JP2022532795A - ホスト細胞タンパク質の同定および定量方法 - Google Patents

Abstract

物理的パラメータによって、試料中の１または複数の混入タンパク質の変異体を検出および／または区別する方法であって、該方法は、キャピラリ電気泳動を用いて、１以上のキャピラリ中で分子量または電荷によって試料のタンパク質成分を分離することと、前記１以上のキャピラリ中の前記試料のタンパク質成分を固定化することと、前記１以上のキャピラリ中のタンパク質成分を、前記試料中の１または複数の混入タンパク質に特異的に結合する１以上の一次抗体と接触させ、それによって、前記試料中の変異体を検出および／または区別することと、を含む、方法。【選択図】図１

Description

本発明は、バイオ医薬品に関し、宿主細胞タンパク質混入物を含むバイオ医薬品調製物中の混入ポリペプチドを検出するためのキャピラリ電気泳動の使用に関する。

モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は生物療法製品の重要なクラスであり、多くの生命を脅かすおよび慢性疾患の治療において顕著な成功を達成している。しかしながら、ｍＡｂは、サイズおよび電荷変異体、種々のグリコシル化パターンを含む種々の翻訳後修飾、ならびにＮおよびＣ末端不均一性を有する生物学的高分子の高度に複雑な混合物から精製される。したがって、個々のモノクローナル抗体調製物は、宿主細胞タンパク質の独特なプロファイル、最終製品の開発中および製造中の両方において、これらの製品の評価の際に考慮される必要がある特徴を示し得る。組換え生物医薬品タンパク質がヒト患者への投与に許容されるためには、製造および精製工程から生じる残留不純物を最終生物学的製剤から除去することが重要である。これらのプロセスのコンポーネントには、培養培地タンパク質、免疫グロブリン親和性リガンド、ウイルス、エンドトキシン、ＤＮＡ、および宿主細胞タンパク質が含まれる。これらの宿主細胞不純物には、組換えＤＮＡ技術に由来する生物製剤中のプロセス関連不純物／混入物であるプロセス特異的宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）が含まれる。ＨＣＰは、典型的には、最終薬物物質中に少量（意図した組換えタンパク質の百万分率またはナノグラム／ミリグラム）で存在するが、ＨＣＰは望ましくないことが認識されており、その量は最小限に抑えるべきである。例えば、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、ヒトでのｉｎ ｖｉｖｏ適用を目的とするバイオ医薬品には、可能な限り不純物を含まないこと、およびＨＣＰなどの潜在的な混入物／不純物の検出および定量のための試験が必要であることを求めている。さらに、医薬品規制調和国際会議（ＩＣＨ）は、バイオテクノロジー／生物学的製品の試験手順と合格基準に関するガイドラインを提供する。本ガイドラインは、ＨＣＰのために、広範囲のタンパク質不純物を検出することができる高感度免疫測定法が利用されることを示唆している。

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳのような高感度な分析法を用いて、タンパク質成分を超えて存在する単一のＨＣＰ種を同定し、定量することができる。このような単一のＨＣＰ種の同定に際しては、十分な感度および特異性を有し、規制当局による承認のためにバリデーションを行うことができ、かつ複数の組換えタンパク質産物にわたってプラットホームとして使用することができる別のアッセイ法を開発する必要がある。

電気泳動は、電場中での移動速度の違いに基づいて分子の混合物を分離するために用いられてきた。一般に、電気泳動は、流体またはゲルと接触する１以上の電極または導電性部材に加えられる起電力の動作下で、流体またはゲルを通る懸濁分子または溶解分子の移動を指す。電気泳動分離のいくつかの公知の様式は、緩衝溶液（一般的にゾーン電気泳動と呼ばれる）、ゲルまたはポリマー溶液（一般的にゲル電気泳動と呼ばれる）、または水素（ｐＨ）勾配の電位（一般的に等電点電気泳動と呼ばれる）におけるそれらのモビリティの差に少なくとも部分的に基づいて分子を分離することを含む。キャピラリ電気泳動法は、生体分子の純度や電荷の不均一性を検討するために有効であり、産業界で広く使用されているが、種々の種の選択的検出を可能にせず、また、生成物およびプロセス不純物の区別を可能にしない。したがって、宿主細胞タンパク質不純物を検出するためのｍＡｂ調製物および製剤をモニタリングする追加の方法が必要である。

１の態様において、本発明は、抗体調製試料中の目的のタンパク質混入物を検出するための方法を提供し、この方法は、キャピラリ電気泳動を用いて１以上のキャピラリ中で物理的パラメータにより試料のタンパク質成分を分離することと、試料のタンパク質成分を前記１以上のキャピラリ内に固定化することと、目的のタンパク質混入物に特異的に結合する１以上の一次抗体と、１以上のキャピラリ内の前記タンパク質成分を接触させることと、１以上の一次抗体の結合を検出し、それによって抗体調製試料中の目的のタンパク質混入物を検出および定量することと、を含む。

いくつかの実施形態において、本方法は、物理的パラメータによって、抗体調製試料中の目的のタンパク質混入物の変異体を区別することをさらに含む。

本方法の様々な実施形態において、１以上のキャピラリは分離マトリックスを含む。

本方法の様々な実施形態において、分離マトリックスは、担体両性電解質を含む。

本方法の様々な実施形態において、物理的パラメータは電荷を含む。

本方法の様々な実施形態において、分離マトリックスは、分子量によってタンパク質を分離するように構成されたふるい分けマトリックスを含む。

本方法の様々な実施形態において、物理的パラメータは分子量を含む。

本方法の様々な実施形態において、１以上の一次抗体は、検出可能な標識で標識付けされ、１以上の一次抗体の結合を検出することは、検出可能な標識を検出することを含む。

いくつかの実施形態において、１以上の一次抗体の結合を検出することは、
１以上の一次抗体を、１以上の一次抗体のうちの少なくとも１つに特異的に結合する二次抗体と接触させることであって、二次抗体が、検出可能な標識を有する、ことと、
検出可能な標識を検出することと
を含む。

いくつかの実施形態において、本方法は、目的のタンパク質混入物の電荷変異体またはサイズ変異体を検出することおよび／または区別することをさらに含む。

いくつかの実施形態において、本方法は、目的のタンパク質混入物の相対量または絶対量を決定することをさらに含む。

本方法の様々な実施形態において、検出可能な標識は、化学発光標識、蛍光標識または生物発光標識を含む。

本方法の様々な実施形態において、試料は内部標準を含む。

いくつかの実施形態において、固定化は、光固定化、化学的固定化、または熱固定化を含む。

本方法の様々な実施形態において、１以上の一次抗体はポリクローナル抗体を含む。

本方法の様々な実施形態において、１以上の一次抗体はモノクローナル抗体を含む。

本方法の様々な実施形態において、目的のタンパク質混入物は、ＰＬＢＤ２、ＣＴＳＤ、ＴＩＭＰ１、酸セラミダーゼ（ＡＳＡＨ１）、リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）、アネキシン、カテプシンＢ、抗ロイコプロテイナーゼ（ＡＬＰ）、またはそれらのフラグメントを含む。

別の態様では、本発明は、物理的パラメータによって抗体調製試料中の目的のタンパク質混入物を検出および／または区別するための方法を提供し、この方法は、キャピラリ電気泳動を用いて、１以上のキャピラリ中で物理的パラメータによって試料のタンパク質成分を分離することと、１以上のキャピラリ中の試料のタンパク質成分を固定化することと、目的の第１のタンパク質混入物に特異的に結合する第１の一次抗体と、１以上のキャピラリ中のタンパク質成分を接触させることと、第１の一次抗体の結合を検出し、それによって目的の第１の抗体を検出することと、１以上のキャピラリ中のタンパク質成分を、目的の第２のタンパク質混入物に特異的に結合する第２の一次抗体と接触させることと、第２の一次抗体の結合を検出し、それによって目的のタンパク質混入物を検出して、試料中の目的のタンパク質混入物を区別することとを含む。

いくつかの実施形態において、本方法は、１以上のキャピラリ内のタンパク質成分を、目的の第３のタンパク質混入物に特異的に結合する第３の一次抗体と接触させることと、第３の一次抗体の結合を検出し、それによって目的の第３のタンパク質混入物を検出することをさらに含む。

