JP5155515B2 - トランスフェラーゼ酵素活性を検出する方法 - Google Patents
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Description
本発明は概して酵素学および分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、トランスフェラーゼ活性の検出および定量化を改善する方法、組成物ならびにキットに関する。
この非仮出願は、「トランスフェラーゼ酵素活性を検出する方法(METHOD FOR DETECTING TRANSFERASE ENZYMATIC ACTIVITY) 」という表題で2002年9月6日に出願された米国特許仮出願第60/408,662号に対する優先権の利益を主張する。
生物学的、生物医学的および薬学的科学の向上は、これまでとは無比の研究および診断学の基盤を促進してきた。全ゲノム配列が迅速かつ相次いで入手可能となりつつあるのに伴って、小分子の巨大ライブラリーの構築、ならびに医薬品開発、臨床診断試験および基礎研究を還元主義から全システム的アプローチまで移行させることができるには、ハイスループット解析を容易とするアッセイが望まれる。分子はもはや、単独のプロセスに対する影響に関して個々に分析する必要はなく、代わりに、幾つかの生物学的システムに対する多くの分子の影響を同時に研究することができ、適切な場合には、迅速で信頼性が高く、かつ正確なアッセイが利用可能である。
少量しか存在しないが、細胞調節において等しく重要な役割を果たす。これらのキナーゼとしては、srcファミリーのプロテインキナーゼのような幾つかの可溶性酵素、および上皮成長因子レセプター、インスリンレセプターおよび血小板由来成長因子レセプターのような成長因子に関するレセプターなどが挙げられる。研究により、多くのチロシンキナーゼが、細胞の外側に位置するレセプタードメインおよび内側に位置するキナーゼドメインを有する膜貫通タンパク質であることが示されている。
フォアを励起する場合、放出光の強度は、偏光平面(励起平面)に平行した平面および偏光平面に垂直な平面の両方でモニタリングすることができる。放出光の強度が平行な平面から垂直な平面まで移動する度合いは、蛍光標識分子の移動性に関連する。蛍光標識分子が大きい場合、例えば蛍光標識分子が結合試薬と結合している場合、蛍光標識分子は励起状態の間にあまり移動せず、放出された光は励起平面に関して高度に偏光されたままである。蛍光標識分子が小さい場合、例えば結合試薬が蛍光標識分子に結合していない場合、蛍光標識分子はより迅速に回転または傾斜し、生じた放出光は励起平面に対して減偏光される。したがって、FPアッセイは、蛍光標識分子に対して高度に特異的に結合することが可能な高親和性結合試薬、例えば抗体を要する。抗体を使用する場合、ペプチドのような特定の蛍光標識分子と結合する抗体についての最適化が必要とされるが、これには時間および費用がかかる。さらに、FPアッセイには、リン酸化タンパク質および他の反応構成成分、例えば脂質および界面活性剤が、偏光を妨害する可能性が存在する。
。
本発明は、試料中のトランスフェラーゼ活性の検出に使用される方法、組成物およびキットに関する。本明細書中に記載する方法は、均質で、迅速で、高感度で、簡素で、かつ非放射性である。上記方法は、利便性が高く、任意の器具基盤とともに使用することができる。必要とされる試薬を、比較的容易に設計することができ、容易に合成可能である。上記方法は、迅速な開発時間および低費用のアッセイを提供する。
化合物による干渉の影響を受けにくい。さらに、試薬組成物は、単一試料における長期間にわたるトランスフェラーゼ活性の測定、ならびにハイスループット方式の多くの試料における長期間にわたるトランスフェラーゼ活性の測定を容易とし、その結果、試薬インジェクターを備えたルミノメータの必要性を排除し、複数の試料のバッチ様式での処理を可能にする。
試料の発光量と、あるいは既知量のATPならびに同じルシフェラーゼ、基質および反応条件(すなわち、温度、pH等)を用いることで決定した標準曲線と比較すれば、ATP定量値が求められる。当然のことであるが、定量化には、バックグラウンド値を差し引くことが含まれる。ある試料の発光を、別の試料の発光と比較すれば、試料中に存在するATPの絶対量を知る必要なくATP定量値が求められる(例えば、試験化合物の存在下または非存在下での試料の比較)。当業者であれば多くのそのような実験を容易に設計することができる。
する化合物の影響を決定するように設計される。キットは、複数の目的が実現され得るように多機能性であり得る。一実施形態では、試料中のトランスフェラーゼ活性を検出するのに使用されるキットは、1つの容器中に凍結ルシフェラーゼを含み、別の容器が1つまたはそれ以上のトランスフェラーゼクエンチング剤を含んだ再構成用緩衝剤を含んでいてもよい。トランスフェラーゼクエンチング剤は、非界面活性剤のトランスフェラーゼ阻害剤または界面活性剤、好ましくは陽イオン性界面活性剤(好ましくは、DTABまたはBDDABr)、陰イオン性界面活性剤(好ましくは、SDSまたはデオキシコール酸)または両性イオン性界面活性剤(好ましくは、スルホベタイン3‐10)を含むイオン性基を有する界面活性剤、あるいはそれらの組合せであり得る。
本発明は、ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼ基質、および1つまたはそれ以上のトランスフェラーゼクエンチング剤を含む、安定性の高い特性を有する組成物を提供する。本発明はさらに、トランスフェラーゼの阻害工程ならびにルシフェラーゼおよび基質の添加工程を単一工程とし、同工程に続いて生じた発光を検出することでATPを検出することにより、上記の新規組成物を使用して試料中のトランスフェラーゼ活性を測定する方法を提供する。好ましくは、本発明の組成物と試料との組合せから生じる発光は、持続期間が長い。すなわち、該発光は組成物を試料と組み合わせた直後の発光に対して、1時間当たり約50%未満しか減少しない。本発明の処理方法は、ルシフェラーゼを添加する前にトランスフェラーゼ活性を別個に阻害する必要性を排除することにより、試料中のトランスフェラーゼ活性のルシフェラーゼによる検出の時間と労力を有意に減少させる。
別記しない限り、技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。引用する特許および刊行物はすべて、別記しない限り、その全体が参照により本明細書に援用される。
