JPH0627108A - 新規標識薬物ハプテン類似体を用いるイムノアッセイ - Google Patents
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Abstract
ン類似体を用いるイムノアッセイに向けられている。
(A)アミンもしくはスルフヒドリル基を有する、イム
ノアッセイに用いられるタイプの標識、(B)ヒダント
イン核もしくはバルビツレート核より選ばれる薬物ハプ
テン核、及び(C)薬物ハプテン核の3位をカルボニル
橋を介して標識に連結する連結鎖。 【効果】 標識薬物類似体類を含む要素を用いて行われ
る競合イムノアッセイは、通常治療を目的とする薬物濃
度範囲において、反射濃度変化を十分に示す。上記標識
薬物ハプテン類似体は、加水分解に対して安定である。
Description
ムノアッセイに関する。
ッセイは、臨床化学における分析技術として広範な使用
が見い出されている。反応の特異性により、それらは、
生物学的流体中に非常に低濃度で存在する生物学的被検
体を定量する際に特に都合が良い。このような被検体と
しては、例えば、抗体類、治療薬物類、麻酔薬類、酵素
類、ホルモン類及びタンパク質類等が挙げられる。
免疫適格誘導体類及びリガンドの類似体類を含む標識リ
ガンドが、所定量の適当なバインディング材料(本明細
書ではレセプターと称される)を用いる反応において、
未標識リガンドと競合して存在する。未知濃度のリガン
ドは、結合もしくは未結合(すなわち、遊離)の標識リ
ガンドのどちらか一方のシグナルを測定することより求
めることができる。反応は以下のように進行する。
素類、色素原類、蛍光団類、安定遊離基類及び酵素のコ
ファクター類、阻害剤類並びにアロステリックエフェク
ター類が挙げられる。
(例えば、フェノバルビタール及びフェニトイン)につ
いてのイムノアッセイは、固定化抗体バインディング部
位について、患者血清中の薬物とこのような薬物ハプテ
ンの酵素標識類似体との競合に基づくことができる。
称することが多い)についての特定の必要条件は、1)
少なくとも65%のLDHが過剰の固定化抗体により結
合されうること;2)固定化抗体についてのLDHの親
和性が、所定量のLDHと薬物との競合が治療に関連し
た薬物濃度範囲で発生するようなものであること;及び
3)保存条件下におけるその酵素標識の加水分解に対す
るLDHの安定性;を含む。
は、1)酵素標識との結合後の固定化抗体に対する類似
体の接近しやすさ;2)薬物に対する抗体による、LD
H類似体の特異的認識能;及び3)酵素活性に悪影響を
与えない条件下、直接又は酵素もしくは類似体の活性化
後のどちらかに、酵素標識を担持する類似体が有する十
分な反応性;を含む。
開示されたグルコースオキシダーゼ(GOD)及びアル
カリ性ホスファターゼ(ALP)酵素標識結合フェノバ
ルビタール及びフェニトインハプテン類似体類は、所望
のフォーマットで有効な競合イムノアッセイを遂行する
のに適切な酵素標識類似体を提供した。
サビペルオキシダーゼ(HRP)を用いる場合に、上記
特許に開示された標識フェノバルビタール及びフェニト
イン類似体類が、競合イムノアッセイを遂行するのに不
十分であることが課題である。このような類似体とHR
P間のカプリング反応は、緩慢かつ不完全であった。更
に、フェノバルビタール及びフェニトインHRP標識は
非常に弱い結合であったので、判読可能なシグナルを得
るのに非常に高濃度の標識もしくは抗体結合部位が必要
とされるであろう。
求項1に従う薬物のイムノアッセイ方法を提供する。上
記方法に有用な標識薬物ハプテン類似体類は、次式に従
うそれらの態様を含む。
1〜10個のアルキル、未置換もしくは置換フェニルを
表し、R2 ,R4 ,R5 及びR6 は、各々独立して、C
1 〜C10のアルキレンもしくは少なくとも1つ以上のエ
ステル基、アミド基、−O−,−S−、及び−NR─を
割り込ませたこのようなアルキレン基を表し、R3 は、
C1 〜C3 のアルキレンを表し、Zは、−O−,−S
−、及び−NR─(ここで、Rは、水素もしくはC1 〜
C 6 のアルキル、例えば、メチルプロピル及びヘキシル
を表す)を表し、mは、0,1もしくは2でありnは、
0,1もしくは2でありm+n>0、そしてm,n及び
R2 に含まれる原子の総数が5〜40であり、標識は、
酵素であり、そして更に、(i)少なくとも1つのR1
基が置換もしくは未置換フェニルであり、(ii)R4 ,
R5 及びR6 の1つがフェニレンであってもよく、(ii
i )構造Iの角型括弧成分類が、いずれかの順序でそこ
に表示でき、そして(iv)連結基が、炭素原子数2〜1
2個の飽和もしくは不飽和モノカルボン酸の誘導体以外
のものであることを条件とする。
有用な薬物ハプテン類似体類は、下記を含んで成るもの
である。(a)活性エステル基、例えば、スクシンイミ
ドオキシカルボニル、(b)ヒダントインもしくはバル
ビツレート誘導体類より選ばれる核、及び(c)活性エ
ステル基をヒダントイン核もしくはバルビツレート核に
連結する連結鎖(ここで、連結鎖は、先に定義のとおり
である)。
規薬物ハプテン類似体類は、次式に従うものである。
びにそれらに関連する条件は、先に定義のとおりであ
り、そしてR7 は、エチレンもしくはo−フェニレン基
である。
ムノアッセイに用いられる標識類似体類を製造するのに
用いられる。ヒダントイン核と活性エステル基の間に短
い連結鎖を有するこれらのヒダントイン誘導体類の活性
エステルは、ほんの数種の固定化抗体との使用に際して
受け入れられる酵素標識を製造する場合には、HRPと
十分に反応性であった。活性エステル基とヒダントイン
核の間に8〜20個の原子から成る長い連結基(R2 に
加えて角型括弧基)を担持する誘導体類は、試験される
すべての固定化抗体により結合できる標識を提供した。
連結鎖中の各Zが、隣接するカルボニルとアミド基を形
成する−NR−であるような鎖は、Zが隣接するカルボ
ニルとエステル基を形成するため、Zが−o−もしくは
−s−であるような鎖よりも、加水分解に対して耐性で
あるので、このような鎖を含むヒダントイン誘導体類
は、特に有用である。
ントイン化合物類の下位分類、が製造される下記製造方
法に従って製造できる。
{4−〔2−(3−スクシンイミドオキシカルボニルプ
ロピオニルオキシ)エチルアミノカルボニル〕ブチル}
ヒダントインの製造。
(2−ヒドロキシエチルアミノカルボニル)ブチル〕ヒ
ダントインの製造。
−(4−カルボキシブチル)−5,5−ジフェニル−
2,4−イミダゾリジンジオン(3.52g,0.01
モル)、塩化チオニル(20mL)、N,N−ジメチルホ
ルムアミド(2滴)及びクロロホルム(50mL)の混合
物を、室温で3時間攪拌した。減圧下、ロータリーエバ
ポレーターで溶剤を除去して、そしてこの生成物を次の
パートBに直接用いた。
反応させる。クロロホルム(50mL)中の酸塩化物を、
クロロホルム100(mL)中エタノールアミン(1.2
g,0.02モル)、及びトリエチルアミン(2.4
g,0.024モル)の混合物に15分間かけて滴下し
た。次いで混合物を60℃で2時間加熱し、そして室温
で1時間攪拌した。次いでその溶液を5%塩酸(100
mL×2)で洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液(10
0mL)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥して濾過
し、そして溶剤をロータリーエバポレーターで除去し
た。次いで濾液を酸化アルミニウムカラムを用いるクロ
マトグラフィーにかけ、TLC上に1つのスポットを示
す物質(3.0g)を得た。この物質を次の製造方法に
直接使用した
シプロピオニルオキシ)エチルアミノカルボニル〕ブチ
ル}−5,5−ジフェニルヒダントインの製造。クロロ
ホルム(100mL)中工程1のヒドロキシ化合物(3.