いくつかの実施形態において、本方法は、１以上のキャピラリ内のタンパク質成分を、目的の１以上の追加のタンパク質混入物に特異的に結合する１以上の追加の一次抗体と接触させることと、１以上の追加の一次抗体の結合を検出することと、それによって目的の１以上の追加のタンパク質混入物を検出することとをさらに含む。

いくつかの実施形態において、本方法は、物理的パラメータによって、抗体調製試料中の目的のタンパク質混入物の変異体を区別することをさらに含む。

本方法の様々な実施形態において、１以上のキャピラリは分離マトリックスを含む。

本方法の様々な実施形態において、分離マトリックスは、担体両性電解質を含む。

本方法の様々な実施形態において、物理的パラメータは電荷を含む。

本方法の様々な実施形態において、分離マトリックスは、分子量によってタンパク質を分離するように構成されたふるい分けマトリックスを含む。

本方法の様々な実施形態において、物理的パラメータは分子量を含む。

本方法の様々な実施形態において、一次抗体は、検出可能な標識で標識付けされ、一次抗体の結合を検出することは、検出可能な標識を検出することを含む。

いくつかの実施形態において、一次抗体の結合を検出することは、
一次抗体を、一次抗体に特異的に結合する二次抗体と接触させることであって、二次抗体は、検出可能な標識を有する、ことと、
検出可能な標識を検出することと
を含む。

いくつかの実施形態において、方法は、目的の１以上のタンパク質混入物の相対量または絶対量を決定することをさらに含む。

本方法の様々な実施形態において、検出可能な標識は、化学発光標識、蛍光標識または生物発光標識を含む。

本方法の様々な実施形態において、試料は内部標準を含む。

本方法の様々な実施形態において、１以上の一次抗体はポリクローナル抗体を含む。

本方法の様々な実施形態において、１以上の一次抗体はモノクローナル抗体を含む。

本方法の様々な実施形態において、固定化は、光固定化、化学的固定化、または熱固定化を含む。

本方法の様々な実施形態において、目的のタンパク質混入物は、ＰＬＢＤ２、ＣＴＳＤ、ＴＩＭＰ１、酸セラミダーゼ（ＡＳＡＨ１）、リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）、アネキシン、カテプシンＢ、抗ロイコプロテイナーゼ（ＡＬＰ）、またはそれらのフラグメントを含む。

様々な実施形態において、上記または本明細書で論じた実施形態の特徴または構成要素のいずれかを組み合わせることができ、そのような組合せは、本開示の範囲内に包含される。上記または本明細書で論じた任意の特定の値を、上記または本明細書で論じた別の関連する値と組み合わせて、範囲の上端および下端を表す値を有する範囲を列挙することができ、そのような範囲は、本開示の範囲内に包含される。

図１Ａは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのデジタル画像、およびポリペプチドＰＬＢＤ２の調製物の形成を示すウェスタンブロットである。図１Ｂは、ＰＬＢＤ２の提案形態を示す図である。 図２は、選択された抗ＰＬＢＤ２抗体調製物を用いたウェスタンブロットのデジタル画像のセットである。組換えＰＬＢＤ２またはＨＩＣストリップを用いてマウスを免疫し、抗ＰＬＢＤ２ ｍＡｂを作製した。ハイブリドーマをウェスタンブロットにより特異性についてスクリーニングし、１０個を精製およびビオチン化のために選択した。成熟ＰＬＢＤ２タンパク質（約４２ｋＤａ）はいずれのハイブリドーマでも検出されなかった。Ｎ末端を標的とする抗体を同定した。 図３は、抗ＰＬＢＤ２抗体の活性を示す棒グラフである。これらの研究から、最終サンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットのために、ｍＡｂ０９コーティングおよびビオチン化ヤギｐＡｂ判定を選択した。 図４は、選択された抗ＰＬＢＤ２抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡの概略図である。 図５は、選択された一対の抗ＰＬＢＤ２抗体について作成された標準曲線である。 図６は、近似分子量を用いたキャピラリ電気泳動によるポリペプチド混入物の分離および検出のための例示的なワークフローである。 図７は、還元および非還元条件におけるＰＬＢＤ２の濃度依存的分析を示す一連の図を示す。この結果は、抗体試料中のＰＬＢＤ２の定量を示す。 図８は、電荷を用いたキャピラリ電気泳動によるポリペプチドの分離および検出のための例示的なワークフローの図である。 図９は、画像化されたｃＩＥＦ－ウェスタン（ｉｃＩＥＦ－Ｗｅｓｔｅｒｎ）チャージアッセイの結果を示す。ＰＬＢＤ２は、抗ＰＬＢＤ２ ｐＡｂを用いて検出される。ＰＬＢＤ２は、Ｃ２Ｐ２処理には存在せず、試料の含有物は、ＣＥ‐ウェスタンが５～６領域でＰＬＢＤ２ピークを特異的にピックアップしていることを確認した。 図１０は、画像化されたｃＩＥＦ－ウェスタン（ｉｃＩＥＦ－Ｗｅｓｔｅｒｎ）充電アッセイの結果を示す。天然のＰＬＢＤ２は、右の図の５～６のｐＨ領域で見ることができる。これは、ｍＡｂプロセスから検出され、プロセス試料からＰＬＢＤ２を選択的に検出するこの方法の能力を実証した。この電荷モードでは、ＰＬＢＤ２に対する特異的ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を用いて、処理試料中の不純物を検出することができる。

本発明を説明する前に、本発明は、特定の方法に限定されるものではなく、記載された実験条件、例えば、方法および条件が変化し得ることを理解されたい。また、本発明の範囲は、添付した請求の範囲によってのみ限定されるため、ここで使用される用語は、特定の実施形態のみの説明を目的とし、限定することを意図していないことも理解されたい。任意の実施形態または実施形態の特徴は、互いに組み合わせることができ、そのような組合せは、本発明の範囲内に明示的に包含される。

特記しない限り、本明細書で使用する専門用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の列挙された数値を参照して使用される場合、その値が列挙された値から１％以下変動し得ることを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、「約１００」という表現は、９９および１０１と、その間のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）とを含む。

本発明の実施または試験において、ここで説明するものと類似または同等の任意の方法および要素を用いることができるが、ここでは好適な方法および要素について説明する。本明細書において言及されるすべての特許、出願および非特許刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される略語
ｍＡｂ：モノクローナル抗体
ｂｉＡｂ：二重特異性抗体
ＣＥ：キャピラリ電気泳動
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
ｉｃＩＥＦ：画像化されたＣＩＥＦ
ｉｃＩＥＦ－ウェスタン；電荷ベースＣＥ－ウェスタン
ＩＥＣ：イオン交換クロマトグラフィー
ＱＣ：品質管理
ＨＲＰ：ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ＨＣＰ：宿主細胞タンパク質

定義
本明細書中で使用される「抗体」という用語は、４つのポリペプチド鎖、２つの重鎖（Ｈ）鎖および２つの軽鎖（Ｌ）鎖がジスルフィド結合によって相互に連結された免疫グロブリン分子（すなわち、「完全抗体分子」）、ならびにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）またはその抗原結合フラグメントを包含する免疫グロブリン分子を意味することを意図しており、それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「Ｖ_Ｈ」）および重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３のドメインを包含する）を包含する。様々な実施形態において、重鎖は、ＩｇＧアイソタイプであり得る。場合によっては、重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４から選択される。いくつかの実施形態において、重鎖は、アイソタイプＩｇＧ１またはＩｇＧ４であり、場合により、アイソタイプＩｇＧ１／ＩｇＧ２またはＩｇＧ４／ＩｇＧ２のキメラヒンジ領域を含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲまたは「Ｖ_Ｌ」）と軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）を含む。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は、さらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に細分化することができ、より保存された領域、すなわちフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域に散在させることができる。それぞれのＶ_ＨとＶ_Ｌは３つのＣＤＲと４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端までＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に並んでいる。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化および非グリコシル化免疫グロブリンの両方を包含する。「抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作製または単離された抗体分子、例えば、抗体を発現させるためにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体を包含する。抗体構造に関する総説については、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．， ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ， ２７（１） Ｄｅｖ． Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５５－７７ （２００３）； および Ｍ． Ｐｏｔｔｅｒ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ， ２（１） Ｓｕｒｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｓ． ２７－４２ （１９８３） を参照されたい。

