et al., Glycobiology 2012; 22:221-34), glicosilação (ver, por exemplo, Li et al., mAbs 2016:0; Li et al., mAbs 2016:0; Goetze et al., Glycobiology 2011; 21:949-59; Alessandri et al., mAbs 2012; 4:509-20.), dissulfetos (ver, por exemplo, Li Yet al., mAbs 2016:0; Liu et al., The Journal of biological chemistry 2008; 283:29266-72), piroglutamato N- terminal (ver, por exemplo, Yin et al., Pharmaceutical research 2013; 30:167-78; Li et al., mAbs 2016:0; Li et al., mAbs 2016:0; Liu et al., The Journal of biological chemistry 2011; 286:11211-7), e remoção de lisina C-terminal (ver, por exemplo, Li et al., mAbs 2016:0; Cai et al., Biotechnology and bioengineering 2011; 108:404-12) foi investigado em amostras animais ou humanas. Consequentemente, são necessários métodos adicionais de monitoramento das preparações de mAb.
[005] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para detectar e/ou discriminar entre variantes de modificação pós- tradução de um anticorpo de interesse em uma amostra, em que o método inclui:
colocar uma amostra compreendendo um ou mais anticorpos de interesse em contato com uma protease para digerir a amostra em fragmentos de anticorpos; separar fragmentos de anticorpos por peso molecular e/ou carga em um ou mais capilares usando eletroforese capilar; eluir fragmentos de anticorpo separados de um ou mais capilares; e determinar a massa dos fragmentos de anticorpo eluídos por análise de espectrometria de massa, detectando assim e/ou discriminando entre variantes de modificação pós-tradução do anticorpo de interesse.
[006] Em várias modalidades do método, a modificação pós- tradução compreende um ou mais dentre desamidação, oxidação, glicação, formação de dissulfeto, formação de piroglutamato N-terminal, remoção de lisina C-terminal e glicosilação de alta manose.
[007] Em várias modalidades do método, a protease compreende IdeS.
[008] Em várias modalidades do método, os fragmentos de anticorpo compreendem um ou mais de uma subunidade de anticorpo F(ab’)2 ou Fc.
[009] Em várias modalidades do método, o anticorpo de interesse é um mAb.
[0010] Em várias modalidades do método, os fragmentos de anticorpo são separados por carga e o método é um método de detecção e/ou discriminação entre variantes de carga do anticorpo de interesse.
[0011] Em várias modalidades do método, os fragmentos de anticorpo são separados por peso molecular e o método é um método de detecção e/ou discriminação entre variantes de tamanho do anticorpo de interesse.
[0012] Em algumas modalidades, o método inclui ainda a determi- nação de uma quantidade relativa ou absoluta das variantes de modifi- cação pós-tradução de um anticorpo de interesse em uma amostra.
[0013] Em várias modalidades do método, o anticorpo de interesse compreende um anticorpo biespecífico.
[0014] Em várias modalidades do método, a amostra inclui um padrão interno.
[0015] Em várias modalidades do método, um ou mais capilares compreendem uma matriz de separação.
[0016] Em várias modalidades do método, a matriz de separação compreende uma matriz de peneiramento configurada para separar proteínas por peso molecular.
[0017] Em várias modalidades do método, a eluição de fragmentos de anticorpo separados de um ou mais capilares compreende ainda a separação dos fragmentos de anticorpo em uma ou mais frações.
[0018] Em algumas modalidades, o método inclui ainda a identificação dos fragmentos de anticorpo.
[0019] Em algumas modalidades, o método inclui ainda a identificação da modificação pós-tradução presente nos fragmentos de anticorpo.
[0020] Em várias modalidades do método, o anticorpo monoclonal de interesse é do isotipo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ou isotipo misto.
[0021] Em algumas modalidades, o método inclui ainda o perfil de modificação pós-tradução do anticorpo de interesse.
[0022] Em algumas modalidades, o método inclui ainda o mapeamento de modificação pós-tradução de pontos críticos de modificação pós-tradução por análise de LC-MS/MS de mapeamento de peptídeo reduzido.
[0023] Em várias modalidades do método, a amostra compreende uma mistura de anticorpos de interesse.
[0024] Em várias modalidades do método, o anticorpo monoclonal de interesse é um conjugado de anticorpo e fármaco.
[0025] Em várias modalidades, qualquer um dos recursos ou componentes das modalidades discutidas acima ou neste documento podem ser combinados e tais combinações são englobadas no escopo da presente divulgação. Qualquer valor específico discutido acima ou neste documento pode ser combinado com outro valor relacionado discutido acima ou neste documento para recitar uma faixa com os valores que representam as extremidades superior e inferior da faixa, e tais faixas são englobadas no escopo da presente divulgação.
[0026] A Figura 1 é um diagrama de um fluxo de trabalho exemplificativa para a separação e detecção de fragmentos de anticorpos modificados pós-tradução por eletroforese capilar e análise espectral de massa.
[0027] As Figuras 2A e 2B são um conjunto de traços mostrando separação comparável de variantes de carga de anticorpo entre CE-MS (Figura 2A) e SCX-UV (Figura 2B).
[0028] As Figuras 3A-3C são um conjunto de gráficos que mostram os testes de sensibilidade e transporte de ZipChip CE-MS nativo. Sensibilidade de IgG1 (Figura 3A), IgG4 (Figura 3B) e Zero Carryover (Figura 3C) de ZipChip CE nativo.
[0029] A Figura 4 é um conjunto de gráficos que mostra a separação da variante de carga de mAb NIST intacto e SEQ ID NO: 1.
[0030] As Figuras 5A-5C são um conjunto de traços que mostram a análise da variante de carga do anticorpo F (ab')2 e subunidades Fc. A separação da variante de carga de (Figura 5A) controle tratado com IdeS e mAbs NIST estressados, eletroferogramas ampliados das regiões F(ab')2 (Figura 5B) e Fc (Figura 5C).
[0031] As Figuras 6A-6E são um conjunto de gráficos que mostram a separação de 3 mAbs IgG1 (Figura 6A), 5 mAbs IgG4 biespecíficos (Figura 6B), 10 mAbs (Figura 6C) e Identificação de mAbs comigrados (Figura 6D e 6E) por ZipChip CE-MS nativo.
[0032] Antes da presente invenção ser descrita, deve-se entender que esta invenção não está limitada a métodos em particular e a condições experimentais descritas, uma vez que tais métodos e condições podem variar. Também se deve entender que a terminologia usada neste documento tem a finalidade de descrever somente modalidades em particular, e não se destina a ser limitante, uma vez que o escopo da presente invenção será limitado somente pelas reivindicações em anexo. Quaisquer modalidades ou características das modalidades podem ser combinadas umas com as outras, e tais combinações são expressamente englobadas no escopo da presente invenção.
[0033] A menos que descrito de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por alguém versado na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou teste, os métodos e materiais específicos são agora descritos. Todas as publicações mencionadas estão incorporadas, por meio deste documento, por referência.
[0034] O termo "um" deve ser entendido como significando "pelo menos um"; e os termos "cerca de" e "aproximadamente" devem ser entendidos para permitir a variação padrão como seria entendido por aqueles versados na técnica; e onde os intervalos são fornecidos, os desfechos são incluídos. Abreviações Utilizadas Neste Documento mAb: Anticorpo Monoclonal biAb: Anticorpo biespecífico CQA: Atributos Críticos de Qualidade (Critical Quality Attributes) CE: Eletroforese capilar PTM: Variante de modificação pós-tradução IEC: Cromatografia de Troca Iônica UV: Ultravioleta QC: Controle de Qualidade MS: Espec. de Massa ADC: Conjugados anticorpo-fármaco
[0035] O termo "anticorpo", conforme usado neste documento, pretende se referir a moléculas de imunoglobulina constituídas por quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfeto (ou seja, "moléculas de anticorpo completo"), bem como multímeros das mesmas (por exemplo IgM) ou fragmentos de ligação ao antígeno das mesmas. Cada cadeia pesada é constituída por uma região variável de cadeia pesada ("HCVR" ou "VH") e uma região constante de cadeia pesada (compreendida pelos domínios CH1, CH2 e CH3). Em várias modalidades, a cadeia pesada pode ser um isotipo de IgG. Em alguns casos, a cadeia pesada é selecionada de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em algumas modalidades, a cadeia pesada é do isotipo de IgG1 ou IgG4, opcionalmente incluindo uma região de dobradiça quimérica do isotipo de IgG1/IgG2 ou IgG4/IgG2. Cada cadeia leve é composta por uma região variável da cadeia leve ("LCVR ou "VL") e uma região constante da cadeia leve (CL). As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de framework (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, arranjadas da extremidade amino terminal até a extremidade carboxi terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. O termo
"anticorpo" inclui referência a imunoglobulinas glicosiladas e não glicosiladas de qualquer isotipo ou subclasse. O termo "anticorpo" inclui moléculas de anticorpo preparadas, expressas, criadas ou isoladas por meios recombinantes, tais como anticorpos isolados de uma célula hospedeira transfectada para expressar o anticorpo. Para uma revisão sobre a estrutura do anticorpo, consulte Lefranc et al., IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains, 27(1) Dev. Comp. Immunol. 55-77 (2003); e M. Potter, Structural correlates of immunoglobulin diversity, 2(1) Surv. Immunol. Res. 27-42 (1983).