本明細書中で使用する場合の「試料」という用語は、その最も広い意味で使用される。試料は、本発明を用いて分析されるトランスフェラーゼ活性を有する可能性がある組成物である。試料は、任意選択で増殖培地または細胞溶解物中にトランスフェラーゼ活性を含有することが既知であるか、またはトランスフェラーゼ活性を含有する可能性があることが多いが、試料はまた、トランスフェラーゼ活性を含有する可能性がある固体表面(例えば、スワブ、膜、フィルター、粒子)であってもよい。かかる固体試料に関しては、該固体を本発明の試薬組成物に、あるいは本発明の試薬組成物が添加される別の水溶液に添加することにより、水性試料が作製される。
「アミノ酸配列同一性の割合(%)」は、2つの配列を最適に整列させたときに、重なり合う領域において一方の配列中のアミノ酸残基が第2の配列中のアミノ酸残基に同一である割合として定義される。アミノ酸配列同一性の割合を決定するために、配列を局所的に整列させて、必要であればギャップを導入して配列同一性の割合を最大にする。保存的置換は、配列同一性を算出する場合には計数されない。同一性の割合を決定するためのアミノ酸配列の整列(アラインメント)の手法は、当業者に既知である。BLASTソフトウェア(NCBI:www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ )のような公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、ペプチド配列を整列させる。当業者であれば、2つのアミノ酸配列を最適に整列させるのに必要とされる任意のアルゴリズムおよびパラメータを含む、アラインメントを測定するための適切なアルゴリズムおよびパラメータを決定することができる。
アミノ酸配列同一性(%)=(X/Y)・100
(ここで、Xは、配列アラインメントプログラムまたはアルゴリズムによるAとBの最適なアラインメントにおいて一致するものとしてスコア付けされたアミノ酸残基数であり、Yは、整列させたアミノ酸位置の総数である)
のように算出することができる。
れる。このエネルギーの少なくとも一部は光の光子として放出されるが、エネルギーは、熱など他の形態でも放出され得る。光を生じない発光原性分子は、多くの場合「ダークパスウェイ(dark pathways )」と称される代替様式によりそれらのエネルギーを分散する。
本発明の試薬組成物は、1つまたはそれ以上のトランスフェラーゼクエンチング剤、好ましくは界面活性剤、および非内在性のATP依存性生物発光酵素を含み、ここで該組成物は、酵素をトランスフェラーゼクエンチング剤と組み合わせた直後(0〜10分)の酵素活性と比較して、少なくとも約1時間、好ましくは少なくとも約2時間、より好ましくは少なくとも約4時間、少なくとも約30%の酵素活性を維持することが可能であり、かつ、1つまたはそれ以上のトランスフェラーゼクエンチング剤は、トランスフェラーゼクエンチング剤の非存在下での試料に内在するトランスフェラーゼ活性に対して、試料に内在するトランスフェラーゼ活性を総計で少なくとも約25%、より好ましくは少なくとも約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または99%、あるいはその中の任意の増分だけ減少させるのに十分な濃度で組成物中に存在する。本発明の好ましい実施形態では、非内在性のATP依存性酵素は、ルシフェラーゼである。
その触媒生成物に光が含まれるルシフェラーゼ酵素は、感度、すなわち検出可能な生成物を提供し、ATPの容易な測定を可能にする。しかしながら、ATP依存性の任意の発光性酵素を本発明の方法および組成物において使用可能である。
としては、D‐ルシフェリンメチルエステル、D‐ルシフェリル‐L‐フェニルアラニン、D‐ルシフェリル‐L‐Nα‐アルギニン、D‐ルシフェリン‐O‐硫酸、およびD‐ルシフェリン‐O‐リン酸( ミスカ(Miska )およびガイガー(Geiger)、1987) 、試料中の構成成分により加水分解またはエステラーゼ作用を受けてルシフェリンになるルシフェラーゼのエステル( クレイグ(Craig )他、1991; ヤング(Yang)およびトマソン(Thomason)、1993) が挙げられる。有用なルシフェリン類縁体の他の例としては、ナフチルルシフェリンおよびキノリルルシフェリンが挙げられるが、これらは、それぞれ緑色および赤色のスペクトルの光を放出する( ブランキーニ(Branchini )、1989) 。ルシフェリンの商業的供給元は複数存在する(例えば、米国ウィスコンシン州マディソン所在のプロメガ株式会社(Promega Corp. );米国オレゴン州ユージーン所在のモレキュラー・プローブス(Molecular Probes))。
、ホタルルシフェリン、アデノシン三リン酸(ATP)、マグネシウムおよび分子状酸素が関与する。初期反応では、ホタルルシフェリンおよびATPが反応して、無機ピロリン酸塩が放出されてルシフェリルアデニル酸を形成する。ルシフェリルアデニル酸は、ルシフェラーゼの触媒部位にしっかりと結合されたままである。この形態の同酵素が分子状酸素に暴露されると、酵素に結合しているルシフェリルアデニル酸が酸化されて、電気的に励起状態のオキシルシフェリンを生じる。励起状態の酸化ルシフェリンは、基底状態に戻る際に光を放出する。
%、98%のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは少なくとも約99%アミノ酸配列同一性を有し、発光を生じる能力を保持するものであろう。通常、変異ルシフェラーゼフラグメントは、長さが少なくとも約50アミノ酸、多くの場合、長さが少なくとも約60アミノ酸、より多くの場合、長さが少なくとも約70、80、90、100、150、200、300、400、500または550アミノ酸またはそれ以上であり、発光を生じる能力を保持している。ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼフラグメント、ルシフェラーゼ変異体または変異ルシフェラーゼフラグメントを、他の非ルシフェラーゼアミノ酸配列と融合させ、かつ本発明における機能を維持した状態にしてもよい。
フェラーゼ変異体のDNAを産生することができる( オーズベル(Ausubel )他、1987; サンブルック(Sambrook)、1989) 。
