ITMI990210A1 - Biosensore amperometrico reattivo al ph. - Google Patents

Biosensore amperometrico reattivo al ph.

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ITMI990210A1
ITMI990210A1 IT1999MI000210A ITMI990210A ITMI990210A1 IT MI990210 A1 ITMI990210 A1 IT MI990210A1 IT 1999MI000210 A IT1999MI000210 A IT 1999MI000210A IT MI990210 A ITMI990210 A IT MI990210A IT MI990210 A1 ITMI990210 A1 IT MI990210A1
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biosensor
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IT1999MI000210A
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Andrea Pizzariello
Miroslav Stredansky
Silvia Stredanska
Stanislav Miertus
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Saicom S R L
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Description

Domanda di breveto per invenzione industriale dal titolo:
“Biosensore amperometrico reativo al pH”
CAMPO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione si colloca nel setore dell'analisi eletrochimica. Si riferisce in particolare a sistemi per la rilevazione eletrochimica di analiti basati sull'atività di biocatalizzatori. L'invenzione ha per oggeto un nuovo gruppo di biosensori ed il loro uso in un metodo di determinazione degli analiti.
TECNICA ANTERIORE
Un biosensore è un dispositivo che incorpora un elemento biologico sensibile collegato ad un trasdutore o integrato all’interno di esso. Lo scopo è quello di produrre segnali eletronici proporzionali alla concentrazione della sostanza specifica che deve essere determinata. L'introduzione dei biosensori ha fornito un’alternativa interessante all'analisi tradizionale di laboratorio. Grazie alla semplicità di manipolazione, compatezza e versatilità d'uso, i biosensori permettono di eseguire con facilità l’analisi di campioni direttamente sul luogo. Dispositivi specifici e sensibili sono stati utilizzati nella diagnostica medica, nel monitoraggio della qualità degli alimenti, nel monitoraggio ambientale, nella fermentazione, e nel controllo analitico e via di seguito. I biosensori elettrochimici, specialmente quelli amperometrici, rivestono un ruolo significativo nell’applicazione di questi dispositivi.
I biosensori amperometrici emettono un segnale lineare e sono caratterizzati da un’alta sensibilità. In condizioni favorevoli, concentrazioni di 10<-8 >a 10<-9 >M dell'analita possono essere rilevate ed un intervallo dinamico tra tre e quattro ordini di grandezza può essere ottenuto facilmente (G.S. Wilson, in: Biosensors, Fundamentals and Applications, A.P.F. Turner, I. Karube and G.S. Wilson Ed., Oxford Univ.. Press, 165-179, 1987).
La prima generazione di biosensori amperometrici si basa suil'ossidazione di un’analita mediante ossidasi (biocatalizzatori) che utilizza l'ossigeno come elettron-accettore. Di conseguenza o la diminuzione nella concentrazione di ossigeno oppure l’aumento della concentrazione di perossido di idrogeno prodotto vengono misurati da un elettrodo in forma di corrente che è proporzionale alia concentrazione dell'analita.
Nei sistemi di seconda generazione, l’enzima esegue la prima reazione redox con il substrato (analita) ma viene poi riossidata da un mediatore redox sostituito all’ossigeno; il mediatore viene a sua volta ossidato dall’elettrodo ed il segnale amperometrico corrispondente viene misurato. Molti esempi di mediatore che contengono biosensori vengono citati in una review di Gorton ( Electroanalysis , 7, 23-45, 1995).
Dal momento che i mediatori redox trasportano elettroni, che arrivano al centro redox del biocatalizzatore dal substrato all'elettrodo di lavoro, questi biosensori amperometrici hanno come limite l’utilizzo di biocatalizzatori appartenenti al gruppo delle ossidoreduttasi. Di conseguenza con questi biosensori è possibile effettuare la determinazione solo di un gruppo limitato di analiti.
Un certo numero di enzimi appartenenti ai gruppi di idrolasi, trasferasi, ossidoreduttasi, Nasi, ligasi, tra cui in particolare decarbossilasi, fosforilasi, esterasi, fosfatasi, deaminasì, chinasi, cambia la concentrazione di ioni H+ (o per consumo o per produzione) con la loro interazione biocatalitica con un substrato e tale cambiamento dipende dalla concentrazione del substrato stesso. Questi biocatalizzatori in combinazione con un trasduttore potenziometrico adeguato, ad es. il tipico elettrodo a vetro pH-sensibile, o ad un elettrodo a membrana solida e liquida pH-sensibile, vengono utilizzati per la realizzazione di biosensori potenziometrici. Esempi di analiti che vengono determinati da questi biosensori sono l’urea, la penicillina, il glucosio, il malato (S.S. Kuan e G.G. Guibault, In: Biosensors, Fundamentals and Applications, A.P.F. Turner, I. Karube e G.S. Wilson Ed., Oxford Univ. Press, 135-152, 1987; Palleschi et al., Talanta, 41. 917-923, 1994). Gli svantaggi di questi biosensori sono costituiti da una risposta logaritmica e da una bassa sensibilità. Il loro range analiticamente utile va generalmente da 10<-1 >a 10<-4 >M, eccezionalmente a 10<-6 >M.
Un altro gruppo di biosensori potenziometrici utilizza una combinazione di biocatalizzatori che modificano il pH interfacciati a transistor ad effetto di campo iono-sensibili (ISFET). Gli ISFET vengono preparati con una tecnologìa dì fabbricazione a base di silicio dove lo strato dì nitruro di silicio depositato sulla superficie viene usato principalmente come trasduttore pH-sensibile. Alcuni esempi sono costituiti da biosensori per la determinazione di urea, ATP, penicillina, glucosio e acetilcolina (G.F. Blackbum, In: Biosensors, Fundamentals and Applications, A.P.F. Turner, I. Karube e G.S. Wilson Ed., Oxford Univ. Press, 481-530, 1987).
Gli svantaggi presentati da questo tipo di biosensore sono costituiti da una bassa sensibilità (risposta misurabile nel range di concentrazione da 10<-1 >a 10<-4 >M) insieme con un costo elevato ed una procedura di fabbricazione complessa.