[0036] O termo anticorpo também abrange "anticorpo biespecífico", que inclui uma imunoglobulina heterotetramérica que pode se ligar a mais de um epítopo diferente. Metade do anticorpo biespecífico, que inclui uma única cadeia pesada e uma única cadeia leve e seis CDRs, se liga a um antígeno ou epítopo, e a outra metade do anticorpo se liga a um antígeno ou epítopo diferente. Em alguns casos, o anticorpo biespecífico pode se ligar ao mesmo antígeno, mas em diferentes epítopos ou epítopos não sobrepostos. Em alguns casos, ambas as metades do anticorpo biespecífico têm cadeias leves idênticas, mantendo a especificidade dupla. Os anticorpos biespecíficos são descritos geralmente na Publicação de Pedido de Patente U.S. Nº 2010/0331527 (30 de dezembro de 2010).
[0037] O termo "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo (ou "fragmento de anticorpo"), refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno. Exemplos de fragmentos de ligação englobados no termo "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., Nature (1989) 241:544-546), que consiste em um domínio VH, (vi) uma CDR isolada e (vii) um scFv, que consiste nos dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, unidos por um ligante sintético para formar uma única cadeia proteica na qual as regiões VL e VH se pareiam para formar moléculas monovalentes. Outras formas de anticorpos de cadeia única, como diacorpos, também estão abrangidas pelo termo "anticorpo" (ver, por exemplo, Holliger et al. (1993) 90 PNAS EUA 6444- 6448; e Poljak et al. (1994) 2 Estrutura 1121-1123).
[0038] Além disso, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno destes podem ser obtidos usando técnicas de DNA recombinante padrão comumente conhecidas na técnica (ver Sambrook et al., 1989).
[0039] O termo "anticorpo humano" pretende incluir anticorpos que têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Os mAbs humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados pelas sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese randômica ou sítio específica in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo nas CDRs e, em particular, CDR3. No entanto, o termo "anticorpo humano", conforme usado neste documento, não se destina a incluir mAbs nos quais as sequências CDR derivadas da linhagem germinativa de outra espécie de mamífero (tal como um camundongo) foram enxertadas em sequências FR humanas. O termo inclui anticorpos produzidos de forma recombinante em um mamífero não humano ou em células de um mamífero não humano. O termo não se destina a incluir anticorpos isolados ou gerados em um sujeito humano.
[0040] O termo "ADC" ou "conjugado anticorpo-fármaco" refere-se a um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conjugado a uma fração terapêutica, tal como um agente citotóxico, um fármaco quimioterápico, imunossupressor ou um radioisótopo. Os agentes citotóxicos incluem qualquer agente que seja prejudicial ao crescimento, viabilidade ou propagação das células. Exemplos de agentes citotóxicos adequados e agentes quimioterápicos para formar ADCs são conhecidos na técnica.
[0041] O termo "amostra", tal conforme usado neste documento, refere-se a uma mistura de moléculas que inclui pelo menos um polipeptídeo de interesse, como um anticorpo monoclonal ou um anticorpo biespecífico ou fragmento do mesmo, que é submetido à manipulação de acordo com os métodos da invenção, incluindo, por exemplo, separação, análise, extração, concentração ou perfilamento.
[0042] Os termos "análise" ou "analisar", conforme usados neste documento, são usados indistintamente e referem-se a qualquer um dos vários métodos de separação, detecção, isolamento, purificação, solubilização, detecção e/ou caracterização de moléculas de interesse (por exemplo, polipeptídeos, tal como anticorpos) e concomitantes em preparações de anticorpos. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, eletroforese, espectrometria de massa, por exemplo, espectrometria de massa em tandem, detecção ultravioleta e combinações das mesmas.
[0043] "Cromatografia", tal conforme usado neste documento, refere-se ao processo de separação de uma mistura, por exemplo, uma mistura contendo peptídeos, proteínas, polipeptídeos e/ou anticorpos, como anticorpos monoclonais. Envolve a passagem de uma mistura por uma fase estacionária, que separa as moléculas de interesse de outras moléculas na mistura e permite que uma ou mais moléculas de interesse sejam isoladas. No método divulgado neste documento, cromatografia refere-se a eletroforese capilar, incluindo eletroforese capilar baseada em tamanho e focalização isoelétrica ou eletroforese capilar baseada em carga.
[0044] O termo "isolado", tal conforme usado neste documento, refere-se a um componente biológico (como um anticorpo, por exemplo, um anticorpo monoclonal) que foi substancialmente separado, produzido separadamente ou purificado de outros componentes biológicos na célula do organismo em que o componente ocorre naturalmente ou é expresso transgenicamente, isto é, outros DNA e RNA cromossômicos e extracromossômicos, proteínas, lipídios e metabólitos. Os ácidos nucleicos, peptídeos, proteínas, lípidios e metabólitos que foram "isolados" incluem, assim, ácidos nucleicos, peptídeos, proteínas, lípidios e metabólitos purificados por métodos de purificação padrão ou não padrão. O termo também abrange ácidos nucleicos, peptídeos, proteínas, lipídios e metabólitos preparados por expressão recombinante em uma célula hospedeira, bem como peptídeos, lipídios, metabólitos e ácidos nucleicos sintetizados quimicamente.
[0045] Os termos "peptídeo", "proteína" e "polipeptídeo" referem-se, indistintamente, a um polímero de aminoácidos e/ou análogos de aminoácidos que são unidos por ligações peptídicas ou miméticos de ligação peptídica. Os vinte aminoácidos de ocorrência natural e suas designações de uma e três letras são os seguintes: Alanina A Ala; Cisteína C Cys; Ácido Aspártico D Asp; Ácido glutâmico E Glu; Fenilalanina F Phe; Glicina G Gly; Histidina H His; Isoleucina I He; Lisina K Lys; Leucina L Leu; Metionina M Met; Asparagina N Asn; Prolina P Pro; Glutamina Q Gln; Arginina R Arg; Serina S Ser; Treonina T Thr; Valina V Val; Triptofano w Trp; e Tirosina Y Tyr. Em uma modalidade, um peptídeo é um anticorpo ou fragmento ou parte do mesmo, por exemplo, qualquer um dos fragmentos ou cadeias de anticorpos listados acima. Em algumas modalidades, o peptídeo pode ser modificado pós-tradução. Tal conforme usado neste documento, os termos "proteína de interesse" e/ou "proteína alvo de interesse" referem-se a qualquer proteína a ser separada e/ou detectada com os métodos fornecidos neste documento. Proteína de interesse adequada inclui anticorpos, por exemplo, anticorpos monoclonais e fragmentos dos mesmos.
[0046] "Detectar" e "detecção" têm seu significado padrão e se destinam a abranger a detecção incluindo a presença ou ausência, medição e/ou caracterização de uma proteína de interesse, como um mAb ou fragmento do mesmo.
[0047] Conforme usado neste documento, os termos "padrão" e/ou "padrão interno" referem-se a uma substância bem caracterizada de quantidade e/ou identidade conhecida (por exemplo, peso molecular conhecido, perfil de mobilidade eletroforética) que pode ser adicionada a uma amostra e tanto o padrão quanto as moléculas da amostra, com base no peso molecular ou ponto isoelétrico por eletroforese). Uma comparação do padrão fornece então uma medida quantitativa ou semiquantitativa da quantidade de analito, tal como mAb ou fragmentos presentes na amostra da mesma.
[0048] "Contato", conforme usado neste documento, inclui reunir pelo menos duas substâncias em solução ou fase sólida, por exemplo, o contato de uma amostra com uma enzima, como uma protease.
[0049] O termo "correspondente" é um termo relativo que indica semelhança na posição, finalidade ou estrutura, e pode incluir peptídeos de estrutura idêntica, mas para a presença ou ausência de uma modificação pós-tradução. Em algumas modalidades, os sinais espectrais de massa em um espectro de massa que são devidos a peptídeos correspondentes de estrutura idêntica, mas para a presença ou ausência de uma modificação pós-tradução, são sinais espectrais de massa "correspondentes". Um sinal espectral de massa devido a um determinado peptídeo também é referido como um sinal correspondente ao peptídeo. Em certas modalidades, uma sequência peptídica particular ou conjunto de aminoácidos, pode ser atribuído a uma massa de peptídeo correspondente.