本発明の好ましいルシフェラーゼは、ATPに依存し、かつ光子を放出する触媒活性を有する。本発明の好ましいルシフェラーゼは、トランスフェラーゼクエンチング剤の存在下で、同じ反応条件におけるP.ピラリスのルシフェラーゼ(LucPpy)の化学的安定性レベルに対して、高い化学的安定性を有する。本発明の組成物および方法で使用する好ましいルシフェラーゼは安定なシグナルを生じる。すなわち該ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼ反応が開始された時点の発光に対して、1時間当たりの発光の損失が50%未満と定義されるように、ルシフェラーゼ反応における発光の持続期間が長い。本発明の好ましいルシフェラーゼは、ルシフェラーゼをトランスフェラーゼクエンチング剤と合わせた1時間後、より好ましくは2時間後、最も好ましくは4時間以上後に、長期間にわたって試料を複数回分析すること、または長期間にわたって多くの試料を分析することを可能にする。任意選択で、本発明の組成物および方法で使用されるルシフェラーゼは、高い熱安定性を有していてもよい。好ましいルシフェラーゼの例は、LucPpe2m146(配列番号4)である。本発明で有用な酵素のさらなる例としては、LucPpe2m78(配列番号1)、LucPpe2m90(配列番号2)およびLucPpe2m133(配列番号3)が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用する場合、「化学的に安定なルシフェラーゼ」とは、一般にトランスフェラーゼを阻害し、かつLucPpyのような化学的に安定ではないルシフェラーゼの機能を妨害する化合物の存在下または条件下で、活性を保持するルシフェラーゼを定義する。上記のように特定されるルシフェラーゼの例[(LucPpe2m78(配列番号1)、LucPpe2m90(配列番号2)、LucPpe2m133(配列番号3)およびLucPpe2m146(配列番号4)]は、トランスフェラーゼクエンチング剤に対して高い化学的安定性を有することが、本明細書に示されている。
幾つかの実施形態では、発光を生じる熱に安定なルシフェラーゼ、または検出可能なシグナルを生じる熱に安定な他のATP依存性酵素は、特にATP検出の直前に熱で処理される試料において望ましい。熱に安定なポリペプチドは、他のタンパク質が不活性化または変性する温度で活性状態のままである。LucPpe2m78、LucPpe2m90、LucPpe2m133およびLucPpem146酵素は、天然に見出されるか、または天然物から単離されるポリヌクレオチドにコードされるルシフェラーゼと比較して、高い熱安定性を示す。
本発明の組成物および方法で使用する好ましいルシフェラーゼは、安定なシグナルを生じる。すなわち、かかるルシフェラーゼは、ルシフェラーゼ反応で使用する場合に、ルシフェラーゼ反応を開始した時点での発光に対して、1時間当たりの発光の損失が50%未満と定義される高い持続期間を有する発光を生じる。この特性をシグナル安定性と称する。本発明の好ましいルシフェラーゼにより、ルシフェラーゼをトランスフェラーゼクエンチング剤と組み合わせた少なくとも1時間後、より好ましくは少なくとも2時間後、最も
好ましくは少なくとも4時間以上後に、長期間にわたり試料を複数回分析することや長期間にわたり多くの試料を分析することが可能になる。試料中に存在するATPの量を安定化するトランスフェラーゼクエンチング剤(および、任意選択でキナーゼ阻害剤)の存在下でルシフェラーゼが持続期間の長い発光を生じることが可能であるような、試薬組成物におけるルシフェラーゼおよびトランスフェラーゼクエンチング剤の組合せは、長期間にわたりATPを検出および定量化する信頼性が高くかつ効率的な方法をもたらす。
ATP依存性の様式で基質の酸化時に光子を放出し、かつ化学的に安定である、すなわち本発明のトランスフェラーゼクエンチング剤の存在下で活性を保持する任意のルシフェラーゼ、ルシフェラーゼフラグメント、またはそれらの変異体が本発明で使用され得る。望ましいが必須ではない他の特性(例えば、熱安定性およびシグナル安定性)も意図される。さらに、ルシフェラーゼを別のアミノ酸配列に融合させて、本発明における機能は維持するようにしてもよい。かかる酵素は、in vitroで合成してもよいし、他の生物から単離してもよい。
本発明がキットとして供給される場合、組成物の種々の構成成分を別個の容器に包装して使用前に混合すればよい。構成成分をこのように個別に包装することにより、ルシフェラーゼ−ルシフェリン活性を損失せずに長期間保管することが可能になる。しかしながら、キットの各種パーツを混合することにより「試薬組成物」を形成する場合、試薬組成物は、ルシフェラーゼ(配列番号1〜4に例示されるが、これらに限定されない)、および1つまたはそれ以上のトランスフェラーゼクエンチング剤を含み、ここで試薬組成物の活性は、安定性が高く[すなわち、試薬組成物が、(試薬組成物を試料と組み合わせる際の発光による測定される場合)、試薬組成物の活性が最初に創出される際、すなわち、ルシフェラーゼ酵素を最初にトランスフェラーゼクエンチング剤と組み合わせた0〜10分後の試薬組成物の活性に対して、少なくとも1時間、少なくとも約30%、より好ましくは少なくとも約60%の活性を維持すること、さらにより好ましくは、少なくとも1時間、さらに好ましくは少なくとも2時間、さらにより好ましくは少なくとも4時間、少なくとも70%、80%、90%、95%、99%またはそれ以上の活性を維持することが可能である]、かつトランスフェラーゼクエンチング剤は、トランスフェラーゼクエンチング剤の非存在下で試料に内在するトランスフェラーゼ活性に対して、少なくとも約25%、より好ましくは少なくとも約30%、さらにより好ましくは少なくとも約40%、50%
、60%、70%、80%、90%、95%または99%、あるいはそれ以上、同トランスフェラーゼ活性を減少させるのに十分な濃度で試薬組成物中に存在する。操作用資料、ならびに標準物質または対照としての役割を果たし得る物質もまた、キットの目的に応じて、キット中に納められてもよい。
好ましい一実施形態では、本発明の試薬組成物の構成成分は、使用直前に混合される2つのパーツ、すなわち(1)ルシフェラーゼを含むパーツ、および(2)1つまたはそれ以上のトランスフェラーゼクエンチング剤を含むパーツとして供給することができる。かかる実施形態の例を表Cに示し、その他は実施例に示している。ルシフェラーゼ構成成分は、ルシフェリンをさらに含んでもよく、好ましくは凍結乾燥物とする。ルシフェラーゼ構成成分は任意選択で、凍結乾燥用の賦形剤、タンパク質(ルシフェラーゼ)安定化剤、マグネシウム(または代替の陽イオン)、およびマグネシウムキレート剤(または代替の陽イオンキレート剤)を含む。トランスフェラーゼクエンチング剤構成成分は、緩衝液、二価陽イオン金属キレート剤、マグネシウム(または代替の陽イオン)、消泡剤、および酵素安定化剤(例えば、THESIT)をさらに含んでもよい。本発明の種々の構成成分は、これらのパーツのサブセットを含んでもよく、本発明の適用を容易にするか、または保管寿命を延長させる任意の様式で組み合わせることができる。