Recentemente, è stato descritto un nuovo gruppo di biosensori elettrochimici, basati sulla combinazione di un biocatalizzatore che modifica il pH e di un trasduttore conduttometrico (A.Q. Contractor et al., Electrochim. Acta, 39, 1321-1324, 1994; J.M. Goncalves Laranjeira et al., Anal. Lett. 30, 2189-2209, 1997; Nishizawa et al., Anal. Chem., 64, 2642-2644, 1992). Questo nuovo tipo di biosensori sfrutta l’effetto del pH sulle proprietà elettriche di un polimero conduttivo (polianilina, polipirroio) depositato sulla superficie dell’elettrodo. Essi consistono di due elettrodi di platino a distanza di diversi μm, coperti dal film di polimero conduttore e da una membrana enzimatica. Questi biosensori non hanno bisogno di un elettrodo di riferimento classico. Con questo tipo di biosensore è possibile misurare analiti come l’urea, il glucosio, i lipidi, l’emoglobina e la penicillina. Questi biosensori forniscono una risposta rapida ed una sensibilità migliore dei biosensori potenziometrici (il range analiticamente utile va da 10<-1 >a 10<-5 >M, nel migliore dei casi 10<-6 >M); tuttavia la loro sensibilità è ancora lontana da quélla ottenibile con biosensori amperometrici. Inoltre, essi hanno bisogno di una procedura di fabbricazione costosa e precisa.
Di conseguenza, in considerazione degli svantaggi elencati precedentemente, si avverte l’esigenza di individuare biosensori elettrochimici alternativi dotati dì una maggiore sensibilità e che richiedano una procedura di fabbricazione semplice.
SOMMARIO
La presente invenzione descrive un nuovo biosensore elettrochimico che comprende (i) un biocatalizzatore che produce una variazione del pH quando interagisce con l’analita da determinare ed (ii) un composto che esibisce diverse proprietà redox nelle sue forme protonizzate e non (composto redox sensibile al pH).
Gli elementi di cui sopra vengono integrati in un sistema biosensore composto da un elettrodo di lavoro e da un elettrodo di riferimento collegati ad un amperometro. In presenza dell'analita, il sistema genera un cambiamento di corrente che è proporzionale alla concentrazione dell'analita. I biosensori qui descritti permettono la rilevazione precisa di un ampio spetro di analiti. Essi possono essere usati nei setori della diagnostica umana e veterinaria, nei processi industriali, nel controllo qualità di alimenti e mangimi, nelle biotecnologie, nell’industria farmaceutica, nel monitoraggio ambientale, ecc.
DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Le Figure 1-7 rappresentano il cambiamento di corrente con il pH ad adeguati potenziali costanti utilizzando vari composti redox sensibili al pH e vari elettrodi come descritto agli Esempi 1-7.
Figura 1 : elettrodo di platino; emateina in soluzione alla concentrazione di 0.5 mM (curva a) e 2.5 mM (curva b);
Figura 2: emateina in soluzione; elettrodo a pasta di carbone (curva a) ed elettrodo composito solido (curva b);
Figura 3: elettrodo d’oro con monostrato di blu di metilene;
Figura 4: elettrodo composito solido; ematossillina in soluzione (curva a), quercitina in soluzione (curva b), armalina in soluzione (curva c);
Figura 5: elettrodo composito solido con orto-fenilendiammina elettropolimerizzata;
Figura 6: elettrodo di platino con pirogallolo elettropolimerizzato;
Figura 7: elettrodo solido composito modificato con laurilgallato;
Le Figure 8-16 mostrano le curve di calibrazione di vari analiti misurati con i biosensori dell'invenzione descritti negli Esempi 8-17.
Figura 8: biosensore per la determinazione dell'urea, emateina in soluzione, elettrodo di platino (curva a) o elettrodo composito solido (curva b);
Figura 9: biosensore per la determinazione dell'urea, emateina in soluzione, elettrodo composito solido contenente ureasi, in presenza di tampone fosfato 5 mM (curva a) o 1 mM (curva b);
Figura 10: biosensore per la determinazione dell’urea, elettrodo solido composito contenente lauril gallato;
Figura 11. biosensore per la determinazione dell'ossalacetato, emateina in soluzione, elettrodo solido composito;
Figura 12: biosensore per la determinazione del glucosio, elettrodo composito solido modificato con film di poli(orto-fenilendiammina);
Figura 13: biosensore per la determinazione dell’idrogencarbonato, emateina in soluzione, elettrodo di platino;
Figura 14: biosensore per la determinazione della penicillina, emateina in soluzione, elettrodo di platino;
Figura 15: biosensore per la determinazione dell’ATP, emateina in soluzione, elettrodo di platino;
Figura 16: biosensore per la determinazione dell’urea, elettrodo d'oro con monostrato di blu di metilene.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
L'oggetto della presente invenzione è un sistema biosensore amperometrìco per la determinazione degli analiti, che comprende:
(a) almeno un biocatalizzatore che produce una variazione di pH a seguito della sua interazione con l'analita da determinare;
(b) almeno un composto che esibisca diverse proprietà redox nelle sue forme protonizzate e non. Detto composto sarà di seguito indicato come “composto redox pH-sensibile";
(c) un elettrodo di lavoro;
(d) un elettrodo di riferimento
Gli elettrodi citati alle voci (c) e (d) sono entrambi collegati ad un amperometro.
In una delle realizzazioni dell’invenzione, il biocatalizzatore (a) ed i composti redox sensibili al pH (b) sono tutti contenuti nell’elettrodo di lavoro; in alternativa uno o più di tali componenti sono presenti nella soluzione di misura in cui gli elettrodi sono immersi.
Il biosensore dell’invenzione può essere a scelta coperto da un’adeguata membrana semipermeabile.
Il principio operativo dei biosensori in oggetto è di seguito descritto. Gli elettrodi vengono messi in una soluzione di misura e tra loro viene applicato un potenziale di lavoro. La reazione agli elettrodi viene fatta proseguire fino al raggiungimento del'equilibrio tra la forma ossidata e la forma ridotta del composto redox pH-sensibile (b). Questa reazione elettrochimica viene accompagnata da un flusso di elettroni misurato come corrente elettrica mediante l’amperometro. Fino a questo punto, il biocatalizzatore (a) non viene coinvolto. Una volta che il campione con l’analita viene aggiunto alla soluzione, si verifica la reazione biocatalizzatore/analita ed il pH si modifica conseguentemente; la variazione di pH sposta l'equilibrio delle forme protonizzate/non protonizzate del composto redox (b). Dal momento che queste forme del composto redox esibiscono diverse proprietà redox, cambiamenti nella loro concentrazione danno luogo ad un cambiamento di corrente al potenziale costante applicato. Il cambiamento di corrente viene monitorato dall’amperometro e dipende dalla concentrazione del substrato.
Per quanto riguarda la natura di detto biocatalizzatore (a), questo può essere una qualsiasi entità biologica capace di interagire con l'analita da determinare e di causare una variazione di pH come risultato di questa interazione. In pratica, ogni biocatalizzatore che reagisca con il suo substrato normale generando o consumando ioni H+ può essere usato come biocatalizzatore per la determinazione di quel substrato.
