KR20210122803A - 항체 전하 이질성의 고유 마이크로유체 ce-ms 분석 - Google Patents

Abstract

샘플에서 관심 항체의 번역 후 변형 변이체를 검출하고/거나 구별하는 방법. 방법은 하기 단계를 포함한다: 샘플을 항체 단편으로 소화하기 위해 하나 이상의 관심 항체를 포함하는 샘플을 프로테아제와 접촉시키는 단계; 모세관 전기영동을 사용하여 하나 이상의 모세관에서 분자량 및/또는 전하에 의해 항체 단편을 분리하는 단계; 하나 이상의 모세관으로부터 분리된 항체 단편을 용리하는 단계; 및 질량 스펙트럼 분석에 의해 용리된 항체 단편의 질량을 결정하여, 관심 항체의 번역 후 변형 변이체를 검출하고/거나 구별하는 단계.

Description

항체 전하 이질성의 고유 마이크로유체 CE-MS 분석

서열 목록에 대한 참조

본 출원은 2019년 5월 22일에 생성되고 487 바이트를 포함하는, 파일 10553P2-US_Sequence.txt로서 컴퓨터로 판독 가능한 형태로 제출된 서열 목록을 참조로 포함한다.

발명의 분야

본 발명은 바이오의약품에 속하고, 치료용 항체의 시험관 내 및/또는 생체 내 번역 후 변형을 검출하기 위한 모세관 전기영동 및 질량 스펙트럼 분석의 용도에 관한 것이다.

단일클론 항체 (mAb)는 바이오치료제 제품의 중요한 부류이고, 이들은 많은 생명을 위협하는 만성 질환의 치료에 뛰어난 성공을 달성하였다. 그러나, 특정 상황에서 치료적 단일클론 항체 (mAb)는 번역 후 변형 (PTM)으로 발생하는 변이체를 비롯한, 많은 생성물 변이체를 갖는 포유동물 세포에서 생성된 이종 분자이다. PTM을 통해 생성된 변이체는 생산, 정제, 보관 및 사후관리 동안 mAb의 수명 내내 발생할 수 있다. 이러한 변이체 또는 생성물 관련 변형은 제품 품질 속성 (PQA)으로도 지칭된다. 사전 정의된 허용 기준 내에서 PQA를 제어하는 것은 일관된 제품 품질을 보장하고 의약품 안전성 및 효능에 대한 잠재적인 영향을 줄이기 때문에 바이오 제약 산업에 매우 중요하다.

따라서 각각의 산업적 단일클론 항체는 개발 및 최종 제품의 제조 모두 동안 이들 제품의 평가 동안 고려해야 할 특징, 독특한 프로필을 나타낼 수 있다. 산업에 대한 식품의약품국 지침은 스폰서가 생체 내 환경 내에서 변형에 대한 치료적 단백질의 감수성을 평가해야 한다고 권장한다 (Guidance for Industry, Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products. 2014 참조). 결과적으로, 탈아미드화 (예를 들어, Huang 등, Analytical chemistry 2005; 77:1432-9; Ouellette 등, mAbs 2013; 5:432-44; Yin 등, Pharmaceutical research 2013; 30:167-78; Li 등, mAbs 2016:0; Li 등, mAbs 2016:0 참조), 산화 (예를 들어, Yin 등, Pharmaceutical research 2013; 30:167-78; Li 등, mAbs 2016:0; Li 등, mAbs 2016:0 참조), 당화 (예를 들어, Goetze 등, Glycobiology 2012; 22:221-34 참조), 글리코실화 (예를 들어, Li 등, mAbs 2016:0; Li 등, mAbs 2016:0; Goetze 등, Glycobiology 2011; 21:949-59; Alessandri 등, mAbs 2012; 4:509-20. 참조), 이황화물 (예를 들어, Li Y등, mAbs 2016:0; Liu 등, The Journal of biological chemistry 2008; 283:29266-72 참조), N-말단 피로글루타메이트 (예를 들어, Yin 등, Pharmaceutical research 2013; 30:167-78; Li 등, mAbs 2016:0; Li 등, mAbs 2016:0; Liu 등, The Journal of biological chemistry 2011; 286:11211-7 참조), 및 C-말단 라이신 제거 (예를 들어, Li 등, mAbs 2016:0; Cai 등, Biotechnology and bioengineering 2011; 108:404-12 참조)를 포함하는, 많은 PQA의 시험관 내 및/또는 생체 내 거동이 동물 또는 인간 샘플에서 조사되었다. 따라서, mAb 제제를 모니터링하는 추가 방법이 필요하다.

한 양태에서, 본 발명은 샘플에서 관심 항체의 번역 후 변형 변이체를 검출하고/거나 구별하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: 샘플을 항체 단편으로 소화시키기 위해 하나 이상의 관심 항체를 포함하는 샘플을 프로테아제와 접촉시키는 단계; 모세관 전기영동을 사용하여 하나 이상의 모세관에서 분자량 및/또는 전하에 따라 항체 단편을 분리하는 단계; 하나 이상의 모세관으로부터 분리된 항체 단편을 용리하는 단계; 및 질량 스펙트럼 분석에 의해 용리된 항체 단편의 질량을 결정함으로써, 관심 항체의 번역 후 변형 변이체를 검출하고/거나 구별하는 단계.

상기 방법의 다양한 구현예에서, 상기 번역 후 변형은 중 하나 이상 탈아미드화, 산화, 당화, 이황화물 형성, N-말단 피로글루타메이트 형성, C-말단 리신 제거, 및 고 만노오스 글리코실화를 포함한다.

상기 방법의 다양한 구현예에서, 상기 프로테아제는 IdeS를 포함한다.

상기 방법의 다양한 구현예에서, 상기 항체 단편은 F(ab')₂ 또는 Fc 항체 서브유닛 중 하나 이상을 포함한다.

상기 방법의 다양한 구현예에서, 상기 관심 항체는 mAb이다.

상기 방법의 다양한 구현예에서, 상기 항체 단편은 전하에 의해 분리되고 상기 방법은 관심 항체의 전하 변이체를 검출하고/거나 구별하는 방법이다.

상기 방법의 다양한 구현예에서, 상기 항체 단편은 분자량에 의해 분리되고 상기 방법은 관심 항체의 크기 변이체를 검출하고/거나 구별하는 방법이다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 샘플에서 관심 항체의 번역 후 변형 변이체 상대 또는 절대량을 결정하는 단계를 추가로 포함한다.

상기 방법의 다양한 구현예에서, 상기 관심 항체는 이중특이적 항체를 포함한다.

상기 방법의 다양한 구현예에서, 상기 샘플은 내부 표준을 포함한다.

상기 방법의 다양한 구현예에서, 상기 하나 이상의 모세관은 분리 매트릭스를 포함한다.

상기 방법의 다양한 구현예에서, 상기 분리 매트릭스는 분자량에 의해 단백질을 분리하도록 구성된 체질 매트릭스를 포함한다.

상기 방법의 다양한 구현예에서, 하나 이상의 모세관으로부터 분리된 항체 단편을 용리하는 단계는 항체 단편을 하나 이상의 분획으로 분리하는 것을 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 항체 단편을 식별하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 항체 단편에 존재하는 번역 후 변형을 식별하는 단계를 추가로 포함한다.

상기 방법의 다양한 구현예에서, 상기 관심 단일클론 항체는 동형 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 혼합된 동형이다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 관심 항체의 번역 후 변형 프로파일링을 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 환원 펩티드 매핑 LC-MS/MS 분석에 의한 번역 후 변형 핫스팟의 번역 후 변형 매핑을 추가로 포함한다.

상기 방법의 다양한 구현예에서, 상기 샘플은 관심 항체의 혼합물을 포함한다.

상기 방법의 다양한 구현예에서, 상기 관심 단일클론 항체는 항체 약물 컨쥬게이트이다.

다양한 구현예에서, 상기 또는 본원에서 논의된 임의의 기능 또는 구성요소는 조합될 수 있고, 이러한 조합은 본 개시의 범위 내에 포함된다. 상기 또는 본원에서 논의된 임의의 특정 값은 범위의 상한 및 하한을 나타내는 값을 갖는 범위를 언급하기 위해 상기 또는 본원에서 논의된 다른 관련 값과 조합될 수 있고, 이러한 범위는 본 개시의 범위 내에 포함된다.