ATP依存性反応を触媒し、かつ発光を発生するルシフェラーゼ、ルシフェラーゼ変異体、ルシフェラーゼフラグメントおよび変異ルシフェラーゼフラグメントはすべて、本発明で使用することが意図される。一部の実施形態には、ルシフェリンを含めず、例えば、使用者が、使用者の選択したルシフェリンを供給できるようにするか、あるいはルシフェリンを別個に提供してもよい。提供されるルシフェリンのタイプは様々であり得るが、提供されるルシフェラーゼのタイプに合った基質でなくてはならない。
例えば血清アルブミンまたはPrionex(登録商標)を含めうる。他の実施形態では、ルシフェラーゼを、グリセロールを含む水性組成物または酵素が安定である他の溶媒中に懸濁させてもよい。当業者であれば、本発明の組成物および方法において作用する各種成分の量を容易に決定することができる。
好ましい一実施形態では、キットは、溶液中に1つまたはそれ以上のトランスフェラーゼクエンチング剤と、任意選択で緩衝液、消泡剤、酵素安定化剤等のような他の機能的構成成分を含有する構成成分を含む。この構成成分は、実操作用の溶液として供給されてもよいし、濃縮物として供給されてもよい。トランスフェラーゼクエンチング剤は、本明細書中で上述した任意のものであってよい。この構成成分は、ルシフェラーゼ‐ルシフェリン反応を妨害する可能性のある金属イオンをキレート化する作用物質(例えば、EDTA、EGTA)、マグネシウム(好ましくは硫酸塩または塩化物のような塩として供給されるもの、あるいは他の機能的に等価な陽イオン)、消泡剤、およびATP生成酵素の阻害剤(例えば、NaF)をさらに含んでもよい。実操作用の溶液のpHを維持する緩衝剤、例えばクエン酸塩またはMES(ナトリウムなどの塩または遊離の酸もしくは塩基として供給すればよい)、あるいは任意の他の適切な緩衝液を使用してもよい。
本発明の一態様は、トランスフェラーゼクエンチング剤、好ましくはトランスフェラーゼを阻害する界面活性剤、より好ましくは荷電基を有する界面活性剤、例えば、陽イオン性界面活性剤(好ましくは、DTABまたはBDDABr)、陰イオン性界面活性剤(好ましくは、デオキシコール酸塩またはSDS)または両性イオン性界面活性剤(好ましくは、スルホベタイン3‐10)である。かかる阻害剤は、ルシフェラーゼがルシフェラーゼ‐ルシフェリン反応のために試料中のATPを利用するのが可能となる前に、試料に内在するトランスフェラーゼによりATPがアデノシン二リン酸(ADP)およびアデノシン一リン酸(AMP)へと処理されるのを防止する。トランスフェラーゼクエンチング剤は、直接的または間接的にトランスフェラーゼを不活性化し得る。トランスフェラーゼクエンチング剤は、トランスフェラーゼの活性部位のいずれかに結合することによって基質の結合を防止してもよいし、例えば変性作用を有する界面活性剤などによりトランスフェラーゼを変性させてもよいし、あるいはトランスフェラーゼクエンチング剤がトランスフェラーゼをその基質から選択的に分離してもよい。
中に含めるのに適したトランスフェラーゼクエンチング剤の濃度を決定する方法に精通しており、例えば、長期間にわたってルシフェリン‐ルシフェラーゼ由来のシグナルを検査して、様々な濃度のトランスフェラーゼクエンチング剤候補を有する試料を、既知のトランスフェラーゼクエンチング剤を含有しない試料と比較してもよい。
適切な非界面活性剤系阻害剤は、トランスフェラーゼクエンチング剤として、および本発明の有用性をなくすような不都合な影響をルシフェラーゼに及ぼさない限りにおいて任意の適切な濃度で使用してもよい。当業者であれば、阻害剤が新規であろうと、既知であろうと、かかる阻害剤の適切な濃度を決定する方法がわかるであろう。
ATP) 」という表題のUS20030104507A1として公開された米国特許出願第09/813,279号(これは、その全体が参照により本明細書に援用される)における実施例および3を参照されたい。本発明で使用する界面活性剤および/または非界面活性剤系阻害剤に関する機能的濃度範囲は、本明細書中に開示する方法を用いて当業者により容易に決定され得る。
実操作用の溶液に適切なpHを維持し、かつルシフェラーゼ‐ルシフェリン反応を妨害しない任意の緩衝液が意図される。好ましいpH範囲は、約pH4.5〜約pH9.0、より好ましくは約pH6.0〜約8.0である。MESおよびクエン酸緩衝物のほかに、他の緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、トリス、N‐(2‐ヒドロキシエチル)ピペラジン‐N’‐(2‐エタンスルホン酸)(HEPES)、ピペラジン‐1,4‐ビス(2‐エタンスルホン酸)(PIPES)、ホウ酸塩、および当業者に既知の他の任意の緩衝液が適切であり得る。適切な緩衝液の選択は、pH緩衝能力およびルシフェラーゼ‐ルシフェリン反応との相互作用に依存する。
消泡剤は、特に発光を定量化する用途において、泡が生物発光の検出を妨害するのを防ぐために望ましい。MAZU(登録商標)のような試薬は、有機性であっても、あるいはシリコーンベースであってもよい。消泡剤の選択は、ルシフェラーゼ‐ルシフェリン反応を妨害せずに泡を排除するそれらの能力に依存する。
甲虫ルシフェラーゼ‐ルシフェリン反応は、ATPだけでなく、マグネシウムイオンにもまた依存性である。ルシフェラーゼ活性を保証するために、マグネシウムを外から供給する。硫酸マグネシウムのほかに、塩化マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、臭化マグネシウム、炭酸マグネシウム等のようなマグネシウムの他の塩が考えられる。いずれの場合にも、マグネシウム錯体は、Mg2+イオンがルシフェラーゼに利用可能となるように解離しなくてはならず、ルシフェラーゼ‐ルシフェリン反応を妨害してはならない。当業者であれば、他の陽イオンがマグネシウムに代わって機能し得ることを認識するであろう。これらの陽イオンとしては、カルシウムおよびマンガンが挙げられる。
非イオン性界面活性剤および低濃度の両性イオン性界面活性剤の作用に対して耐性である( シンプソン(Simpson )およびハモンド(Hammond )、1991) のに対して、天然のホタルルシフェラーゼは、陽イオン性界面活性剤、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、CTAB(セチルトリメチルアンモニウム)、DTAB(臭化ドデシルトリメチルアンモニウム)、および塩化メチルベンゼトニウムにより不活性化される( シンプソン(Simpson )およびハモンド(Hammond )、1991) 。