Biocatalizzatori adeguati sono ad esempio enzimi che catalizzano reazioni che implicano la produzione o il consumo di ioni H+; esempi tipici sono le idrolasi, ossidoreduttasi, transferasi, liasi, ligasi e preferibilmente le fosforilasi, decarbossilasi, esterasi, proteinasi, deaminasi, amidasi, fosfatasi, sintetasi. Altri esempi di biocatalizzatori con le stesse caratteristiche si possono trovare tra le immunoproteine, gli acidi nucleici, i sinzimi, gli anticorpi catalitici.
Altri biocatalizzatori che modificano il pH si possono ritrovare tra le strutture biologiche o gli aggregati biologici come le cellule, i frammenti cellulari, i tessuti, gli organelli ed i loro frammenti, frazioni, omogenati, estratti, lisati.
E’ possibile utilizzare un singolo biocatalizzatore oppure una miscela di due o più degli stessi.
La scelta del biocatalizzatore adatto è determinata dalla natura dell’analita stesso, in base alla regola secondo la quale l’anaiita deve agire come substrato per il biocatalizzatore: per esempio, le esterasi saranno indicate per la determinazione analitica degli esteri; ie decarbossilasi saranno utilizzate per la determinazione degli acidi carbossilici, le deaminasi per le ammine e via di seguito.
Esempi dei biocatalizzatori preferiti per la presente invenzione sono: ureasi, ossalacetato decarbossilasi, glucosio ossidasi, anidrasi carbonica, penicillinasi, apirasi, per la determinazione rispettivamente di urea, ossalacetato, glucosio, idrogenocarbonati, penicillina, ATP.
Nei biosensori dell’invenzione, i biocatalizzatori (a) possono essere incorporati nell’elettrodo di lavoro oppure possono essere presenti nella soluzione di misura in forma dispersa o solubile.
L'incorporazione di detto biocatalizzatore nell’elettrodo di lavoro è particolarmente indicato per la preparazione di biosensori compositi. Detti biocatalizzatori possono essere anche applicati aila superficie degli elettrodi di lavoro. In questo caso, essi vengono normalmente immobilizzati mediante metodi fisici o chimici. I metodi preferiti per l'immobilizzazione consistono nella copertura con membrana semipermeabile, inclusione in un polimero o uno strato di gel, crosslinking con agenti bifunzionali, legame covalente, adsorbimento, immobilizzazione nella membrana esterna.
La sistemazione del biocatalizzatore nella soluzione di misura viene normalmente effettuata sciogliendo il biocatalizzatore in soluzione, oppure disperdendolo omogeneamente. Ciò è particolarmente indicato per i biosensori usa e getta a pellicola spessa, dove il biocatalizzatore viene disciolto in tutto il volume del campione aggiunto. E’ indicata per i biosensori specifici per gli analiti polimerici perché evita l'insorgere di impedimenti sterici che si verificherebbero nel caso del biocatalizzatore immobilizzato. Un'altra possibile modo di alloggiamento del biocatalizzatore nel sistema biosensore dell’invenzione consiste nella sua immobilizzazione in un piccolo bioreattore inserito di fronte all'elettrodo di lavoro quando il sistema di flusso viene applicato.
Quando l'attività del biocatalizzatore richiede la presenza di un cofattore, ad es. un coenzima o un attivatore, i biosensori dell’invenzione comprendono anche detto cofattore. Il cofattore viene preferibilmente messo insieme al biocatalizzatore , cioè entrambi sono presenti sulla superficie dell'elettrodo, oppure entrambi nel corpo dell'elettrodo o nella soluzione.
Un ulteriore elemento del sistema biosensore secondo l’invenzione è rappresentata dal composto redox pH-sensibile (b). Questi sono composti che sono presenti in soluzione in equilibrio tra forma protonizzata e quella non protonizzata, che hanno diversi potenziali redox.
I composti redox sensibili al pH possono essere scelti nel gruppo degli idrocarburi ciclici che contengono da 4 a 30 atomi di carbonio e sostituiti con almeno un gruppo scelto tra
ono catene di idrocarburi eventualmente ulteriormente sostituite, o dal gruppo di composti eterociclici, contenenti da 3 a 30 atomi di carbonio ed uno o più eteroatomi scelti tra N eventualmente sostituiti con un gruppo scelto tra
sono catene di idrocarburi indipendenti. Questi composti possono essere a scelta in forma di monomero, oligomero o polimero. I composti di cui sopra possono essere utilizzati da soli o in una miscela di due o più di loro.
Le classi preferite di composti redox sensibili al pH sono indicatori di pH (ad es. ematossillina, emateina), fenossazine e fenotiazine (ad es. blu metilene), antiossidanti naturali (ad es. quercitina, flavonoidi, alchilgallati) orto-fenilendiammine o para-fenilendiammine polimerizzate. Secondo l’invenzione, il composto redox pH-sensibile è presente nell’elettrodo di lavoro oppure viene sciolto nella soluzione di misura. I composti redox sensibili al pH che sono solubili in acqua vengono preferibilmente aggiunti alla soluzione; quelli insolubili in acqua vengono preferibilmente usati per modificare l'elettrodo di lavoro.
Quando è presente nell’elettrodo di lavoro, il composto redox pH-sensibile può essere depositato sulla sua superficie in forma libera, oppure può essere chimicamente o fisicamente legato (immobilizzato) alla superficie dell’elettrodo di lavoro; oppure può essere un componente del corpo di un elettrodo di lavoro composito.
Se il composto redox pH-sensibile è un polimero o un oligomero, questo può essere anche preparato in situ sulla superficie dell’elettrodo di lavoro mediante polimerizzazione chimica o fisica, preferìbilmente mediante una polimerizzazione radicalica, elettropolimerizzazione o fotopolimerizzazione.
Tra i composti redox citati sopra, i coloranti fenotiazinici e le po)i(ortofeniiendiammine) sono particolarmente indicati per essere fisicamente o chimicamente legati alla superficie dell'elettrodo. L'emateina, l’ematossillina, i coloranti fenotiazinici e la quercitina sono particolarmente indicati per essere aggiunti alla soluzione di misura. Gli alchil gallati sono preferibilmente adatti per essere incorporati nel corpo del biosensore come componenti di un elettrodo di lavoro composito. Vari elettrodi di lavoro possono essere utilizzati quale elemento (c) del sistema biosensore dell’invenzione. Detti elettrodi di lavoro sono scelti nel gruppo composto da elettrodi di lavoro classici usati in amperometria (come ad esempio, elettrodi di platino, oro, mercurio, grafite vetrosa) oppure da elettrodi compositi (come ad esempio gli elettrodi di grafite).