도 1은 모세관 전기영동 및 질량 스펙트럼 분석에 의한 번역 후 변형된 항체 단편의 분리 및 검출에 대한 예시적인 작업 흐름의 다이아그램이다.
도 2a 및 2b는 CE-MS (도 2a)와 SCX-UV (도 2b) 사이의 항체 전하 변이체의 비교 가능한 분리를 나타내는 흔적의 세트이다.
도 3a-3c는 고유 ZipChip CE-MS의 감도 및 캐리오버 검사를 나타내는 그래프의 세트이다. 고유 ZipChip CE의 IgG1 (도 3a), IgG4 (도 3b) 및 제로 캐리오버 (도 3c)의 감도.
도 4는 온전한 NIST mAb 및 서열 번호 1의 전하 변이체 분리를 나타내는 그래프의 세트이다.
도 5a-5c는 항체 F(ab')2 및 Fc 서브유닛의 전하 변이체 분석을 나타내는 흔적의 세트이다. IdeS 처리된 대조군 및 스트레스를 받은 NIST mAb의 전하 변이체 분리 (도 5a), F(ab')2 (도 5b) 및 Fc (도 5c) 영역의 줌-인 전기영동도.
도 6a-6e는 3 IgG1 mAbs (도 6a), 5개의 이중특이적 IgG4 mAb (도 6b), 10개의 mAb (도 6c)의 분리 및 고유 ZipChip CE-MS에 의해 공동 이동된 mAb의 식별 (도 6d 및 6e)을 나타내는 그래프의 세트이다.

본 발명을 기술하기 전에, 본 발명은 기술된 특정 방법 및 실험 조건에 한정되지 않고, 이러한 방법 및 조건은 다양할 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 본 발명의 범위는 첨부된 청구 범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며 제한하려는 의도가 아님이 이해되어야 한다. 구현예의 임의의 구현예 또는 특징은 서로 조합될 수 있으며, 이러한 조합은 본 발명의 범위 내에 명시적으로 포함된다.

달리 기술되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 실행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 이제 특정 방법 및 재료가 기술된다. 언급된 모든 출판물은 본원에 참고로 포함된다.

용어 "a"는 "적어도 하나의"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다; 그리고 용어 "약" 및 "대략"은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 표준 변이를 허용하는 것으로 이해되어야 하고; 범위가 제공되는 경우, 종점은 포함된다.

본원에 사용된 약어

mAb: 단일클론 항체

biAb: 이중특이적 항체

CQA: 중요 품질 속성

CE: 모세관 전기영동

PTM: 번역 후 변형 변이체

IEC: 이온 교환 크로마토그래피

UV: 자외선

QC: 품질 관리

MS: 질량 스펙트럼

ADC: 항체 약물 컨쥬게이트

본원에서 사용된, 용어 "항체"는 4개의 폴리펩티드 사슬, 이황화 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L) (즉, "전체 항체 분자"), 뿐만 아니라 이의 다량체 (예를 들어 IgM) 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 면역글로불린 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 ("HCVR" 또는 "V_H") 및 중쇄 불변 영역 (도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3을 포함)을 포함한다. 다양한 구현예에서, 중쇄는 IgG 동형일 수 있다. 일부 경우에, 중쇄는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 중쇄는 선택적으로 동형 IgG1/IgG2 또는 IgG4/IgG2의 키메라 힌지 영역을 포함하는, 동형 IgG1 또는 IgG4이다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 ("LCVR" 또는 "V_L") 및 경쇄 불변 영역 (C_L)을 포함한다. V_H 및 V_L 영역은 더 보존된, 프레임워크 영역 (FR)이라는 영역에 산재된 상보성 결정 영역 (CDR)이라는 초가변성의 영역으로 추가로 분할될 수 있다. 각각의 V_H 및 V_L은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 용어 "항체"는 임의의 동형 또는 서브클래스의 글리코실화 및 비-글리코실화 면역글로불린 모두에 대한 지칭을 포함한다. 용어 "항체"는 항체를 발현하기 위해 형질감염된 숙주 세포로부터 단리된 항체와 같은, 재조합 수단에 의해 제조되고, 발현되고, 생성되거나 단리되는 항체 분자를 포함한다. 항체 구조에 대한 검토를 위해, Lefranc 등,　IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,　27(1) Dev. Comp. Immunol. 55-77 (2003); 및 M. Potter,　Structural correlates of immunoglobulin diversity,　2(1) Surv. Immunol. Res. 27-42 (1983) 참조.

용어 항체는 또한 "이중특이적 항체"를 포함하고, 이는 하나의 상이한 에피토프 이상에 결합할 수 있는 이종사량체 면역글로불린을 포함한다. 단일 중쇄 및 단일 경쇄 및 6개의 CDR을 포함하는, 이중특이적 항체의 하나의 절반은 하나의 항원 또는 에피토프에 결합하고, 항체의 다른 절반은 상이한 항원 또는 에피토프에 결합한다. 일부 경우에, 이중특이적 항체는 동일한 항원에 결합할 수 있지만, 상이한 에피토프 또는 비중첩 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 이중특이적 항체의 두 반쪽은 이중특이성을 유지하면서 동일한 경쇄를 가지고 있다. 이중특이적 항체는 미국 특허 출원 공보 번호 2010/0331527(Dec. 30, 2010)에 일반적으로 기술되어 있다.

용어 항체의 "항원-결합 부분" (또는 "항체 단편")은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하고 있는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진, dAb 단편 (Ward 등 (1989) Nature 241:544-546), (vi) 단리된 CDR, 및 (vii) VL 및 VH 영역 쌍이 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬을 형성하는 합성 링커에 의해 연결되는, Fv 단편의 2개의 도메인, VL 및 VH으로 이루어진 scFv를 포함한다. 단일 사슬 형태의 다른 형태, 예를 들어 디아바디가 또한 용어 "항체"에 포함된다 (예를 들어 Holliger et at. (1993) 90 PNAS U.S.A. 6444-6448; 및 Poljak et at. (1994) 2 Structure 1121-1123 참조).

또한, 항체 및 이의 항원-결합 단편은 당 업계에서 일반적으로 공지된 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 얻을 수 있다 (Sambrook 등, 1989 참조).

용어 "인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 인간 mAb는 예를 들어 CDR 및 특정 CDR3에서 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관 내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발 또는　생체 내　체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용된, 용어 "인간 항체"는 다른 포유동물 종 (예를 들어, 마우스)의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열에 mAb가 인간 FR 서열에 이식된 것을 포함하는 것으로 의도되지 않는다. 용어는 비-인간 포유동물, 또는 비-인간 포유동물의 세포에서 재조합적으로 생산된 항체를 포함한다. 용어는 인간 대상체로부터 단리되거나 생성된 항체를 포함하도록 의도되지 않는다.

용어 "ADC" 또는 "항체-약물 컨쥬게이트"는 세포독성제, 화학치료 약물, 면역억제제 또는 방사성 동위원소와 같은 치료적 모이어티와 컨쥬게이션되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 지칭한다. 세포독성제는 세포의 성장, 생존력 또는 증식에 해로운 임의의 작용제를 포함한다. ADC 형성에 적합한 세포독성제 및 화학치료제의 예는 당업계에 공지되어 있다.

본원에서 사용된, 용어 "샘플"은 적어도 하나의 관심 폴리펩티드, 예를 들어 단일클론 항체 또는 이중특이적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 분자의 혼합물을 지칭하고, 이는 예를 들어, 분리, 분석, 추출, 농축 또는 프로파일링을 비롯하여 본 발명의 방법에 따라 조작이 실시된다.

본원에서 사용된, 용어 "분석" 또는 "분석하는"은 상호 교환적으로 사용되고 항체 제제의 관심 분자 (예를 들어, 폴리펩티드, 예를 들어 항체) 및 오염물의 분리, 검출, 단리, 정제, 가용화, 검출 및/또는 특성화의 임의의 다양한 방법을 지칭한다. 예는 전기영동, 질량 분광분석, 예를 들어, 탠덤 질량 분광분석, 자외선 검출, 및 이의 조합을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용된, "크로마토그래피"는 혼합물, 예를 들어 펩티드, 단백질, 폴리펩티드 및/또는 항체, 예를 들어 단일클론 항체를 함유하는 혼합물을 분리하는 공정을 지칭한다. 이는 고정상을 통해 혼합물을 통과시키는 것을 포함하고, 이는 관심 분자를 혼합물의 다른 분자와 분리하여 하나 이상의 관심 분자가 단리될 수 있도록 한다. 본원에 개시된 방법에서 크로마토그래피는 크기 기반 모세관 전기영동 및 등전점 전기영동 또는 전하 기반 모세관 전기영동을 포함하는, 모세관 전기영동을 지칭한다.