抗体という用語はまた、「二重特異性抗体」を包含し、それは、複数のエピトープに結合し得るヘテロ四量体免疫グロブリンを包含する。二重特異性抗体の半分は、１の重鎖と１の軽鎖と６のＣＤＲを含み、１の抗原またはエピトープに結合し、残りの半分は異なる抗原またはエピトープに結合する。場合によっては、二重特異性抗体は、同一の抗原に結合することができるが、異なるエピトープまたは重複しないエピトープに結合することができる。場合によっては、二重特異性抗体の両半分は同一の軽鎖を有し、一方で二重特異性を保持する。二重特異性抗体は、一般に、米国特許出願公開第２０１０／０３３１５２７号（２０１０年１２月３０日）に記載されている。

抗体（または「抗体フラグメント」の「抗原結合部分」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上のフラグメントを指す。抗体の用語「抗原結合部分」内に包含される結合フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ′）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントからなる二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体のシングルアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなる、ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ２４１：５４４－５４６）、（ｖｉ）分離されたＣＤＲ、および（ｖｉｉ）Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬとＶＨで構成され、合成リンカーによって結合されて単一のタンパク質鎖を形成し、ＶＬ領域とＶＨ領域がペアになって一価の分子を形成するｓｃＦｖが挙げられる。二重特異性抗体のような一本鎖抗体の他の形態もまた、用語「抗体」（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｔ． （１９９３） ９０ ＰＮＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ． ６４４４－６４４８； ａｎｄ Ｐｏｌｊａｋ ｅｔ ａｔ． （１９９４） ２ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １１２１－１１２３参照）に包含される。

さらに、抗体およびその抗原結合フラグメントは、当技術分野で一般的に知られている標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して得ることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９を参照のこと）。

「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図される。本発明のヒトｍＡｂは、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダムまたは部位特異的変異誘発によって、またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞変異によって導入される変異）、例えばＣＤＲおよび特にＣＤＲ３を含むことができる。しかしながら、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列上に移植されたｍＡｂを含むことを意図していない。用語は、非ヒト哺乳動物において、または非ヒト哺乳動物の細胞において組換えにより産生された抗体を含む。この用語は、ヒト対象から単離された、またはヒト対象中で生成された抗体を含むことを意図していない。

用語「試料」は、本明細書で使用される場合、例えば、分離、分析、抽出、濃縮またはプロファイリングを含む、本発明の方法に従って操作される、モノクローナル抗体、二重特異性抗体および／または１以上の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）混入物などの、目的の少なくとも１のポリペプチドを含む分子の混合物を指す。

「分析」または「分析する」という用語は、本明細書で使用される場合、互換的に使用され、抗体調製物などのバイオ医薬品調製物中の目的の分子（例えば、抗体およびＨＣＰ混入物などのポリペプチド）を分離、検出、単離、精製、可溶化、検出および／または特徴づける種々の方法のいずれかを指す。

「クロマトグラフィー」とは、本明細書中で使用される場合、混合物、例えば、ペプチド、タンパク質、ポリペプチドおよび／または抗体、例えばモノクローナル抗体を含有する混合物を分離する方法を指す。それは、混合物を固定相に通すことを含み、それは、目的の分子を混合物中の他の分子から分離し、目的の１以上の分子を単離することを可能にする。本明細書に開示される方法において、クロマトグラフィーは、サイズに基づくキャピラリ電気泳動および等電点電気泳動または荷電ベースのキャピラリ電気泳動を含むキャピラリ電気泳動を指す。

本明細書中で使用される場合、「接触すること」は、溶液または固相中の少なくとも２つの物質を一緒にすること、例えば、ＨＣＰ混入物などの目的の分子に特異的に結合する抗体などの抗体と試料を接触させることを含む。

「単離された」という用語は、本明細書で使用される場合、コンポーネントが天然に存在する、またはトランスジェニックに発現される生物体の細胞中の他の生物学的コンポーネント、すなわち、他の染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質、脂質、および代謝産物から実質的に分離、産生、または精製された生物学的構成要素（例えば、モノクローナル抗体のような抗体）を指し、「単離された」核酸、ペプチド、タンパク質、脂質および代謝産物は、したがって、「単離された」核酸、ペプチド、タンパク質、脂質および代謝産物には、標準または非標準の精製方法によって精製された核酸、ペプチド、タンパク質、脂質、および代謝産物が含まれる。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸、ペプチド、タンパク質、脂質、および代謝産物、ならびに化学的に合成されたペプチド、脂質、代謝産物、および核酸を包含する。

「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、互換的に、ペプチド結合またはペプチド結合模倣体によって結合されるアミノ酸および／またはアミノ酸類似体の重合体を意味する。天然に存在するアミノ酸２０個とそれらの１文字および３文字の名称は、アラニン Ａ Ａｌａ、システイン Ｃ Ｃｙｓ、アスパラギン酸 Ｄ Ａｓｐ、グルタミン酸 Ｅ Ｇｌｕ、フェニルアラニン Ｆ Ｐｈｅ、グリシン Ｇ Ｇｌｙ、ヒスチジン Ｈ Ｈｉｓ、イソロイシンＩ Ｈｅ、リジン Ｋ Ｌｙｓ、ロイシン Ｌ Ｌｅｕ、メチオニン Ｍ Ｍｅｔ、アスパラギン Ｎ Ａｓｎ、プロリン Ｐ Ｐｒｏ、グルタミン Ｑ Ｇｌｎ、アルギニン Ｒ Ａｒｇ、セリン Ｓ Ｓｅｒ、トレオニン Ｔ Ｔｈｒ、バリン Ｖ Ｖａｌ、トリプトファン ｗ Ｔｒｐ、チロシン Ｙ Ｔｙｒである。一実施形態では、ペプチドは、抗体またはそのフラグメントの一部、例えば、上に列挙されたフラグメントもしくは抗体鎖のいずれかである。いくつかの実施形態において、ペプチドは翻訳後修飾され得る。別の実施形態では、ペプチドはＨＣＰ混入物である。

「検出」および「検出」は、それらの標準的な意味を有し、混入ポリペプチド、例えばＨＣＰのような目的のタンパク質の有無、測定、および／または特徴付けを含む検出を包含することが意図される。

本明細書中で使用される用語「目的のタンパク質」および／または「目的の標的タンパク質」は、本明細書中で提供される方法で分離および／または検出される任意のタンパク質を指す。目的の適切なタンパク質には、ＨＣＰのような抗体調製物中の混入タンパク質が含まれる。

本明細書で使用される場合、「標準」および／または「内部標準」という用語は、分子量または等電点に基づいて、試料および試料中の標準および分子の両方に加えることができる既知の量および／または同一性（例えば、既知の分子量、電気泳動移動度プロファイル）の十分に特徴づけられた物質を指す。次いで、標準の比較は、試料中に存在する混入タンパク質、例えばＨＣＰのような分析物の量の定量的または半定量的な測定を提供する。

概要
混入宿主細胞タンパク質変異体の特徴づけは、可能性のあるまたは実現された治療用抗体の精製に対する可能性のある影響を同定するために重要である。ｍＡｂの特徴づけに加えて、タンパク質混入物の性質を理解することはｍＡｂ治療薬の開発におけるもう１つの重要な因子である。例えば、残留タンパク質Ａ、ＨＣＰ、残留ＤＮＡおよび他の可能性のある培養または精製残渣の制御は、典型的には、薬剤物質の仕様の一部である。加えて、このような制御は、プロセスの一貫性と性能に関する貴重な情報を提供する。したがって、本明細書には、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のサイズおよび／または電荷に基づく検出方法が開示され、例えば、目的のタンパク質を汚染するＨＣＰに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などの抗体を使用する。開示された方法は、処理試料中の問題のあるＨＣＰおよびそれらの種々の種の検出および可視化を可能にする（例えば、ＣＨＯ細胞から精製された試料中の一般的な混入物であるハムスタータンパク質ＰＬＢＤ２における不均一性を示す図１Ａおよび図１Ｂを参照）。本明細書で使用される場合、ＰＬＢＤ２は、遺伝子または遺伝子産物、例えば、ＰＬＢＤ２遺伝子によって産生されるＰＬＢＬ２タンパク質を指す。したがって、ＰＬＢＤ２は、ＰＬＢＬ２タンパク質と同義である遺伝子または遺伝子産物を指すことができる。これらの方法により、所与のＨＣＰ不純物の種々の種を低ｐｐｍレベルで検出し、示すことができる。したがって、本開示の態様は、モノクローナル抗体調製試料中の目的のタンパク質混入物を検出するための方法を含む。生物学的試料中の、目的のより混入された宿主細胞タンパク質またはそのフラグメントを区別する能力は、タンパク質および／またはフラグメントの活性が、治療用抗体などの活性剤の活性に対して異なる効果を有することがあるので、ますます重要になってきている。したがって、潜在的な治療的ｍＡｂおよびｍＡｂ製剤の潜在的混入物を特徴づける方法が必要である。本明細書に開示される方法は、それらのニーズを満たす。