Similmente, gli elettrodi di riferimento utili quale elemento (d) del sistema biosensore dell'invenzione sono comunemente disponibili in amperometria. Gli elettrodi di riferimento preferiti sono gli elettrodi standard a calomelano (SCE) e ad Ag/AgCI. L’elettrodo Ag/AgCI è particolarmente indicato, grazie alla possibilità di assumere vari design (forme), come ad esempio, coclea, strato, o barra.
Il potenziale di lavoro da applicare tra i due elettrodi è preferibilmente vicino a 0.0 mV oppure è negativo (verso Ag/AgCI elettrodo di riferimento). L’applicazione di questo potenziale riduce sostanzialmente possibili interferenze elettrochimiche che derivano da composti interferenti facilmente ossidabili presenti nei campioni reali.
Diversamente dai biosensori amperometrici classici, dove le misure sono eseguite in soluzioni fortemente tamponate che richiedono un pH costante, nella presente invenzione le misure sono eseguite con soluzioni non tamponate oppure con soluzioni di misura con una bassa capacità tampone. Se viene utilizzata una soluzione con bassa capacità tampone, la concentrazione preferita dei composti tampone è compresa nell’intervallo tra 0.5 e 20 mM.
Il termine “soluzione di misura” utilizzato in questa invenzione non è strettamente limitato ai sistemi dove tutti i componenti sono sciolti, ma racchiude anche i sistemi liquidi dove almeno parti delle componenti sono contenute in uno stato disperso omogeneamente, come le sospensioni, le emulsioni e via di seguito.
Il sistema biosensore realizzato come descritto nella presente invenzione permette di determinare, per via amperometrica, molti più analiti di quanti non sia finora possibile. Il segnale in uscita è lineare. Tale linearità permette di correlare facilmente all’interno di un ampio range di concentrazione i cambiamenti di corrente registrati per le concentrazioni dell’analita.
Il sistema biosensore secondo la presente invenzione esibisce una buona specificità e sensibilità, una procedura di fabbricazione semplice ed un design versatile. La sensibilità dei biosensori descritti di seguito (sezione Esempi) si situa nel range da 0.1 a 5 μΑ mM<-1 >cm<-2 >e i limiti di rilevamento sono compresi nell’intervallo compreso tra 10<-5 >e 10<-7 >M. I biosensori della presente invenzione sono versatili per quanto riguarda la variabilità del biocatalizzatore, i composti redox pH-sensibili, gli elettrodi di lavoro e di riferimento e la sistemazione del biosensore. Essi permettono anche una buona variabilità nel design del biosensore. Infatti, il sistema biosensore dell’invenzione può essere applicato ai design più comuni di biosensori, che hanno diverse forme, dimensioni e sistemazione, quali ad es. i biosensori a striscia, puntale, ago. Disco, tubo, spirale, strato spesso, strato sottile ed altre forme degli elettrodi ben si adattano al biosensore descritto nell’invenzione. La costruzione dei microelettrodi basata sulla presente invenzione è anche possibile. II sistema biosensore secondo la presente invenzione può essere vantaggiosamente usato nella diagnostica sia nell’uomo che negli animali, nei processi industriali, nell’industria agro-alimentare, nelle biotecnologie, nell’industria farmaceutica, nel monitoraggio ambientale e via di seguito.
Tutti questi usi sono compresi nella presente invenzione.
Un’ulteriore realizzazione dell’invenzione riguarda un metodo per determinare la concentrazione di analiti caratterizzata dall’utilizzo dei nuovi biosensori descritti precedentemente.
Un metodo preferito di determinazione comprende i seguenti passaggi: (a) sistemare gii elettrodi in una soluzione di misura;
(b) applicare un potenziale adeguato tra gii elettrodi;
(c) misurare una corrente di base;
(d) aggiungere alla soluzione il campione contenente l'analita da determinare;
(e) misurare un cambiamento di corrente che è proporzionale alla concentrazione dell’anaiita;
(f) eventualmente sottrarre il cambiamento di corrente misurato con un elettrodo di bianco dal valore ottenuto in (e).
Il passaggio (f) viene aggiunto in modo da eliminare possibili interferenze. L’elettrodo di bianco differisce da un normale elettrodo di lavoro come descritto finora, soltanto in quanto contiene detti biocatalizzatori in forma non-attiva oppure non li contiene affatto. La procedura per l’ottenimento del cambiamento di corrente misurato con l’elettrodo di bianco è identica a quella descritta nei passaggi (a)- (e). Tutte le letture vengono fatte dopo che il campione è stato uniformemente diluito nella soluzione di misura ed il segnale è stabile. Come scritto sopra, l’invenzione è compatibile con diversi design del biosensore, come puntali, aghi, strisce, etc. Alcune di queste forme (vedi biosensori a striscia) lavorano in assenza di una soluzione di misura e reagiscono immediatamente per contatto con il campione contenente l’analita. Questo contatto awiene ad esempio per aggiunta al biosensore di una goccia del campione contenente l'analita, sul biosensore oppure per immersione del biosensore in questa stessa soluzione. In questi casi il metodo di determinazione dell’analita viene così modificato:
(a) applicare un potenziale adeguato tra gli elettrodi;
(b) misurare una corrente di base;
(c) mettere il campione contenente l’anaiita in contatto con il biosensore; (d) misurare un cambiamento di corrente che è proporzionale alla concentrazione dell’analita;
(e) eventualmente sottrarre il cambiamento di corrente misurato con un elettrodo di bianco dal valore ottenuto in (d).
I metodi di cui sopra possono essere qualitativi (cioè permettono di determinare la presenza dell'analita nella soluzione) oppure quantitativi (cioè permettono di determinare la sua concentrazione) poiché il cambiamento di corrente è proporzionale alla concentrazione dell'analita.