0g,0.0075モル)、無水コハク酸(1.0g,
0.01モル)及びジメチルアミノピリジン(0.9
g,0.0075モル)を50〜60℃で4時間加熱
し、そして週末の間に室温まで冷却した。
して混合物を5%塩酸溶液(100mL×3)で洗浄し、
飽和塩化ナトリウム溶液(100mL)で洗浄し、無水硫
酸マグネシウムで乾燥して濾過し、そして溶剤を除去し
てTLC上に1つのスポットを与える物質を得た。
−{4−〔2−(3−スクシンイミドオキシカルボニル
プロピオニルオキシ)エチルアミノカルボニル〕ブチ
ル}ヒダントインの製造。
(3.0g,0.006モル)、N,N′−ジシクロヘ
キシルカルボジイミド(1.5g,0.007モル)及
びN−ヒドロキシスクシンイミド(0.7g,0.00
6モル)の混合物を室温で20時間攪拌した。その混合
物を濾過し、そして減圧下ロータリーエバポレーターで
濾液を濃縮した。次いで残渣をシリカを用いるクロマト
グラフィーにかけ、生成物を1.3g得た(収率40
%)。C30H32N4 O9 についての分析計算値:C,6
0.8;H,5.44;N,9.45。実験値:C,5
9.6;H,5.51;N,8.91。
{4−〔4−(3−スクシンイミドオキシカルボニルプ
ロピオニル)−1−ピペラジニルカルボニル〕ブチル}
−2,4−イミダゾリジンジオンの製造。
ピペラジニルカルボニルブチル)ヒダントインの製造。
ジルオキシカルボニルピペラジニルカルボニル)ブチ
ル〕−5,5−ジフェニル−2,4−イミダゾリジンジ
オンを製造した。上記HD1の製造のパートAに記載さ
れるように製造した酸塩化物(0.01モル)を、クロ
ロホルム(50mL)中ベンジル1−ピペラジンカルボキ
シレート(2.4g,0.011モル)及びトリエチル
アミン(2.0g,0.02モル)の混合物に、15分
間かけて滴下した。この混合物を室温で一晩攪拌し、そ
してジクロロメタン(300mL)を添加した。その混合
物を5%塩酸(100mL×2)で洗浄し、希炭酸ナトリ
ウム溶液(100mL)で洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶
液(100mL)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥
し、濾過し、そして減圧下ロータリーエバポレーターで
溶剤を除去した。次いで濾液をクロマトグラフィーにか
け、油状物4.3gを得た(収率78%)。これを次の
工程に直接使用した。
0.008モル)及び30〜35%臭化水素酢酸溶液
(25mL)を室温で1.5時間攪拌した。次いでこの混
合物をジエチルエーテル(1L)に注ぎ入れ、そして分
離した油状物を新たなエーテル(1L×3)で摩砕し
た。その油状物を10%水性水酸化ナトリウム溶液(pH
=14)に溶解し、そして水性溶液をジクロロメタン
(100mL×4)で抽出した。合わせた有機溶液を飽和
塩化ナトリウム溶液(150mL)で洗浄し、無水硫酸マ
グネシウムで乾燥し、濾過し、そして減圧下、ロータリ
ーエバポレーターで溶剤を除去した。濾液を凝固させる
と白色固体が得られた(2.6g,収率77%)。この
物質を次の工程に直接用いた。
シプロピオニル)−1−ピペラジニルカルボニル〕ブチ
ル}−5,5−ジフェニル−2,4−イミダゾリジンジ
オンの製造。
のアミン(2.1g,0.005モル)及び無水コハク
酸(0.54g,0.0054モル)を50〜60℃で
30分間加熱し、そして周囲温度で20時間放置した。
ジクロロメタン(150mL)を添加し、そして混合物を
5%塩酸(100mL×2)で洗浄し、飽和塩化ナトリウ
ム溶液(100mL)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで
乾燥し、濾過し、そして減圧下ロータリーエボパレータ
ーで溶剤を除去したところ、白色固体2.5g(95
%)が得られ、これを次の工程に直接用いた。
−{4−〔4−(3−スクシンイミドオキシカルボニル
プロピオニル)−1−ピペラジニルカルボニル〕ブチ
ル}−2,4−イミダゾリジンジオンの製造。
(1.56g,0.003モル)、N,N′−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド(0.64g,0.003モ
ル)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(0.36g,
0.003モル)の混合物を室温で週末の間攪拌した。
その混合物を濾過し、そして減圧下ロータリーエバポレ
ーターで濾液から溶剤を除去して生成物1.9gを得た
(収率100%)。その固体をクロマトグラフィーにか
け、そして生成物画分をジクロロメタン(200mL)に
溶解し、希炭酸ナトリウム溶液(100mL×2)で洗浄
し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そしてロ
ータリーエバポレーターで溶剤を除去したところ、TL
C上に1つのスポットを与える白色固体が得られた。
{4−〔6−(3−スクシンイミドオキシカルボニルプ
ロピオンアミド)ヘキシルアミノカルボニル〕ブチル}
−2,4−イミダゾリジンジオンの製造。
アミノカルボニル)ブチル〕−5,5−ジフェニル−
2,4−イミダゾリジンジオンの製造。
シカルボニルアミノヘキシルアミノカルボニル)ブチ
ル〕−5,5−ジフェニル−2,4−イミダゾリジンジ
オンの製造。 HD1の製造で中間体として生成される酸塩化物を、H
D2の製造の工程1に記載の方法により、N−ベンジル
オキシカルボニル−1,6−ヘキサンジアミンで処理し
たところ、保護アミン7.5g、収率85%が得られ
た。
2の製造の工程1、パートBの方法により臭化水素酸−
酢酸で処理したところ遊離アミンが得られ、精製するこ
となくそれを工程2に用いた。
シプロピオンアミド)ヘキシルアミノカルボニル〕ブチ
ル}−5,5−ジフェニル−2,4−イミダゾリジンジ
オンの製造。 この化合物を、HD2の製造の工程2と同様の方法を用
いて製造した。
−{4−〔6−(3−スクシンイミドオキシカルボニル
プロピオンアミド)ヘキシルアミノカルボニル〕ブチ
ル}−2,4−イミダゾリジンジオンの製造。
を用いて製造したところ、生成物2.6gを得た(収率
80%)。融点133〜134℃。C34H41N5 O8 に
ついての分析計算値:C,63.05;H,6.38;
N,10.81。実験値:C,62.91;H,6.4
1;N,10.69。
バルビツレート薬物ハプテン類似体類の製造を具体的に
説明するものである。一般的には、類似体類は、(1)
バルビツレート誘導体、例えば、フェノバルビタール
を、オメガ−ハロアルカンカルボキシレートエステルと
縮合させる工程、(2)そのエステルを、対応する酸に
ケン化させる工程、(3)その酸を、対応する酸塩化物
に転化させる工程、及び(4)酸塩化物をN−ヒドロキ
シスクシンイミドと縮合させる工程、又は更に長い連結
鎖を得るために、ブロックされたアミンもしくはヒドロ
キシ基を1つ有するジアミン、ジオールもしくはアミノ
アルコールと縮合させる工程、(5)ブロックを取り除
き、ジカルボン酸、例えばコハク酸と縮合させ、次いで
N−ヒドロキシスクシンイミドと縮合させて、類似体を
製造する工程、により製造される。
オールもしくはアミノアルコールと縮合させ、次いで別
の二酸を一回もしくは2回以上繰り返し処理して、連結
鎖を更に長くできる。しかしながら、同様の製造が、よ
り長い鎖の二酸類、ジオール類、ジアミン類、アミノア
ルコール類もしくはハロアルカンカルボキシレートエス
テル類を用いることにより、より少ない工程で達成でき
る。