본원에서 사용된, 용어 "단리된"은 유기체의 세포에서 다른 생물학적 구성요소로부터 분리되고, 별도로 생산되고, 또는 정제된 생물학적 구성요소 (예를 들어 항체, 예를 들어 단일클론 항체)를 지칭하고 여기서 구성요소는 자연적으로 발생하거나 형질 전환으로　발현된, 즉, 다른 염색체 및 염색체 외 DNA 및 RNA, 단백질, 지질, 및 대사 산물이다. 따라서 "단리된" 핵산, 펩티드, 단백질, 지질 및 대사 산물은 표준 또는 비표준 정제 방법으로 정제된 핵산, 펩티드, 단백질, 지질, 및 대사 산물을 포함한다. 용어는 또한 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산, 펩티드, 단백질, 지질, 및 대사 산물뿐만 아니라 화학적으로 합성된 펩티드, 지질, 및 대사 산물, 및 핵산을 포괄한다.

용어 "펩티드", "단백질" 및 "폴리펩티드"는 상호 교환적으로, 펩티드 결합 또는 펩티드 결합 모방체에 의해 결합된 아미노산 및/또는 아미노산 유사체의 중합체를 지칭한다. 20개의 자연 발생 아미노산 및 이들의 한 글자 및 세 글자 명칭은 다음과 같다: 알라닌 A Ala; 시스테인 C Cys; 아스파르트산 D Asp; 글루타민산 E Glu; 페닐알라닌 F Phe; 글리신 G Gly; 히스티딘 H His; 이소류신 I He; 라이신 K Lys; 류신 L Leu; 메티오닌 M Met; 아스파라긴 N Asn; 프롤린 P Pro; 글루타민 Q Gln; 아르기닌 R Arg; 세린 S Ser; 트레오닌 T Thr; 발린 V Val; 트립토판 w Trp; 및 티로신 Y Tyr. 하나의 다른 구현예에서 펩티드는 항체 또는 단편 또는 이의 일부, 예를 들어, 상기 열거된 임의의 단편 또는 항체 사슬이다. 일부 구현예에서, 펩티드는 번역 후 변형될 수 있다. 본원에서 사용된, 용어 "관심 단백질" 및/또는 "관심 표적 단백질"은 본원에 제공된 방법에 의해 분리되고/거나 검출되는 단백질을 지칭한다. 적합한 관심 단백질은 항체, 예를 들어 단일클론 항체, 및 이의 단편을 포함한다.

"검출하다" 및 "검출"은 그들의 표준 의미를 가지고, 관심 단백질, 예를 들어 mAb 또는 이의 단편의 존재 또는 부재, 측정, 및/또는 특성화를 포함하는 검출을 포함하는 것으로 의도한다.

본원에서 사용된, 용어 "표준" 및/또는 "내부 표준"은 분자량 또는 전기영동에 의한 등전점을 기준으로 샘플 및 샘플의 표준 및 분자에 첨가할 수 있는 잘 특성화된 물질의 알려진 양 및/또는 독자성 (예를 들어, 공지된 분자량, 전기영동 이동성 프로파일)을 지칭한다). 그런 다음 표준의 비교는 분석물, 예를 들어 샘플에 존재하는 mAb 또는 이의 단편의 양의 정량적 또는 반-정량적 측정을 제공한다.

본원에서 사용된, "접촉하는"은 용액 또는 고체상에서 적어도 2개의 물질을 함께 모으는 것, 예를 들어 샘플과 효소, 예를 들어 프로테아제를 접촉시키는 것을 포함한다.

용어 "대응하는"은 위치, 목적 또는 구조의 유사성을 나타내는 상대적 용어이고, 번역 후 변형이 있거나 없지만 동일한 구조의 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 번역 후 변형이 있거나 없지만 동일한 구조의 대응하는 펩티드로 인한 질량 스펙트럼에서 질량 스펙트럼 신호는 "대응하는" 질량 스펙트럼 신호이다. 특정 펩티드로 인한 질량 스펙트럼 신호는 또한 펩티드에 대응하는 신호로서 지칭된다. 특정 구현예에서, 특정 펩티드 서열 또는 아미노산 세트는 대응하는 펩티드 질량에 할당될 수 있다.

본원에서 사용된, 용어 "단편 펩티드" 또는 "펩티드 단편"은 단편화, 효소 단백질분해, 또는 화학적 가수분해를 포함하는 과정을 통해 전장 폴리펩티드, 예를 들어 단백질 및/또는 단일클론 항체로부터 유래된 펩티드를 지칭한다. 이러한 단백질 분해 펩티드는 IdeS 프로테아제와 같은 하나 이상의 프로테아제로 단백질을 처리하여 생성된 펩티드를 포함한다. 단편 펩티드, 또한 펩티드 단편은 소화된 펩티드일 수 있다.

"질량 분광분석"은 샘플로부터 기체상 이온을 생성하여 분석되는 방법을 지칭하고, 그런 다음 이는 이들의 질량 대 전하 비율 (m/z)에 따라 분리되고 검출된다. 샘플로부터 기체상 이온을 생성하는 방법은 전기분무 이온화 (ESI), 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 (MALDI), 표면 강화 레이저 탈착 이온화 (SELDI), 화학 이온화, 및 전자 충격 이온화 (EI)를 포함한다. 이들의 m/z 비율에 따른 이온의 분리는 사중극자 질량 분석기 (Q), 비행 시간법 (TOF) 질량 분석기, 자기 섹터 질량 분석기, 3D 및 선형 이온 트랩 (IT), 오비트랩 질량 분석기, 푸리에-변환 이온 사이클로트론 공명 (FT-ICR) 분석기, 및 이들의 조합 (예를 들어, 사중극자-비행 시간법 분석기, 또는 Q-TOF 분석기)을 포함하는 임의의 유형의 질량 분석기로 수행될 수 있다. 분리 전에, 샘플은 하나 이상의 차원의 크로마토그래피 분리, 예를 들어, 하나 이상의 차원의 액체 또는 크기 배제 크로마토그래피를 거칠 수 있다.

탠덤 질량 분광분석 또는 MS/MS는 선택된 이온 (전구체 이온)을 단편 (생성물 이온)으로 분해하는 기술이다. 그런 다음 단편은 전구체 이온의 화학 구조의 측면을 드러낸다. 탠덤 질량 분광분석에서, 이온, 전구체 이온의 화합물을 생성하기 위해 일단 샘플이 이온화되면 (예를 들어 ESI, MALDI, EI 등에 의함), 예를 들어 특정 질량 대 전하 비율 (m/z)의 다이제스트로부터 펩티드가 선택되고 (MS1) 그런 다음 검출을 위해 생성물 이온을 생성하기 위해 단편화된다 (MS2).　전형적인 탠덤 MS 기기는 QqQ, QTOF, 및 하이브리드 이온 트랩/FTMS 등을 포함한다. 탠덤 질량 분광분석의 적용 예시 중 하나는 단백질 식별이다. 제1 질량 분석기는 이온 공급원에 도입된 후　방출되는　많은 펩티드 중에서 단일 종의 펩티드를 나타내는 특정 m/z　값의 이온을 단리한다. 그런 다음 이들 이온은 이온 단편화를 유도하기 위해 아르곤과 같은 불활성 기체를 함유하는 충돌 셀로 가속된다. 이러한 과정은 충돌 유도 해리 (CID) 또는　충돌 활성 해리　(CAD)으로 지정된다. 그런 다음 단편 이온의 m/z　값을 아미노산 서열 정보를 얻기 위해 제2 질량 분석기에서 측정한다.