[0050] Os termos "fragmento de peptídeo" ou "fragmento de peptídeo", tal conforme usados neste documento, referem-se a um peptídeo que é derivado do polipeptídeo de comprimento total, como uma proteína e/ou anticorpo monoclonal, por meio de processos que incluem fragmentação, proteólise enzimática ou hidrólise química. Esses peptídeos proteolíticos incluem peptídeos produzidos por tratamento de uma proteína com uma ou mais proteases, como a protease IdeS. Um fragmento de peptídeo, ou fragmento de peptídeo, pode ser um peptídeo digerido.
[0051] "Espectrometria de massa" refere-se a um método em que uma amostra é analisada gerando íons de fase gasosa da amostra, que são então separados de acordo com sua razão massa carga (m/z) e detectados. Os métodos de geração de íons de fase gasosa a partir de uma amostra incluem ionização por eletropulverização (ESI), dessorção-ionização a laser assistida por matriz (MALDI), dessorção- ionização a laser aprimorada por superfície (SELDI), ionização química e ionização por impacto de elétrons (EI). A separação de íons de acordo com sua razão m/z pode ser realizada com qualquer tipo de analisador de massa, incluindo analisadores de massa quadrupolo (Q), analisadores de massa de tempo de voo (TOF), analisadores de massa de setor magnético, armadilhas de íons lineares e 3D (IT), analisador de massa orbitrap, analisadores de ressonância cíclotron iônica com transformada de Fourier (FT-ICR) e combinações das mesmas (por exemplo, um analisador quadrupolo-tempo de voo ou analisador Q- TOF). Antes da separação, a amostra pode ser submetida a uma ou mais dimensões de separação cromatográfica, por exemplo, uma ou mais dimensões de cromatografia líquida ou de exclusão de tamanho.
[0052] A espectrometria de massa em tandem ou MS/MS é uma técnica para quebrar íons selecionados (íons precursores) em fragmentos (íons produto). Os fragmentos então revelam aspectos da estrutura química do íon precursor. Em espectrometria de massa em tandem, uma vez que as amostras são ionizadas (por exemplo, por ESI, MALDI, EI, etc.) para gerar uma mistura de íons, íons precursores, por exemplo, peptídeos de uma digestão, de uma razão massa-carga específica (m/z) são selecionados (MS1) e, em seguida, fragmentados (MS2) para gerar íons de produto para detecção. Os instrumentos de MS em tandem típicos incluem QqQ, QTOF e armadilha de íons híbrida/FTMS, etc. Um exemplo de uma aplicação de espectrometria de massa em tandem é a identificação de proteínas. O primeiro analisador de massa isola íons de um valor m/z específico que representa uma única espécie de peptídeo entre muitas introduzidas e emergentes da fonte de íons. Esses íons são então acelerados em uma célula de colisão contendo um gás inerte, como o argônio, para induzir a fragmentação do íon. Este processo é denominado dissociação induzida por colisão (CID) ou dissociação ativada por colisão (CAD). Os valores m/z dos íons do fragmento são então medidos em um 2º analisador de massa para obter informações da sequência de aminoácidos.
[0053] As referências a uma massa de um aminoácido significam a massa monoisotópica ou massa média de um aminoácido em uma dada abundância isotópica, como uma abundância natural. Em alguns exemplos, a massa de um aminoácido pode ser distorcida, por exemplo, marcando um aminoácido com um isótopo. Algum grau de variabilidade em torno da massa média de um aminoácido é esperado para aminoácidos individuais com base na composição isotópica exata do aminoácido. As massas, incluindo as massas monoisotópicas e médias dos aminoácidos, são facilmente obtidas por um versado na técnica.
[0054] Da mesma forma, as referências a uma massa de um peptídeo significam a massa monoisotópica ou massa média de um peptídeo em uma dada abundância isotópica, tal como uma abundância natural. Em alguns exemplos, a massa de um peptídeo pode ser distorcida, por exemplo, marcando um ou mais aminoácidos no peptídeo com um isótopo. Algum grau de variabilidade em torno da massa média de um peptídeo é esperado para peptídeos individuais com base na composição isotópica exata do peptídeo. A massa de um determinado peptídeo pode ser determinada por um versado na técnica. Descrição Geral
[0055] A caracterização de variantes de anticorpos monoclonais (mAb) é importante para identificar seu impacto potencial na segurança, potência e estabilidade de um anticorpo terapêutico potencial. Por exemplo, para ser considerada para aprovação por agências reguladoras, uma caracterização extensa da molécula deve ser realizada. Em fármacos que compreendem misturas de anticorpos, a caracterização das quantidades absolutas ou relativas de cada anticorpo deve ser determinada. Como agregados e fragmentos podem afetar potencialmente a imunogenicidade e a potência, seus níveis são normalmente monitorados durante a liberação, estabilidade e caracterização do lote. Além disso, são determinadas as vias de degradação primária para a molécula e as impurezas e variantes relacionadas com o produto. A cromatografia de troca iônica (IEC) juntamente com a detecção de UV é frequentemente usada para separar e quantificar variantes de mAb no controle de qualidade de rotina (QC). No entanto, a caracterização dos picos cromatográficos resultantes de uma separação IEC é um processo extremamente demorado. Assim, são necessários métodos adicionais para caracterizar potenciais mAbs terapêuticos e preparações de mAb. Os métodos divulgados neste documento atendem a essas necessidades.
[0056] É divulgado neste documento um método para detectar e/ou discriminar entre variantes de um anticorpo de interesse, como um anticorpo monoclonal (mAb), em uma amostra por um parâmetro físico, como massa e/ou carga. Os inventores desenvolveram um método de eletroforese capilar microfluídica nativa (CE)-MS de alto rendimento e altamente sensível para a identificação rápida de variantes de carga de anticorpo para degradação forçada e estudos de estabilidade de longo prazo.
[0057] Em comparação com os métodos IEC, perfis de carga comparáveis e de alta resolução são obtidos pelo CE-MS microfluídico nativo. Os métodos divulgados podem ser usados na avaliação de QC de preparações de anticorpos. Em modalidades do método, uma amostra que inclui um anticorpo de interesse é resolvida ou separada usando eletroforese capilar, por exemplo, em um ou mais capilares de um sistema CE. Em certas modalidades, a amostra é resolvida ou separada por peso molecular e carga. Por exemplo, usando a separação por massa e carga ou fragmentos de razão m/z com a mesma massa, mas cargas diferentes, podem ser resolvidos. Da mesma forma, usando separação por massa e carga ou fragmentos de razão m/z com a mesma mudança, mas massas diferentes, podem ser resolvidos. Em modalidades, o método inclui a liberação de fragmentos de um anticorpo de interesse, como um anticorpo monoclonal (mAb), por exemplo, contatando a amostra que compreende um ou mais anticorpos de interesse com uma protease para digerir a amostra. Em uma modalidade, a protease é a protease IdeS. Uma vez que a digestão, parcial ou completa, é conduzida, os fragmentos de anticorpo podem ser separados por peso molecular e/ou carga em um ou mais capilares usando eletroforese capilar. Os fragmentos de anticorpo separados podem ser eluídos de um ou mais capilares e a massa dos fragmentos de anticorpo eluídos determinada por análise de espectrometria de massa para detectar e/ou discriminar entre variantes de modificação pós-tradução do anticorpo de interesse, por exemplo, por detecção e/ou determinação do perfil de PTM dos fragmentos do anticorpo de interesse. Em certas modalidades, os fragmentos de anticorpo incluem um ou mais de uma subunidade de anticorpo F(ab') 2 ou Fc, por exemplo, como digerido do anticorpo intacto usando uma protease, como a protease IdeS. Em certas modalidades, o anticorpo de interesse é um anticorpo monoclonal, como um anticorpo terapêutico usado atualmente ou um em avaliação, incluindo novos anticorpos monoclonais. Em certas modalidades, o anticorpo monoclonal de interesse faz parte de um conjugado fármaco-anticorpo (ADC). Em certas modalidades, os fragmentos de anticorpo são separados por carga e o método é um método de detecção e/ou discriminação entre variantes de carga do anticorpo de interesse. Em certas modalidades, os fragmentos de anticorpo são separados por peso molecular e o método é um método de detecção e/ou discriminação entre variantes de tamanho do anticorpo de interesse. Em certas modalidades, os fragmentos de anticorpo são separados por carga e peso molecular e o método é um método de detecção e/ou discriminação entre variantes de carga e de peso molecular do anticorpo de interesse. Em certas modalidades, o método inclui a determinação de uma quantidade relativa ou absoluta das variantes de modificação pós-tradução de um anticorpo de interesse em uma amostra, por exemplo, a partir dos fragmentos de anticorpo.