1−{4−〔4−(3−スクシンイミドオキシカルボニ
ルプロピオニル)−1−ピペラジニルカルボニル〕ブチ
ル}−2,4,6(1H,3H,5H)−ピリミジント
リオンの製造。
−(4−メトキシカルボニルブチル)−5−フェニル−
2,4(3H,5H)−ピリミジンジオンの製造。 ジクロロメタン(500mL)中フェノバルビタール(4
6.5g,0.2モル)及び水酸化テトラブチルアンモ
ニウム(500mL、0.2モル、0.4M水溶液)の混
合物を製造し、そしてそれに5−ブロモ吉草酸メチル
(39.0g,0.2モル)を添加した。その反応混合
物を一晩(20時間)激しく攪拌した。この混合物に、
飽和塩化ナトリウム溶液(100mL)を添加し、有機層
を分離し、そして水性溶液をジクロロメタン(100mL
×2)で洗浄した。合わせた有機溶液を飽和塩化ナトリ
ウム溶液(100mL)で洗浄し、無水MgSO4 で乾燥
し、濾過し、そして溶剤を除去した。
5−エチル−6−ヒドロキシ−5−フェニル−2,4
(3H,5H)−ピリミジンジオンの製造。 ジオキサン(500mL)中の工程1の5−エチル−6−
ヒドロキシ−3−(4−メトキシカルボニルブチル)−
5−フェニル−2,4(3H,5H)−ピリミジンジオ
ンエステル(54.0g,0.156モル)、濃塩酸
(55mL)及び水(55mL)の混合物を4時間加熱還流
し、そして室温で一晩放置した。ジオキサンを減圧下で
除去し、そして飽和塩化ナトリウム溶液(250mL)及
びジクロロメタン(400mL)を残渣に加えた。有機層
を分離し、そして水性溶液をジクロロメタン(150mL
×3)で抽出した。合わせた有機溶液を飽和塩化ナトリ
ウム溶液(200mL)で洗浄し、無水MgSO4 で乾燥
し、濾過し、そして溶剤を取り除いた。残渣にジエチル
エーテルを添加し、そしてその混合物を週末の間−16
℃の冷凍庫に置き、次いで濾過した。
ル)−5−エチル−5−フェニル−2,4,6(1H,
3H,5H)−ピリミジントリオンの製造。 製造2由来の酸(6.6g,0.2モル)、塩化チオニ
ル(50mL)、N,N−ジメチルホルムアミド(2滴)
及びクロロホルム(80mL)の混合物を室温で1.5時
間攪拌した。減圧下ロータリーエバポレーターで溶剤を
除去し、そしてこの生成物を次の工程4に直接用いた。
カルボニル−1−ピペラジニルカルボニル)ブチル〕−
5−エチル−5−フェニル−2,4,6(1H,3H,
5H)−ピリミジントリオンの製造。 クロロホルム(75mL)中工程3の酸塩化物(0.2モ
ル)を、クロロホルム(100mL)中ベンジル1−ピペ
ラジンカルボキシレート(6.0g,0.030モル)
及びトリエチルアミン(4.0g,0.04モル)の混
合物に15分間かけて滴下した。この混合物を室温で2
0時間攪拌し、次いでジクロロメタン(300mL)を添
加した。その混合物を10%塩酸溶液(100mL×3)
で洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液(100mL)で洗浄
し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そして溶
剤を除去した。次いで残渣をSiO2 でのクロマトグラ
フィーにかけて固体を得た。
〔4−(1−ピペラジニルカルボニル)ブチル〕−2,
4,6(1H,3H,5H)−ピリミジントリオンヒド
ロブロミドの製造。 製造4由来の保護アミン(6.5g,0.012モル)
及び30〜35%臭化水素酢酸溶液(30mL)を室温で
1.5時間攪拌した。次いでその混合物を酢酸エチル
(2L)中に注ぎ入れ、1時間攪拌し、濾過し、そして
固体を酢酸エチル500mLで洗浄した。
シプロピオニル)−1−ピペラジニルカルボニル〕ブチ
ル}5−エチル−5−フェニル−2,4,6(1H,3
H,5H)−ピリミジントリオンの製造。 クロロホルム(150mL)中、工程5のアミン(4.8
g,0.01モル)、無水コハク酸(1.2g,0.0
12モル)及びトリエチルアミン(2.2g,0.02
モル)を、50〜60℃で30分間加熱し、(温水)そ
して周囲温度で16時間攪拌した。ジクロロメタン(2
00mL)を添加し、その混合物を10%塩酸溶液(10
0mL×3)で洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液(100
mL)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過
し、そして減圧下ロータリーエバポレーターで溶剤を除
去すると、白色固体3.3gが得られた(収率66
%)。この物質をSiO2 カラムを用いるクロマトグラ
フィーにかけたところ、白色固体が得られた。
{4−〔4−(3−スクシンイミドオキシカルボニルプ
ロピオニル)−1−ピペラジニルカルボニル〕ブチル}
−2,4,6(1H,3H,5H)−ピリミジントリオ
ンの製造。
(3.4g,0.007モル)、N,N′−ジシクロヘ
キシルカルボジイミド(1.6g,0.008モル)及
びN−ヒドロキシスクシンイミド(1.0g,0.00
8モル)を室温で20時間攪拌した。その混合物を濾過
し、そして酢酸エチル(100mL)を添加した。その有
機溶液を水(100mL×2)で洗浄し、飽和塩化ナトリ
ウム溶液(50mL)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで
乾燥し、濾過し、そして減圧下ロータリーエバポレータ
ーで溶剤を除去した。固体部分をクロマトグラフィーに
かけたところ、白色固体が得られた。
2−(4−スクシンイミドオキシカルボニルブチル−
2,4,6(1H,3H,5H)−ピリミジントリオン
の製造。
4、工程7の方法を用いてこの物質を製造した。その物
質をエチルエーテル/酢酸エチル(1:1)から結晶化
したところ、白色固体が得られた。
1−{4−〔2−(3−スクシンイミドオキシカルボニ
ルプロピオニルオキシ)エチルアミノカルボニル〕ブチ
ル}−2,4,6(1H,3H,5H)−ピリミジント
リオンの製造。
ドロキシエチルアミノカルボニル)ブチル〕−5−フェ
ニル−2,4,6(1H,3H,5H)−ピリミジント
リオンの製造。 ベンジル1−ピペラジンカルボキシレートの代わりに2
−ヒドロキシエチルアミンを用いる以外は、製造例4の
工程4に概説されたようにこの物質を製造した。
シプロピオニルオキシ)エチルアミノカルボニル〕ブチ
ル}−5−エチル−5−フェニル−2,4,6(1H,
3H,5H)−ピリミジントリオンの製造。 クロロホルム(100mL)中、工程1由来の生成物
(2.9g,0.007モル)、無水コハク酸(0.7
g,0.007モル)及びジメチルアミノピリジン
(0.9g,0.007モル)を温水(50〜60℃)
で30分間加熱し、次いで室温で3日間攪拌した。ジク
ロロメタン(300mL)を添加し、そして混合物を10
%塩酸溶液(100mL×2)で洗浄し、飽和塩化ナトリ
ウム溶液(100mL)で洗浄し、無水硫酸マグネシウム
で乾燥し、濾過し、そして溶剤を除去したところ、油状
物が得られ、それを次の工程に直接用いた。
ル−1−{4−〔2−(3−スクシンイミドオキシカル
ボニルプロピオニルオキシ)エチルアミノカルボニル〕
ブチル}−2,4,6(1H,3H,5H)−ピリミジ
ントリオンの製造。
例4の工程7に概略された方法を用いて、この物質を製
造した。
1−{4−〔3−(3−スクシンイミドオキシカルボニ
ルプロピオンアミド)プロピルアミノカルボニル〕ブチ
ル}−2,4,6(1H,3H,5H)−ピリミジント
リオンの製造。
カルボニルアミノプロピルアミノカルボニル)ブチル〕
−5−エチル−5−フェニル−2,4,6(1H,3