本明細書には、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）調製物などの生物学的試料中の混入宿主細胞タンパク質の変異体を、混入宿主細胞タンパク質の分子量または等電点などの物理的パラメータによって検出および／または区別するための方法が開示されている。開示された方法は、抗体調製物のＱＣ評価に使用することができる。本方法の実施形態において、目的の１の混入宿主細胞タンパク質または複数の混入宿主細胞タンパク質を含む試料は、キャピラリ電気泳動を使用することによって、例えばＣＥ－システムの１以上のキャピラリ上で分解または分離される。特定の実施形態では、試料は、分子量によって分解または分離される。分子量による分解により、試料中にどのようなフラグメントまたは種の混入宿主細胞タンパク質が存在するかを決定することができる。特定の実施形態では、試料は、電荷によって、例えば等電点電気泳動によって分解または分離される。電荷による混入宿主細胞タンパク質の分離は、混入宿主細胞タンパク質の均一性、例えば、分子量による分離では容易には見られない混入宿主細胞タンパク質の表面電荷の変化を決定することができるという付加的な利点を有する。特定の実施形態では、試料は、単一のキャピラリ内で分解または分離される。特定の実施形態では、試料は、複数のキャピラリ内で、例えば並行して、分解または分離される。

タンパク質成分が１以上のキャピラリ中で分解または分離されると、タンパク質成分、例えば、目的の混入宿主細胞タンパク質は、１以上のキャピラリ中の目的の混入宿主細胞タンパク質の相対位置が維持されるように、キャピラリ内に固定化される。実施形態では、目的の混入宿主細胞タンパク質は、目的の混入宿主細胞タンパク質を含む１以上のキャピラリ内のタンパク質成分を、混入宿主細胞タンパク質またはそのフラグメントの存在を検出するために、目的の混入宿主細胞タンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する１以上の一次抗体と接触させることによって検出される。実施形態において、本方法は、例えば、キャピラリ内でのその移動性が、そのまたはそのフラグメントの固定化によって損なわれるため、１以上の一次抗体の結合を検出することを含む。一次抗体の結合の検出は、例えばキャピラリの長さに沿って、試料を質量または電荷によりそれぞれ分離されたかどうかに応じて、試料中の目的の混入宿主細胞タンパク質またはそのフラグメントのサイズ変異体および／または変化変異体の検出および／または区別を可能にする。分子量による分離に関しては、例として、キャピラリ内でさらに細かいフラグメントが移動することが予想される。実施形態では、試料は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ以上の混入宿主細胞タンパク質またはそのフラグメントなどの複数のタンパク質を含有することができ、そのそれぞれが、目的の個々の混入宿主細胞タンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する一次抗体を用いて検出することができる。いくつかの実施形態において、本方法は、例えば、検出された標識付けされた一次抗体の量に対応し、したがって標識付けされた一次抗体に結合するためにどれだけの混入宿主細胞タンパク質またはそのフラグメントが利用可能であるかに対応するピーク高さまたは面積の測定によって、試料中の混入宿主細胞タンパク質の変異体の相対量または絶対量を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、目的の混入宿主細胞タンパク質は、ＰＬＢＤ２、ＣＴＳＤ、ＴＩＭＰ１、酸セラミダーゼ（ＡＳＡＨ１）、リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）、アネキシン、カテプシンＢ、抗ロイコプロテイナーゼ（ＡＬＰ）、またはそれらのフラグメントのうちの１以上を含む。いくつかの実施形態において、目的のタンパク質混入物は、ＰＬＢＤ２を含む。いくつかの実施形態において、試料は、試料中の１以上の内部標準、例えば分子量標準のラダー、等電点標準のラダー、または混入宿主細胞タンパク質またはそのフラグメントの量を決定するためのベースラインまたはベンチマークとして使用される標準を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、目的のタンパク質混入物の電荷変異体またはサイズ変異体の検出および／または区別を含む。いくつかの実施形態において、目的のタンパク質混入物の相対量または絶対量を決定することができる。本方法の様々な実施形態において、１以上の一次抗体は、ポリクローナル抗体を含み、本方法の様々な実施形態において、１以上の一次抗体は、モノクローナル抗体を含む。

実施形態では、本方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはさらにそれ以上のような、目的の混入宿主細胞タンパク質の２つ以上のサイズ変異体を有する試料のタンパク質成分を、キャピラリ電気泳動を用いて、１以上のキャピラリ中で分子量によって分離することを含む。図６に、流れの一例を示す。実施形態では、方法は、試料のタンパク質成分を１以上のキャピラリ内に固定することを含む。実施形態では、方法は、１以上のキャピラリ内のタンパク質成分を、目的の第１のモノクローナル抗体に特異的に結合する第１の一次抗体と接触させることを含む。実施形態では、方法は、第１の一次抗体の結合を検出することを含み、それによって、目的の第１のモノクローナル抗体を検出する。いくつかの実施形態において、混入宿主細胞タンパク質の分子量ベースのプロファイルまたはフィンガープリントは、例えば、混合物中の混入宿主細胞タンパク質の分子量ベースのプロファイルまたはフィンガープリントと比較するために、混入宿主細胞タンパク質のみのものを作成することができる。次いで、この比較を用いて、目的の混入宿主細胞タンパク質が混合物中で、例えば経時的に、または調製物全体にわたって変化するかどうかを決定することができる。これは、調製のための条件を最適化するために、例えば、所与の治療用ｍＡｂの調製物中に存在し得る混入宿主細胞タンパク質の効果または活性を最小化するために行うことができる。このプロファイルまたはフィンガープリントの比較は、混合物中の対象となる混入宿主細胞タンパク質のいずれかまたはすべてについて行うことができる。実施形態では、方法は、１以上のキャピラリ内のタンパク質成分を、目的の第２のモノクローナル抗体に特異的に結合する第２の一次抗体と接触させることを含む。実施形態では、本方法は、第２の一次抗体の結合を検出することを含み、それにより、目的の第２のモノクローナル抗体を検出し、試料中の混入宿主細胞タンパク質を区別することを含む。これは、試料中の複数の異なる混入宿主細胞タンパク質について継続することができる。例えば、実施形態において、本方法は、１以上のキャピラリ内のタンパク質成分を、目的の第３の混入宿主細胞タンパク質に特異的に結合する第３の一次抗体と接触させ、第３の一次抗体の結合を検出することを含み、それによって、目的の混入宿主細胞タンパク質を検出することができる。追加の実施形態では、本方法は、１または複数のキャピラリ内のタンパク質成分を、１または複数の追加の混入宿主細胞タンパク質、例えば、第４、第５、第６、第７など、追加の混入宿主細胞タンパク質に特異的に結合する１または複数の一次抗体、例えば、第４、第５、第６、第７などの一次抗体と接触させることと、１または複数の一次抗体の結合を検出し、それによって目的の混入宿主細胞タンパク質を検出することと、を含むことができる。実施形態において、試料は、複数のキャピラリに分割され、これらのキャピラリの各々は、異なる１の一次抗体または複数の一次抗体と接触され、検出される。得られたシグナルは後で組み合わせることができる。特定の実施形態では、検出は、単一のキャピラリ、例えば、マルチプレックスで行うことができる。