Fino ad ora si è inteso che il biocatalizzatore reagisce positivamente con l’analita provocando il cambiamento di pH. In una ulteriore realizzazione dell’invenzione, il sistema individua la presenza di un analita che inibisce il biocatalizzatore. L’interazione funziona in questo caso in senso negativo ed il cambiamento di corrente che dipende dal grado di inibizione sarà proporzionale alla concentrazione dell’analita-inibitore. Questo aspetto amplia ulteriormente lo spettro di analiti individuabili con la presente invenzione. Infatti, ogni sostanza che funzioni come inibitore di un biocatalizzatore che modifica il pH può essere così individuata. Al fine di implementare questo aspetto dell'invenzione, il metodo di misura viene in parte modificato aggiungendo al sistema il normale substrato del biocatalizzatore prima di aggiungere il campione con l'analita-inibitore che deve essere testato. Il metodo di conseguenza comprende le seguenti fasi:
(a) sistemare gli elettrodi in una soluzione di misura;
(b) applicare un potenziale adeguato tra gli elettrodi;
(c) aggiungere il substrato di detto biocatalizzatore alla soluzione di misura;
(d) misurare una corrente di base;
(e) aggiungere alla soluzione il campione contenente l'anal<'>ita-inibitore da determinare;
(f) misurare un cambiamento di corrente che è proporzionale alla concentrazione dell'analita-inibitore;
(g) eventualmente sottrarre il cambiamento di corrente misurato con un eletrodo di bianco dal valore ottenuto in (f).
Se il design del biosensore (vedi biosensore a striscia) consente di lavorare in assenza di una soluzione di misura, allora il metodo di cui sopra viene modificato come segue:
(a) applicare un potenziale adeguato tra gli eletrodi;
(b) aggiungere il substrato di detto biocatalizzatore;
(c) misurare una corrente di base;
(d) mettere il campione contenente l’analita-inibitore in contato con il biosensore;
(d) misurare un cambiamento di corrente che è proporzionale alla concentrazione dell’analita-inibitore;
(e) eventualmente sottrarre il cambiamento di corrente, misurata con un elettrodo di bianco, dal valore misurato in (d).
Il passaggio (c) viene condotto aggiungendo al biosensore una goccia del campione contenente l'analita-inibitore oppure per immersione nella stessa soluzione.
Questo metodo può essere ulteriormente usato per determinare le attività enzimatiche. In questo caso, i cambiamenti di corrente devono essere misurati in dipendenza del tempo.
L’invenzione viene ora illustrata con i seguenti esempi sperimentali, che tuttavia non sono limitativi.
PARTE SPERIMENTALE
Esempio n.1
Variazione dei cambiamenti di corrente con il pH in presenza di emateina in soluzione utilizzando un elettrodo di platino.
L’emateina (Fluka, Cat. No. 51230) viene sciolta in tampone fosfato 0.05 M contenente 0.1 M di cloruro di sodio. L'elettrodo di lavoro in platino e l’elettrodo di riferimento SCE vengono immersi nella soluzione e la corrente viene misurata con un rilevatore amperometrico Amel 559 (Amel Instruments, Milano, Italy) al potenziale costante di 0.0 mV. Il valore del pH diminuisce con l'aggiunta di aliquote di acido solforico 2M ed il corrispondente cambiamento di corrente viene monitorato. Contemporaneamente il pH viene misurato dal pH-metro (PHM 85, Radiometer, Copenhagen, Danimarca). La relazione tra il cambiamento di corrente ed il pH per due concentrazioni di emateina (0.5 mM - curva a; e 2.5 mM - curva b) è illustrato alla Figura 1.
Esempio n. 2
Variazione dei cambiamenti di corrente con il pH in presenza di emateina in soluzione usando elettrodi compositi.
L’elettrodo a pasta composita viene preparato mescolando sotto agitazione vigorosa 7 parti (p/p) di grafite (Fluka, Cat. No. 50870) con 3 parti (p/p) di olio di paraffina (Fluka, Cat. No. 76235) in mortaio. La miscela viene introdotta in un tubo di plastica (diametro interno 2 mm) dotato di un cilindretto di ottone. L'elettrodo a pasta composita viene preparato miscelando vigorosamente 2 parti (p/p) di grafite con 3 parti (p/p) di n-eicosano fuso (Sigma, Cat. No. E-9752) a 45°C. Tale miscela viene introdotta in un tubo di plastica (diametro interno 2 mm) dotato di un cilindretto di ottone. Entrambi gli elettrodi vengono levigati su un foglio di carta prima dell’uso. Le misure elettrochimiche vengono eseguite come descritto nell’Esempio 1 con 0.5 mM di emateina ed i cambiamenti di corrente ottenuti vengono illustrati alla Figura 2 (curva a - elettrodo a pasta composita, curva b - elettrodo solido composito).
Esempio n. 3
Variazione dei cambiamenti di corrente con il pH utilizzando un elettrodo d’oro modificato con blu di metilene.
L’elettrodo d’oro appena pulito (Amel Instruments) viene immerso in una soluzione 0.5 mM di blu di metilene (Aldrich, Cat. No. 86, 124-3) per 12 ore. Quindi, l’elettrodo viene adeguatamente risciacquato con acqua deionizzata. Le misure elettrochimiche vengono svolte come descritto nell’Esempio n.1, utilizzando un potenziale di lavoro di -100 mV (contro SCE). I risultati vengono illustrati nella Figura 3.
Esemplo n. 4
Variazione dei cambiamenti di corrente con il pH utilizzando un elettrodo composito in presenza di ematossilina, quercitina ed armalina in soluzione.
Gli elettrodi solidi compositi vengono preparati come descritto all’Esempio n. 2. Il pH viene misurato in soluzioni di 0.5 mM di ematossilina, quercitina, armalina utilizzando il tampone descritto all’Esempio n.1. Il potenziale di lavoro per l'ematossilina e la quercitina è di 0.0 mV (contro SCE), per l’armalina è invece 600 mV. I risultati sono illustrati alla Figura 4 (curva a -ematossilina; curva b - quercitina; curva c - armalina).
Esempio n. 5
Variazione dei cambiamenti di corrente con il pH utilizzando un elettrodo composito solido la cui superficie è stata modificata con un film di poliorto-fenilendiammina.
L’elettrodo composito solido viene preparato miscelando vigorosamente la grafite con n-eicosano fuso (rapporto del peso 1:1) a 45°C. La miscela cosi ottenuta viene introdotta in un tubo di plastica (diametro interno 2 mm) provvisto di un cilindretto di ottone. Una pellicola di poli-(ortofenilendiammina) viene depositata sulla superficie dell’elettrodo levigato mediante polimerizzazione elettrochimica del monomero di ortofenilendiammina (Sigma, Cat. No P-9029) in soluzione acquosa. Tale processo viene eseguito nel seguente modo: la scansione del potenziale di elettrodo viene ripetuta 30 volte tra -0.5 mV e 0.7 V (contro SCE) a 50 mVs<-1 >in un tampone privo di ossigeno di 0.1 mM acetato a pH 5.0 contenente 0.5 mM di orto-fenilendiammina in atmosfera inerte. L'elettrodo modificato viene quindi risciacquato completamente con il tampone fosfato. Questo biosensore viene testato a diversi valori di pH di una soluzione ed il cambiamento di corrente viene misurato seguendo la stessa procedura descritta all’Esempio 1. Il potenziale di lavoro è di -600 mV. I risultati sono illustrati alla Figura 5.