H,5H)−ピリミジントリオンの製造。 ベンジル1−ピペラジンカルボキシレートの代わりにN
−ベンジルオキシカルボニル−1,3−プロパンジアミ
ンを用いる以外は、製造例4の工程4に概略された方法
を用いてこの物質を製造し、そして粗物質を次の工程に
用いた。
アミノカルボニル)ブチル〕−5−エチル−5−フェニ
ル−2,4,6(1H,3H,5H)−ピリミジントリ
オンヒドロブロミドの製造。 製造例4の工程5のようにこの物質を製造した(本例の
工程1のアミドを用いて開始し、エチルエーテル中に注
ぎ入れた時に油状物が得られたことを除く)。
シプロピオンアミド)プロピルアミノカルボニル〕ブチ
ル}−5−エチル−5−フェニル−2,4,6(1H,
3H,5H)−ピリミジントリオンの製造。 本例の工程2由来のアミンを用いて開始し、酸が得られ
たこと以外は、製造例4の工程6の方法により、この物
質を製造した。
ル−1−{4−〔3−(3−スクシンイミドオキシカル
ボニルプロピオンアミド)プロピルアミノカルボニル〕
ブチル}−2,4,6(1H,3H,5H)−ピリミジ
ントリオンの製造。
は、製造例4の工程7の方法を用いてこの物質を製造し
た。
1−{4−〔6−(3−スクシンイミドオキシカルボニ
ルプロピオンアミド)ヘキシルアミノカルボニル〕ブチ
ル}−2,4,6(1H,3H,5H)−ピリミジント
リオンの製造。
1,3−プロパンジアミンの代わりにN−ベンジルオキ
シカルボニル−1,6−ヘキサンジアミンを使用し、そ
してその後の製造例7の工程2,3及び4では各々反応
生成物を用いること以外は、製造例7の反応順序に従っ
てこの化合物を製造した。
類、特にフェノバルビタール及びフェニトインについて
の競合イムノアッセイに有用である、先に製造したバル
ビツレート及びヒダントイン類似体類の新規標識薬物ハ
プテン類似体類を製造した。標識類は、競合イムノアッ
セイで被検体もしくは被検体類似体と共に通常用いられ
る、アミンもしくはスルフヒドリル基を担持するイムノ
アッセイで常用されるもの、例えば、酵素類、可視色素
類、ロイコ色素類、蛍光色素類及び放射性物質類等であ
る。
性ホスファターゼ(ALP)、グルコースオキシダーゼ
(GOD)及び西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)
である。
含んで成る新規方法を用いて製造される。 1)求核基、例えばアミンもしくはスルフヒドリル基を
表面上に担持する標識を、過剰の上記バルビツレートも
しくはヒダントイン薬物ハプテン類似体と接触させる工
程。好ましくは類似体及び標識を水混和性有機溶剤、例
えば、N,N−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホ
キシド(DMSO)もしくは溶剤及び水の混合物に溶解
し(緩衝化)、その後一緒に混合する工程、及び 2)未使用活性エステル及び縮合副生成物を、好ましく
は透析により取り除く工程。
の新規標識類似体類の製造方法を具体的に説明するもの
である。標識類似体類は、フェニントイン及びフェノバ
ルビタール薬物ハプテン類似体類を用いて製造した。
結鎖、標識AHRP−HD1、標識Aを含む)の製造。
アセトアニリドを含む乾燥DMF(DMF 4′−H
A)1.452mLに溶解した。
28号明細書に記載のように製造し、またその内容は、
引用することにより本明細書に組み入れられる。簡単に
いえば、乾燥HRPを0.1モルMES緩衝液、pH5.
5に溶解して、緩衝液10mL中の最終濃度が2.5×1
0-6モル(100mg)となるようにした(MES=2−
(N−モルホリノ)エタンスルホン酸)。伝統的なファ
クターA403 1mg/mL=2.24を用いてA403 測定法
によりタンパク質濃度を求めた。HRP溶液を、0.1
モルMES緩衝液、pH5.5、10mL中に溶解したL−
リジン一塩酸塩1.5×10-3モル(275mg)と合わ
せた。新たに調整したMES緩衝液中1−エチル−3−
(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩
(EDC、5×10-4モル、960mL)の溶液を添加し
た。容器にフタをし、そして室温で一晩混合した。その
反応生成物を再び0.02モルMOPS緩衝液pH7.0
(3L、10℃)で透析した。透析緩衝液を3回変え
た。MOPS=3−(N−モルホリノ)プロパンスルホ
ン酸。
を、30,000NMWL(呼称分子量制限分離)セン
トリセル(Centricells)遠心用ウルトラフ
ィルターを用いて、MOPS緩衝液から0.1モルEP
PS緩衝液、pH8.0に交換した。次いで、この試料を
希釈して、最終濃度10mg/mLの溶液を得た。
ジメチルホルムアミド中4′−ヒドロキシアセトアニリ
ドの10ミリモル溶液(DMF 4′−HA)500μ
Lと、ボルテックスで混合しながら合わせ、次いでそれ
を42℃の水浴中に設置した。乾燥DMF 4′−HA
溶液1.452mL中にHD1を21mg溶解することによ
り調整したHD1溶液(500μL)を、ボルテックス
で混合しながらAHRPに滴下したので、フェニトイン
/HRPのモル比は、50/1となった。その反応混合
物を、42℃の水浴中で穏やかに振動させながら1時間
インキュベーションした。
2透析管に入れ、更なるDMF 4′−HA/0.1モ
ルEPPS(1:1)0.5mLを用いて反応容器をすす
ぎ、そのすすぎ液も一緒に透析管に入れた。
(1:1)、pH8.0を用いて42℃で1時間、 b)透析条件a)を用いてもう1回繰り返す、 c)2Lの0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含
む0.1モルEPPS、pH8.0を用いて8℃で15時
間 d)2Lの0.1モルEPPS、pH8.0を用いて8℃
で3時間、 e)3Lの0.04モル トリス(ヒドロキシメチル)
アミノメタン塩酸塩(トリスHCl)/0.15モルN
aCl、pH7.5を用いて8℃で3時間、そして f)透析条件e)を用いて3時間、もう1回繰り返す。
rthiolate)(商標)を防腐剤として添加し、
そしてAHRP−HD1を冷蔵保存した。
結合を伴う伸長連結鎖、標識AHRP−HD2、標識B
を含む)の製造。
4′−ヒドロキシアセトアニリドを含む乾燥DMF(D
MF 4′−HA)1.031mLに溶解した。
AHRPの溶液(10mg/mL、0.1モルEPPS溶
液、pH8.0を1mL)を、DMF 4′−HA 500
μLと、ボルテックスで混合しながら合わせ、次いでそ
れを42℃の水浴中に設置した。上記HD2溶液(50
0μL)を、ボルテックスで混合しながらAHRPに滴
下したので、モル比は50/1となった。その反応混合
物を、42℃の水浴中で穏やかに振動させながら1時間
インキュベーションした。
2透析管に入れ、そして以下のように透析した。 a)1LのDMF 4′−HA/0.1モルEPPS
(1:1)、pH8.0を用いて42℃で1時間、 b)透析条件a)を用いてもう1回繰り返す、 c)1.5Lの0.1%BSAを含む0.1モルEPP
S、pH8.0を用いて8℃で1.5時間 d)1.5Lの0.1モルEPPS、pH8.0を用いて
8℃で18時間、 e)1.5Lの0.04モル トリスHCl/0.15
モルNaCl、pH7.5を用いて8℃で2時間、そして f)透析条件e)を用いて4時間、もう1回繰り返す。
標)を防腐剤として添加した。標識ヒダントイン誘導体
を冷蔵庫に保存した。
伸長連結鎖、標識AHRP−HD3、標識Cを含む)の
製造。
−ヒドロキシアセトアニリドを含む乾燥DMF(DMF
4′−HA)1mLに溶解した。
AHRPの溶液を、0.1モルEPPS緩衝液、pH8.