実施形態では、本方法は、例えば等電点電気泳動により、キャピラリ電気泳動を用いて、１以上のキャピラリ中でチャージすることにより、目的の宿主細胞タンパク質、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはさらにそれ以上の混入宿主細胞タンパク質の２つ以上の電荷変異体で試料のタンパク質成分を分離することを含む。実施形態において、本方法は、試料のタンパク質成分を１以上のキャピラリ内に固定化することを含む。図８に例示的な流れを示す。実施形態では、方法は、１以上のキャピラリ内のタンパク質成分を、目的の第１のモノクローナル抗体に特異的に結合する第１の一次抗体と接触させることを含む。実施形態では、方法は、第１の一次抗体の結合を検出することを含み、それによって、目的の第１のモノクローナル抗体を検出する。いくつかの実施形態において、混入宿主細胞タンパク質の電荷に基づくプロファイルまたはフィンガープリントは、例えば、混合物中の混入宿主細胞タンパク質の電荷に基づくプロファイルまたはフィンガープリントと比較するために、混入宿主細胞タンパク質のみのものを作成することができる。次いで、この比較を用いて、目的の混入宿主細胞タンパク質が混合物中で、例えば経時的に、または調製物全体にわたって変化するかどうかを決定することができる。これは、調製のための条件を最適化するために、例えば、所与の治療用ｍＡｂの調製物中に存在し得る混入宿主細胞タンパク質の効果または活性を最小化するために行うことができる。このプロファイルまたはフィンガープリントの比較は、混合物中の対象となる混入宿主細胞タンパク質のいずれかまたはすべてについて行うことができる。実施形態では、方法は、１以上のキャピラリ内のタンパク質成分を、目的の第２のモノクローナル抗体に特異的に結合する第２の一次抗体と接触させることを含む。実施形態では、本方法は、第２の一次抗体の結合を検出することを含み、それにより、目的の第２のモノクローナル抗体を検出し、試料中の混入宿主細胞タンパク質を区別することを含む。これは、試料中の複数の異なる混入宿主細胞タンパク質について継続することができる。例えば、実施形態において、本方法は、１以上のキャピラリ内のタンパク質成分を、目的の第３の混入宿主細胞タンパク質に特異的に結合する第３の一次抗体と接触させ、第３の一次抗体の結合を検出することを含み、それによって、目的の混入宿主細胞タンパク質を検出することができる。さらなる実施形態において、該方法は、１または複数のキャピラリ内のタンパク質成分を、１または複数の追加の混入宿主細胞タンパク質、例えば、第４、第５、第６、第７など、追加の混入宿主細胞タンパク質に特異的に結合する１または複数の一次抗体、例えば、第４、第５、第６、第７などの一次抗体と接触させることと、１または複数の一次抗体の結合を検出し、それによって目的の混入宿主細胞タンパク質を検出することと、を含むことができる。実施形態において、試料は、複数のキャピラリに分割され、これらのキャピラリの各々は、異なる１の一次抗体または複数の一次抗体と接触され、検出される。得られた信号は後で組み合わせることができる。特定の実施形態では、検出は、単一のキャピラリ、例えば、マルチプレックスで行うことができる。

開示された方法において使用するための試料は、種々の成分、すなわち異なるタンパク質を含有する不均一であり得る。あるいは、試料は均質であり得、複数の電荷または分子量種の１の成分または本質的に１の成分を含む。混入タンパク質などの目的タンパク質を検出する前に、前分析処理を試料に対して行ってもよい。例えば、試料は、溶解工程、変性工程、加熱工程、精製工程、析出工程、免疫沈降工程、カラムクロマトグラフィー工程、遠心分離などに供することができる。いくつかの実施形態において、試料の分離および固定化は、天然基材上で実施され得る。他の実施形態において、試料は、変性、例えば、熱および／または変性剤との接触に供され得る。変性剤は当技術分野で公知である。いくつかの実施形態において、試料は、非還元条件に付され得る。いくつかの実施形態において、試料は、例えば、１以上の還元剤と接触させた還元条件に付されてもよい。還元剤は当技術分野では知られている。

いくつかの実施形態において、一次抗体は、検出可能な標識で標識付けされ、１以上の一次抗体の結合を検出することは、検出可能な標識を検出することを含む。いくつかの実施形態において、１以上の一次抗体の結合を検出することは、１以上の一次抗体を、１以上の一次抗体のうちの少なくとも１つに特異的に結合する二次抗体と接触させ、二次抗体の結合を検出することを含む。実施形態では、二次抗体は、検出可能な標識を有し、検出可能な標識は検出される。

いくつかの実施形態において、一次抗体および／または二次抗体は、１以上の検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、化学発光標識、蛍光標識または生物発光標識を含む。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、化学発光標識を含む。化学発光標識は、光信号を提供し、本明細書に開示される方法に従って使用することができる任意の実体を含むことができる。種々のそのような化学発光標識は、当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第６，６８９，５７６号、第６，３９５，５０３号、第６，０８７，１８８号、第６，２８７，７６７号、第６，１６５，８００号、および第６，１２６，８７０を参照されたい。適切な標識には、化学発光による光子放出が誘導されるような方法で化学発光基質と反応することができる酵素が含まれる。このような酵素は、酵素活性を介して他の分子の化学発光を誘導する。そのような酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ベータガラクトシダーゼ、ホスファターゼ、または化学発光基質が利用可能な他のものなどのペルオキシダーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、化学発光標識は、様々なクラスのルミノール標識、イソルミノール標識などのいずれかから選択することができる。いくつかの実施形態において、一次抗体は、化学発光標識抗体を含む。化学発光基質は、当技術分野において周知であり、例えば、カリフォルニア州フォスターシティのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なガラクトン基質、またはイリノイ州ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から入手可能なＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ基質、または他の適切な基質などである。

いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、生物発光性化合物を含む。生物発光とは、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を高める、生物系において見られる化学発光の一種である。生物発光性化合物の存在は、発光の存在を検出することによって決定される。好適な生物発光化合物としては、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、蛍光色素などの蛍光標識を含む。蛍光色素は、蛍光シグナルを提供し、本明細書に記載の方法および装置に従って使用することができる任意の実体を含むことができる。典型的には、蛍光色素は、第１の波長で光を吸収し、吸収事象に応答して第２の波長で蛍光を放射する共鳴非局在化系または芳香族環系を含む。このような蛍光色素分子は多種多様であることが当技術分野で知られている。例えば、蛍光色素は、種々のクラスの蛍光化合物のいずれかから選択することができ、非限定的な例としては、キサンテン、ローダミン、フルオレセイン、シアニン、フタロシアニン、スクアライン、ボディー染料、クマリン、オキサジン、およびカルボピロニンが挙げられる。いくつかの実施形態において、例えば、一次抗体および／または二次抗体が蛍光色素などの蛍光体を含有する場合、それらの蛍光は、それらを適切な光源で励起し、それらの特徴的な蛍光発光波長に敏感な検出器によってそれらの蛍光をモニターすることによって検出される。いくつかの実施形態において、一次抗体は、蛍光色素標識抗体を含む。

実施形態では、目的の異なる混入タンパク質などの異なる目的のタンパク質に結合または相互作用する２つ以上の異なる一次抗体または二次抗体を使用して、異なるタイプの目的のタンパク質を、例えば、同一または単一のキャピラリ内のマルチプレックスにおいて、例えば、異なるまたはさらに同じ検出可能な標識を使用して、同時に検出することができる。いくつかの実施形態において、複数の一次抗体および／または二次抗体を複数の基質と共に使用して、色多重化を提供することができる。例えば、使用される異なる化学発光基質は、それらが異なる色の光子を放出するように選択されるであろう。異なる色の選択的検出は、回折格子、プリズム、一連の着色フィルタ、または他の手段を使用することによって達成することができる。

実施形態において、キャピラリは分離マトリックスを含むことができ、これは装置および／またはシステムによって自動化された方法で加えることができる。いくつかの実施形態において、試料は、分離前にスタッカーマトリックス上にロードされる。分離マトリックスは、一実施形態では、サイズ分離マトリックスであり、従来の電気泳動技術で使用される、ポリマーゲルの類似または実質的に同じ特性を有する。分離マトリックス中のキャピラリ電気泳動は、ポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲルのようなポリマーゲル中での分離に類似しており、ここで分子は、試料中の分子のサイズに基づいて分離され、その中を分子が移動することができる多孔質通路を提供する。より大きな分子は、より小さな分子よりもゆっくりとマトリックスを通って移動するため、分離マトリックスは、分子サイズによる分子の分離を可能にする。いくつかの実施形態において、１以上のキャピラリは、分離マトリックスを含む。いくつかの実施形態において、目的のタンパク質を含有する試料は、分子量に基づいて分離または分割される。いくつかの実施形態において、分離マトリックスは、分子量によってタンパク質を分離するように構成されたふるい分けマトリックスを含む。いくつかの実施形態において、試料のタンパク質成分は、分子量によって分離され、方法は、目的のモノクローナル抗体のサイズ変異体を検出および／または区別する方法である。いくつかの実施形態において、試料のタンパク質成分は、分子量によって分離され、方法は、目的の混入タンパク質のサイズ変異体を検出および／または区別する方法である。