아미노산의 질량에 대한 참조는 주어진 동위 원소 존재비, 예를 들어 자연 존재비에서 아미노산의 단일 동위 원소 질량 또는 평균 질량을 의미한다. 일부 예에서, 아미노산의 질량은 예를 들어, 아미노산을 동위 원소로 표지함으로써 왜곡될 수 있다. 아미노산의 정확한 동위 원소 구성을 기반으로 개별 단일 아미노산에 대한 아미노산의 평균 질량 주위에　어느 정도의 가변성이 예상된다. 아미노산에 대한 단일 동위 원소 및 평균 질량을 포함하는, 질량은 당업자에　의해 쉽게 얻을 수 있다.

유사하게, 펩티드의 질량에 대한 참조는 주어진 동위 원소 존재비, 예를 들어 자연 존재비에서 단일 동위 원소 질량 또는 평균 질량을 의미한다. 일부 예에서, 펩티드의 질량은 예를 들어, 펩티드에서 하나 이상의 아미노산을 동위 원소로 표지함으로써 왜곡될 수 있다. 펩티드 펩티드의 정확한 동위 원소 구성을 기반으로 개별 단일 아미노산에 대한 펩티드의 평균 질량 주위에　어느 정도의 가변성이 예상된다. 특정 펩티드 펩티드의 질량은 당업자에 의해 결정될 수 있다.

개괄적 기술

단일클론 항체 (mAb) 변이체의 특성화는 잠재적 치료 항체의 안전성, 효능, 및 안정성에 대한 이들의 잠재적 영향을 확인하기 위해 중요하다. 예를 들어, 규제 기관의 승인을 고려하면, 분자의 광범위한 특성화를 수행해야 한다. 항체의 혼합물을 포함하는 약물 제품에서, 각각의 항체의 절대 또는 상대량의 특성화는 결정되어야 한다. 응집체 및 단편은 잠재적으로 면역원성과 효능에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 일반적으로 로트 방출, 안정성, 및 특성화 중에 그 수준을 모니터링한다. 또한, 분자 및 제품　관련 불순물 및 변이체에　대한 1차 분해 경로가 결정된다. UV 검출과 결합된 이온 교환 크로마토그래피 (IEC)는 일상적인 품질 관리 (QC)에서 mAb 변이체를 분리하고 정량화하는 데 자주 사용된다. 그러나, IEC 분리로 인한　크로마토그래피 피크의 특성화는 매우 시간이 많이 걸리는 과정이다. 따라서, 잠재적 치료 mAb 및 mAb 제제를 특성화하기 위한 추가 방법이 필요하다. 본원에 개시된 방법은 이러한 요구를 충족시킨다.

샘플에서 물리적 매개변수, 예를 들어 질량 및/또는 전하에 의해 관심 항체, 예를 들어 단일클론 항체 (mAb)의 변이체를 검출하고/거나 구별하는 방법이 본원에서 개시된다. 본 발명은 강제 분해 및 장기 안정성 연구를 위한 항체 전하 변이체의 신속한 식별을 위한 대용량 처리 및 고감도 고유 마이크로유체 모세관 전기영동 (CE)-MS 방법을 개발하였다.

IEC 방법과 비교하여, 고유 마이크로유체 CE-MS에 의해 고 해상도 및 비슷한 전하 프로파일이 얻어진다. 개시된 방법은 항체 제제의 QC 평가에 사용될 수 있다. 방법의 구현예에서, 관심 항체를 포함하는 샘플은 예를 들어 CE-시스템의 하나 이상의 모세관 상의 모세관 전기영동을 사용하여 분해되거나 분리된다. 특정 구현예에서, 샘플은 분자량 및 전하에 의해 분해되거나 분리된다. 예를 들어, 질량 및 전하로 분리하거나 동일한 질량은 동일하지만 전하가 상이한 m/z 비율 단편을 사용하여 분해될 수 있다. 유사하게, 질량 및 전하로 분리하거나 변화는 동일하지만 질량이 상이한 m/z 비율 단편을 사용하여 분해될 수 있다. 구현예에서, 방법은 예를 들어 샘플을 소화하기 위해 하나 이상의 관심 항체를 포함하는 샘플을 프로테아제와 접촉시킴으로써 단편 관심 항체, 예를 들어 단일클론 항체 (mAb)의 단편을 해방시키는 것을 포함한다. 한 구현예에서, 프로테아제는 IdeS 프로테아제이다. 일단 부분 또는 전체 소화가 수행되면,　항체 단편은 모세관 전기영동을 사용하는 하나 이상의 모세관에서 분자량 및/또는 전하에 의해 분리될 수 있다. 분리된 항체 단편은 하나 이상의 모세관으로부터 용리될 수 있고 용리된 항체 단편의 질량은 관심 항체의 번역 후 변형 변이체를 검출하고/거나 구별하기 위해, 예를 들어 관심 항체의 단편의 PTM 프로파일의 검출 및/또는 결정에 의해 질량 스펙트럼 분석에 의해 결정된다. 특정 구현예에서, 항체 단편은 예를 들어 프로테아제, 예를 들어 IdeS 프로테아제를 사용하여 온전한 항체로부터 소화된, F(ab')₂ 또는 Fc 항체 서브유닛 중 하나 이상을 포함한다. 특정 구현예에서, 관심 항체는 단일클론 항체, 예를 들어 현재 사용되는 치료 항체 또는 신규한 단일클론 항체를 포함하는 평가 중인 항체이다. 특정 구현예에서, 관심 단일클론 항체는 항체 약물 컨쥬게이트 (ADC)의 일부이다. 특정 구현예에서, 항체 단편은 전하에 의해 분리되고 방법은 관심 항체의 전하 변이체를 검출하고/거나 구별하는 방법이다. 특정 구현예에서, 항체 단편은 분자량에 의해 분리되고 방법은 관심 항체의 크기 변이체를 검출하고/거나 구별하는 방법이다. 특정 구현예에서, 항체 단편은 전하 및 분자량에 의해 분리되고 방법은 검출하고/거나 구별하는 관심 항체의 전하 및 분자량 변이체를 검출하고/거나 구별하는 방법이다. 특정 구현예에서, 방법은 샘플에서, 예를 들어 항체 단편으로부터 관심 항체의 번역 후 변형 변이체의 상대 또는 절대량을 결정하는 것을 포함한다.

상기 언급한 바와 같이, 질량 및 전하에 의한 항체 단편의 분리는 항체 단편의 동질성, 예를 들어, 단지 분자량에 의한 분리에서는 용이하게 나타날 수 없는 항체의 표면 전하의 변화를 결정할 수 있는 이점을 갖는다. 이러한 분리는 샘플에서 단편 상의 번역 후 변형의 유형 및 수준을 결정할 수 있도록 한다. 단일클론 항체 (mAb) 상의 번역 후 변형 (PTM)의 존재는 전하 이질성을 유도하고 (표 1 참조) 잠재적으로 약물 안정성 및 생물학적 활성에 영향을 준다. 따라서, 약물 개발 동안 mAb의 PTM 및 관련된 전하 변이체 프로파일을 모니터링하는 것이 중요하다. 여기서, 본 발명자는 mAb 전하 변이체의 신속한 식별을 위한 대용량 처리 및 고감도 고유 마이크로유체 CE-MS 방법의 개발 및 강제 분해 및 장기 안정성 연구에 대한 이의 적용을 제시한다. 이온 교환 크로마토그래피 (IEX) 기반 접근법에 비해, 비슷한 전하 변이체 프로파일을 갖는 고해상도를 본원에 개시된 고유 마이크로유체 CE-MS 방법을 사용하여 얻을 수 있다.

표 1. 항체 전하 이질성의 원인

특정 구현예에서, 번역 후 변형은 탈아미드화, 산화, 당화, 이황화물 형성, N-말단 피로글루타메이트 형성, C-말단 리신 제거, 및 고만노오스 글리코실화 중 하나 이상이다.

특정 구현예에서, 샘플은 단일 모세관 내에서 분해되거나 분리된다. 특정 구현예에서, 샘플은 다중 모세관 내에서, 예를 들어 병렬로 분해되거나 분리된다. 분자량에 의한 분리에 대한 예시로서, 항체의 단편이 작을수록, 모세관 내에서 주어진 일정 시간 동안 더 이동할 것으로 예상된다. 또한, 전하에 따라 상이한 이동 시간에 적용될 항체 단편의 전하 차이를 예상할 수 있다.

