ITTO940176A1 - Substrati per la determinazione per via amperometrica dell'attivita' di un enzima avente attivta' idrolitica sugli esteri fosforici e loro impiego per tale determinazione. - Google Patents

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "Substrati per la determinazione per via amperometrica dell'attività di un enzima avente attività idrolitica sugli esteri fosforici e loro impiego per tale determinazione"

La presente invenzione si riferisce ad un procedimento per la determinazione dell'attività e/o concentrazione di enzimi aventi attività idrolitica di fosfatasi alcalina ed in particolare ad esteri fosforici utili come substrati degli enzimi suddetti in tale procedimento.

Con il termine di "enzima avente attività idrolitica di fosfatasi" si intendono comprendere tutti gli enzimi, quali in particolare la fosfatasi alcalina stessa, che sono in grado di operare la sostituzione del gruppo fosfato di un estere fosforico con un gruppo ossidrilico.

Per la determinazione dell’attività della fosfatasi alcalina sono stati riportati diversi tipi di substrati, quali p-nitrofenilfosfato e p-amminofenilfosfato.

La sostituzione del gruppo fosfato con un gruppo -OH, a carattere fenolico nel caso degli arilfosfati, operata dalla fosfatasi alcalina varia le caratteristiche del composto utilizzato come substrato e permette la rivelazione per via amperometrica del prodotto di reazione. In questo modo, mediante la misura del fenolo formato nella reazione, si può determinare la concentrazione o attività della fosfatasi alcalina.

Per aumentare la sensibilità del metodo, è stata sintetizzata e testata una grande varietà di substrati, come i1lustrato dai seguenti riferimenti bibliografici :

a) H.T.Tang, C.E. Lunte, H.B.Halsall, W.R.Heineman , Anal.Chim.Acta 214 (1988), 187-195;

b) J.Kulys, V.Razumas e Malinauskas J., Electroanal.Chem., 116 (1989) 11;

c) J.Kulys, V.Razumas e Malinauskas,Anal.Chim.Acta 117 (1980) 387;

d) R.Q.Thompson , Anal.Chim.Acta 271 (1993) 223-339.

Lo scopo primario della presente invenzione è quello di fornire substrati per gli enzimi suddetti che permettano la determinazione dell’enzima a concentrazioni particolarmente basse in confronto a quel le misurabili con i substrati attualmente disponibili, oppure che permettano di abbassare i tempi di analisi necessari grazie all'amplificazione del segnale generata dall’azione dell’enzima sui substrati stessi, in quanto l’abbassamento dei limiti di rivelazione permette di ridurre i tempi necessari per l’amplificazione.

In vista di tali scopi, costituisce oggetto dell’invenzione l’impiego di composti di formula generale :

(I)

in cui Ar è fenile o naftile, non sostituito o monodi- o tri-sostituito con radicali scelti indipendentemente uno dall'altro dal gruppo che consiste di C1-C4 alchile, C1-C4 alcossi, alogeno, nitro (N02), solfonico (-SO3H).

Un ulteriore oggetto dell’invenzione è un procedimento per la determinazione per via amperometrica dell'attività e/o concentrazione di un enzima avente attività idrolitica di fosfatasi alcalina, in cui una sostanza comprendente detto enzima è posta a contatto con un substrato costituito da un estere fosforico aromatico idrolizzabile da detto enzima ed il prodotto di reazione è ossidato per via elettrochimica con misurazione della corrente di ossidazione, caratterizzato dal fatto che come substrato per detto enzima si utilizza un mezzo comprendente un composto di formula generale (I) sopra citata.

Composti preferiti nell’ambito dell'invenzione sono quelli in cui quando Ar è fenile, il gruppo ossidrile è in posizione orto o para rispetto al gruppo di estere fosforico e quando Ar è naftile, il gruppo ossidrile è in posizione 2 o 4 rispetto al gruppo fosforico.