Esempio n. 6
Variazione dei cambiamenti di corrente per un elettrodo di platino la cui superficie è modificata con polipirogallolo.
La pellicola di polipirogallolo viene depositata sulla superfìcie appena pulita dell’elettrodo di platino mediante polimerizzazione elettrochimica di 25 mM di pirogallolo (Aldrich, Cat. Mo. 25.400-2) in soluzione acquosa contenente tampone fosfato 0.15 M (pH 7.0) e tetraetilammonio tetrafluoroborato 0.1 M (Aldrich, Cat. No. 24, 214-4). La scansione del potenziale dell’elettrodo viene ripetuta 3 volte tra 0.0 V ed 1.1 V (contro SCE) a 50 mVs<-1>. L’elettrodo modificato viene poi risciacquato completamente con il tampone fosfato. Questo biosensore viene testato a diversi valori di pH di una soluzione ed il cambiamento di corrente viene misurato con la stessa procedura descritta all’Esempio 1. Il potenziale di lavoro è di 200 mV. I risultati sono illustrati alla Figura 6. Esempio n. 7
Variazione dei cambiamenti di corrente con il pH per un elettrodo solido composito modificato con lauril gallato.
La polvere di grafite viene modificata come segue: 100 mg di lauril gallato (Fluka, Cat. No. 48660) vengono sciolti in 2 mi di acetone e 400 mg di grafite vengono aggiunti alla soluzione. La miscela viene poi sottoposta ad agitazione fino a renderla omogenea e l’acetone viene quindi evaporato con un flusso di aria forzata a temperatura ambiente.
100 mg di acido laurico (Fluka, Cat. Mo. 61610) e 150 mg di 2-esadecanone (Fluka, Cat. No 69250) vengono sciolti in un crogiolo di porcellana a 50°C e miscelati vigorosamente con 250 mg della grafite modificata. Un tubo di plastica (diametro interno 2 mm) provvisto di un cilindretto dì ottone viene riempito con questa miscela e poi il materiale dell’elettrodo viene solidificato a temperatura ambiente. La superfìcie dell'elettrodo viene levigata con carta vetrata e ripulita con un foglio di carta comune. La dipendenza del cambiamento di corrente dal pH dell'elettrodo modificato con lauril gallato si misura con la stessa procedura descritta all’Esempio n.1. Il potenziale di lavoro è di 200 mV. I risultati sono illustrati alla Figura 7.
Esempio n. 8
Preparazione dal biosensore per la determinazione di urea basato su un elettrodo di platino modificato con ureasi ed emateina in soluzione.
Una soluzione (2 μl, 10 mg/ml) di ureasi (EC 3.5.1.5., Sigma, Cat. No. U-0376) viene applicata sulla superficie dell'elettrodo di platino. Dopo essiccazione a temperatura ambiente, l’elettrodo viene coperto con una membrana di dialisi (Spectra/Por MWCO 6,000 - 8,000), fissata mediante un anello ad O. Il biosensore viene immerso in un tampone fosfato 1 mM (pH = 7.35) che contiene emateina 0.5 mM e cloruro di 1498PTIT Notarbartolo & Gervasi S.p.A.
sodio 0.1 mM. Quindi il biosensore viene polarizzato a 0.0 mV (contro SCE). Si aggiungono alcune aliquote di soluzione di urea (5 mg/ml) al tampone di misura. La relazione tra la concentrazione di urea ed il cambiamento di corrente è rappresentato alla Figura 8 (curva a).
Esempio n. 9
Preparazione del biosensore per la determinazione dell’urea basato sull’elettrodo composito solido modificato con ureasi ed emateina in soluzione
L’elettrodo composito solido viene preparato come descritto all’Esempio 2. L’ureasi (2μΙ, 10 mg) viene applicata sulla superficie dell’elettrodo pulita. Dopo essiccazione, l’elettrodo viene coperto con una membrana di dialisi (Spectra/Por MWCO 6,000 - 8,000) per mezzo di un anello ad O. Il biosensore viene immerso in tampone fosfato 1mM (pH = 7.35) contenente emateina 0.5 mM e cloruro di sodio 0.1 M. L’elettrodo viene polarizzato a 0.0 mV (contro SCE). Si aggiungono alcune aliquote di soluzione standard di urea (5mg/m!) al tampone di misura. La relazione tra la concentrazione di urea ed il cambiamento di corrente è rappresentata alla Figura 8 (curva b).
Esempio n. 10
Preparazione del biosensore per l'urea basato sull’elettrodo composito solido modificato nel corpo ed emateina in soluzione
La polvere di grafite viene modificata nel seguente modo: 97 mg di polvere di grafite vengono aggiunti a 0.5 mi della soluzione acquosa di ureasi (6 mg/ml). La miscela viene mescolata accuratamente fino a renderla omogenea e l’acqua viene fatta evaporare delicatamente. 50 mg della grafite modificata vengono mescolati a 50 mg di 2-esadecanone a 50°C e la miscela ottenuta viene introdotta in un tubo di plastica (diametro interno di 2 mm) provvisto di un cilindretto di ottone; la miscela viene quindi lasciata raffreddare a temperatura ambiente. L’elettrodo viene levigato con un foglio di carta e coperto con una membrana di dialisi (Spectra/Por MWCO 6,000 - 8,000). li biosensore viene immerso nel tampone fosfato (1 o 5 mM, pH 7.50) contenente emateina 0.5 mM e cloruro di sodio 0.1 M e viene poi polarizzato a 0.0 mV (contro SCE). Si aggiungono quindi alcune aliquote di soluzione standard di urea (5 mg/ml) al tampone di misura. I cambiamenti di corrente vengono registrati ed i risultati sono illustrati alla Figura 9. dove la curva b) si riferisce a 1 mM di tampone fosfato.
Esempio n. 11
Preparazione del biosensore per l’urea che utilizza un elettrodo composito solido modificato con ureasi e contenente laudi gallato.