구현예에서, 샘플은 관심 다중 항체로부터 항체 단편의 다중, 예를 들어 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5개 이상의 세트를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 예를 들어 샘플에서 항체 단편의 양에 대응하는, 피크 높이 또는 면적의 측정에 의해, 샘플에서 항체 단편의 변이체의 상대 또는 절대량을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 관심 항체는 이중특이적 단일클론 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플은 하나 이상의 내부 표준, 예를 들어 분자량 표준의 래더, 등전점 표준의 래더, 또는 심지어 샘플에서 관심 항체 단편의 양을 결정하기 위한 기준선 또는 벤치마크로서 사용되는 표준을 포함한다.

다중 mAb의 mAb 칵테일에서 mAb를 구별하는 능력은 질환 치료에서 이들 다중 구성요소 치료법이 증가된 효능을 입증함에 따라 점점 더 중요해지고 있다. 따라서, 개별 mAb가 이들 시스템에서 어떻게 거동하는지 모니터링하는 개선된 방법은 이들 다중 mAb 치료법의 호환성 및 안정성을 평가하는데 점점 더 중요해질 것이다. 이러한 증가하는 요구를 충족하기 위해 본 개시는 샘플에서 둘 이상의 단일클론 항체의 혼합물에서 단일클론 항체를 검출하고/거나 구별하는 방법을 제공한다.

구현예에서, 방법은 모세관 전기영동을 사용하여 하나 이상의 모세관에서 전하에 의해 둘 이상의 관심 mAb, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10개 또는 그 이상의, 관심 mAb를 갖는 샘플의 단백질 구성 성분을 분리하는 것을 포함한다.

일부 구현예에서, 전하 기반 프로파일 또는 지문 관심 항체, 예를 들어 혼합물에서 관심 항체 단독과 비교를 위한 항체의 전하 기반 프로파일 또는 지문, 예를 들어 번역 후 변형에 대응하는 전하 기반 프로파일 또는 지문이 생성될 수 있다. 그런 다음 이러한 비교는 혼합물에서 관심 항체가 변하는지 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 프로파일 또는 지문 비교는 혼합물에서 임의의 또는 모든 관심 항체에 대해 수행될 수 있다.

개시된 방법에 사용하기 위한 샘플은 다양한 구성요소, 즉 상이한 단백질을 함유하는, 이종성일 수 있다. 대안적으로, 샘플은 하나의 구성요소 또는 다중 전하 또는 분자량 종의 본질적으로 하나의 구성요소를 함유하는, 균질성일 수 있다. 사전-분석 과정이 관심 항체, 예를 들어 mAb 또는 다중 mAb를 검출하기 전에 샘플 상에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 용해 단계, 변성 단계, 가열 단계, 정제 단계, 침전 단계, 면역침전 단계, 컬럼 크로마토그래피 단계, 원심분리 등을 거칠 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플의 분리 및 고정화는 고유 기판 상에서 수행될 수 있다. 다른 구현예에서, 샘플은 변성, 예를 들어, 가열 및/또는 변성제와의 접촉을 겪을 수 있다. 변성제는 당 업계에 알려져 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 비-환원 조건을 겪을 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 예를 들어, 샘플을 하나 이상의 환원제와 접촉시킴으로써, 환원 조건을 겪을 수 있다. 환원제는 당 업계에 알려져 있다.

구현예에서, 모세관은 분리 매트릭스를 포함할 수 있고, 이는 장치 및/또는 시스템에 의해 자동화 방식으로 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 분리 전에 스태커 매트릭스에 로딩된다. 한 구현예에서, 분리 매트릭스는 크기 분리 매트릭스이고, 기존 전기영동 기술에서 사용되는, 중합체 겔의 유사하거나 실질적으로 동일한 특성을 갖는다. 분리 매트릭스에서 모세관 전기영동은 중합체 겔, 예를 들어 폴리아크릴아미드 겔 또는 아가로스 겔에서의 분리와 유사하고, 여기서 분자는 분자가 이동할 수 있는 다공성 통로를 제공함으로써 샘플에서 분자의 크기를 기반으로 분리된다. 더 큰 분자는 더 작은 분자보다 매트릭스를 통해 더욱 천천히 이동할 것이기 때문에 분리 매트릭스는 분자 크기에 의한 분자의 분리를 허용한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 모세관은 분리 매트릭스를 포함한다. 일부 구현예에서, 관심 항체를 함유하는 샘플은 분자량을 기반으로 분리되거나 분해된다. 일부 구현예에서, 분리 매트릭스는 분자량에 따라 단백질을 분리하도록 구성된 체질 매트릭스를 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플의 단백질 구성요소는 분자량에 의해 분리되고 방법은 관심 항체의 크기 변이체를 검출하고/거나 구별하는 방법이다. 일부 구현예에서, 샘플의 항체 단편은 분자량에 의해 분리되고 방법은 관심 오염물 단백질의 크기 변이체를 검출하고/거나 구별하는 방법이다.

광범위한 고체상 기판, 예를 들어 겔, 예를 들어 폴리아크릴아미드 겔이 당 업계에 알려져 있다. 일부 구현예에서, 관심 하나 이상의 단백질 분해는 중합체 겔에서 샘플의 전기영동을 포함한다. 중합체 겔, 예를 들어 폴리아크릴아미드 겔 또는 아가로스 겔에서의 전기영동은 분자 크기를 기준으로 분자를 분리한다. 중합체 겔은 분자가 통해서 이동할 수 있는 다공성 통로를 제공한다. 더 큰 분자는 더 작은 분자보다 매트릭스를 통해 더욱 천천히 이동할 것이기 때문에 중합체 겔은 분자 크기에 의한 분자의 분리를 허용한다.

일부 구현예에서, 관심 단백질을 함유하는 샘플은 샘플의 구성요소의 전하를 기준으로 분리되거나 분해된다. 일부 구현예에서, 샘플의 단백질 구성요소는 전하에 의해 분리되고 방법은 관심 단일클론 항체의 전하 변이체를 검출하고/거나 구별하는 방법이다. 일부 구현예에서, 샘플의 단편은 전하에 의해 분리되고 방법은 관심 항체의 전하 변이체를 검출하고/거나 구별하는 방법이다.

일부 구현예에서, 내부 표준은 관심 항체의 그 자체 또는 이의 단편으로부터 정제될 수 있고, 이는 일반적으로 일부 방법으로 관심 항체로부터 구별 가능하게 한다. 관심 항체 그 자체 또는 이의 단편의 정제된 형태를 수득하는 방법은 자연 정제, 실험실에서 성장된 유기체로부터 정제 (예를 들어, 화학　합성을 통하여), 및 등을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 내부 표준의 구별 특성은 염료 표지, 방사성 표지, 또는 그것이 관심 항체로부터 분리되도록 전기영동 분리 동안 표준의 이동성을 변경하는 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 변화일 수 있다. 예를 들어, 표준은 관심 항체 그 자체 또는 이의 단편에 비해 (예를 들어, 결실, 융합, 및/또는 화학적 변형을 통하여) 표준의 전하, 질량, 및/또는 길이를 변화시키는 관심 항체 그 자체 또는 이의 단편의 변형을 함유할 수 있다. 따라서, 관심 항체 그 자체 또는 이의 단편 및 내부 표준은 별개의 발광 파장에서 서로 검출 가능하여, 관심 단백질 및 표준이 독립적으로 검출 가능하게 하는 형광 염료로 각각 표지될 수 있다. 일부 예에서, 내부 표준은 관심 항체 그 자체 또는 이의 단편과 다르지만 관심 항체 그 자체 또는 이의 단편과 유사하거나 동일한 방식으로 거동하고, 적절한 비교 측정을 가능하게 한다.

당업자에 의해 이해될 바와 같이, 사실상 모세관에 샘플을 로딩하는 임의의 방법이 수행될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 모세관의 말단으로 로딩될 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 유체역학 흐름에 의해 모세관의 하나의 말단으로 로딩된다. 예를 들어, 유체 경로가 모세관인 구현예에서, 샘플은 유체역학 흐름에 의해 모세관의 하나의 말단으로 로딩될 수 있고, 모세관은 마이크로피펫으로 사용된다. 일부 구현예에서, 샘플은 예를 들어, 모세관이 겔 충진되어 유체역학 흐름에 더욱 저항성인 경우 전기영동에 의해 모세관으로 로딩될 수 있다.