[0058] Conforme observado acima, a separação dos fragmentos de anticorpo por massa e carga tem o benefício de ser capaz de determinar a homogeneidade dos fragmentos de anticorpo, por exemplo, mudanças na carga de superfície do anticorpo que podem não ser facilmente vistas na separação apenas pelo peso molecular. Esta separação permite a determinação do tipo e nível de modificação pós- tradução nos fragmentos da amostra. A presença de modificações pós- tradução (PTMs) em um anticorpo monoclonal (mAb) induz heterogeneidade de carga (ver Tabela 1) e potencialmente afeta a estabilidade do fármaco e a atividade biológica. Portanto, é importante monitorar os PTMs e os perfis de variantes de carga associados de mAbs durante o desenvolvimento do fármaco. Aqui, apresentam o desenvolvimento de um método CE-MS microfluídico nativo de alto rendimento e alta sensibilidade para a rápida identificação de variantes de carga de mAb e sua aplicação em estudos de degradação forçada e estabilidade de longo prazo. Em relação às abordagens baseadas em cromatografia de troca iônica (IEX), alta resolução com perfis de variantes de carga comparáveis pode ser obtida usando o método CE- MS microfluídico nativo conforme divulgado neste documento. Tabela 1. Fonte de Heterogeneidade de Carga de Anticorpo Principais PTMs/Caminho de Efeito Espécie Formada Degradação Sialilação Adição de COOH Ácido Desamidação Formação de COOH Ácido Clivagem de lisina C-terminal Perda de NH2 Ácido Formação de aduto Formação de COOH ou perda de NH2 Ácido Formação de succinimida Perda de COOH Básico Oxidação de metionina, cisteína, Alteração conformacional Básico lisina, histidina, triptofano Mediada por dissulfeto Alteração conformacional Básico Asialilação (terminal galactose) Perda de COOH Básico Lisina C-terminal e amidação de Formação de NH2 ou perda de COOH Básico glicina
[0059] Em certas modalidades, a modificação pós-tradução é um ou mais dentre desamidação, oxidação, glicação, formação de dissulfeto, formação de piroglutamato N-terminal, remoção de lisina C-terminal e glicosilação de alta manose.
[0060] Em certas modalidades, a amostra é resolvida ou separada dentro de um único capilar. Em certas modalidades, a amostra é resolvida ou separada dentro de vários capilares, por exemplo, em paralelo. A título de exemplo, no que diz respeito à separação por peso molecular, quanto menor o fragmento de um anticorpo, mais dentro de um capilar seria esperado que ele viajasse durante um determinado período de tempo. Além disso, seria de se esperar que as diferenças na carga dos fragmentos de anticorpo fossem submetidas a diferentes tempos de viagem, dependendo da carga.
[0061] Em modalidades, a amostra pode conter vários, como pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5 ou mais conjuntos de fragmentos de anticorpos de vários anticorpos de interesse. Em algumas modalidades, o método inclui ainda a determinação de uma quantidade relativa ou absoluta das variantes dos fragmentos de anticorpo em uma amostra, por exemplo, por medição da altura ou área do pico, que corresponde à quantidade de fragmento de anticorpo na amostra. Em algumas modalidades, o anticorpo de interesse compreende um anticorpo monoclonal biespecífico. Em algumas modalidades, a amostra inclui um ou mais padrões internos, por exemplo, uma escada de padrões de peso molecular, uma escada de padrões de ponto isoelétrico ou mesmo um padrão usado como linha de base ou referência para determinar a quantidade de fragmentos de anticorpo de interesse na amostra.
[0062] A capacidade de discriminar entre mAbs em um coquetel de mAbs de vários mAbs está se tornando cada vez mais importante, pois essas terapias de múltiplos componentes demonstram maior eficácia no tratamento da doença. Assim, os métodos melhorados de monitoramento de como os mAbs individuais se comportam nesses sistemas se tornarão cada vez mais importantes na avaliação da compatibilidade e estabilidade dessas terapias de multi-mAb. Para atender a essa necessidade crescente, esta divulgação fornece um método para detectar e/ou discriminar entre anticorpos monoclonais em uma mistura de dois ou mais anticorpos monoclonais em uma amostra.
[0063] Em modalidades, o método inclui a separação de componentes de proteína de uma amostra com dois ou mais mAbs de interesse, como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mesmo mais, mAbs de interesse, por carga em um ou mais capilares usando eletroforese capilar.
[0064] Em algumas modalidades, um perfil baseado em carga ou impressão digital do anticorpo de interesse pode ser criado, por exemplo, do anticorpo de interesse sozinho para comparação com um perfil baseado em carga ou impressão digital do anticorpo na mistura, por exemplo, um perfil baseado em carga ou impressão digital correspondente à modificação pós-tradução. Esta comparação pode então ser usada para determinar se o anticorpo de interesse muda na mistura. Este perfil ou comparação de impressão digital pode ser feito para qualquer um ou todos os anticorpos de interesse na mistura.
[0065] As amostras para uso nos métodos divulgados podem ser heterogêneas, contendo uma variedade de componentes, ou seja, proteínas diferentes. Alternativamente, a amostra pode ser homogênea, contendo um componente ou essencialmente um componente de carga múltipla ou espécies de peso molecular. O processamento de pré- análise pode ser realizado na amostra antes de detectar o anticorpo de interesse, como um mAb ou vários mAbs. Por exemplo, a amostra pode ser submetida a uma etapa de lise, etapa de desnaturação, etapa de aquecimento, etapa de purificação, etapa de precipitação, etapa de imunoprecipitação, etapa de cromatografia em coluna, centrifugação,
etc. Em algumas modalidades, a separação da amostra e a imobilização pode ser realizada em substratos nativos. Em outras modalidades, a amostra pode ser submetida a desnaturação, por exemplo, calor e/ou contato com um agente desnaturante. Os agentes desnaturizantes são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, a amostra pode ser submetida a condições não redutoras. Em algumas modalidades, a amostra pode ser submetida a condições de redução, por exemplo, pelo contato da amostra com um ou mais agentes redutores. Os agentes redutores são conhecidos na técnica.
[0066] Em modalidades, o capilar pode incluir uma matriz de separação, que pode ser adicionada de uma forma automatizada pelo aparelho e/ou sistema. Em algumas modalidades, a amostra é carregada em uma matriz empilhadora antes da separação. A matriz de separação, em uma modalidade, é uma matriz de separação por tamanho e tem propriedades semelhantes ou substancialmente as mesmas de um gel polimérico, usado em técnicas convencionais de eletroforese. A eletroforese capilar na matriz de separação é análoga à separação em um gel polimérico, como um gel de poliacrilamida ou um gel de agarose, onde as moléculas são separadas com base no tamanho das moléculas na amostra, fornecendo uma passagem porosa através do qual as moléculas podem viajar. A matriz de separação permite a separação de moléculas por tamanho molecular porque moléculas maiores viajarão mais lentamente através da matriz do que moléculas menores. Em algumas modalidades, um ou mais capilares compreendem uma matriz de separação. Em algumas modalidades, o a amostra contendo um anticorpo de interesse é separada ou resolvida com base no peso molecular. Em algumas modalidades, a matriz de separação compreende uma matriz de peneiramento configurada para separar proteínas por peso molecular. Em algumas modalidades, os componentes da proteína de uma amostra são separados por peso molecular e o método é um método de detecção e/ou discriminação entre variantes de tamanho de um anticorpo de interesse. Em algumas modalidades, fragmentos de anticorpo de uma amostra são separados por peso molecular e o método é um método de detecção e/ou discriminação entre variantes de tamanho de uma proteína contaminante de interesse.
[0067] Uma grande variedade de substratos de fase sólida é conhecida na técnica, por exemplo géis, tais como gel de poliacrilamida. Em algumas modalidades, a resolução de uma ou mais proteínas de interesse inclui eletroforese de uma amostra em um gel polimérico. A eletroforese em um gel polimérico, como um gel de poliacrilamida ou um gel de agarose, separa as moléculas com base no tamanho da molécula. Um gel polimérico fornece uma passagem porosa através da qual as moléculas podem viajar. Os géis poliméricos permitem a separação de moléculas por tamanho molecular porque as moléculas maiores viajarão mais lentamente através do gel do que as moléculas menores.
[0068] Em algumas modalidades, a amostra contendo uma proteína de interesse é separada ou resolvida com base na carga dos componentes da amostra. Em algumas modalidades, os componentes da proteína de uma amostra são separados por carga e o método é um método de detecção e/ou discriminação entre variantes de carga de um anticorpo monoclonal de interesse. Em algumas modalidades, os fragmentos de uma amostra são separados por carga e o método é um método de detecção e/ou discriminação entre variantes de carga de um anticorpo de interesse de interesse.