0で透析した。最終濃度が5.71mg/mLとなるように
した。
ながらDMF 4′−HA 500μLと合わせ、次い
でそれを42℃の水浴中に設置した。上記HD3溶液
(500μL)を、ボルテックスで混合しながらAHR
Pに滴下したので、HD3/AHRPのモル比は50/
1となった。その反応混合物を42℃の水浴中で穏やか
に振動させながら1時間インキュベーションした。その
反応混合物をSpectrapor#2透析管に入れ、
更なるDMF 4′−HA/0.1モルEPPS(1:
1)0.5mLを用いて反応容器をすすぎ、そのすすぎ液
も一緒に透析管に入れた。
(1:1)、pH8.0を用いて42℃で1時間、 b)透析条件a)を用いてもう1回繰り返す、 c)1.5Lの0.1%BSAを含む0.1モルEPP
S、pH8.0を用いて5℃で15時間 d)1.5Lの0.1モルEPPS、pH8.0を用いて
8時間、 e)2Lの0.02モル3−モルホリノプロパンスルホ
ン酸(MOPS)、pH7.0を用いて5℃で13時間、
そして f)透析条件e)を用いて2回繰り返す。
標)を防腐剤として添加し、そしてその標識生成物を冷
蔵保存した。
製造を具体的に説明するものである。
AHRP−PB2、標識D)の製造。 PB2をDMSOに溶解して10.7mg/mL溶液(1.
25×10-2モル)を得た。次いでこの溶液の500μ
Lを、ボルテックスで混合しながらアミン富化HRP/
DMSO溶液(AHRP/DMFと同様に調整される)
に滴下した。フェノバルビタール/HRPのモル比は5
0/1であった。
間インキューベーションを行った。その試料をSpec
trapor#2透析管に移し、更に透析後1mLを用い
て反応容器をすすぎ、そのすすぎ液も一緒に透析管に入
れた。標識を0.02モルMOPS緩衝液、pH7.0を
用いて5〜10℃で透析した。この透析条件を、各回と
も2〜3Lの緩衝液を用いて3回繰り返した。透析後、
0.02%メルチオレート(商標)を防腐剤として添加
し、そして標識を冷蔵保存した。
鎖を含むAHRP−PB3、標識E)の製造。 アミン富化HRPを、セントリセル(Centrice
ll)遠心用ウルトラフィルター(30,000呼称分
子量制限)を用いてMOPS緩衝液から0.1モルEP
PS緩衝液、pH8.0に交換した。次いでこの試料を
4.6mL、0.743mg/mLまで希釈した。
5×10-5モル)。10ミリモル4′−ヒドロキシアセ
トアニリドを含むジメチルホルムアミド(Aldric
h22、705〜6)(DMF 4′−HA)500μ
Lをバイアルに添加し、ボルテックスで混合し、そして
42℃の水浴に設置した。
溶解して2.12mg/mL溶液(3.70×10-3モル)
を得た。この溶液500μLを、ボルテックスで混合し
ながらHRP/DMF 4′−HA溶液に滴下した。フ
ェノバルビタール/HRPのモル比は、100/1であ
った。
1時間インキュベーションを行った。その試料をSpe
ctrapor#2透析管に移し、更にDMF 4′−
HA/0.1モルEPPS(1:1)1mLを用いて反応
容器をすすぎ、そのすすぎ液も一緒に透析管に入れた。
(1:1)、pH8.0を用いて42℃で1時間、 b)透析条件a)を用いてもう1回繰り返す、 c)1.5Lの0.1%BSAを含む0.1モルEPP
S、pH8.0を用いて5℃で一晩 d)1.5Lの0.1モルEPPS、pH8.0を用いて
5℃で8時間、 e)2Lの0.02モルMOPS、pH7.0を用いて5
℃で少なくとも8時間、そして f)透析条件e)を用いて2回繰り返す。
標)を防腐剤として添加し、そしてその標識生成物を冷
蔵保存した。
RP−PB1、標識F、アミド結合を伴う伸長連結鎖を
含むフェノバルビタールハプテン類似体の活性エステ
ル)の製造。
EPPS緩衝液、pH8.0に交換して10mg/mLの溶液
(2.5×10-4モル)を得た。標識Fを、アミン富化
HRP5mL(50mg)を用いて製造した。磁気攪拌プレ
ートで攪拌しながら、DMSO 2.5mLをゆっくりと
添加した。その溶液を室温で15分間攪拌した。
9mg/mL溶液を得た。この溶液2.5mLを、HRP/D
MSO溶液に攪拌しながらゆっくり添加した。フェノバ
ルビタール/HRPのモル比は50/1であった。
間インキュベーションを行った。その試料をSpect
rapor#2透析管に移し、更に透析液を用いて反応
容器をすすぎ、そのすすぎ液も一緒に透析管に入れた。
標識を0.02モルMOPS緩衝液、pH7.0を用いて
5〜10℃で透析した。この透析条件を、各回とも3L
の緩衝液を用いて3回繰り返した。透析後、0.02%
メルチオレート(商標)を防腐剤として添加し、そして
標識を冷蔵保存した。
すものである。
識A)を結合する、数種の固定化抗体(DilAs8 ,
DilAs9 ,DilAs14, DilAs16及びDil
As21)の能力を検討する。
れに共有結合した先に同定された型の抗体の1つを担持
する)を、米国特許第081,206号明細書に記載さ
れる方法及び材料を用いて製造した。
する固定化抗体の能力を以下のように測定した。各種の
抗体ビーズを、各々1%BSAを含むPBSで連続的に
希釈して、濃度が500〜0.5ナノモル抗体バインデ
ィング部位となるようにした。ビーズ希釈液を、等量の
10×10-11 モルの標識と混合した。1時間インキュ
ベーション後、遠心によりビーズをペレットにした。上
清のサンプル(100μL)を、基質(o−フェニレン
ジアミン/H2 O2 )100μLと混合した。450nm