La polvere di grafite viene modificata nel modo seguente: 20 mg di lauril gallato vengono sciolti in 0.5 mi di acetone e 90 mg di grafite vengono aggiunti alla soluzione. La miscela viene agitata fino a renderla omogenea e l’acetone viene fatto evaporare sotto flusso di aria forzata a temperatura ambiente. 40 mg di 2-esadecanone e 5 mg di acido stearico (Aldrich, Cat. No. 26, 838 - 0) vengono sciolti in un crogiolo di porcellana a 55°C e mescolati vigorosamente con 55 mg della grafite modificata di cui sopra. La miscela viene introdotta in un tubo di plastica (diametro interno 2 mm) provvisto di un cilindretto di ottone. L’ureasi (1 μΙ, 30 mg/ml) viene applicata sulla superficie dell'elettrodo appena pulita. Dopo averlo fatto asciugare, l’elettrodo viene coperto con una membrana di dialisi (Spectra/Por MWCO 6,000 - 8,000) fissata con un anello ad O. Il biosensore viene immerso in un tampone fosfato 1mM (pH. 7.35 contenente cloruro di sodio 0.1 M). Viene poi polarizzato a 200 mV (contro SCE). Si aggiungono quindi vane aliquote di soluzioni standard di urea (5 mg/ml) al tampone di misura. I cambiamenti di corrente vengono registrati. La relazione tra la concentrazione di urea ed il cambiamento di corrente sono illustrati alla Figura 10.
Esempio n. 12
Preparazione del biosensore per l’ossalacetato basato sull’elettrodo composito solido modificato con decarbossilasi ossalacetato e con emateina in soluzione.
L'elettrodo composito solido viene descritto all'Esempio n. 2. La decarbossilasi ossalacetato (EC 4.1.1.3., ICN, Cat. No. 156007, 5,3 U) viene applicata sulla superficie dell’elettrodo. Dopo averlo asciugato, l'elettrodo viene coperto con una membrana di dialisi (Spectra/Por MWCO 6,000 - 8,000), fissata mediante un anello ad O. Il biosensore viene immerso in tampone fosfato 1mM (pH 8.0) contenente emateina 0.5 mM e cloruro di sodio 0.1 M. Viene quindi polarizzato a 0.0 mV (contro SCE). Vengono aggiunte varie aliquote di soluzione standard di sodio ossalacetato (20 mg/ml) al tampone di misura. I cambiamenti di corrente vengono registrati. La relazione tra la concentrazione di ossalacetato ed il cambiamento di corrente è illustrata alla Figura 11. Esempio n. 13
Preparazione del biosensore basato su un elettrodo composito solido modificato con glucosio ossidasi e ricoperto con una pellicola di poli-(para-fenilendiammina).
L’elettrodo composito solido con la spessa pellicola di poli-(parafenilendiammina) viene preparato come descritto all’Esempio 5. La glucosio ossidasi (EC 1.1.3.4, Sigma, Cat. No. G-7016, 2 μΙ, 10 mg/ml) viene applicata sulla superficie dell’elettrodo, che viene quindi asciugato e coperto con una membrana di dialisi (Spectra/Por MWCO 6,000 -8,000), fissata mediante un anello ad O. Il biosensore viene immerso in tampone fosfato, 1mM (pH 7.0) contenente cloruro di sodio 0.1 M. Viene quindi polarizzato a -600 mV (contro SCE). Si aggiungono poi varie aliquote di soluzione standard di glucosio (20 mg/ml) al tampone di misura. I cambiamenti di corrente vengono registrati. Il rapporto tra la concentrazione di glucosio ed il cambiamento di corrente è illustrato alla Figura 12.
Esempio n. 14
Preparazione del biosensore idrogeno carbonato basato sull’elettrodo di platino modificato con anidrasi carbonica ed ematoma in soluzione.
Una soluzione di anidrasi carbonica (EC 4.2.1.1, Sigma, Cat. No. C-4831, 2400 W-A unità, 2 μΙ, 100 mg/ml) viene applicata sulla superficie dell’elettrodo di platino. Dopo averlo asciugato, l'elettrodo viene coperto con una membrana di dialisi (Spectra/Por MWCO 6,000 - 8,000) fissata mediante un anello ad O. Il biosensore viene immerso in Tris-HCI 4 mM (pH 8.30) contenente 0.5 mM di emateina e 0.1 M di cloruro di sodio. Viene quindi polarizzato a 0.0 mV (contro SCE). Si aggiungono alcune aliquote di soluzione standard di sodio idrogeno-carbonato (10 mg/ml) al tampone di misura. I cambiamenti di corrente vengono registrati. Il rapporto tra la concentrazione di idrogencarbonati ed il cambiamento di corrente viene illustrato alla Figura 13.
Esempio n.15
Preparazione del biosensore basato su un elettrodo di lavoro in platino modificato con penicillinasi e con emateina in soluzione.
Una soluzione (2 μΙ, 100 mg/ml) di penicillinasi (EC 3.5.2.6, Sigma, Cat. No P-0389) viene applicata sulla superficie dell'elettrodo di platino. Dopo averio asciugato a temperatura ambiente, l'elettrodo viene coperto con una membrana di dialisi (Spectra/Por® MWCO 6,000 - 8,000) fissata mediante un anello ad O. Il biosensore viene quindi immerso in tampone fosfato 1 mM (pH= 7.5) contenente emateina 0.5 mM e cloruro di sodio 0.1 M. Viene quindi polarizzato a 0.0 mV (contro SCE). Si aggiungono poi alcune aliquote di soluzione standard di benzilpenicillina sodica (20 mg/ml) al tampone di misura. I cambiamenti di corrente vengono registrati. La relazione tra la concentrazione di benzilpenicillina ed il cambiamento di corrente è illustrata alla Figura 14.
Esempio n. 16
Preparazione del biosensore per ATP basato su un elettrodo di lavoro in platino modificato con apirasi ed emateina in soluzione.
Una soluzione (2μΙ, 200 mg/ml) di apirasi (EC 3.6.1.5, Sigma, Cat. No A-6132) viene applicata sulla superficie dell’elettrodo in platino. Dopo averlo asciugato a temperatura ambiente, l’elettrodo viene coperto con una membrana di dialisi (Spectra/Por® MWCO 6,000 - 8,000) fissata mediante un anello ad O. Il biosensore viene immerso in Tris-HCI 2 mM (pH = 7.0) contenente 0.5 mM di emateina e 0.25 M di cloruro di sodio. Viene quindi polarizzato a 0.0 mV (contro SCE). Si aggiungono poi varie aliquote di soluzione standard di ATP sale sodico (20 mg/ml) al tampone di misura. I cambiamenti di corrente vengono registrati. Il rapporto tra la concentrazione di ATP ed il cambiamento di corrente è illustrato alla Figura 15.
Esempio n. 17
Preparazione del biosensore per l’urea basato su elettrodo in oro modificato con blu di metilene.