[0069] Em algumas modalidades, um padrão interno pode ser uma forma purificada do próprio anticorpo de interesse ou fragmento do mesmo, que geralmente é distinguido do anticorpo de interesse de alguma forma. Os métodos de obtenção de uma forma purificada do próprio anticorpo de interesse ou fragmento do mesmo podem incluir, mas não estão limitados a, purificação da natureza, purificação de organismos cultivados em laboratório (por exemplo, via síntese química) e/ou os semelhantes. A característica distintiva de um padrão interno pode ser qualquer alteração adequada que pode incluir, mas não está limitada a, marcação com corante, radiomarcação ou modificação da mobilidade do padrão durante a separação eletroforética de modo que seja separado do anticorpo de interesse. Por exemplo, um padrão pode conter uma modificação do próprio anticorpo de interesse ou fragmento do mesmo que altera a carga, massa e/ou comprimento (por exemplo, por meio de deleção, fusão e/ou modificação química) do parente padrão ao próprio anticorpo de interesse ou fragmento do mesmo. Assim, o próprio anticorpo de interesse ou fragmento do mesmo e o padrão interno podem ser marcados com corantes fluorescentes que são detectáveis em comprimentos de onda de emissão discretos, permitindo assim que a proteína de interesse e o padrão sejam detectáveis independentemente. Em alguns casos, um padrão interno é diferente do próprio anticorpo de interesse ou fragmento do mesmo, mas se comporta de maneira semelhante ou igual ao próprio anticorpo de interesse ou fragmento do mesmo, permitindo medições comparativas relevantes.
[0070] Como será apreciado por aqueles na técnica, virtualmente qualquer método de carregamento da amostra no capilar pode ser executado. Por exemplo, a amostra pode ser carregada em uma extremidade do capilar. Em algumas modalidades, a amostra é carregada em uma extremidade do capilar por fluxo hidrodinâmico. Por exemplo, em modalidades em que o caminho do fluido é um capilar, a amostra pode ser carregada em uma extremidade do capilar por fluxo hidrodinâmico, de modo que o capilar seja usado como uma micropipeta. Em algumas modalidades, a amostra pode ser carregada no capilar por eletroforese, por exemplo, quando o capilar é preenchido com gel e, portanto, mais resistente ao fluxo hidrodinâmico.
[0071] O capilar pode incluir qualquer estrutura que permite o fluxo de moléculas líquidas ou dissolvidas. Assim, o capilar pode incluir qualquer estrutura conhecida na técnica, desde que seja compatível com os métodos. Em algumas modalidades, o capilar é um orifício ou canal através do qual um líquido ou molécula dissolvida pode fluir. Em algumas modalidades, o capilar é uma passagem em um material permeável no qual líquidos ou moléculas dissolvidas podem fluir.
[0072] O capilar inclui qualquer material que permite a detecção da proteína de interesse dentro do capilar. O capilar inclui qualquer material conveniente, como vidro, plástico, silício, sílica fundida, gel ou semelhantes. Em algumas modalidades, o método emprega uma pluralidade de capilares. Uma pluralidade de capilares permite que várias amostras sejam analisadas simultaneamente.
[0073] O capilar pode variar quanto às dimensões, largura, profundidade e seção transversal, bem como a forma, sendo arredondado, trapezoidal, retangular, etc., por exemplo. O capilar pode ser reto, arredondado, serpentino ou semelhante. Conforme descrito abaixo, o comprimento do caminho do fluido depende em parte de fatores como o tamanho da amostra e a extensão da separação da amostra necessária para resolver a proteína de interesse.
[0074] Em algumas modalidades, o capilar inclui um tubo com um orifício. Em algumas modalidades, o método emprega uma pluralidade de capilares. Os tamanhos adequados incluem, mas não estão limitados a, capilares com diâmetros internos de cerca de 10 a cerca de 1000 μm, embora mais tipicamente capilares com diâmetros internos de cerca de 25 a cerca de 400 μm possam ser utilizados. Capilares de diâmetro menor usam cargas de amostra relativamente baixas, enquanto o uso de capilares de orifício relativamente grande permite cargas de amostra relativamente altas e pode resultar em detecção de sinal melhorada.
[0075] Os capilares podem ter comprimentos variados. Comprimentos adequados incluem, mas não estão limitados a, capilares de cerca de 1 a 20 cm de comprimento, embora capilares um pouco mais curtos e mais longos possam ser usados. Em algumas modalidades, o capilar tem cerca de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 cms de comprimento. Capilares mais longos normalmente resultam em separações melhores e resolução aprimorada de misturas complexas. Capilares mais longos podem ser de uso particular na resolução de proteínas de interesse de baixa abundância.
[0076] Geralmente, os capilares são compostos de sílica fundida, embora capilares de plástico e PYREX (ou seja, vidro amorfo) possam ser utilizados. Conforme observado acima, os capilares não precisam ter uma forma redonda ou tubular. Outras formas, desde que sejam compatíveis com os métodos descritos neste documento, também podem ser usadas.
[0077] Em algumas modalidades, o capilar pode ser um canal. Em algumas modalidades, o método emprega uma pluralidade de canais. Em algumas modalidades, o capilar pode ser um canal em um dispositivo microfluídico. A microfluídica emprega canais em um substrato para realizar uma ampla variedade de operações. Os dispositivos microfluídicos podem incluir um ou uma pluralidade de canais contornados em uma superfície de um substrato. O dispositivo microfluídico pode ser obtido a partir de um substrato sólido inerte e, em algumas modalidades, na forma de um chip. As dimensões do dispositivo microfluídico não são críticas, mas em algumas modalidades as dimensões são da ordem de cerca de 100 μm a cerca de 5 mm de espessura e cerca de 1 centímetro a cerca de 20 centímetros de lado. Tamanhos adequados incluem, mas não estão limitados a, canais com uma profundidade de cerca de 5 μm a cerca de 200 μm, embora mais tipicamente tendo uma profundidade de cerca de 20 μm a cerca de 50 μm possam ser utilizados. Canais menores, como micro ou nanocanais também podem ser usados, desde que sejam compatíveis com os métodos.
[0078] Os fragmentos de anticorpo podem ser obtidos a partir de um anticorpo de interesse, como um anticorpo monoclonal. Os fragmentos de anticorpos podem ser preparados por redução, digestão enzimática, desnaturação, fragmentação, clivagem química ou uma combinação dos mesmos. Os métodos divulgados neste documento são aplicáveis a qualquer isotipo de anticorpo, como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ou de isotipo misto.
[0079] A redução é para reduzir as ligações dissulfeto em dois tióis em uma proteína tridimensional, como o anticorpo monoclonal. A redução pode ser realizada por desnaturação por calor, adição de um surfactante ou adição de um agente desnaturante, por exemplo, HCl guanidina (6M), na presença de um agente redutor, por exemplo, TCEP- HCl. A degradação enzimática é uma digestão da proteína com uma protease, por exemplo, tripsina ou protease I de Achromobacter (Lys- C). Além disso, a glicoproteína pode ser desnaturada por calor ou produtos químicos, ou uma combinação dos mesmos. A fragmentação envolve a clivagem de porções de proteína de uma proteína de subunidade única ou múltipla, como um anticorpo monoclonal, com métodos físicos, biológicos ou químicos. Por exemplo, uma enzima degradante de imunoglobulina de S. pyogenes (IdeS) é comumente usada para fragmentação de subunidade de anticorpo.
[0080] Em várias modalidades, um anticorpo em uma amostra pode ser tratado e preparado por redução, degradação enzimática, desnaturação ou fragmentação antes do contato com o substrato de enriquecimento hidrofílico. Os métodos fornecem um novo método cromatográfico para caracterizar a modificação pós-tradução de anticorpos, por exemplo, terapêutica de anticorpo monoclonal (mAb), por meio de fragmentos. Em certas modalidades, as amostras em qualquer etapa intermediária podem ser concentradas, dessalinizadas ou semelhantes.
[0081] Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda a detecção dos fragmentos de anticorpo modificados pós-tradução, por exemplo, usando o sinal UV da porção de peptídeo dos fragmentos de anticorpo modificados pós-tradução. Isso pode ser feito para frações de uma amostra e permite a seleção de frações específicas para análise posterior, por exemplo, análise de espectrometria de massa (MS). Assim, em outras modalidades, a etapa de detecção compreende espectroscopia de massa ou cromatografia líquida-espectroscopia de massa (LC-MS). Em aplicações da espectrometria de massa para a análise de biomoléculas, as moléculas são transferidas da fase líquida ou sólida para a fase gasosa e para a fase de vácuo. Uma vez que muitas biomoléculas são grandes e frágeis (as proteínas são um excelente exemplo), dois dos métodos mais eficazes para sua transferência para a fase de vácuo são a ionização por dessorção a laser assistida por matriz (MALDI) ou ionização por eletropulverização (ESI). Aspectos do uso desses métodos e requisitos de preparação de amostra são conhecidos por aqueles versados na técnica. Em geral, ESI é mais sensível, enquanto MALDI é mais rápido. Significativamente, alguns peptídeos ionizam melhor no modo MALDI do que ESI e vice- versa (Genome Technology, junho 220, pág. 52). Os métodos e dispositivos do canal de extração da presente invenção são particularmente adequados para preparar amostras para análise de MS, especialmente amostras de biomoléculas, tais como fragmentos de anticorpos modificados pós-tradução. Uma vantagem importante da invenção é que ela permite a preparação de uma amostra enriquecida que pode ser analisada diretamente, sem a necessidade de etapas de processo intermediárias, por exemplo, concentração ou dessalinização.