모세관은 액체 또는 용해된 분자가 흐를 수 있도록 하는 임의의 구조를 포함할 수 있다. 따라서, 모세관은 그것이 방법과 호환 가능한 한, 당 업계에 알려진 임의의 구조를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 모세관은 액체 또는 용해된 분자가 흐를 수 있는 구멍 또는 채널이다. 일부 구현예에서, 모세관은 액체 또는 용해된 분자가 흐를 수 있는 투과 가능한 물질의 통로이다.

모세관은 모세관 내의 관심 단백질의 검출을 허용하는 임의의 물질을 포함한다. 모세관은 임의의 편리한 물질, 예를 들어 유리, 플라스틱, 실리콘, 용융 실리카, 겔, 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 복수의 모세관을 이용한다. 복수의 모세관은 다중 샘플이 동시에 분석 가능하게 한다.

모세관은 치수, 폭, 깊이 및 단면, 뿐만 아니라 예를 들어 원형, 사다리꼴, 직사각형 등의 형태가 달라질 수 있다. 모세관은 직선, 둥근 형, 구불구불 등일 수 있다. 하기 기술된 바와 같이, 유체 경로의 길이는 부분적으로 인자 예를 들어 샘플 크기 및 관심 단백질을 분해하기 위해 필요한 샘플 분리의 정도에 따라 다르다.

일부 구현예에서, 모세관은 구멍이 있는 튜브를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 복수의 모세관을 이용한다. 보다 전형적으로 약 25 내지 약 400 μm의 내부 직경을 갖는 모세관이 활용될 수 있지만 적합한 크기는 약 10 내지 약 1000 μm의 내부 직경을 갖는 모세관을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 더 작은 직경 모세관은 비교적 낮은 샘플 로드를 사용하는 반면 비교적 큰 구멍 모세관의 사용은 비교적 높은 샘플 로드를 허용하고 개선된 신호 검출을 초래할 수 있다.

모세관은 다양한 길이를 가질 수 있다. 적합한 길이는 약 1 내지 20 cm 길이의 모세관을 포함하지만, 이에 한정되지 않지만, 어느 정도 더 짧은 및 더 긴 모세관이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 모세관은 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 cm 길이이다. 모세관이 길수록 복합체 혼합물의 양호한 분리 및 개선된 해상도를 일반적으로 초래한다. 더 긴 모세관은 낮은 존재비 관심 단백질을 분해하는데 특히 사용할 수 있다.

일반적으로, 모세관은 용융 실리카로 구성되지만, 플라스틱 모세관 및 PYREX (즉, 비정질 유리)가 활용될 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 모세관은 둥글거나 관 형태일 필요가 없다. 본원에 기술된 방법과 호환되는 한, 다른 형태가 또한 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 모세관은 채널일 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 복수의 채널을 이용한다. 일부 구현예에서, 모세관은 마이크로유체 장치의 채널일 수 있다. 마이크로유체는 광범위한 조작을 수행하기 위해 기판에서 채널을 이용한다. 마이크로유체 장치는 기판의 표면에 그려진 하나의 또는 복수의 채널을 포함할 수 있다. 마이크로유체 장치는 고체 불활성 기판으로부터, 일부 구현예에서 칩의 형태로 수득될 수 있다. 마이크로유체 장치의 치수는 중요하지 않지만, 일부 구현예에서 치수는 순서대로 약 100 μm 내지 약 5 mm 두께 및 측면에 대략 1 센티미터 내지 약 20 센티미터이다. 적합한 크기는 약 5 μm 내지 약 200 μm의 깊이를 갖는 채널을 포함하지만, 이에 한정되지 않지만, 더욱 일반적으로 약 20 μm 내지 약 50 μm의 깊이를 갖는 채널이 사용될 수 있다. 이들이 방법과 호환 가능한 한, 더 작은 채널, 예를 들어 마이크로 또는 나노채널이 또한 사용될 수 있다.

항체 단편은 관심 항체, 예를 들어 단일클론 항체로부터 수득될 수 있다. 항체 단편은 환원, 효소 소화, 변성, 단편화, 화학적 절단 또는 이들의 조합에 의해 제조될 수 있다. 본원에 개시된 방법은 임의의 항체 동형, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 혼합된 동형에 적용 가능하다.

환원은 3차원 단백질, 예를 들어 단일클론 항체에서 이황화 결합을 2개의 티올로 환원시키는 것이다. 환원은 열변성, 계면 활성제 첨가, 또는 환원제, 예를 들어 TCEP-HCl의 존재하에 변성제 첨가, 예를 들어, 구아니딘 HCl (6M)에 의해 수행될 수 있다. 효소 분해는 프로테아제, 예를 들어, 트립신 또는 아크로모박터 프로테아제 I (Lys-C)를 사용한 단백질의 소화이다. 또한, 당단백질은 열 또는 화학 물질, 또는 이들의 조합에 의해 변성될 수 있다. 단편화는 물리적, 생물학적 또는 화학적 방법을 사용하여 단일 또는 다중-서브유닛 단백질, 예를 들어 단일클론 항체의 단백질 부분을 절단하는 것을 포함한다. 예를 들어, S. 피오게네스 (IdeS)로부터의 면역글로불린 분해 효소가 항체 서브유닛 단편화를 위해 일반적으로 사용된다.

다양한 구현예에서, 샘플에서 항체는 친수성　농축 기판과 접촉하기 전에 환원, 효소 분해, 변성 또는 단편화에 의해 처리되고 제조될 수 있다. 방법은 단편의 도움으로, 항체, 예를 들어, 단일클론 항체 (mAb) 치료제의 번역 후 변형을 특성화하기 위한 신규한 크로마토그래피 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 임의의 개입 단계에서 샘플은 농축, 탈염 등이 될 수 있다.

일부 구현예에서, 방법은 예를 들어 번역 후 변형된 항체 단편의 펩티드 부분으로부터 UV 신호를 사용하여, 번역 후 변형된 항체 단편을 검출하는 것을 추가로 포함한다. 이는 샘플의 분획에 대해 수행될 수 있고 추가 분석, 예를 들어 질량 스펙트럼 (MS) 분석을 위한 특정 분획의 선택을 허용한다. 따라서, 추가 구현예에서, 검출 단계는 질량 분광분석 또는 액체 크로마토그래피-질량 분광분석 (LC-MS)을 포함한다. 생체분자의 분석을 위한 질량 분광분석의 적용에서, 분자는 액체 또는 고체상으로부터 기체상 및 진공상으로 이송된다. 많은 생체분자가 크고 깨지기 쉽기 때문에 (단백질이 주요 예임), 진공상으로 이들을 이송하는 가장 효과적인 방법 중 두 가지는 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 (MALDI) 또는 전기분무 이온화 (ESI)이다. 이들 방법의 사용 측면, 및 샘플 제조 요구사항은 당업자에게 알려져 있다. 일반적으로, ESI는 더 민감하지만, MALDI는 더 빠르다. 중요하게, 일부 펩티드는 ESI보다 MALDI 모드에서 더 잘 이온화되며 그 반대도 마찬가지이다 (Genome Technology, June 220, p 52). 본 발명의 추출 채널 방법 및 장치는 MS 분석을 위한 샘플, 특히 번역 후 변형된 항체 단편과 같은 생체분자 샘플을 제조하는데 특히 적합하다. 본 발명의 중요한 장점은　개입 공정 단계, 예를 들어, 농도 또는 탈염에 대한 필요없이, 직접 분석할 수 있는 농축된 샘플의 제조를 허용한다는 것이다.

ESI는 휘발성 산 및 유기 용매를 샘플과 혼합하고 하전된 전도성 바늘을 통해 주입함으로써 수행된다. 바늘 끝에서 분사 (또는 분출)된 하전된 액적은 질량 분광분석계로 향하고 날아가면서 열과 진공에 의해 건조된다. 액적이 건조된 후, 나머지 하전된 분자는 전자기 렌즈에 의해 질량 검출기로 향하고 질량이 분석된다. 한 구현예에서, 용리된 샘플은 모세관에서 전기 분무 노즐로 직접 침착되며, 예를 들어, 모세관은 샘플 로더로서 기능한다. 다른 구현예에서, 모세관 자체는 추출 장치 및 전기 분무 노즐 둘 다로서 기능한다.