多種多様な固相基質、例えば、ポリアクリルアミドゲルなどのゲルが当技術分野で公知である。いくつかの実施形態において、目的の１以上のタンパク質を分離することは、ポリマーゲル中の試料の電気泳動を含む。ポリアクリルアミドゲルやアガロースゲルのような高分子ゲル中での電気泳動は、分子の大きさに基づいて分子を分離する。高分子ゲルは、分子が移動できる多孔性通路を提供する。より大きな分子は、より小さな分子よりもゆっくりとゲル中を移動するため、高分子ゲルは、分子サイズによる分子の分離を可能にする。

いくつかの実施形態において、目的のタンパク質を含有する試料は、試料の成分の電荷に基づいて分離または分解される。いくつかの実施形態において、試料のタンパク質成分は電荷によって分離され、方法は、目的のモノクローナル抗体の電荷変異体を検出および／または区別する方法である。いくつかの実施形態において、試料のタンパク質成分は電荷によって分離され、方法は、目的の混入タンパク質の電荷変異体を検出および／または区別する方法である。いくつかの実施形態において、分離マトリックスは、担体両性電解質を含む。いくつかの実施形態において、電荷によって試料を分離することは、試料の等電点電気泳動（ＩＥＦ）を含む。例えば、電場中では、分子は、その分子によって運ばれる正味の電荷とは反対の電荷を運ぶ極（カソードまたはアノード）に向かって移動する。この正味の電荷は、分子が移動する媒体のｐＨに部分的に依存する。１の一般的な電気泳動法は、電場の各端に異なるｐＨ値を有するソリューションを確立することであり、その間にｐＨの傾き温度範囲がある。あるｐＨでは、分子の等電点が得られ、分子は正味の電荷をもたない。分子がｐＨ傾きを横切ると、正味電荷がゼロ（すなわち等電点）になるスポットに到達し、その後電場に固定化される。したがって、この電気泳動法は分子を異なった等電点に従って分離する。

いくつかの実施形態において、例えば、分離が等電点電気泳動による場合、両性電解質試薬をキャピラリ電気泳動装置の１以上のキャピラリに装填することができる。両性電解質試薬は、異なる等電点の範囲を有する分子の混合物である。典型的な両性電解質試薬は、イングランド、バッキンガムシャー州のＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから利用可能なＰｈａｒｍａｌｙｔｅ（商標）およびＡｍｐｈｏｌｉｎｅ（商標）である。

実施形態では、分離が完了すると、分離された試料の成分（例えば、目的の混入タンパク質などの目的のタンパク質を含む）は、化学的、光化学的、および熱処理を含むがこれらに限定されない任意の適切な方法を用いて、１以上のキャピラリの壁に固定される。いくつかの実施形態において、分離された試料の成分は、分子が例えばサイズまたは電荷によって電気泳動によって分離された後、ＣＥ－システムの１以上のキャピラリ中に固定化される。いくつかの実施形態において、固定化は、光固定化、化学的固定化、または熱固定化を含む。固定化は、共有結合または疎水性またはイオン性相互作用などによる非共有結合手段を介するものであり得る。特定の実施形態では、目的のタンパク質は、１以上の反応性部分を用いて固定化される。反応性部分は、試料の個々の分子の対応する反応性基と共有結合を形成することができる任意の反応性基を含むことができる。したがって、反応性部分は、本明細書中に開示される方法と適合性である限り、当技術分野で公知の任意の反応性基を含むことができる。いくつかの実施形態において、反応性部分は、目的の混入タンパク質などの、上記のタンパク質の対応する反応性基と共有結合を形成することができる反応性基を含む。

反応性部分は、直接的に、または間接的にキャピラリに結合することができる。いくつかの実施形態において、反応性部分は、溶液または懸濁液中で供給され得、活性化されると、キャピラリの壁と試料中の分子との間に架橋を形成し得る。例えば、一実施形態では、固定化は、分離された試料およびキャピラリを紫外（ＵＶ）光に曝すことによって起こり、紫外（ＵＶ）光は、目的のタンパク質（試料中に存在する場合）および試料中の分子をキャピラリの壁に固定するのに役立つ。固定化は、共有結合または疎水性またはイオン性相互作用などによる非共有結合手段を介するものであり得る。別の実施形態では、反応性部分を使用して、目的の分離されたタンパク質またはキャピラリ内の目的のタンパク質を共有結合的に固定化することができる。反応性部分は、キャピラリ（例えば、キャピラリの壁）に直接的または間接的に付着させることができる。いくつかの実施形態において、反応性部分は、溶液または懸濁液中で供給することができ、活性化の際にキャピラリの壁と試料中の分子との間に架橋を形成するように構成することができる。反応性部分は、キャピラリを並べることができ、または活性化前および／または活性化後にキャピラリの壁に連結されていてもいなくてもよい、キャピラリ中の線状または架橋高分子上に存在することができる。反応性部分は、試料の個々の分子の対応する反応性基と共有結合を形成することができる任意の反応性基、例えば、上記のものであり得、および／または、これらを含み得る。

いくつかの実施形態において、反応性部分は、疎水性相互作用、イオン性相互作用、水素結合などを介して目的のタンパク質に付着する官能性に変換され得る官能基を含む。いくつかの実施形態において、上記反応性部分は、キャピラリの表面上および／またはキャピラリの表面に付着した粒子の表面上に目的のタンパク質を固定化するために、ＵＶ光、レーザー、温度、または任意の他のエネルギー源で活性化される。いくつかの実施形態において、キャピラリの表面は、温度を変化させると表面の疎水性の変化を可能にする熱応答性ポリマーで官能化される。いくつかの実施形態において、目的のタンパク質は、キャピラリ内である温度範囲に達したときに、温度応答性ポリマーの疎水性を増加させることによって、そのような表面上に固定化される。

２つの分子を共に共有結合するのに適した多種多様な反応性部分は、当該技術分野において公知である。例えば、反応性部分は、タンパク質の炭素－水素（Ｃ－Ｈ）結合に結合することができる。多くの分離媒体は、Ｃ－Ｈ結合を有する成分も含むので、スルフヒドリル（Ｓ－Ｈ）基と反応する化学反応は、Ｓ－Ｈ基がほとんどの分離媒体成分と比較してタンパク質上に独特に見出される点で有利であり得る。好適な反応性部分は、限定されるわけではないが、光反応性基、化学反応性基、および熱反応性基を含む。キャピラリ系における光固定化は、１以上の光反応性基の活性化により達成することができる。光反応性基は、外部エネルギー源による活性化の際に、他の分子と共有結合を形成する１以上の潜在的な光反応性基を含む。例えば、米国特許第５，００２，５８２号、および第６，２５４，６３４号を参照。光反応性基は、電磁エネルギーの吸収により、フリーラジカル、特にニトレン、カルベン、およびケトンの励起状態のような活性種を生成する。光反応性基は、スペクトルの紫外線、赤外線および可視部分に応答するものなど、電磁スペクトルの様々な部分に応答するものを選択することができる。例えば、光源に暴露すると、光反応性基を活性化して、隣接する分子と共有結合を形成することができる。好適な光反応性基としては、アリールケトン、アジド、ジアゾ、ジアジリン、およびキノンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、試料の目的の分離されたタンパク質は、等電点電気泳動によってＣＥ－システムのキャピラリ中に固定化される。

検出可能な標識を検出することは、本明細書に記載の方法と適合する限り、当該技術分野で公知の任意の方法によって可能である。ラベル検出は、従来の方法および器具を用いて信号をモニタリングすることによって行うことができ、非限定的な例としては、光検出器、光検出器のアレイ、荷電結合素子（ＣＣＤ）アレイなどが挙げられる。典型的には、検出可能な標識を検出することは、キャピラリを画像化することを含む。いくつかの実施形態では、キャピラリの全長を画像化することができる。あるいは、キャピラリの別個の部分または部分を画像化することができる。