L’elettrodo viene preparato come descritto all’Esempio 3. L'ureasi (3μί, 10 mg/ml) viene applicata sulla superfìcie dell’elettrodo. Dopo averlo asciugato, l’elettrodo viene coperto con una membrana di dialisi (Spectra/Por MWCO 6,000 - 8,000) fissata mediante un anello ad O. Il biosensore viene immerso in tampone fosfato 1 mM (pH = 7.50) contenente cloruro di sodio 0.1 M. Viene quindi polarizzato a -100 mV (contro SCE). Vengono aggiunte alcune aliquote di soluzione standard di urea (5 mg/ml) al tampone di misura. I cambiamenti di corrente vengono registrati. La relazione tra la concentrazione di urea ed il cambiamento di corrente è illustrata alla Figura 16.

Claims (17)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Un sistema biosensore amperometrico per la determinazione di analiti che comprende: a) almeno un biocatalizzatore che per reazione con l'analita provoca una variazione di pH; b) almeno un composto che esibisce diverse proprietà redox nelle sue forme protonizzata e non-protonizzata (composti redox pH-sensibili); c) un elettrodo di lavoro; d) un elettrodo di riferimento. essendo detti elettrodi collegati ad un amperometro.
  2. 2. Il sistema biosensore secondo la rivendicazione 1, dove detto biocatalizzatore (a) viene scelto nel gruppo composto da enzimi, sinzimi, cellule, componenti cellulari, tessuti, immunoproteine, acidi nucleici, e loro estratti, loro frazioni, loro frammenti, loro omogenati, loro lisati.
  3. 3. Il sistema biosensore secondo la rivendicazione 2, dove detto enzima viene scelto nel gruppo composto da idrolasi, ossidoreduttasi, trasferasi, iiasi, ligasi.
  4. 4. Il sistema biosensore secondo la rivendicazione 2, dove detto enzima viene scelto nel gruppo composto da fosforilasi, decarbossilasi, esterasi, fosfatasi, deaminasi.
  5. 5. Il sistema biosensore secondo la rivendicazione 2, dove detto enzima viene scelto nel gruppo composto da ureasi, ossaiacetato decarbossilasi, glucosio ossidasi, anidrasi carbonica, penicillinasi, apirasi.
  6. 6. Il sistema biosensore secondo le rivendicazioni 1-5, dove detto composto redox pH-sensibile (b) viene scelto nel gruppo composto da idrocarburi ciclici, contenenti da 4 a 30 atomi di carbonio e sostituiti con almeno un gruppo selezionato tra
    sono catene di idrocarburi eventualmente ulteriormente sostituite, oppure nel gruppo dei composti eterociclici contenenti da 3 a 30 atomi di carbonio ed uno o più eteroatomi selezionati tra essendo tali composti eventualmente sostituiti preferibilmente con un gruppo
    , 2 , , 2
  7. 7. Il sistema biosensore secondo le rivendicazioni 1-6, dove detto composto redox pH-sensibile (b) è in forma di monomero, oligomero o polimero.
  8. 8. Il sistema biosensore secondo le rivendicazioni 1-7, dove detto composto redox pH-sensibile (b) viene scelto tra gli indicatori di pH, i coloranti fenossazinici e fenotiazinici, e gli antiossidanti naturali.
  9. 9. Il sistema biosensore in base alla rivendicazione 8, dove detto composto redox pH-sensibile (b) viene selezionato tra ematossillina, emateina, blu di metilene, quercitina, flavonoidi, alchil gallati, ortofenilendiammina, oppure para-fenilendiammina polimerizzate.
  10. 10. Il sistema biosensore secondo le rivendicazioni 1-9, dove detto elettrodo di lavoro (c) è un elettrodo composito di platino, d'oro, di mercurio o di grafite vetrosa. ,
  11. 11. Il sistema biosensore in base alle rivendicazioni 1-10, dove detto elettrodo di riferimento (d) è selezionato nel gruppo composto da elettrodi Ag/AgCI ed a calomelano.
  12. 12. Un metodo di determinazione di analiti caratterizzato dall'uso di un sistema biosensore come descritto nelle rivendicazioni 1-11.
  13. 13. Metodo secondo la rivendicazione 12, dove detto metodo consiste in: a) sistemare gli elettrodi in una soluzione di misura; b) applicare un potenziale adeguato tra gli elettrodi; c) misurare una corrente di base; d) aggiungere alla soluzione il campione contenente l’analita da determinare; e) misurare un cambiamento di corrente che è proporzionale alla concentrazione dell'analita; f) eventualmente sottrarre il cambiamento di corrente misurato con un elettrodo di bianco dal valore ottenuto in (e).
  14. 14. Metodo secondo la rivendicazione 12, dove detto metodo consiste in: a) applicare un potenziale adeguato tra gli elettrodi; b) misurare una corrente di base; c) mettere il campione contenente l’analita in contatto con il sistema biosensore; d) misurare un cambiamento di corrente che è proporzionale alla concentrazione dell'analita; e) eventualmente sottrarre il cambiamento di corrente misurato con un elettrodo di bianco dal valore ottenuto in (d).
  15. 15. Metodo secondo la rivendicazione 12, dove il biocatalizzatore contenuto nel sistema biosensore viene selezionato tra i biocatalizzatori che vengono inibiti da detto analita, detto metodo essendo consistente in: a) sistemare gli elettrodi in una soluzione di misura; b) applicare un adeguato potenziale tra gli elettrodi; c) aggiungere il substrato di detto biocatalizzatore alla soluzione di misura; d) misurare una corrente di base; e) aggiungere alla soluzione il campione contenente l’analita-inibitore da determinare; f) misurare un cambiamento di corrente che è proporzionale alla concentrazione dell'inibitore di analita; g) eventualmente, sottrarre dal valore ottenuto in f) il cambiamento di corrente misurato con l’elettrodo di bianco.
  16. 16: Metodo secondo la rivendicazione 12, dove il biocatalizzatore contenuto nel sistema biosensore viene selezionato tra i biocatalizzatori che vengono inibiti da detto analita, detto metodo essendo consistente in: a) applicare un potenziale adeguato tra gli elettrodi; b) aggiungere il substrato di detto biocatalizzatore; c) misurare una corrente di base; d) mettere il sistema a contatto con il campione che contiene l’anallta che deve essere determinato; e) misurare un cambiamento di corrente, che è proporzionale alla concentrazione dell'inibitore-analita; eventualmente, sottrarre dal valore ottenuto in e) il cambiamento di corrente misurato con un elettrodo di bianco.
  17. 17. Uso del sistema biosensore descritto nelle rivendicazioni 1-11 per la determinazione amperometrica di analiti nella diagnostica umana e veterinaria, nei processi industriali, nel controllo qualità di alimenti e mangimi, nel’industria farmaceutica e nel monitoraggio ambientale.
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