MALDI에 대해, 분석물 분자 (예를 들어, 단백질)을 금속 표적에 증착하고 유기 매트릭스와 공결정화한다. 샘플을 건조하고 질량 분광분석계로 삽입하고, 일반적으로 비행 시간법 (TOF) 검출에 의해 분석한다. 한 구현예에서, 용리된 샘플을 모세관으로부터 금속 표적에 직접 증착하고, 예를 들어, 모세관 자체는 샘플 로더로서 기능한다. 한 구현예에서, 추출된 분석물은 MALDI 표적에 증착되고, MALDI 이온화 매트릭스가 첨가되고, 샘플이 이온화되고 예를 들어, TOF 검출에 의해 분석된다.

일부 구현예에서, 다른 이온화 모드 예를 들어 ESI-MS, 터보스프레이 이온화 질량 분광분석, 나노스프레이 이온화 질량 분광분석, 열분무 이온화 질량 분광분석, 소닉 스프레이 이온화 질량 분광분석, SELDI-MS　및 MALDI-MS가 사용된다. 일반적으로, 이러한 방법의 장점은 이들이 샘플의 "적시" 정제 및 이온화 환경에　직접 도입을 허용한다 것이다. 다양한 이온화 및 검출 모드가 사용되는 탈착 용액의 특성에 대한 자체 제약을 도입한다는 것을 주의하는 것이 중요하고, 탈착 용액이 둘 다와 호환되는 것이 중요하다. 예를 들어, 많은 적용에서 샘플 매트릭스는 이온 강도가 낮거나, 특정 pH 범위 등 내에 있어야 한다. ESI에서, 샘플의 염은 이온화를 낮추거나 노즐을 막음으로써 검출을 방지할 수 있다. 이러한 문제는　저염 및/또는 휘발성 염의 사용으로 분석물을 제시함으로써 해결된다. MALDI의 경우, 분석물은 표적의 스팟팅 및 사용된 이온화 매트릭스와 호환되는 용매에 있어야 한다. 구현예에서, 방법은 항체 단편, 예를 들어 항체 단편의 서열을 확인하는 것을 추가로 포함한다. 구현예에서, 방법은 항체 단편 상에 제시된 번역 후 변형을 확인하는 것을 추가로 포함한다. 구현예에서, 방법은 관심 항체의 번역 후 변형 프로파일링을 추가로 포함한다. 구현예에서, 방법은 환원 펩티드 매핑 LC-MS/MS 분석에 의한 번역 후 변형 핫스팟의 번역 후 변형 매핑을 추가로 포함한다.

특정 구현예가 상세히 상기 기술되었지만, 상기 설명은 예시의 목적에 불과하다. 따라서, 상기 기술된 많은 측면은 명시적으로 달리 명시하지 않는 한 필요하거나 필수 요소로 의도되지 않음을 이해해야 한다. 상기 기술된 것들에 더하여, 실시 구현예의 개시된 측면들의 변형 및 등가 구성요소 또는 이에 대응하는 행위는　본 개시의 이점을 갖고, 하기 청구 범위에 정의된 구현예의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않고, 당업자에 의해 이루어질 수 있고, 그 범위는 그러한 변형 및 등가 구조를 포함하도록 가장 넓은 해석에 따른다.

하기 실시예는 특정 구현예의 특정한 특성을 설명하기 위해 제공된다. 그러나, 기술된 특정한 특성은 본 발명의 범위에 대한 제한으로 간주되어서는 안 되며, 오히려 당업자가 등가물을 인식할 수 있는 예로서 인식될 것이다.

실시예

하기 실시예는 당업자에 완전한 개시 및 본 발명의 방법을 제조하고 사용에 대한 기술을 제공하고자 하며, 본 발명자가 이들의 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하고자 의도되지 않는다. 사용된 숫자 (예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만 오류 및 편차를 고려해야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 부분은 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이고, 온도는 섭씨이고, 실온은 약 25℃이고, 압력은 대기압 또는 그 근처이다.

고유 마이크로유체 모세관 전기영동-질량 분광분석에 의한 항체 전하 이질성의 대용량 처리 분석

항체 전하 이질성 분석을 위한 고해상도, 고감도 및 대용량 처리 고유 모세관 전기영동 (CE)-질량 분광분석 (MS) 방법 개발.

NIST의 모델 mAb을 강제 분해 연구에 사용한다. 상이한 배양 시간을 갖는 샘플을 F(ab')₂ 또는 Fc 관련 서브유닛 종을 생성하기 위해 IdeS 소화로 절단한다. 온전한 대조군 및 스트레스를 받은 항체를 전하 변이체의 식별을 위해 고유 상태 가까이에서 Zipchip CE-MS에 의해 분석한다. 상승된 전하 변이체를 서브유닛 전하 변이체 분석에 의해 F(ab')₂ 또는 Fc로 할당한다. PTM 핫스팟을 환원 펩티드 매핑 LC-MS/MS 분석에 의해 모니터링한다. 온전한 질량 데이터를 PMi-Intact 소프트웨어에 의해 처리한다. 환원 펩티드 매핑 데이터를 각각, PTM 식별 및 정량을 위해 BioPharma Finder 3.0 및 Skyline-daily 4.2로 처리한다. NIST 항체를 고유 Zipchip CE-MS 시스템 평가를 위해 철저히 사용하였다. 결과는 제로 캐리오버 및 양호한 실행 간 재현성을 보여주었다. 고감도 측정을 1ng 항체 로딩 양으로 달성하였다. 산성 및 염기성 전하 변이체는 기본 조건에서 실행되는 Zipchip CE에 의해 NIST 항체 표준에 대한 주요 피크로부터 잘 분리되었다. MS 분석은 중쇄에 1개 및 2개의 처리되지 않은 C-말단 라이신을 갖는 항체에 대응하는 2개의 염기성 변이체를 식별한 반면, 산성 변이체는 주로 탈아미드화에 의해 유발되었다. 비교 가능한 고해상도 전하 변이체 분리를 NIST 항체를 사용하여 IEX와 고유 CE-MS 간에서 달성하였다.

NIST mAb 표준품 및 이의 열-스트레스를 받은 형태를 최대 28일 동안 45℃에서 배양한 다음 분석하였다. 배양 후, 샘플을 F(ab')2 및 Fc 단편을 생성하기 위해 IdeS 소화로 우선 절단하였다. 대조군 및 스트레스를 받은 항체 모두의 온전한 질량 분석을 유니버셜 고유 Zipchip CE-MS 방법을 사용하여 수행하였다. PTM 핫스팟을 스트레스를 받은 조건하에 상승된 전하 변이체를 확실하게 하기 위한 환원 펩티드 매핑 LC-MS/MS 분석에 의해 식별하였다. IgG1, IgG4 및 이중특이적 mAb를 포함하는, 15개 항체의 패널을 고유 Zipchip CE-MS 방법을 사용하여 분석하였다.

샘플 제조

강제 분해 연구: NIST IgG1 mAb (5 mg/mL, pH 6.0)를 0, 1, 4, 8, 15 및 28일 동안 45℃에서 배양하였다.

IdeS 처리: 각각의 NIST mAb 샘플을 2 mg/mL로 Milli-Q 워터로 희석하였다. 그런 다음 125 유닛의 IdeS (Promega)를 100 μg의 mAb에 1.25/1의 효소/항체 비율에서 첨가하였다. 혼합물을 F(ab')2 및 Fc 단편을 생성하기 위해 30분 동안 600 rpm에서 진탕하며 37℃에서 배양하였다. 각각의 연구/처리 후 대조군 및 스트레스를 받은 샘플을 -20℃에서 즉시 보관하였다.

고유 ZipChip CE-MS

항체 및 이의 전하 변이체의 온전한 질량 분석을 Exactive 플러스 EMR 오비트랩 질량 분광분석계 (Thermo Scientific)와 결합된 Zipchip CE 인터페이스 (908 장치)를 사용하여 수행하였다. 항체 전하 변이체를 고유 배경 전해질 (BGE), pH ~5.5 (908 장치)로 고유 마이크로유체 HRN 칩 (22 cm 분리 채널, 908 장치) 상에서 분리하였다.

CE 매개변수: 전계 강도: 650 V/cm, 압력 지원: 사용 가능, 압력 지원 개시 시간: 0.2분, 복제 지연: 30초, 주입 부피: 1nL

MS 매개변수:

(1) ESI 조정: 분무 전압: 0, 모세관 온도: 300℃, S-렌즈: 150, 차단 가스: 2, 보조 가스: 0, 트랩핑 가스: 1.0.