での発色速度を標準のものと比較して、溶液中に残存す
るフェニトイン−HRP標識の量を計算した。抗体最高
濃度(250ナノモル バインディング部位)で試験さ
れた固定化抗体に結合した標識の量を報告する。
−HD1標識(標識A)を確実に認識することを示して
いる。
合を有する本発明の標識フェニトイン誘導体、AHRP
−HD2(標識B)の加水分解安定性を具体的に説明す
るものである。
d)抗体を担持するビーズを、米国特許第081,20
6号明細書に記載されるように製造した。
もしくは8.5に調整した1%BSAを含むPBSで1
×10-10 モルとなるまで希釈した。その標識を室温で
6日間インキュベーションした。その標識を、2日後及
び6日後に、固定化抗体によるバインディングについ
て、以下のように試験した。
−2抗体ビーズを、1%BSAを含むPBSで連続的に
希釈して、濃度が500〜0.50ナノモル抗体バイン
ディング部位となるようにした。ビーズ希釈液を、等量
の10×10-11 モルの標識と混合した。1時間インキ
ュベーション後、遠心によりビーズをペレットにした。
上清のサンプル(100μL)を、基質(o−フェニレ
ンジアミン/H2 O2)100μLと混合した。速度を
標準のものと比較して、溶液中に残存する標識の量を計
算した。抗体最高濃度(250ナノモル バインディン
グ部位)で試験された固定化抗体に結合した標識の量を
報告する。
含むAHRP−HD2(標識B)のバインディングが、
この時間内で全く分解を示さなかったことを示してい
る。これは、標識Bが加水分解による分解に耐性である
であろうことを示す。このような加水分解は、経過時間
に対応するアッセイ応答の変動の原因となったであろ
う。
て製造されたフェノバルビタール−HRP標識の比較。 本例では、吉草酸エステル連結鎖を担持する標識(標識
D、AHRP−PB2)及び伸長連結鎖を担持する標識
(標識F、AHRP−PB1)を結合する、数種の固定
化抗体(Kall 1571及びPbAs9 )の能力を
比較した。
造した。ポリマービーズ(30mg)〔ポリ(スチレン−
コ−P−ビニルベンジル2−クロロエチルスルホン)
(モル比95:5)〕を、緩衝液(0.1モルEPP
S、pH8.5)1mLに分散し、そして抗体(Kall
1571もしくはPbAs9)0.3mgを添加した。総
容量を1.5mLにした。その混合物を室温で4時間転倒
回転させた。次いで、BSAの10%溶液0.3mLを添
加し、そして上清を取り除き、抗マウスIgGを用いて
未結合抗体について分析した。表面上に結合した抗体の
量をELISAを用いて計算した。そのペレットを、P
BS、pH7.2を用いて、緩衝液への再懸濁及び遠心に
より3回洗浄した。最終再分散液をPBS1.8mLで調
整し、メルチオレート(商標)を0.02%の濃度で添
加し、そして生成物を使用するまで4℃で保存した。
ように測定した。各種の抗体ビーズを、各々1%BSA
を含むPBSで連続的に希釈して、濃度が200〜0.
50ナノモル抗体バインディング部位となるようにし
た。ビーズ希釈液を、等量の10×10-11 モルのフェ
ノバルビタール−HRP標識と混合した。1時間インキ
ュベーション後、遠心によりビーズをペレットにした。
上清のサンプル(100μL)を、基質(o−フェニレ
ンジアミン/H2 O2 )100μLと混合した。450
nmでの発色速度を標準のものと比較して、溶液中に残存
するフェノバルビタール−HRP標識の量を計算した。
抗体最高濃度(100ナノモル バインディング部位)
で試験された固定化抗体に結合した標識の量を報告す
る。
標識薬物ハプテン類似体類に用いられる伸長連結基を担
持するハプテン類を用いて製造された標識類に対して、
これらの抗体の認識が改良されることを示している。伸
長連結鎖を備えたハプテンを用いることで、これらの抗
体がフェノバルビタール酵素イムノアッセイの検出用要
素として考慮されるため、これは、重要な利点を表すも
のである。
ン及びバルビツレート誘導体類に付着できるいずれか適
当な標識を用いて実施できる。前記標識薬物ハプテン類
似体類を製造するのに用いられた西洋ワサビペルオキシ
ダーゼに加えて、有用な標識としては、放射性標識類、
色素類、蛍光発光剤類、別の酵素類、酵素基質類、酵素
阻害剤類、アロステリックエフェクター類、コファクタ
ー類及び別の既知酵素モジュレーター類が挙げられる。
酵素類、例えば、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシ
ダーゼ類、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びア
ミン富化西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホス
ファターゼ、並びにガラクトシダーゼは、好ましい標識
である。
する基質を、要素に存在させるか、又は発色液中それに
添加する。基質は、液状試料の添加前にもしくは同時に
添加してもよく、あるいはバインディング反応の完了後
に添加してもよい。標識を与えるのに適する基質を決定
することは、臨床化学業者の技術範囲内である。基質
は、酵素標識が直接作用する物質であってもよく、又は
標識の酵素反応を伴う一連の反応に関与する物質であっ
てもよい。例えば、酵素標識がペルオキシダーゼであれ
ば、基質は過酸化水素である。或る例として、グルコー
スオキシダーゼを用いる場合には、一般的には基質グル
コースを、付着量0.01モル/m2 、好ましくは0.