Quando il sostituente o i sostituenti sul gruppo Ar sono alchile, alcossi o alogeno, essi sono preferibilmente scelti tra metile., etile, metossi, etossi e cloro. Particolarmente preferiti sono parafi orto-idrossi-fenilfosfati non sostituti o mono-sostituiti con metile, etile, metossi, etossi, cloro, N02, S03H.

Gli esteri mono-fosforici di difenoli o dinaftoli di formula (I), sono preparati a partire dai corrispondenti difenoli o dinaftoli, previa protezione di uno dei gruppi ossidrile con un gruppo protettore, ad esempio con l'impiego di un composto come il benzoilcloruro in grado di reagire con il gruppo OH stesso. L'estere così prodotto viene posto a contatto con un prodotto fosforilante, ad esempio ossitr icloruro di fosforo e quindi il derivato fosforilato viene trattato con una base, ad esempio ammoniaca, atta a rigenerare il gruppo fenolico inizialmente protetto.

In presenza di un enzima con attività idrolitica di fosfatasi, i composti di formula (I) sono soggetti a idrolisi con formazione dei corrispondenti difenoli o dinaftoli che hanno proprietà chimico-fisiche differenti da quelle del substrato enzimatico e che possono essere determinati per via elettrochimica su un elettrodo polarizzato ad un potenziale idoneo, essendo i difenoli o dinaftoli - formati nell’interazione con l’enzima - elettroattivi in un intervallo di potenziali (da -0,1050V a 1V, usando come riferimento l’elettrodo argento-argento cloruro) nettamente inferiori a quello di ossido-riduzione dei composti fosforilati di partenza, dando quindi luogo, a differenza del substrato di origine, ad una.corrente elettrica misurabile.

Grazie all’impiego dei suddetti composti come substrato, è possibile determinare concentrazioni dell’enzima notevolmente inferiori a 10<-12>M, utilizzando tempi di incubazione dell'ordine di alcuni minuti .

Altri vantaggi offerti dall’impiego dei substrati proposti dalla presente invenzione sono dovuti alla maggior stabilità dei prodotti di reazione {difenoli) ed alla possibilità di utilizzare un secondo ciclo di amplificazione che permette di abbassare ulteriormente i limiti di rivelazione.

A questo scopo, secondo un aspetto preferenziale dell'invenzione, il procedimento per la determinazione dell’attività o concentrazione dell'enzima comprende l’introduzione nella cella elettrochimica di misurazione di un secondo sistema enzimatico di ampiificazione del tipo difenolo sostituito o non sostituito (odinaftolo)-elettrodo-glucosio-glucosio ossidasi che utilizzando il chinone, formatosi all’elettrodo nell’ossidazione del difenolo stesso, come ossidante del sistema enzimatico glucosio ossidasi-glucosio ,permette un ulteriore aumento della corrente stessa e quindi un abbassamento del limite di rivelazione dell’enzima.

Nella determinazione dell’attività e/o concentrazione dell'enzima con attività idrolitica sugli esteri fosforici, l’enzima può essere libero o legato ad una seconda molecola, ad esempio a molecole aventi attività biologica quali DNA, anticorpi, antigeni, ai quali l'enzima è coniugato come marcante. Per l’attuazione del procedimento, ad una soluzione acquosa del composto di formula (I), tamponata con un pH idoneo a consentire la successiva idrolisi, viene aggiunto l’enzima idrolitico libero o legato ad una seconda molecola. Dopo un tempo noto, in cui si accumula nella soluzione il difenolo (o dinaftolo) ottenuto per azione idrolitica dell’enzima, si procede alla determinazione del difenolo stesso per via elettrochimica. In particolare, si polarizza l'elettrodo di lavoro costituito in genere da una superficie metallica (platino, oro), o da un materiale carbonaceo (quale grafite, pasta di carbone) ad un potenziale di lavoro compreso da -0,15V e 1 ,0V rispetto ad un elettrodo di calomelano saturo (elettrodo di riferimento) e si misura la corrente di ossidazione.