[0082] O ESI é realizado misturando a amostra com ácido volátil e solvente orgânico e infundindo-a por meio de uma agulha condutora carregada com alta voltagem. As gotículas carregadas que são pulverizadas (ou ejetadas) da ponta da agulha são direcionadas para o espectrômetro de massa e secam pelo calor e vácuo à medida que voam para dentro. Depois que as gotas secam, as moléculas carregadas restantes são direcionadas por lentes eletromagnéticas para o detector de massa e a massa analisada. Em uma modalidade, a amostra eluída é depositada diretamente do capilar em um bocal de eletropulverização, por exemplo, o capilar funciona como o carregador de amostra. Em outra modalidade, o próprio capilar funciona como dispositivo de extração e bico de eletropulverização.
[0083] Para MALDI, as moléculas de analito (por exemplo, proteínas) são depositadas em alvos de metal e cocristalizadas com uma matriz orgânica. As amostras são secas e inseridas no espectrômetro de massa e, normalmente, analisadas por meio da detecção de tempo de voo (TOF). Em uma modalidade, a amostra eluída é depositada diretamente do capilar no alvo de metal, por exemplo, o próprio capilar funciona como o carregador de amostra. Em uma modalidade, o analito extraído é depositado em um alvo MALDI, uma matriz de ionização MALDI é adicionada e a amostra é ionizada e analisada, por exemplo, por detecção de TOF.
[0084] Em algumas modalidades, outros modos de ionização são usados, por exemplo, ESI-MS, espectrometria de massa de ionização de turbopulverização, espectrometria de massa de ionização de nanopulverização, espectrometria de massa de ionização de termopulverização, espectrometria de massa de ionização de pulverização sônica, SELDI-MS e MALDI-MS. Em geral, uma vantagem desses métodos é que eles permitem a purificação "just-in-time" da amostra e a introdução direta no ambiente ionizante. É importante notar que os vários modos de ionização e detecção apresentam suas próprias restrições sobre a natureza da solução de dessorção usada, e é importante que a solução de dessorção seja compatível com ambos. Por exemplo, a matriz da amostra em muitas aplicações deve ter baixa força iônica, ou residir dentro de uma faixa de pH particular, etc. Em ESI, o sal na amostra pode impedir a detecção reduzindo a ionização ou obstruindo o bico. Este problema é resolvido apresentando o analito em baixo teor de sal e/ou pelo uso de um sal volátil. No caso de MALDI, o analito deve estar em um solvente compatível com a mancha no alvo e com a matriz de ionização empregada. Em modalidades, o método inclui ainda a identificação dos fragmentos de anticorpo, por exemplo, a sequência dos fragmentos de anticorpo. Em modalidades, o método inclui ainda a identificação da modificação pós-tradução presente nos fragmentos de anticorpo. Em modalidades, o método inclui ainda o perfil de modificação pós- tradução do anticorpo de interesse. Em modalidades, o método inclui ainda o mapeamento de modificação pós-tradução de pontos críticos de modificação pós-tradução por análise de LC-MS/MS de mapeamento de peptídeo reduzido.
[0085] Embora modalidades específicas tenham sido descritas acima em detalhes, a descrição é meramente para fins de ilustração. Deve ser apreciado, portanto, que muitos aspectos descritos acima não são pretendidos como elementos necessários ou essenciais, a menos que explicitamente declarado de outra forma. Modificações e componentes equivalentes ou atos correspondentes aos aspectos divulgados das modalidades de exemplo, além daqueles descritos acima, podem ser feitas por uma pessoa versada na técnica, tendo o benefício da presente divulgação, sem se afastar do espírito e escopo das modalidades definidas nas reivindicações a seguir, cujo escopo deve receber a interpretação mais ampla, de modo a abranger tais modificações e estruturas equivalentes.
[0086] Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar características particulares de certas modalidades. No entanto, as características particulares descritas abaixo não devem ser consideradas como limitações ao escopo da invenção, mas sim como exemplos a partir dos quais equivalentes serão reconhecidos por aqueles versados na técnica.
[0087] O seguinte exemplo é apresentado de modo a fornecer aos versados na técnica uma divulgação e descrição completas de como preparar e utilizar os métodos da invenção e não se destinam a limitar o escopo do que os inventores consideram como sua invenção. Esforços têm sido feitos para garantir a precisão com respeito a números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.) mas alguns erros e desvios experimentais devem ser considerados. A menos que indicado de outra forma, as partes são partes em peso, o peso molecular é o peso molecular médio, a temperatura é em graus centígrados, a temperatura ambiente é de cerca de 25°C e a pressão é atmosférica ou próxima. Análise de Alto Rendimento da Heterogeneidade da Carga do Anticorpo por Eletroforese Capilar Microfluídica Nativa - Espectrometria de Massa
[0088] Desenvolva um método de espectrometria de massa (MS) de eletroforese capilar (CE) nativa de alta resolução, alta sensibilidade e alto rendimento para análise de heterogeneidade de carga de anticorpo.
[0089] Um modelo de mAb do NIST é usado para um estudo de degradação forçada. Amostras com diferentes tempos de incubação são clivadas por digestão com IdeS para gerar espécies de subunidades associadas a F(ab')2 ou Fc. O controle intacto e os anticorpos estressados são analisados por Zipchip CE-MS em estados quase nativos para a identificação de variantes de carga. As variantes de carga elevada são alocadas para F(ab')2 ou Fc pela análise de variante de carga de subunidade. Os pontos quentes de PTM são monitorados por análise LC-MS/MS de mapeamento de peptídeo reduzido. Os dados de massa intactos são processados pelo software PMi-Intact. Os dados de mapeamento de peptídeos reduzidos são processados pelo BioPharma Finder 3.0 e Skyline-daily 4.2 para identificação e quantificação de PTMs, respectivamente. Um anticorpo NIST foi usado para avaliação completa do sistema Zipchip CE-MS nativo. Os resultados mostraram carryover zero e boa reprodutibilidade run-to-run. A medição de alta sensibilidade foi obtida com 1ng de quantidade de carga de anticorpo. Variantes de carga ácida e básica foram bem separadas do pico principal para o padrão de anticorpo NIST por Zipchip CE executando em condições nativas. A análise de MS identificou duas variantes básicas correspondentes ao anticorpo com uma e duas lisinas C- terminais não processadas na cadeia pesada, enquanto uma variante ácida foi causada principalmente por desamidação. A separação de variante de carga comparável e de alta resolução foi alcançada entre IEX e CE-MS nativo usando o anticorpo NIST.
[0090] O padrão de referência de mAb NIST e suas formas estressadas pelo calor foram analisados após incubação a 45ºC por até 28 dias. Após a incubação, as amostras foram primeiro clivadas por digestão com IdeS para gerar fragmentos F(ab')2 e Fc. A análise de massa intacta de ambos os anticorpos de controle e estressados foi conduzida usando um método Zipchip CE-MS nativo universal. Os pontos quentes de PTM foram identificados por análise LC-MS / MS de mapeamento de peptídeo reduzido para elucidar as variantes de carga elevada sob condição de estresse. Um painel de quinze anticorpos, incluindo IgG1, IgG4 e mAbs biespecíficos, foi analisado usando o método Zipchip CE-MS nativo. Preparação de Amostras
[0091] Estudo de degradação forçada: o mAb NIST IgG1 (5 mg/mL, pH 6,0) foi incubado a 45ºC por 0, 1, 4, 8, 15 e 28 dias.
[0092] Tratamento IdeS: Cada amostra de mAb NIST foi diluída para 2 mg/mL com água Milli-Q. Em seguida, 125 unidades de IdeS (Promega) foram adicionadas a 100 μg de mAb na proporção enzima/anticorpo de 1,25/1. A mistura foi incubada a 37ºC com agitação a 600 rpm por 30 minutos para gerar fragmentos F(ab')2 e Fc. As amostras de controle e estressadas após cada estudo/tratamento foram armazenadas imediatamente a -20ºC. ZipChip CE-MS nativo
[0093] A análise de massa intacta do anticorpo e suas variantes de carga foi conduzida usando a interface Zipchip CE (908 Devices) acoplada ao espectrômetro de massa Exactive Plus EMR Obitrap (Thermo Scientific). Variantes de carga de anticorpo foram separadas em chip HRN microfluídico nativo (canal de separação de 22 cm, dispositivos 908) com eletrólito de fundo nativo (BGE), pH ~5,5 (dispositivos 908).