キット中に包含され得る他の試薬としては、ルシフェラーゼ反応に起因する発光の持続期間を高めることが知られている物質、例えば、補酵素A(CoA)、チオール試薬(例えば、ジチオスレイトールおよびβメルカプトエタノール)(ウッド(Wood)、米国特許第5,283,179号、1994年;ウッド(Wood)、米国特許第5,650,289号、1997年)、シグナルを延長させるための金属イオンキレート剤(例えば、EDTA)およびプロテアーゼ阻害剤(シェイラー(Scheirer)、米国特許第5,618,682号、1997年;シェイラー(Scheirer)、米国特許第5,866,348号、199
9年)、あるいは高濃度の塩(バン・ルーン(Van Lune)およびトレル・ウィール(Trer
Wiel )、国際公開第00/18953号パンフレット、2000年)が挙げられる。
キットはまた、特定の試験(例えば、細胞生存率、細胞毒性、細胞増殖、またはATP濃度の決定)の実行を容易とする別個の容器に入った試薬を含んでもよい。例えば、標準曲線を決定するため、または内部対照として使用できるようにATPを供給してもよい。トランスフェラーゼ阻害剤または活性化剤であることが既知である物質を、トランスフェラーゼ活性の検出において陽性対照として使用するために、あるいはトランスフェラーゼ活性に対する化合物の影響を測定するために含めることもできる。キットが、マルチウェルプレートおよび/または1つ以上のトランスフェラーゼ酵素を供給してもよい。キットは、任意選択でトランスフェラーゼの基質、緩衝剤およびトランスフェラーゼの活性化補助因子を含んでもよい。
キットに含まれる試薬は、種々の構成成分の寿命が維持され、かつ容器の材料により吸着または変更されないような任意の種類の容器に入れて供給することができる。例えば、密封ガラスアンプルに、中性の非反応性ガス(例えば、窒素)下で包装された凍結乾燥ルシフェラーゼまたは緩衝液を含めてもよい。アンプルは、ガラス、有機ポリマー(例えば、ポリカーボネート、ポリスチレン等)、セラミック、金属または試薬を保持するのに通常使用される任意の他の材料のような任意の適切な材料から構成され得る。適切な容器の他の例としては、アンプルと同様の物質から製造され得る簡単な瓶、ならびにアルミニウムまたは合金などの箔で内部が裏打ちされていてもよい包装材料が挙げられる。他の容器としては、試験管、バイアル、フラスコ、瓶、シリンジ等が挙げられる。容器は、皮下注射針で突き刺すことができるストッパーを有する瓶のような滅菌アクセス口を有していてもよい。他の容器は、除去して構成成分を混合させることができる、容易に除去可能な膜により隔てられた2つの区画を有してもよい。除去可能な膜は、ガラス、プラスチック、ゴム等であり得る。
キットを、操作用資料とともに供給することもできる。指示書を、紙または他の物質上に印刷してもよいし、かつ/または電子的に読取り可能な媒体(例えば、フロッピーディスク、CD‐ROM、DVD‐ROM、Zipディスク、ビデオテープ、オーディオテープ等)として供給してもよい。詳細な指示書を物理的にキットに付随させなくてもよく、代わって、使用者が、キットの製造業者または販売業者により指定されるインターネットウェブサイトへと案内されてもよいし、あるいは電子メールとして供給されてもよい。好ましい実施形態では、指示書により、使用者は、ルシフェラーゼをトランスフェラーゼクエンチング剤と合わせてから試薬組成物を試料に添加するように指示される。
発光を測定し、それにより試薬組成物の活性を決定するためには、試薬組成物を試料と合わせた後の所定の時点でのルシフェラーゼ反応により生成される相対発光量(rlu)値を測定すればよい。例えば、トランスフェラーゼクエンチング剤を含む構成成分を、ルシフェラーゼを含む構成成分に添加することにより、試薬組成物を創出した直後に(0〜10分)、試薬組成物と組み合わせた既知濃度のATPを有する試料から生じた発光を測定することにより、rlu値を得ることができる。このrlu値を、その条件下での100%の活性(時間0)とみなす。トランスフェラーゼクエンチング剤を含む構成成分を、ルシフェラーゼを含む構成成分と合わせることにより試薬組成物を生成した後、試薬組成物が、好ましくは室温(約20℃〜約25℃)〜約37℃の温度範囲で2時間放置されてから時間0のときのアッセイと同一の条件下で発光が測定され、かつ得られたrlu値が
時間0で得られるrlu値の60%を上回る場合、該試薬組成物は、その活性の少なくとも60%を2時間保持したことになる。
甲虫ルシフェラーゼ‐ルシフェリン反応は、光の発生(「発光」)をもたらす。本発明は、発光を測定することによるATP測定のためのアッセイを提供する。使用者は、単に試料の反応を目で検査して、光の産生を確認してもよい。しかしながら、より高感度の計測により、微光シグナルの検出だけでなく、光シグナルの定量化も可能となる。産物の性質に応じて、光ではない産物が測定される反応も考えられる。ATP測定のためのシグナルを生じるあらゆるアッセイが、本発明の利益を享受し得る。かかる産物に適切な機器および方法は当業者には明らかであろう。
もよい。
甲虫ルシフェラーゼ‐ルシフェリン反応はATP依存性であるため、ルシフェラーゼを使用して、ATPに関してアッセイすることができる。反応は非常に高感度であり、10−16モルまたはそれ未満という少量のATPを含有する試料中でATPを検出することが可能である。この感度を利用して、細胞生存率、ならびに外来物質が細胞の代謝および生存率に対して与える影響を理解することができる。細胞に関して述べれば、ATPは、細胞代謝にエネルギーを供給し、ATPの存在は活発に代謝している細胞に関連し、そのような細胞は「生存」している。
本発明の方法、組成物およびキットは、試料中のATP(またはルシフェラーゼ基質として機能しうるATP類縁体)の簡単な定性的または定量的検出を提供する。好ましい実施形態では、本発明を用いて試料中で発光を生じさせる簡単な定性的実験により、ATPの存在が示される。発光は、LucPpe2m78、LucPpe2m90、LucPpe2m133またはLucPpe2m146のようなルシフェラーゼ、および1つまたはそれ以上のトランスフェラーゼクエンチング剤を含む試薬組成物を用いて発生させる。さらに、試薬組成物は、1つまたはそれ以上の以下の構成成分、すなわち、ルシフェリン(凍結乾燥させた調製物から再構成させてもよい)(あるいは、適切なルシフェリン類縁体基質)、トランスフェラーゼクエンチング剤(複数可)、キナーゼのようなATP消費酵素の阻害剤(複数可)、二価陽イオン(例えば、マグネシウム)、酵素安定化剤、緩衝剤、細胞溶解剤、細胞ATP抽出剤、または外部から添加されたATPをさらに含んでもよい。
の臓器外植片など)、哺乳類の細胞株(例えば、マディン・ダービィ(Madin-Darby) イヌ腎臓(MDCK)およびチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞)、ならびに昆虫の細胞株(例えば、Z細胞)が挙げられる。これらの例は、単なる例として与えられるものであり、限定することを意味しない。