Come si è detto precedentemente, l'aggiunta di un secondo sistema enzimatico di amplificazione quale glucosio ossidasi-glucosio è vantaggiosa al fine di conseguire un ulteriore aumento della corrente ed un abbassamento del limite di rivelazione dell’enzima.

Esempio

Ad una soluzione 1 mM di p-idrossifenilfosfato, tamponata a pH 9,5 con borato 20 mM, è stata aggiunta fosfatasi alcalina ad una concentrazione di 1 pM. Dopo un periodo di incubazione di 10 minuti, aliquote di 0,1 mi della soluzione di incubazione vengono aggiunte nella cella elettrochimica che contiene il secondo sistema di amplificazione glucosio-glucosio ossidasi costituito da 1 mi di una soluzione contenente 0,1 M glucosio e 0,5 mg di glucosio ossidasi, tamponati a pH 7 con fosfato 0,1 M. La cella elettrochimica contiene un elettrodo di lavoro, un controelettrodo ed elettrodo di riferimento collegati ad un polarografo. L’elettrodo di lavoro è un elettrodo a pasta di carbone con superficie di 3 mm<2 >, mentre l'elettrodo di riferimento è un elettrodo a calomelano saturo. L'elettrodo di lavoro è polarizzato a 350 mV rispetto all’elettrodo di riferimento. L’aumento di corrente ottenuto, dovuto al difenolo generato nel periodo di incubazione e mediante l'azione amplificante del sistemo elettrodo glucosio-glucosio ossidasi è stato di 10,4± 0,9 nA/pM fosfatasi alcalina nella cella di misura elettrochimica. Tale sistema permette di misurare quantità particolarmente basse di fosfatasi alcalina,dell'ordine delle attomole, nella cella elettrochimica.

Claims (9)

1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la determinazione per via amperometrica dell'attività e/o concentrazione di un enzima avente attività idrolitica di fosfatasi, in cui una sostanza comprendente detto enzima è posta a contatto con un substrato di estere fosforico aromatico in condizioni atte a causare l'idrolisi di detto substrato, caratterizzato dal fatto che come substrato si utilizza un mezzo comprendente un composto di formula generale: (I) in cui Ar è fenile o naftile non sostituito o mono-, di- o tri-sostituito con radicali scelti indipendentemente l'uno dall'altro tra C1-C4 alchile, C1-C4 alcossi, alogeno, N02 , S03H.
2. 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1 . in cui Ar è fenile non sostituito o sostituite ed in cui il gruppo ossidrile è in porizione orto o para rispetto al gruppo fosfor’co.
3. 3. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui Ar è naftile non sostituito o sostituito ed in cui ’1 gruppo ossidrile è in posizione 2 o 4 rispetto al gruppo fosforico.
4. 4. Procedimento secondo la rivendicazione 2, in cui Ar è fenile non sostituito o mono-sostituito con un radicale scelto dal gruppo che consiste di metile, etile, metossi, etossi, cloro, N02 , S03H.
5. 5. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il prodotto di reazione idrolitica enzimatica è ossidato per via elettrochimica ad un potenziale più basso del potenziale di ossidazione del substrato di partenza, con misurazione della corrente di ossidazione.
6. 6. Procedimento secondo la rivendicazione 5, in cui la reazione di ossidazione elettrochimica è effettuata in presenza di un sistema enzimatico di amplificazione comprendente glucosio ossidasi-glucosio .
7. 7. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui detto enzima con attività idrolitica di fosfatasi alcalina è libero o legato ad una molecola con attività biologica.
8. 8. Impiego di un composto di formula generale (I) come substrato di un enzima con attività idrolitica di fosfatasi nella determinazione della concentrazione e/o attività di tale enzima.
9. 9. Impiego secondo la rivendicazione 8, in cui detto composto è p-idrossifenilfostato.