本明細書に記載される方法のステップの順番の変更は、当業者には容易に想起されるであろう。例えば、試料を分離し、次いで、目的のタンパク質を一次抗体と接触させる前に、キャピラリ内のそれらの分離された位置に固定化した目的のタンパク質を分離することができる。いくつかの実施形態において、一次抗体を目的のタンパク質と接触させて複合体を形成し、次いで、複合体をＣＥ－システムのキャピラリ内で分離する。いくつかの実施形態において、一次抗体は、試料に予めロードされ、その後、システムにロードされ得る。別の実施例として、等電点電気泳動のような分割工程は、化学発光試薬が供給された後に適用することができる。

いくつかの実施形態において、試料は、内部標準を含む。内部標準は、等電点または分子量に関して分離を較正するのに役立つ。ＩＥＦの内部標準は、当該技術分野でよく知られており、例えば、Ｋ．，Ｋａｍｉｙａ，Ｋ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｋ．Ｋａｓａｉ （２００２） Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－Ｌａｂｅｌｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ ｐＩ Ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｖ７４：１０４６－１０５３、および、米国特許第５，８６６，６８３号を参照のこと。蛍光によって検出される標準は、化学ルミネセンスの前または後のいずれかで照明することができるが、一般に化学ルミネセンスと同時に照明することはできない。いくつかの実施形態において、目的のタンパク質および標準は、蛍光によって検出される。目的のタンパク質および標準は、それぞれ、目的のタンパク質および標準が独立して検出可能であるように、個々の発光波長で検出可能な蛍光色素で標識付けすることができる。

いくつかの実施形態において、内部標準は、一般に何らかの方法で目的のタンパク質と区別可能にされる、目的のタンパク質自体の精製された形態であり得る。目的のタンパク質の精製形態を得る方法には、限定されるものではないが、性質からの精製、実験室で増殖させた生物からの精製（例えば、化学合成を介した）、および／または類似物が含まれ得る。内部標準の区別特性は、電気泳動分離中の色素標識、放射性標識、または標準の移動度を、それが目的のタンパク質から分離されるように改変することができるが、これらに限定されない任意の適切な変化であり得る。例えば、標準は、目的のタンパク質に対して標準の電荷、質量、および／または長さ（例えば、欠失、融合、および／または化学修飾を介して）を変化させる目的のタンパク質の改変を含むことができる。したがって、目的のタンパク質および内部標準は、それぞれ、別個の発光波長で検出可能な蛍光色素で標識付けすることができ、それによって、目的のタンパク質および標準を独立して検出可能にすることができる。場合によっては、内部標準は目的のタンパク質とは異なるが、目的のタンパク質と同様または同じように振る舞い、関連する比較測定を可能にする。いくつかの実施形態では、使用に適した標準は、米国特許出願公開第２００７／００６２８１３号に記載されているもののいずれであってもよく、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

当業者には理解されるように、キャピラリに試料を装填する実質的に任意の方法を実施することができる。例えば、試料をキャピラリの一端に装填することができる。いくつかの実施形態において、試料は、流体力学的流れによってキャピラリの一端に装填される。例えば、流体経路がキャピラリである実施形態において、試料は、流体力学的流れによってキャピラリの一端に装填され得、その結果、キャピラリは、マイクロピペットとして使用される。いくつかの実施形態において、試料は、例えば、キャピラリがゲル充填され、したがって流体力学的流れに対してより抵抗性である場合、電気泳動によってキャピラリに装填され得る。

キャピラリは、液体または溶解した分子を流動させる任意の構造を含むことができる。したがって、キャピラリは、方法に適合する限り、当該技術分野で公知の任意の構造を含むことができる。いくつかの実施形態では、キャピラリは、液体または溶解した分子が流れることができる穴またはチャネルである。いくつかの実施形態において、キャピラリは、液体または溶解した分子が流れることができる透過性材料中の通路である。

キャピラリは、キャピラリ内の目的タンパク質の検出を可能にする任意の材料を含む。キャピラリは、ガラス、プラスチック、シリコン、溶融シリカ、ゲルなどの任意の好都合な材料を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、複数のキャピラリを使用する。複数のキャピラリは、複数の試料を同時に分析することを可能にする。

キャピラリは、例えば、寸法、幅、深さおよび断面、ならびに形状が丸く、台形、長方形等であるように変化することができる。キャピラリは、直線状、丸みを帯びた、蛇行状、または類似のものであり得る。以下に記載するように、流体経路の長さは、試料サイズや、目的のタンパク質を分解するのに必要な試料分離の程度などの要因に部分的に依存する。

いくつかの実施形態において、キャピラリは、ボア（ｂｏｒｅ）を有する管を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、複数のキャピラリを使用する。適当なサイズとしては、限定されないが、約１０～約１０００μｍの内径を有するキャピラリが挙げられ、しかしながら、約２５～約４００μｍの内径を有するキャピラリをより一般的に用いることができる。より小さな直径のキャピラリは比較的低い試料充填を使用し、一方、比較的大きなボアキャピラリの使用は比較的高い試料充填を可能にし、改善された信号検出をもたらし得る。

キャピラリは様々な長さを有することができる。適当な長さは、限定されないが、長さが約２～２０ｃｍのキャピラリを含み、しかしながら、幾分短いおよび長いキャピラリを使用することができる。いくつかの実施形態において、キャピラリは、約３、４、５、または６ｃｍの長さである。より長いキャピラリは、典型的には、複雑な混合物のより良い分離および改善された分解能をもたらす。より長いキャピラリは、目的の低量のタンパク質を分解するのに特に使用され得る。

一般に、キャピラリは溶融シリカから構成されるが、塑性キャピラリおよびパイレックス（すなわち、非晶質ガラス）を利用することができる。上記のように、キャピラリは、円形または管状の形状を有する必要はない。本明細書に記載の方法と適合する限り、他の形状も使用することができる。

いくつかの実施形態において、キャピラリは、チャネルであり得る。いくつかの実施形態において、本方法は、複数のチャネルを使用する。いくつかの実施形態において、キャピラリは、マイクロ流体デバイス内のチャネルであり得る。マイクロフルイディクスは、多種多様な操作を行うために、基質内のチャネルを使用する。マイクロ流体デバイスは、基質の表面に輪郭形成された１以上のチャネルを含むことができる。マイクロ流体デバイスは、固形不活性基質から、およびいくつかの実施形態では、チップの形態で得ることができる。マイクロ流体デバイスの寸法は重要ではないが、いくつかの実施形態では、寸法は、約１００μｍ～約５ｍｍの厚さのオーダーであり、約１センチメートル～約２０センチメートルのサイドである。好適なサイズとしては、限定されるものではないが、約５μｍ～約２００μｍの深さを有するチャネルが挙げられるが、より典型的には、約２０μｍ～約５０μｍの深さを有するチャネルを利用することができる。マイクロチャネルまたはナノチャネルなどのより小さなチャネルも、それらが方法に適合する限り、使用することができる。

特定の実施形態は、上記で詳細に説明されているが、説明は、単に説明のためのものである。したがって、上記の多くの態様は、明示的に別段の記載がない限り、必要なまたは必須の要素として意図されていないことが理解されるべきである。例示的な実施形態の開示された態様に対応する、および同等の構成要素または作用の改変は、上記のものに加えて、以下の特許請求の範囲に定義される実施形態の精神および範囲から逸脱することなく、本開示の利益を有する当業者によってなされることができ、その範囲は、そのような修正および同等の構造を包含するように、最も広い解釈が与えられる。

以下の実施例は、特定の実施形態の特定の特徴を説明するために提供される。しかしながら、以下に記載される特定の特徴は、本発明の範囲に対する限定と見なされるべきではなく、むしろ、当業者によって均等物が認識される実施例として見なされるべきである。