(2) 수집 방법: 양성 모드 검출을 사용한 전체 스캔 분석, 공급원 CIS: 100 eV, 해상도: 17,500, AGC: 3e6, 최대 IT: 50 ms, 마이크로스캔: 3, 스캔 범위: 1000-10000 m/z.

강한 양이온 교환 크로마토그래피 (SCX)

항체 전하 변이체를 Agilent 1290 인피니티 HPLC에서 CX-1 pH 완충액 (A: 5.6, B:10.2) (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 pH 구배로 MabPac SCX-10 컬럼 (4 x 250 mm) 상에서 분리하였다. 흡광도는 280 nm의 UV 파장에서 측정하였다.

데이터 처리

온전한 질량 데이터를 PMI-Intact 소프트웨어 (Protein Metrics)를 사용하여 분리하였다.

결과

고유 ZipChip CE-MS를 사용한 고감도 및 유니버설 12분 방법을 개발하고 IgG1, IgG4 및 이중특이적 IgG4 항체의 전하 변이체 분석에 적용하였다. 비교 가능한 전하 변이체 분리를 고유 ZipChip CE-MS와 SCX 방법 간에 수득하였다. 분해된 전하 변이체를 고유 MS 분석에 의해 식별하였다. 가까운 pI 값을 갖는 항체를 잘 분리할 수 있다. 공동 이동된 항체를 단순화된 고유 질량 스펙트럼을 기반으로 개별적으로 식별하였다. 스트레스 조건하에 배양으로 인한 산성 변이체 및 Fab 단편의 수준 증가를 서브유닛 분석에 의해 F(ab')2 및 Fc 도메인 내에 국지화시켰다. 더욱이, 더 높은 해상도 서브유닛 분석은 스트레스 조건하에 이성질화 및 증가된 절반 글리코실화 종으로부터 도입된 추가 산 변이체를 나타냈다.

CE-MS와 SCX-UV 간의 항체 전하 변이체의 비교 가능한 분리

IgG1, IgG4 및 이중특이적 IgG4를 포함하는 3개의 항체 표준을 고해상도 SCX-UV 및 고유 ZipChip CE-MS로 분석하였다. 두 플랫폼 간에　동일한 전하 변이체 분리 프로파일이 수득되었다 (도 2a-2b).

고유 ZipChip CE-MS의 감도 및 캐리오버 검사

나노스프레이 ESI와 결합된 ZipChip CE-MS는 낮은 풍부 종을 검출하는 큰 감도를 제공한다. IgG1 및 IgG4는 각각, 0.01ng 및 0.02ng에서 검출되었다. 연속 주입에서 캐리오버는 관찰되지 않았다 (도 3a-3c).

온전한 항체의 전하 변이체 분석

온전한 대조군 및 열 (45℃) 스트레스를 받은 NIST mAb를 고유 ZipChip CE-MS로 분석하였다. 분리된 질량 데이터는 NIST mAb의 상부 힌지 영역에서 4개의 주요 Fab 절단이 28일 열 스트레스 시 생성되고, 또한 대조군에 비해 산성 변이체 (A1)가 유의하게 증가하였음을 나타냈다 (도 4 및 표 2).

표 2. 전하 변이체 식별의 요약

항체 F(ab')2 및 Fc 서브유닛의 전하 변이체 분석

F(ab')2 및 Fc를 유니버설 CE-MS 방법에 의해 잘 분리하였다. 모든 작은 피크는 확인되고 도 5a-5c에 나타냈다. 28일 배양으로 인한 새로운 전하 변이체를 파란색 강조 영역에 나타냈다. 1개 및 2개의 처리되지 않은 C-말단 라이신을 갖는 2개의 염기성 변이체는 Fc 영역에 위치하였다 (도 5c). 스트레스를 받은 샘플 (45℃, D28)의 His²²⁷/Thr²²⁸에서 Fab 절단으로 인한, 염기성 변이체 3는 도 5b에 F(ab')2 염기성 변이체 (b*1)로서 확인하였다.

모든 다른 Fab 절단 부위는 온전한 항체 분석에 확인된 것과 동일한 순서로 F(ab')2의 산 영역에서 발견되었다. Fc 산성 영역의 경우, Asp 이성질화로 인한 새로운 산성 변이체 A1a가 D28 샘플에 나타났다. 주요 Fc와 비교하여, a1 및 a1a 모두의 +1 Da 질량 증가는 산성 변이체가 탈아미드화에 의해 유발될 수 있음을 나타냈다. 이는 표 3에 나타낸 펩티드 매핑 결과로 확인되었다.

표 3. 스트레스 조건 하 차이를 나타내는 주요 PTM 요약

대용량 처리 온전한 질량 분석에 대한 항체 혼합물의 분리

혼합물 1의 3개의 IgG1 mAb (도 6a) 및 혼합물 2의 5개의 IgG4 이중특이적 mAb (도 6b)를 잘 분리하였고, 이는 공동 제제 약물의 온전한 질량 분석에 적용할 수 있다. 2개의 항체가 함께 공동 이동된 경우에도 (도 6c에서 청색 강조), 이들을 고유 MS 데이터로부터 개별적으로 식별할 수 있다 (도 6d 및 6e), 복잡한 스펙트럼은 도 6e 참조.

단일 항체의 고해상도 전하 변이체 분석 이외에, 고유 ZipChip CE-MS 방법은 항체 혼합물 및 ADC의 온전한 질량 분석을 위한 대용량 처리 및 고-감도 접근법으로서 또한 사용될 수 있다.

본 발명은 본원에 기술된 특정 구현예로 그 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 본원에 기술된 것들에 더하여 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명 및 첨부 도면으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구 범위 내에 속하도록 의도된다.

Claims (20)

1. 샘플에서 관심 항체의 번역 후 변형 변이체를 검출하고/거나 구별하는 방법으로서,
   샘플을 항체 단편으로 소화시키기 위해 하나 이상의 관심 항체를 포함하는 샘플을 프로테아제와 접촉시키는 단계;
   모세관 전기영동을 사용하여 하나 이상의 모세관에서 분자량 및/또는 전하에 의해 항체 단편을 분리하는 단계;
   상기 하나 이상의 모세관으로부터 분리된 항체 단편을 용리하는 단계; 및
   질량 스펙트럼 분석에 의해 용리된 항체 단편의 질량을 결정하여, 관심 항체의 번역 후 변형 변이체를 검출하고/거나 구별하는 단계를 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 번역 후 변형은 탈아미드화, 산화, 당화, 이황화물 형성, N-말단 피로글루타메이트 형성, C-말단 리신 제거, 및 고 만노오스 글리코실화 중 하나 이상을 포함하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 프로테아제는 IdeS를 포함하는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단편은 F(ab')₂ 또는 Fc 항체 서브유닛 중 하나 이상을 포함하는 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 항체는 단일클론 항체인 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단편은 전하에 의해 분리되고 상기 방법은 관심 항체의 전하 변이체를 검출하고/거나 구별하는 방법인 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단편은 분자량에 의해 분리되고 상기 방법은 관심 항체의 크기 변이체를 검출하고/거나 구별하는 방법인 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에서 관심 항체의 번역 후 변형 변이체의 상대 또는 절대량을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 항체는 이중특이적 항체를 포함하는 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 내부 표준을 포함하는 방법.
11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 모세관은 분리 매트릭스를 포함하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 분리 매트릭스는 분자량에 의해 단백질을 분리하도록 구성된 체질(sieving) 매트릭스를 포함하는 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 모세관으로부터 분리된 항체 단편을 용리하는 단계는 하나 이상의 분획으로 항체 단편으로 분리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단편을 식별하는 것을 추가로 포함하는 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단편에 제시된 번역 후 변형을 식별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 항체는 동형 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 혼합된 동형인 방법
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 항체의 번역 후 변형 프로파일링을 추가로 포함하는 방법.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 환원 펩티드 매핑 LC-MS/MS 분석에 의한 번역 후 변형 핫스팟의 번역 후 변형 매핑을 추가로 포함하는 방법.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 관심 항체의 혼합물을 포함하는 방법.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 항체는 항체 약물 컨쥬게이트인 방법.

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