本発明の組成物、方法およびキットは、使用者が発光量を定量化することにより試料中のATP量を定量化するのを可能にする。本発明を、目的の試料と、また既知量のATPを含有する試料(対照)とに適用する。本発明をATP濃度未知の試料に適用することから発生するシグナルを、内部対照(既知量のATPを試料に添加して、その結果生じる発光を測定すること)、またはATP濃度既知の幾つかの試料の発光を測定して、当該発光を図にプロットすることにより作成される外部標準曲線により得られるシグナルに相関させる。かかる方法は、当業者に既知である( モイヤー(Moyer )およびヘンダーソン(Henderson )、1983; ロナー(Ronner)他、1999; スタンリー(Stanley )、1989; ウッド(Wood)他、1989) 。
本発明の組成物、方法およびキットは、試料と接触させたときのトランスフェラーゼ活性に対する、無機物質、小有機物質、ペプチド、タンパク質およびポリペプチドのような化合物の影響を測定するために適用することができる( アイギンガー(Aiginger)他、1980; アンドレオッチ(Andreotti )他、1995; ブラッドベリー(Bradbury )他、2000; クリー(Cree)およびアンドレオッチ(Andreotti )、1997; クラウチ(Crouch)他、1993; カンガス(Kangas)他、1984) 。トランスフェラーゼ活性に対する化合物の影響を決定することにより、潜在的な薬学組成物の有効性の指標を評価することができる。トランスフェラーゼ活性の阻害剤は、特に当該阻害剤が、迅速に分裂する細胞を選択的に死滅させる場合、癌細胞の治療に有用であり得る。別の場合には、トランスフェラーゼ阻害剤の影響が望ましくなければ他の何らかの有用性を備えた化合物でも否定されることもありうる。これらの化合物は、化合物ライブラリーに列挙されてもよいし、あるいは単独で試験されてもよい。本発明をこのように適用する場合には対照試料を用意し、対照においては試料をトランスフェラーゼ活性に対するその影響が既知である対照物質と接触させる。また好ましくは、対照試料としては、化合物自体がルシフェラーゼ活性に直接影響を及ぼしていないことを保証するために、ルシフェラーゼおよび化合物が一緒に存在する試料も含める。
[実施例]
市販のプロテインキナーゼC(「PKC」)を、96ウェルプレート中で滴定した(n=2)。キナーゼ反応は、図に示した量のPKC(プロメガ(Promega )、カタログ番号V5621)を用いて、20mM トリス‐HCl(pH 7.5)、10mM MgCl2、0.1mg/mlウシ血清アルブミン(「BSA」)、250μM EGTA、400μM CaCl2、0.32mg/mlのホスファチジルセリン、0.032mg/mlのジアセチルグリセロール、10μM ビオチン化ペプチド(AAKIQASFRGHMARKK)および1μM ATP中で実施した。最終的なキナーゼ反応容量は、50μlであった。90分のキナーゼ反応後に、20mM クエン酸、55mM MES、10.5mM 硫酸マグネシウム、0.6mM CDTA、225mM カリウム緩衝液(pH6.0)、1mM NaF、0.0125μM ピロリン酸ナトリウム、0.5% DTAB、1.0% Thesit、0.1% Mazu DF 204、2.5mM ルシフェリンおよび0.2%の2‐(N‐モルホリノ)エタンスルホン酸を含有する発光緩衝液試薬(pH6.0+0.15)に10μg/ml[正確でない可能性あり]の熱安定性ホタルルシフェラーゼレポーター146−1H2(配列番号4および配列番号8を参照)を含めたもの50μlを各ウェルに添加して、10分間インキュベートしてから発光を読取った。図1は、本発明の方法を用いて、セリン/スレオニンキナーゼのキナーゼ活性を測定して、信頼性の高い滴定曲線が得られることを明らかに示している。
市販のLckを96ウェルプレート中で滴定した(n=2)。Lckは、Srcファミリーの非レセプター型チロシンキナーゼをコードする遺伝子ファミリーである。キナーゼ反応は、図に示した量のLck(アップステート(Upstate )、カタログ番号14−442)を用いて、8mM イミダゾール塩酸塩(pH 7.3)、8mM β‐グリセロリン酸塩、200μM EGTA、20mM MgCl2、1mM MnCl2、0.1mg/mlのBSA、250μM ビオチン化ペプチド基質(AEEEIYGELEA)および3μM ATP中で実施した。最終的なキナーゼ反応容量は、50μlであった。60分のキナーゼ反応後に、実施例1に記載した発光緩衝液試薬50μlを各ウェルに添加して、10分間インキュベートさせた後に、発光を読取った。図2は、本発明の方法を用いて、安定した滴定曲線が得られることを明らかに示している。
市販のプロテインキナーゼA(「PKA」)を、96ウェルプレート中で滴定した(n=8)。キナーゼ反応は、図に示した量のPKA(プロメガ(Promega )、カタログ番号V5161)を用いて、40mM トリス‐HCl(pH 7.5)、20mM MgCl2、0.1mg/mlのBSA、5μM ケムプチド(LRRASLG)および1μM
ATP中で実施した。最終的なキナーゼ反応容量は、50μlであった。20分のキナーゼ反応後に、実施例1に記載した発光緩衝液試薬50μlを各ウェルに添加して、10分間インキュベートさせた後に、発光を読取った。図3は、本発明の方法を用いて、信頼性の高い滴定曲線が得られることを明らかに示している。
96ウェルプレートに入れた市販のPKAの阻害を、スタウロスポリンにより誘導した(n=4)。キナーゼ反応は、図4に示した量のスタウロスポリン(カルビオケム(Calbiochem)、カタログ番号569397)を用いて、40mM トリス‐HCl(pH 7.5)、20mM MgCl2、0.1mg/mlのBSA、5μM ケムプチド(LRRASLG)および1μM ATP中で実施した。最終的なキナーゼ反応容量は、50μlであった。20分のキナーゼ反応後に、実施例1に記載した発光緩衝液試薬50μlを各ウェルに添加して、10分間インキュベートさせた後に、発光を読取った。図4は、本発明の方法を用いて、IC50を容易かつ確実に得ることができることを明らかに示している。さらに、本発明により確定したIC50値は、プロテインキナーゼ阻害に関する十分確立されたアッセイを用いて得られる値と一致する。