実施例１
ＣＥ－ウェスタンについてのＨＣＰに対する抗体開発
ヤギおよびマウスを、組換えＰＬＢＤ２またはＨＩＣストリップを用いて免疫し、それぞれ抗ＰＬＢＤ２ ｐＡｂおよびｍＡｂを生成した。ハイブリドーマをウェスタンブロットにより特異性についてスクリーニングし、１０個を精製およびビオチン化のために選択した。成熟ＰＬＢＤ２タンパク質（約４２ｋＤａ）はいずれのハイブリドーマでも検出されなかった。Ｎ末端を標的とする抗体を同定した。図２は、選択された抗ＰＬＢＤ２抗体調製物を用いたウェスタンブロットのデジタル画像のセットである。図３は、抗ＰＬＢＤ２抗体の異なる組合せを有する抗体調製試料中の測定されたＰＬＢＤ２レベルを示す棒グラフである。ＥＬＩＳＡ測定量をＬＣ－ＭＳデータと比較する。これらの研究から、最終サンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットのために、ｍＡｂ０９コーティングおよびビオチン化ヤギｐＡｂ検出を選択した。図４は、選択された抗ＰＬＢＤ２抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡの概略図である。図５は、ＥＬＩＳＡ法を用いて、選択された抗ＰＬＢＤ２抗体について作成された標準曲線である。

実施例２
サイズベースのＣＥ－ウェスタンによる分離と検出
混入物ＰＬＢＤ２を含む抗体調製物を、還元および非還元条件下でサイズにベースＣＥ－ウェスタンにより分析した（図７参照）。グラフはＰＬＢＤ２の濃度依存分析を示しており、サイズに基づくＣＥ－ウェスタンは、ｍＡｂ調製混入物の検出および定量のためのＥＬＩＳＡ測定と同等であることを示している。さらに、ＥＬＩＳＡとは異なり、混入タンパク質は分子量によって分離されるため、全体的な汚染に寄与する個々の種を決定することができる。

実施例３
電荷ベースのＣＥ－ウェスタンによる分離と検出
混入物ＰＬＢＤ２を含む抗体調製物を電荷ベースのＣＥ－ウェスタンにより分析した（図９および図１０参照）。図９は、画像化されたｃＩＥＦ－ウェスタン（ｉｃＩＥＦ）電荷アッセイの結果を示す。ＰＬＢＤ２は、抗ＰＬＢＤ２ ｐＡｂを用いて検出される。ＰＬＢＤ２はＣ２Ｐ２プロセスには存在せず、試料の含有物はＣＥ‐ウェスタンが５～６領域のＰＬＢＤ２ピークを特異的にピックアップしていることを確認した。図１０は、画像化されたｃＩＥＦ－ウェスタン（ｉｃＩＥＦ）電荷アッセイの結果を示す。天然のＰＬＢＤ２は、右の図のｐＨ５～６の範囲で見ることができる。これは、処理試料からＰＬＢＤ２を選択的に検出するこの方法の能力を実証するｍＡｂ処理から検出された。この電荷モードでは、ＰＬＢＤ２に対する特異的モノクローナル抗体を用いて処理試料を検出することができる。

本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態に限定されるものではない。実際、本明細書に記載されるものに加えて、本発明の様々な修正が、前述の説明および添付の図から当業者に明らかになるであろう。このような変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあるものとする。

Claims (32)

1. 抗体調製試料中の目的のタンパク質混入物を検出するための方法であって、
   キャピラリ電気泳動を用いて１以上のキャピラリ中で物理的パラメータにより試料のタンパク質成分を分離することと、
   前記試料の前記タンパク質成分を前記１以上のキャピラリ内に固定化することと、
   目的のタンパク質混入物に特異的に結合する１以上の一次抗体と、前記１以上のキャピラリ内の前記タンパク質成分を接触させることと、
   前記１以上の一次抗体の前記結合を検出し、それによって抗体調製試料中の目的のタンパク質混入物を検出することと
   を含む、方法。
2. 前記物理的パラメータによって、抗体調製試料中の目的のタンパク質混入物の変異体を区別することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記１以上のキャピラリが分離マトリックスを含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記分離マトリックスが担体両性電解質を含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記物理的パラメータが電荷を含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記分離マトリックスが、分子量によってタンパク質を分離するように構成されたふるい分けマトリックスを含む、請求項３に記載の方法。
7. 前記物理的パラメータが分子量を含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記１以上の一次抗体が、検出可能な標識で標識付けされ、前記１以上の一次抗体の前記結合を検出することが、前記検出可能な標識を検出することを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記１以上の一次抗体の前記結合を検出することが、
   前記１以上の一次抗体を、前記１以上の一次抗体のうちの少なくとも１つに特異的に結合する二次抗体と接触させることであって、前記二次抗体は、検出可能な標識を有する、ことと、
   前記検出可能な標識を検出することと
   を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記目的のタンパク質混入物の電荷変異体またはサイズ変異体を検出および／または区別することをさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記目的のタンパク質混入物の相対量または絶対量を決定することをさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記検出可能な標識が、化学発光標識、蛍光標識または生物発光標識を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記試料が内部標準を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記固定化することが、光固定化すること、化学的に固定化すること、または熱固定化することを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記１以上の一次抗体がポリクローナル抗体を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記目的のタンパク質混入物が、ＰＬＢＤ２、ＣＴＳＤ、ＴＩＭＰ１、酸セラミダーゼ（ＡＳＡＨ１）、リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）、アネキシン、カテプシンＢ、抗ロイコプロテイナーゼ（ＡＬＰ）、またはそれらのフラグメントを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 抗体調製試料中の目的のタンパク質混入物を物理的パラメータによって検出および／または区別するための方法であって、
    キャピラリ電気泳動を用いて１以上のキャピラリ中で物理的パラメータにより試料のタンパク質成分を分離することと、
    前記試料のタンパク質成分を前記１以上のキャピラリ内に固定化することと、
    目的の第１のタンパク質混入物に特異的に結合する第１の一次抗体と、前記１以上のキャピラリ内の前記タンパク質成分を接触させることと、
    前記第１の一次抗体の結合を検出し、それによって目的の前記第１の抗体を検出することと、
    目的の第２のタンパク質混入物に特異的に結合する第２の一次抗体と、前記１以上のキャピラリ内の前記タンパク質成分を接触させることと、
    前記第２の一次抗体の結合を検出し、それによって前記目的のタンパク質混入物を検出して、前記試料中の抗体を区別することと
    を含む、方法。
18. 前記１以上のキャピラリ内の前記タンパク質成分を、目的のタンパク質混入物に特異的に結合する第３の一次抗体と接触させることと、
    前記第３の一次抗体の結合を検出し、それによって前記目的の第３のタンパク質混入物を検出することと
    をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記１以上のキャピラリ内の前記タンパク質成分を、目的の１以上の追加のタンパク質混入物に特異的に結合する１以上の追加の一次抗体と接触させることと、
    前記１以上の追加の一次抗体の結合を検出し、それによって、前記目的の追加のタンパク質混入物を検出することと
    をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記物理的パラメータによって、抗体調製試料中の目的のタンパク質混入物の変異体を区別することをさらに含む、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記１以上のキャピラリが分離マトリックスを含む、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記分離マトリックスが、担体両性電解質を含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記物理的パラメータが電荷を含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記分離マトリックスが、分子量によってタンパク質を分離するように構成されたふるい分けマトリックスを含む、請求項２１に記載の方法。
25. 前記物理的パラメータが分子量を含む、請求項２４に記載の方法。
26. 前記一次抗体が、検出可能な標識で標識付けされ、前記一次抗体の結合を検出することが、検出可能な標識を検出することを含む、請求項１７～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記一次抗体の結合を検出することが、
    前記一次抗体を、該一次抗体と特異的に結合する二次抗体と接触させることであって、前記二次抗体は、検出可能な標識を有する、ことと、
    前記検出可能な標識を検出することと
    を含む、請求項１７～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記目的の１以上のタンパク質混入物の相対量または絶対量を決定することをさらに含む、請求項１７～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記検出可能な標識が、化学発光標識、蛍光標識または生物発光標識を含む、請求項１７～２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記試料が内部標準を含む、請求項１７～２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記固定化することが、光固定化すること、化学的に固定化すること、または熱固定化することを含む、請求項１７～３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記目的のタンパク質混入物が、ＰＬＢＤ２、ＣＴＳＤ、ＴＩＭＰ１、酸セラミダーゼ（ＡＳＡＨ１）、リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）、アネキシン、カテプシンＢ、抗ロイコプロテイナーゼ（ＡＬＰ）、またはそれらのフラグメントを含む、請求項１７～３１のいずれか一項に記載の方法。

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