[0094] Parâmetros CE: Força de campo: 650 V/cm, Assistência de pressão: habilitada, Tempo de início de assistência de pressão: 0,2 min, Atraso de replicação: 30 seg, Volume de injeção: 1nL
[0095] Parâmetros MS:
[0096] Ajuste ESI: Tensão de pulverização: 0, Temperatura capilar: 300ºC, Lente S: 150, Gás de invólucro: 2, Gás auxiliar: 0, gás de aprisionamento: 1,0.
[0097] Método de aquisição: Análise de varredura completa com detecção de modo positivo, CIS na origem: 100 eV, Resolução: 17.500,
AGC: 3e6, TI máx: 50 ms, Microscans: 3, Faixa de varredura: 1000- 10000 m/z. Cromatografia de Troca Catiônica Forte (SCX)
[0098] Variantes de carga de anticorpo foram separadas em coluna MabPac SCX-10 (4 x 250 mm) com gradiente de pH usando tampão de pH CX-1 (A: 5,6, B: 10,2) (Thermo Fisher Scientific) em Agilent 1290 Infinity HPLC. A absorvância foi medida no comprimento de onda UV de 280 nm. Processamento de Dados
[0099] Os dados de massa intacta foram deconvoluídos usando o software PMI-Intact (Protein Metrics). Resultados
[00100] Um método altamente sensível e universal de 12 minutos usando ZipChip CE-MS nativo foi desenvolvido e aplicado para a análise de variante de carga de anticorpos IgG1, IgG4 e IgG4 biespecífico. A separação de variante de carga comparável foi obtida entre os métodos ZipChip CE-MS e SCX nativos. As variantes de carga resolvidas foram identificadas por análise de MS nativa. Os anticorpos com valores próximos de pI podem ser bem separados. Os anticorpos comigrados foram identificados individualmente com base no espectro de massa nativo simplificado. Níveis aumentados de variantes ácidas e fragmentos Fab resultantes da incubação sob a condição de estresse foram localizados dentro dos domínios F(ab')2 e Fc por análise de subunidade. Além disso, a análise de subunidade de resolução mais alta revelou uma variante ácida adicional introduzida a partir da isomerização e aumento das espécies semiglicosiladas em condições de estresse. Separação comparável de variantes de carga de anticorpo entre CE-MS e SCX-UV
[00101] Três padrões de anticorpos, incluindo IgG1, IgG4 e IgG4 biespecífico, foram analisados por SCX-UV de alta resolução e ZipChip CE-MS nativo. Perfis de separação de variantes de carga idênticos foram obtidos entre duas plataformas (Figura 2A-2B). Testes de sensibilidade e transferência de ZipChip CE-MS nativo
[00102] O ZipChip CE-MS combinado com nanospray ESI fornece grande sensibilidade de detecção de espécies de baixa abundância. IgG1 e IgG4 foram detectados a 0,01 ng e 0,02 ng, respectivamente. Nenhum carryover foi observado de injeções de run-to-run (Figuras 3A- 3C). Análise de Variante de Carga de Anticorpo Intacto
[00103] Controle intacto e controle de calor (45ºC) mAbs NIST estressados foram analisados por ZipChip CE-MS nativo. Os dados de massa deconvoluída indicaram que 4 clivagens principais de Fab na região de dobradiça superior do mAb NIST foram geradas após estresse por calor de 28 dias, além da variante ácida (A1) significativamente aumentada em comparação com o controle (Figura 4 e Tabela 2). Tabela 2. Sumário da Identificação de Variante de Carga Variantes de Controle NIST mAb MAb NIST estressado carga (45°C, pH 6,0, 28 dias) Básico 1 (B1) +1 lisina C-terminal +1 lisina C-terminal Básico 2 (B2) +2 lisina C-terminal +2 lisina C-terminal Básico 3 (B3) ND Clivagem Fab em His227/Thr228 Ácido 1 (A1) +Desamidação +Desamidação Ácido 2 (A2) ND Clivagem de Fab em Asp224/Lys225 Ácido 2a (A2a) ND Perda de Fab clivado em Cys223/Asp224 e Lys225/Thr226 Ácido 3 (A3) ND Perda de Fab clivado em His227/Thr228 Observação: ND - não detectado
Análise de Variante de Carga do Anticorpo F(ab')2 e Subunidades Fc
[00104] F(ab')2 e Fc foram bem separados pelo método universal CE-MS. Todos os picos menores foram identificados e mostrados nas Figuras 5A-5C. Novas variantes de carga resultantes da incubação de 28 dias foram mostradas em regiões realçadas em azul. Duas variantes básicas com 1 e 2 lisina C-terminal não processada foram localizadas na região Fc (Figura 5C). A variante básica 3, resultante da clivagem de Fab em His227/Thr228 na amostra estressada (45ºC, D28), foi identificada como variante básica F(ab')2 (b*1) na Figura 5B.
[00105] Todos os outros sítios de clivagem de Fab foram encontrados na região ácida de F(ab')2 e na mesma ordem em que foram identificados durante a análise de anticorpo intacto. Para a região Fc ácida, uma nova variante ácida A1a devido à isomerização de Asp apareceu na amostra D28. Em comparação com o Fc principal, o aumento de massa de +1 Da de a1 e a1a indicou que a variante ácida pode ser causada por desamidação. Isto foi confirmado pelo resultado do mapeamento de peptídeo mostrado na Tabela 3. Tabela 3. Sumário dos principais PTMs mostrando diferença em condições de estresse Região de PTMs Sítio D0 (controle) D1 D4 D7 D15 D28 Anticorpo Fc Desamidação HC Asn387 1,61% 1,64% 1,71% 1,91% 2,15% 2,64% Desamidação HC Asn392 0,75% 0,83% 1,04% 1,40% 1,99% 3,03% Oxidação HC Met255 1,23% 1,56% 1,66% 1,88% 2,05% 3,00 % Isomerização HC Asp283 0,65% 0,70% 0,87% 1,29% 1,70% 2,81% F(ab’)2 Isomerização LC Asp166 2,65% 3,28% 3,58% 4,64% 5,59% 7,62%
Separação de Misturas de Anticorpos para Análise de Massa Intacta de Alto Rendimento
[00106] Três mAbs IgG1 na mistura1 (Figura 6A) e cinco mAbs biespecíficos IgG4 na mistura2 (Figura 6B) foram bem separados, que podem ser aplicados para análise de massa intacta de fármacos coformulados. Mesmo se dois anticorpos comigraram juntos (destaque em azul na Figura 6C), aqueles podem ser identificados individualmente a partir de dados de MS nativos (Figura 6D e 6E), consulte a Figura 6E para espectros convolutos.
[00107] Além da análise de variante de carga de alta resolução de um único anticorpo, o método nativo ZipChip CE-MS também pode ser usado como uma abordagem de alto rendimento e alta sensibilidade para análise de massa intacta da mistura de anticorpos e ADCs.
[00108] A presente invenção não deve ser limitada em escopo pelas modalidades específicas descritas neste documento. De fato, várias modificações da invenção além daquelas mostradas e descritas neste documento se tornarão evidentes para os versados na técnica a partir da descrição anterior e das figuras anexas. Tais modificações se destinam a cair dentro do escopo das reivindicações anexas.