cAMP依存性プロテインキナーゼペプチド阻害剤(PKI)は、96ウェルプレート中でPKAの阻害を誘導した(n=4)。キナーゼ反応は、図に示した量のPKI(プロメガ(Promega )、カタログ番号V5681)を用いて、40mM トリス‐HCl(pH 7.5)、20mM MgCl2、0.1mg/mlのBSA、5μM ケムプチド(LRRASLG)および1μM ATP中で実施した。最終的なキナーゼ反応容量は、50μlであった。0.5U/ウェルのPKAを反応に利用した。20分のキナーゼ反応後に、実施例1の発光緩衝液試薬50μlを各ウェルに添加して、10分間インキュベートさせた後に、発光を読取った。図5は、本発明の方法を用いて、IC50を容易かつ確実に得ることができることを明らかに示している。さらに、本発明を用いて測定したIC50は、プロテインキナーゼ阻害に関する十分確立されたアッセイを用いて得られる値と一致する。
本発明のアッセイは、マルチウェルプレートを用いるハイスループットスクリーニングで容易に使用することができる。アッセイの再現性および有効性の一般的な指標は、Z’因子またはZ’解析である。容認されるZ’値は、通常0.5以上である。本実施例においては、96ウェルプレート中でのPKAアッセイ(n=32)のZ’解析を行った。キナーゼ反応は、PKAなし(白抜き丸)、0.25U/ウェルのPKA(黒塗り丸)、あるいは0.5U/ウェルのPKA(白抜き四角)のいずれかの条件で、40mM トリス‐HCl(pH 7.5)、20mM MgCl2、0.1mg/mlのBSA、5μM
ケムプチド(LRRASLG)および1μM ATP中で実施した。「U/ウェル」は、1ウェル当たりのキナーゼのユニット数である。最終的なキナーゼ反応容量は、50μlであった。20分のキナーゼ反応後に、実施例1の発光緩衝液試薬50μlを各ウェルに添加して、10分間インキュベートさせた後に、発光を読取った。実線は、各々のデータ組の平均値であり、破線は、各々のデータ組の平均値±3SDである。Z’値は、0.5U/ウェルのPKAに関しては0.93であり、0.25U/ウェルのPKAに関しては0.92であった。図6は、本発明の方法のアッセイの再現性を明らかに示している。
ハイスループットスクリーニングとしての本発明の有用性をさらに実証するために、アッセイバリデーションならびにハイスループットスクリーニング用の薬理学的に活性な化合物のLOPACライブラリー(LOPAC Libray of Pharmacologically Active Compounds for Assay Validation and High Throughput Screening) (シグマ(Sigma )、カタログ番号SC001)由来の8個(80)の化合物を96ウェルプレートに包含させた。キナ
ーゼ反応は、10μMの各ライブラリー化合物の存在下で、40mM トリス‐HCl(pH 7.5)、20mM MgCl2、0.1mg/mlのBSA、5μM ケムプチド(LRRASLG)、1μM ATPおよび0.5U/ウェルのPKA中で実施した。最終的なキナーゼ反応容量は、50μlであった。20分のキナーゼ反応後に、発光緩衝液試薬50μlを各ウェルに添加して、10分間インキュベートさせた後に、発光を読取った。
上述のように、本発明は、使用者に、長期間にわたる安定な発光読み出しを提供して、ウェル‐プレートを大量に用いることを可能にする。この実施例では、市販のPKAを96ウェルプレートで評価した(n=32)。キナーゼ反応は、PKAなし、0.25U/ウェルのPKA、あるいは0.5U/ウェルのPKAのいずれかの条件で、40mM トリス‐HCl(pH 7.5)、20mM MgCl2、0.1mg/mlのBSA、5μM ケムプチド(LRRASLG)および1μM ATP中で実施した。最終的なキナーゼ反応容量は、50μlであった。20分のキナーゼ反応後に、実施例1の発光緩衝液試薬50μlを各ウェルに添加して、10分間インキュベートさせた後に、図に示した時間において発光を読取った。4時間でのシグナルの損失は、25%未満であった。図8は、発光シグナルが長期間にわたって非常に安定であるため、本発明の方法が自動化した手法において非常に有用なものとなることを示している。
Claims (33)
- 無細胞試料においてキナーゼの酵素活性を測定する方法であって、
(a)界面活性剤、D‐ルシフェリンまたはD−ルシフェリン誘導体、および化学的に安定なルシフェラーゼを含む一つの混合試薬であって、前記界面活性剤が前記化学的に安定なルシフェラーゼの活性に影響を及ぼすことなくキナーゼ活性を選択的に停止させることを特徴とする一つの混合試薬を供給すること、
(b)キナーゼ、ATP、およびキナーゼの基質を含む第1の反応混合物を、第1の既定期間の間、トランスフェラーゼ反応を起こさせるのに有効な条件下でインキュベートすること、
(c)該第1の反応混合物を該一つの混合試薬と接触させて第2の反応混合物を形成し、該第2の反応混合物を、第2の既定期間の間、キナーゼの酵素活性を停止すると同時に生物発光反応を起こさせるのに有効な条件下でインキュベートすること、および
(d)該第2の反応混合物の発光を測定することによりキナーゼ活性を決定すること
を含む方法。 - 無細胞試料において、化合物を、キナーゼの酵素活性に対する該化合物の影響に関してスクリーニングする方法であって、
(a)スクリーニングするための化合物を供給すること、
(b)界面活性剤、D‐ルシフェリンまたはD−ルシフェリン誘導体、および化学的に安定なルシフェラーゼを含む一つの混合試薬であって、前記界面活性剤が前記化学的に安定なルシフェラーゼの活性に影響を及ぼすことなくキナーゼ活性を選択的に停止させることを特徴とする一つの混合試薬を供給すること、
(c)キナーゼ、ATP、キナーゼの基質および該化合物を含む第1の反応混合物を、第1の既定期間の間、トランスフェラーゼ反応を起こさせるのに有効な条件下でインキュベートすること、
(d)該第1の反応混合物を該一つの混合試薬と接触させて第2の反応混合物を形成し、該第2の反応混合物を、第2の既定期間の間、キナーゼの酵素活性を停止すると同時にATP依存性生物発光反応を起こさせるのに有効な条件下でインキュベートすること、および
(e)化合物を含まない対照混合物に対して、該第2の反応混合物の発光を測定および比較することにより、キナーゼ活性に対する該化合物の影響を決定すること
を含む方法。 - 無細胞試料において、複数の化合物を、キナーゼの酵素活性に対する該化合物の影響を決定するために迅速にスクリーニングするハイスループットスクリーニング方法であって、
(a)スクリーニングするための複数の化合物を供給すること、
(b)界面活性剤、D‐ルシフェリンまたはD−ルシフェリン誘導体、および化学的に安定なルシフェラーゼを含む一つの混合試薬であって、前記界面活性剤が前記化学的に安定なルシフェラーゼに影響を及ぼすことなくキナーゼ活性を選択的に停止させることを特徴とする一つの混合試薬を供給すること、