001〜0.1モル/m2 となるように、試薬層に存在
させるか、又は発色液に添加する。アッセイに用いられ
る酵素標識の量に関連して、特定の基質の量をどのよう
に調節すればよいのかは、当業者には既知であるだろ
う。
素類、コファクター類、酵素基質類もしくは酵素モジュ
レーター類を用いる場合には、試薬層は、標識の反応の
結果として検出可能な種を提供する試薬を1つ以上含ん
で成る指示組成物を含有する。好ましくは、指示組成物
が、基質と酵素標識リガンド類似体の酵素反応の結果と
して比色定量的に検出可能な種を提供する、比色定量的
指示組成物である。
な色素を生成する単一化合物であってもよく、又は色素
を生成する試薬の組み合わせであってもよい。例えば、
基質としてグルコースが用いられ、そして酵素標識とし
てグルコースオキシダーゼが用いられる場合には、比色
定量的指示組成物は、反応して色素を提供するカプラー
及び酸化可能な化合物を含むことができる。あるいは、
組成物はロイコ色素及びペルオキシダーゼ、もしくはグ
ルコースオキシダーゼがグルコースをグルコン酸に転化
する場合に生成される過酸化水素の生成の結果として検
出可能な色素を生成する別の適当なペルオキシダーゼ様
化合物を含むことができる。有用なロイコ色素類は、当
該技術分野で既知であり、そして例えば、米国特許第
4,089,747号及び同第612,509号明細書
に記載されるものが挙げられる。比色定量的指示組成物
の特定の量及びその各種の成分は、当業者の技術範囲内
である。
ってもよい。一般的には、液体中のリガンドの量は、供
給ロール、チップパケットもしくは別の供給源より要素
を取り出し、そして展開層の一定領域を液体の試料、例
えば1〜100μlと物理的に接触させることによっ
て、測定される。接触させる一定領域は、一般的には約
100mm2 以下である。
を直接検出するのに適した装置、又は酵素標識と基質の
酵素的反応の結果として生成される検出可能な種を検出
するのに適した装置を介して、要素を通過せしめること
により検出される。例えば、これらの種は、周知の方法
を用いて、適当な放射計、蛍光計もしくは分光光度計を
用いて検出できる。酵素反応では、得られた生成物は、
例えば、試験試料と接触させた一定領域の中心における
反射もしくは透過濃度又は蛍光を測定することにより、
測定される。測定される領域は、一般的には競合アッセ
イに関しては直径3〜5mmである。液状試料中のリガン
ドの量は、一定領域の中心で測定される標識の量に反比
例する。好ましい態様では、未複合体化リガンドから複
合体化リガンドを最大限分離するために、分離発色工程
を必要とする。一般的には、試料接触及び分離もしくは
発色液の適用後、5〜180秒後に標識測定が実施され
る。
似体を用いた乾式イムノアッセイ要素を使用した伝統的
なイムノアッセイを具体的に説明するものである。これ
らの例は、フェニトイン及びフェノバルビタールについ
てのアッセイを行うことにより、本発明を具体的に説明
している。しかしながら、本発明が、別のバルビツレー
ト及びヒダントイン薬物誘導体類に適用されることは、
明らかであろう。
ロトコールに従い段階を追って実施した。10μLの試
料を本発明の乾式イムノアッセイ要素の表面上にスポッ
トした。次いで今しがた試料をスポットした要素を、3
7℃で5分間インキュベーションした。インキュベーシ
ョン後、その要素をインキュベーターから取り出し、そ
して酵素基質溶液10μLで発色させた。これらの例で
用いられたアッセイでは、標識は西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ(HRP)であり、そして発色溶液に用いられた
基質は、約0.3重量%H2 O2 であった。また、発色
溶液は、リン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)0.01
モル、4′−ヒドロキシアセトアニリド(電子転移剤)
0.005モル、ジエチレントリアミンペンタ酢酸10
マイクロモル及び界面活性剤を含むものであった。発色
溶液は、検出可能な種を発色させる。結合HRP−標識
リガンドは、無色ロイコ色素の着色型への酸化を触媒す
る。このような色素は、乾式分析要素技術分野では周知
であるので、本明細書に詳細に記載するつもりはない。
本明細書に記載される例において、ロイコ色素はトリア
リールイミダゾールである。触媒反応の速度は、37℃
で一定期間における反射濃度の変化により測定した。反
射濃度の測定方法及び手段は、分析技術分野で周知であ
る。
セイにおける標識フェニトイン類似体(AHRP−HD
1、標識A)の使用。 下記構造を有するように、既知技術を用いて要素を製造
した。
A)を含む一連のヒト血清ベースキャリブレーターを調
製した。凍結乾乾血清ベースキャリブレーター(Bio
Rad)をイオン交換水3mLでもとに戻した。フェニト
インの濃度を0.5〜128μg/mLに変化させた。最
終濃度1ナノモルとなるように標識Aを添加した。
μL)を、上記配置を有する一連の同一分析要素の展開
層上にスポットした。37℃で5分間インキュベーショ
ン後、過酸化水素(0.03%)、リン酸ナトリウム緩
衝液(0.01モル、pH6.8)、4′−ヒドロキシア
セトアニリド(5ミリモル)及びジエチレントリアミン
ペンタ酢酸(10マイクロモル)を含む発色溶液(10
μL)を添加して色素生成を開始させた。約1分間経過
後、37℃、680nmで、領域の中心における反射濃度
(Dr)を測定した。クラッパーウィリアムス(Clap
per−Williams)変換により、Dr値をDtに変
換した。30秒間に亘るDtの変化を計算した。結果を以
下に示す。
十分な速度変化があることを示している。治療範囲は1
0〜20μg/mLである。本例は、本発明により提供さ
れるイムノアッセイ方法に有用な分析要素、及び薬物フ
ェニトインを検出するための競合バインディングアッセ
イにおけるその使用を具体的に説明するものである。
セイにおける伸長連結鎖及びアミド結合を担持するAH
RP−HD2(標識B)の使用。 本例は、本発明により提供される別の分析要素及び薬物
フェニトインを検出するための競合バインディングアッ
セイにおける本発明の標識ヒダントイン誘導体としての
その使用を、具体的に説明するものである。下記構造を
有するように、既知技術を用いて要素を製造した。
2)を含む一連のヒト血清ベースキャリブレーターを調
製した。凍結血清ベースキャリブレーターに、0〜70
μg/mLの濃度でフェニトインを含ませた。最終濃度1
ナノモルとなるように標識Bを添加した。
μL)を、上記配置を有する一連の同一分析要素の展開
層上にスポットした。37℃で5分間インキュベーショ
ン後、過酸化水素(0.03%)、リン酸ナトリウム緩
衝液(0.01モル、pH6.8)、4′−ヒドロキシア
セトアニリド(5ミリモル)及びジエチレントリアミン
ペンタ酢酸(10マイクロモル)を含む発色溶液(10
μL)を添加して色素生成を開始させた。約1分間経過
後、37℃、680nmで、領域の中心における反射濃度
(Dr)を測定した。クラッパーウィリアムス(Clap
per−Williams)変換により、Dr値をDtに変
換した。30秒間に亘るDtの変化を計算した。結果を以
下に示す。
十分な速度変化があることを示している。治療範囲は1
0〜20μg/mLである。
セイにおけるアミド結合を有するヘキサンジアミンより
製造された伸長連結鎖を担持する標識フェニトイン誘導
体、AHRP−HD3(標識C)の使用。
の競合バインディングアッセイにおける、本発明の異な
る標識ヒダントイン誘導体を用いた例2に記載の分析要
素の使用を具体的に説明するものである。
Cを含む一連のヒト血清ベースキャリブレーターを調製
した。凍結血清ベースキャリブレーターに、0〜70μ
g/mLの濃度でフェニトインを含ませた。最終濃度1ナ
ノモルとなるように標識Cを添加した。
て例2に記載のものと同一の一連の分析要素の展開層上
に、一連のフェニトイン標準(アリコート10μL)を
スボットした。37℃で5分間インキュベーション後、
過酸化水素(0.03%)、リン酸ナトリウム緩衝液
(0.01モル、pH6.8)、4′−ヒドロキシアセト
アニリド(5ミリモル)及びジエチレントリアミンペン
タ酢酸(10マイクロモル)を含む発色溶液(10μ
L)を添加して色素生成を開始させた。約1分間経過