Claims (20)
1. Método para detectar e/ou discriminar entre variantes de modificação pós-tradução de um anticorpo de interesse em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende: colocar uma amostra compreendendo um ou mais anticorpos de interesse em contato com uma protease para digerir a amostra em fragmentos de anticorpo; separar fragmentos de anticorpos por peso molecular e/ou carga em um ou mais capilares usando eletroforese capilar; eluir fragmentos de anticorpo separados de um ou mais capilares; e determinar a massa dos fragmentos de anticorpo eluídos por análise de espectrometria de massa, detectando assim e/ou discriminando entre variantes de modificação pós-tradução do anticorpo de interesse.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a modificação pós-tradução compreende um ou mais dentre desamidação, oxidação, glicação, formação de dissulfeto, formação de piroglutamato N-terminal, remoção de lisina C-terminal e glicosilação de alta manose.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a protease compreende IdeS.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que os fragmentos de anticorpo compreendem uma ou mais entre uma subunidade de anticorpo F(ab')2 ou Fc.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de interesse é um anticorpo monoclonal.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações
1 a 5, caracterizado pelo fato de que os fragmentos de anticorpo são separados por carga e o método é um método de detecção e/ou discriminação entre variantes de carga do anticorpo de interesse.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que os fragmentos de anticorpo são separados por peso molecular e o método é um método de detecção e/ou discriminação entre variantes de tamanho do anticorpo de interesse.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende ainda determinar uma quantidade relativa ou absoluta das variantes de modificação pós- tradução de um anticorpo de interesse em uma amostra.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de interesse compreende um anticorpo biespecífico.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a amostra inclui um padrão interno.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que um ou mais capilares compreendem uma matriz de separação.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a matriz de separação compreende uma matriz de peneiramento configurada para separar proteínas por peso molecular.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a eluição de fragmentos de anticorpo separados de um ou mais capilares compreende ainda a separação dos fragmentos de anticorpo em uma ou mais frações.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que compreende ainda identificar os fragmentos de anticorpo.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende ainda identificar a modificação pós-tradução presente nos fragmentos de anticorpo.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de interesse é do isotipo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ou isotipo misto.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o perfil de modificação pós-tradução do anticorpo de interesse.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o mapeamento de modificação pós-tradução de pontos críticos de modificação pós- tradução por análise de LC-MS/MS de mapeamento de peptídeo reduzido.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende uma mistura de anticorpos de interesse.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de interesse é um conjugado de fármaco de anticorpo.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201962799331P | 2019-01-31 | 2019-01-31 | |
| US62/799,331 | 2019-01-31 | ||
| US201962851365P | 2019-05-22 | 2019-05-22 | |
| US62/851,365 | 2019-05-22 | ||
| PCT/US2020/015875 WO2020160266A1 (en) | 2019-01-31 | 2020-01-30 | Native microfluidic ce-ms analysis of antibody charge heterogeneity |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR112021013716A2 true BR112021013716A2 (pt) | 2021-09-21 |
Family
ID=69811860
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BR112021013716-5A BR112021013716A2 (pt) | 2019-01-31 | 2020-01-30 | Análise microfluídica nativa ce-ms de heterogeneidade de carga de anticorpo |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20200249241A1 (pt) |
| EP (1) | EP3918339A1 (pt) |
| JP (1) | JP2022519246A (pt) |
| KR (1) | KR20210122803A (pt) |
| CN (1) | CN113646638B (pt) |
| AU (1) | AU2020216172A1 (pt) |
| BR (1) | BR112021013716A2 (pt) |
| CA (1) | CA3126712A1 (pt) |
| IL (1) | IL284929A (pt) |
| MX (1) | MX2021009267A (pt) |
| SG (1) | SG11202108033TA (pt) |
| WO (1) | WO2020160266A1 (pt) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114544839A (zh) * | 2022-01-20 | 2022-05-27 | 未名生物医药有限公司 | 一种抗人神经生长因子抗体的电荷变异体检测方法 |
| TW202346856A (zh) * | 2022-03-18 | 2023-12-01 | 美商里珍納龍藥品有限公司 | 分析多肽變體的方法及系統 |
| WO2024020199A1 (en) * | 2022-07-21 | 2024-01-25 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Native microfluidic ce-ms analysis of antibody charge heterogeneity |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2862134B1 (fr) * | 2003-11-12 | 2007-07-27 | Sebia Sa | Analyse et typage de proteines monoclonales par electrophorese capillaire et immunodeplacement |
| CN101201355A (zh) * | 2006-12-15 | 2008-06-18 | 许洋 | 免疫组质谱检测个体化肿瘤生物标志及疗效试剂盒和方法 |
| US20100187113A1 (en) * | 2009-01-26 | 2010-07-29 | Vladislav Dolnik | Capillary sieving electrophoresis with a cationic surfactant for size separation of proteins |
| MX2011014008A (es) | 2009-06-26 | 2012-06-01 | Regeneron Pharma | Anticuerpos biespecificos facilmente aislados con formato de inmunoglobulina original. |
| CN103033628A (zh) * | 2012-12-18 | 2013-04-10 | 北京科技大学 | 制备个体全蛋白质组芯片的方法及其应用 |
| GB201603291D0 (en) * | 2016-02-25 | 2016-04-13 | Binding Site Group The Ltd | Antibodies |
-
2020
- 2020-01-30 US US16/777,230 patent/US20200249241A1/en active Pending
- 2020-01-30 MX MX2021009267A patent/MX2021009267A/es unknown
- 2020-01-30 KR KR1020217026598A patent/KR20210122803A/ko unknown
- 2020-01-30 BR BR112021013716-5A patent/BR112021013716A2/pt unknown
- 2020-01-30 AU AU2020216172A patent/AU2020216172A1/en active Pending
- 2020-01-30 SG SG11202108033TA patent/SG11202108033TA/en unknown
- 2020-01-30 EP EP20711357.2A patent/EP3918339A1/en active Pending
- 2020-01-30 JP JP2021544511A patent/JP2022519246A/ja active Pending
- 2020-01-30 WO PCT/US2020/015875 patent/WO2020160266A1/en unknown
- 2020-01-30 CA CA3126712A patent/CA3126712A1/en active Pending
- 2020-01-30 CN CN202080009967.XA patent/CN113646638B/zh active Active
-
2021
- 2021-07-18 IL IL284929A patent/IL284929A/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA3126712A1 (en) | 2020-08-06 |
| IL284929A (en) | 2021-09-30 |
| AU2020216172A1 (en) | 2021-08-05 |
| CN113646638A (zh) | 2021-11-12 |
| WO2020160266A1 (en) | 2020-08-06 |
| EP3918339A1 (en) | 2021-12-08 |
| CN113646638B (zh) | 2024-05-24 |
| KR20210122803A (ko) | 2021-10-12 |
| US20200249241A1 (en) | 2020-08-06 |
| JP2022519246A (ja) | 2022-03-22 |
| SG11202108033TA (en) | 2021-08-30 |
| MX2021009267A (es) | 2021-09-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gahoual et al. | Cutting-edge capillary electrophoresis characterization of monoclonal antibodies and related products | |
| RU2476886C2 (ru) | Способ характеризации рекомбинантного поликлонального белка | |
| Giorgetti et al. | Combination of intact, middle-up and bottom-up levels to characterize 7 therapeutic monoclonal antibodies by capillary electrophoresis–Mass spectrometry | |
| BR112021013716A2 (pt) | Análise microfluídica nativa ce-ms de heterogeneidade de carga de anticorpo | |
| Patrick et al. | Review applications of capillary electrophoresis to the analysis of biotechnology‐derived therapeutic proteins | |
| Biacchi et al. | Top-down and middle-down approach by fraction collection enrichment using off-line capillary electrophoresis–mass spectrometry coupling: application to monoclonal antibody Fc/2 charge variants | |
| Todoroki et al. | Current mass spectrometric tools for the bioanalyses of therapeutic monoclonal antibodies and antibody-drug conjugates | |
| Maráková et al. | Capillary electrophoresis‐mass spectrometry for intact protein analysis: Pharmaceutical and biomedical applications (2018–March 2023) | |
| Schwenzer et al. | Capillary electrophoresis‐mass spectrometry for protein analyses under native conditions: Current progress and perspectives | |
| US20230043610A1 (en) | Native microfluidic ce-ms analysis of antibody charge heterogeneity | |
| US20240053359A1 (en) | Native microfluidic ce-ms analysis of antibody charge heterogeneity | |
| WO2024020199A1 (en) | Native microfluidic ce-ms analysis of antibody charge heterogeneity | |
| Han et al. | Therapeutic monoclonal antibody intact mass analysis by capillary electrophoresis–mass spectrometry | |
| US20230018713A1 (en) | Characterization of proteins by anion-exchange chromatography mass spectrometry (aex-ms) | |
| Zeng et al. | Impurity characterization and quantification by liquid chromatography–high-resolution mass spectrometry | |
| Dremina et al. | The Role of Liquid Chromatography–Mass Spectrometry in the Characterization of Therapeutic Monoclonal Antibodies | |
| Reinert et al. | CE–MS Methods for the Characterization of Monoclonal Antibodies | |
| CN118076890A (zh) | 通过阴离子交换色谱质谱(aex-ms)表征蛋白质 | |
| Han et al. | Capillary Electrophoresis–Mass Spectrometry (CE-MS) by Sheath–Flow Nanospray Interface and Its Use in Biopharmaceutical Applications | |
| Pinetre et al. | High‐throughput untargeted screening of biotherapeutic macromolecules in equine plasma by UHPLC‐HRMS/MS: Application to monoclonal antibodies and Fc‐fusion proteins for doping control | |
| Mojumdar et al. | Advances in mass spectrometry-based approaches for characterizing monoclonal antibodies: resolving structural complexity and analytical challenges | |
| Biacchi et al. | Top-down and middle-down approach by fraction collection enrichment using CE-UV/MALDI-MS: Application to monoclonal antibody F c/2 charge variants | |
| Belov | Top-Down Proteomic Analysis of Protein Pharmaceuticals, Mixtures of Protein Complexes, and Ribosomal Protein Extracts by Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry | |
| Wang | Dynamic pH junction focusing and isoelectric focusing in capillary electrophoresis mass spectrometry | |
| KR20230123498A (ko) | 생체분자에서 스크램블된 디설파이드의 식별 방법 |