(c)キナーゼ、ATP、キナーゼ基質および少なくとも1つの化合物を含む複数の第1の反応混合物を、第1の既定期間の間、トランスフェラーゼ反応を起こさせるのに有効な条件下でインキュベートすること、
(d)該第1の反応混合物を、第2の既定期間の間、キナーゼの酵素活性を停止すると同時にATP依存性生物発光反応を起こさせるのに有効な条件下で該一つの混合試薬と接触させて複数の第2の反応混合物を形成すること、および
(e)化合物を含まない少なくとも1つの対照混合物に対して、該第2の反応混合物の発光を測定および比較することにより、キナーゼ活性に対する該化合物の影響を決定すること
を含む方法。 - キナーゼの酵素活性は、プロテインキナーゼ活性、脂質キナーゼ活性、ポリヌクレオチドキナーゼ活性、または糖キナーゼ活性を含む、請求項3に記載の方法。
- キナーゼは、Ser/Thrプロテインキナーゼ、プロテインチロシンキナーゼ、または脂質依存性プロテインキナーゼを含む、請求項3に記載の方法。
- Ser/Thrプロテインキナーゼは、cAMP依存性プロテインキナーゼ(PKA)、カルシウムおよびリン脂質依存性プロテインキナーゼ(PKC)、cGMP依存性プロテインキナーゼ(PKG)、カルシウムおよびカルモジュリン依存性プロテインキナーゼ(CaM KII)または二重特異性プロテインキナーゼを含む、請求項5に記載の方法。
- 二重特異性プロテインキナーゼは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)またはマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ(MEK)を含む、請求項6に記載の方法。
- プロテインチロシンキナーゼは、ラウス肉腫関連プロテインキナーゼ(Src)、成長因子レセプター、またはSrcファミリープロテインチロシンキナーゼを含む、請求項5に記載の方法。
- Srcファミリープロテインチロシンキナーゼは、Src、Lck、Fyn、またはLynを含む、請求項8に記載の方法。
- 成長因子レセプターは、上皮成長因子レセプター(EGFR)、血小板由来成長因子レセプター(PDGFR)またはSteel成長因子レセプター(c‐KIT)を含む、請求項8に記載の方法。
- 脂質依存性プロテインキナーゼは、I型ホスホイノシチド3‐OHホスファチジルイノシトールキナーゼ(PI3K)を含む、請求項5に記載の方法。
- 界面活性剤は、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、または両性イオン性界面活性剤を含む、請求項1、2または3のいずれかに記載の方法。
- 陽イオン性界面活性剤は、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、または臭化ベンジルジメチルドデシルアンモニウムを含む、請求項12に記載の方法。
- 陽イオン性界面活性剤は、臭化ドデシルトリメチルアンモニウムである、請求項12に記載の方法。
- 陰イオン性界面活性剤は、SDSまたはデオキシコール酸塩を含む、請求項12に記載の方法。
- 両性イオン性界面活性剤は、スルホベタイン3‐10を含む、請求項12に記載の方法。
- キナーゼ自体がリン酸化されるか、またはキナーゼ基質がリン酸化される、請求項1、2または3のいずれか1項に記載の方法。
- 化合物がキナーゼの酵素活性を高める、請求項2または3のいずれか1項に記載の方法。
- 化合物がキナーゼの酵素活性を阻害する、請求項2または3のいずれか1項に記載の方法。
- 無細胞試料においてキナーゼの酵素活性を測定するためのキットであって、
(a)化学的に安定なルシフェラーゼの活性に影響を及ぼすことなくキナーゼ活性を選択的に停止させる1つまたはそれ以上の界面活性剤を含む再構成緩衝液、
(b)D‐ルシフェリンまたはD−ルシフェリン誘導体と化学的に安定なルシフェラーゼとを含む組成物、および
(c)該キットを使用するための指示書
を含むキット。 - 前記キナーゼ活性は、プロテインキナーゼ活性、脂質キナーゼ活性、ポリヌクレオチドキナーゼ活性、または糖キナーゼ活性を含む、請求項20に記載のキット。
- キナーゼは、Ser/Thrプロテインキナーゼ、プロテインチロシンキナーゼ、または脂質依存性プロテインキナーゼを含む、請求項20に記載のキット。
- Ser/Thrプロテインキナーゼは、cAMP依存性プロテインキナーゼ(PKA)、カルシウムおよびリン脂質依存性プロテインキナーゼ(PKC)、cGMP依存性プロテインキナーゼ(PKG)、カルシウムおよびカルモジュリン依存性プロテインキナーゼ(CaM KII)または二重特異性プロテインキナーゼを含む、請求項22に記載のキット。
- 二重特異性プロテインキナーゼは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)またはマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ(MEK)を含む、請求項23に記載のキット。
- プロテインチロシンキナーゼは、ラウス肉腫関連プロテインキナーゼ(Src)、成長因子レセプター、またはSrcファミリープロテインチロシンキナーゼを含む、請求項22に記載のキット。
- Srcファミリープロテインチロシンキナーゼは、Src、Lck、Fyn、またはLynを含む、請求項25に記載のキット。
- 成長因子レセプターは、上皮成長因子レセプター(EGFR)、血小板由来成長因子レセプター(PDGFR)またはSteel成長因子レセプター(c‐KIT)を含む、請求項25に記載のキット。
- 脂質依存性プロテインキナーゼは、I型ホスホイノシチド3‐OHホスファチジルイノシトールキナーゼ(PI3K)を含む、請求項22に記載のキット。
- 界面活性剤は、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、または両性イオン性界面活性剤を含む、請求項20に記載のキット。
- 陽イオン性界面活性剤は、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、または臭化ベンジルジメチルドデシルアンモニウムを含む、請求項29に記載のキット。
- 陽イオン性界面活性剤は、臭化ドデシルトリメチルアンモニウムである、請求項30に記載のキット。
- 陰イオン性界面活性剤は、SDSまたはデオキシコール酸塩を含む、請求項29に記載のキット。
- 両性イオン性界面活性剤は、スルホベタイン3‐10を含む、請求項29に記載のキット。
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