後、37℃、680nmで、領域の中心における反射濃度
(Dr)を測定した。クラッパーウィリアムス(Clap
per−Williams)変換により、Dr値をDtに変
換した。30秒間に亘るDtの変化を計算した。結果を以
下に示す。
十分な速度変化があることを示している。
ザイムイムノアッセイにおける伸長連結鎖を用いて製造
されたフェノバルビタールHRP標識の使用。
薬物フェノバルビタールを検出するための競合バインデ
ィングアッセイにおけるその使用を具体的に説明するも
のである。下記構造を有するように、既知技術を用いて
要素を製造した。
ル−HRP標識(標識製造6のPB−3由来の標識AH
RP−PB3もしくは標識E)を含む一連のヒト血清ベ
ースキャリブレーターを調製した。フェノバルビタール
の濃度を0〜80μg/mLに変化させた。最終濃度6ナ
ノモルとなるようにフェノバルビタール−HRP標識を
添加した。
ト10μL)を一連の分析要素の展開層上にスポットし
た。37℃で5分間インキュベーション後、過酸化水素
(0.03%)、リン酸ナトリウム緩衝液(0.01モ
ル、pH6.8)、4′−ヒドロキシアセトアニリド(5
ミリモル)及びジエチレントリアミンペンタ酢酸(10
マイクロモル)を含む洗浄溶液(10μL)を添加し
て、フェノバルビタール標準が塗布された領域の中心か
ら未結合複合体を洗い流し、そして色素生成を開始させ
た。約1分間経過後、37℃、680nmで、領域の中心
における反射濃度(Dr)を測定した。クラッパーウィリ
アムス(Clapper−Williams)変換によ
り、Dr値をDtに変換した。30秒間に亘るDtの変化を計
算した。結果を以下に示す。
十分な速度変化があることを示している。治療範囲は2
0〜40μg/mLである。
ザイムイムノアッセイにおけるアミド結合を有する伸長
連結鎖を用いて製造されたフェノバルビタール−HRP
標識の使用。 本例は、本発明の分析要素の製造方法及び薬物フェノバ
ルビタールを検出するための競合バインディングアッセ
イにおけるその使用を具体的に説明するものである。下
記構造を有するように、既知技術を用いて要素を製造し
た。
ル−HRP標識(AHRP−PB−1、標識製造6由来
の標識F)を含む一連のヒト血清ベースキャリブレータ
ーを調製した。凍結血清ベースキャリブレーターに、0
〜80μg/mLの濃度でフェノバルビタールを含ませ
た。最終濃度が8ナノモルとなるようにフェノバルビタ
ール−HRP標識を添加した。
ト10μL)を一連の分析要素の展開層上にスポットし
た。37℃で5分間インキュベーション後、過酸化水素
(0.03%)、リン酸ナトリウム緩衝液(0.01モ
ル、pH6.8)、4′−ヒドロキシアセトアニリド(5
ミリモル)及びジエチレントリアミンペンタ酢酸(10
マイクロモル)を含む洗浄溶液(10μL)を添加し
て、フェノバルビタール標準が塗布された領域の中心か
ら未結合複合体を洗い流し、そして色素生成を開始させ
た。約1分間経過後、37℃、680nmで、領域の中心
における反射濃度(Dr)を測定した。クラッパーウィリ
アムス(Clapper−Williams)変換によ
り、Dr値をDtに変換した。30秒間に亘るDtの変化を計
算した。結果を以下に示す。
十分な速度変化があることを示している。治療範囲は2
0〜40μg/mLである。これらの例の前記要素におい
て、標識薬物ハプテン誘導体は試料と共に要素上にスポ
ットされる。あるいは、標識薬物ハプテン誘導体は、要
素展開層上にグラビアコーティングできる。
との関連で以下に列挙する。
2,5−ジメチル−1,4−ピペラジニレン、1,3−
イミダゾリジニレン及び1,3−ヘキサヒドロジアゼピ
ニレンより選ばれる複素環式基を含む請求項1のイムノ
アッセイ方法。
に先に定義された構造Iに従う請求項1のイムノアッセ
イ方法。
ル、プロピル、ヘキシル、デシル、未置換フェニルもし
くは炭素原子数1〜6個のアルキル、ニトロ、ハロゲ
ン、シアノ及び炭素原子数1〜6個のアルコキシで置換
されたフェニルで表され、R2 ,R4 ,R5 及びR
6 が、各々独立してエチレン、ブチレン、ペンチレン、
オクチレンもしくは少なくとも1つ以上のエステル基、
アミド基、−O−,−S−もしくは−NR−を割り込ま
せたこのようなアルキレンより選ばれるアルキレンを表
し、R3 が、メチレン、エチレンもしくはトリメチレン
を表し、Zが、−NR−(ここで、Rは、水素、メチ
ル、プロピルもしくはヘキシルを表す)を表し、そして
標識が、酵素を表す、具体的な態様3のイムノアッセイ
方法。
はエチルを表し、R2 がテトラメチレンを表し、R3 が
エチレンを表し、R4 ,R5 及びR6 が各々独立してエ
チレンもしくはヘキシレンを表し、Zが−O−もしくは
−NH−であり、そして標識が酵素である、具体的な態
様4のイムノアッセイ方法。
(HRP)もしくはアミン富化西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ(AHRP)であり、標識薬物ハプテン類似体が標
識フェニトインもしくはフェノバルビタール類似体であ
り、そして薬物ハプテン類似体を西洋ワサビペルオキシ
ダーゼに連結する連結基が、テトラメチレンカルボニル
イミノヘキサメチレンイミノカルボニルエチレンカルボ
ニル、テトラメチレンカルボニル−1,4−ピペラジニ
レンカルボニルエチレンカルボニル及びテトラメチレン
カルボニルイミノエチレンオキシカルボニルエチレンカ
ルボニルより選ばれる、具体的な態様5のイムノアッセ
イ。
特許請求した方法のいずれか1つの方法。
むイムノアッセイ要素で実施される請求項1及び具体的
な態様2〜6のいずれか1つの方法。
して展開層もしくは区画に標識ヒダントイン誘導体を含
むイムノアッセイ要素で実施される請求項1及び具体的
な態様2〜6のいずれか1つの方法。
化され、そして標識薬物ハプテン類似体が抗体を含む層
の上に直接コーティングされているイムノアッセイ要素
を用いて実施される、請求項1及び具体的な態様2〜6
のいずれか1つの方法。
いずれか1つに従うフェニトインもしくはフェノバルビ
タール類似体より選ばれる標識ハプテンの層、区画もし
くはコーティングを有するイムノアッセイ要素。
バルビタールであるアッセイを行うための、請求項1及
び具体的な態様2〜6のいずれか1つのイムノアッセイ
方法。
似体が、薬物に対する過剰の固定化抗体により結合され
うる。伸長連結鎖を担持する標識類似体類、特に連結鎖
中にアミド結合を有するものは、実際に本発明を低減す
るのに用いられるいかなるタイプの固定化抗体によって
も、同様に結合される。また、伸長連結鎖中にアミドを
有する誘導体類は、加水分解に対して非常に安定であ
る。標識薬物類似体類を含む要素を用いて行われる競合
イムノアッセイは、通常治療を目的とする薬物濃度範囲
において、反射濃度変化を十分に示す。
Claims (1)
- 【請求項1】 A.抗体−薬物免疫複合体の生成を促進
する条件下かつ薬物に対する抗体の存在下、薬物もしく
はそれらの誘導体を含む液状試料を、薬物もしくは薬物
誘導体の標識類似体と接触させる工程、及び B.結合もしくは未結合標識薬物ハプテン類似体を測定
することにより、液体中の薬物の量を測定する工程であ
って、上記標識薬物ハプテン類似体が、 (A)アミンもしくはスルフヒドリル基を有する、イム
ノアッセイに用いられるタイプの標識、 (B)ヒダントイン核もしくはバルビツレート核より選
ばれる薬物ハプテン核、及び (C)薬物ハプテン核の3位をカルボニル橋を介して標
識に連結する連結鎖、を含んで成り、上記連結鎖が、
(1)C1 〜C10アルキレン基、(2)フェニレン基、
及び(3)環窒素原子を介して連結基に結合した5〜7
員複素環、から成る5〜40個の原子を有し、上記基及
び環が、(a)エステル 【化1】 (上式中、ZはOもしくはSである)、(b)アミド 【化2】 (c)−O−,−S−、及び−NR−より選ばれるヘテ
ロ原子(ここで、Rは、C1 〜C6 アルキルを表す)、
並びに(d)カルボニルより選ばれる化学基を介して互
いに結合しており、連結基が、炭素原子数2〜12個を
有する飽和もしくは不飽和モノカルボン酸の誘導体以外
のものであることを条件とすることで特徴付けられる工
程、を含んで成る薬物のイムノアッセイ方法。
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