ES2253866T3 - Conjugado de cortisol reducido. - Google Patents
Conjugado de cortisol reducido.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a composiciones que comprenden nuevos conjugados de cortisol reducidos, procedimientos para su preparación y empleo en inmunoensayos para cortisol. En otro aspecto, la invención se refiere a conjugados de cortisoles reducidos como inmunogenes para poner de manifiesto anticortisol o anticuerpos anticortisol reducidos.
Description
Conjugado de cortisol reducido.
La presente invención se refiere a haptenos y
marcas conjugadas que tienen especificidad mejorada para anticuerpos
anti-cortisol, procedimientos para su preparación y
uso en inmunoensayos para la detección de corticol. Más
particularmente, la presente invención se refiere conjugados que
comprenden peroxidasa de rábano picante y cortisol reducido.
El cortisol es el principal glucocorticoide en
seres humanos. Se sintetiza y se secreta por la zona fasciculata y
la zona reticularis del córtex adrenal. Está implicado en la
regulación del metabolismo de carbohidratos, proteínas, y de
lípidos. Los niveles de cortisol pueden alcanzar diez veces después
de cirugía u otro trauma mayor, a medida que el esteroide actúa para
prevenir el colapso vascular, reduce la inflamación, y suprime el
sistema inmune.
Existen tres trastornos médicos principales
asociados a hiperadrenalismo: síndrome de Cushing, hiperadrenalismo,
e hiperplasia adrenal congénita. El síndrome de Cushing es el
término usado para describir cualquier afección que se produce por
una concentración creciente de glucocorticoide circulante,
usualmente cortisol (Clinical Chemistry: Theory, Analysis, and
Correlation; Lawrence A. Kaplan, Amadeo J. Pesce, CV Mosby
Company, 1989, p 673-4).
La detección y cuantificación de cortisol en
suero humano, plasma u orina se requiere para la diagnosis
apropiada, tratamiento y seguimiento de afecciones relacionadas con
cortisol.
Los inmunoensayos de unión competitiva para
cortisol comprenden anticuerpos anti-cortisol,
usualmente unidos a un sustrato inmovilizado o inmovilizable y
cortisol marcado, o análogos marcados (derivados) de cortisol. Se
entenderá que siempre que se haga referencia a cortisol marcado,
salvo que se indique otra cosa, el término pretende comprender
análogos marcados (derivados) de cortisol. El cortisol marcado
compite con cortisol por un número limitado de sitios de unión de
anticuerpos anti-cortisol. La señal derivada de
cotisol marcado libre o unido se determina como medida de la
cantidad de cortisol.
La sensibilidad y especificidad de un
inmunoensayo por cortisol dependen del cortisol marcado. Es
importante que el cortisol marcado compite efectivamente por el
número limitado de sitios de unión de anti-cortisol
con esteroides similares estructuralmente a cortisol que pueden
estar presentes en una muestra. Por otra parte, no se obtendrá una
determinación clínicamente aceptable de la cantidad de cortisol en
la muestra.
Los individuos que tienen una deficiencia de al
enzima 11\beta-hidrolasa, o que reciben metirapona
tendrán niveles aumentados en gran medida de
11-desoxicortisol, que es estructuralmente similar a
cortisol (Fundamentals of Clinical Chemistry, Tietz, N. W.,
W. B. Saunders Co., 1987, p. 569) y potencialmente puede competir
con cortisol marcado para la unión a anticuerpo
anti-cortisol. Otros esteroides de tipo cortisol que
pueden estar presentes en una muestra, que potencialmente pueden
competir con cortisol marcado para el anticuerpo
anti-cortisol, incluyen prednisolona, cortisona,
y
corticosterona. Tal competición con cortisol marcado para el anticuerpo anti-cortisol se denomina reactividad cruzada.
corticosterona. Tal competición con cortisol marcado para el anticuerpo anti-cortisol se denomina reactividad cruzada.
Los ensayos de cortisol comerciales pueden
exhibir reactividad cruzada con todos los esteroides identificados
anteriormente. Por ejemplo se ha observado una reactividad cruzada
con 11-desoxicortisol de más del 10 por ciento; que
comprometa gravemente la exactitud del ensayo para cortisol.
Aqua culture 117, p. 351-63
(1993) describe conjugados de cortisol unidos a
3-carboxi metil-oxima para uso en la
inducción de anticuerpos y en inmunoensayos.
Los problemas asociados con ensayos de la técnica
anterior para cortisol se han evitado usando las marcas conjugadas
descritas en esta memoria descriptiva más adelante.
La presente invención se refiere a composiciones
que comprenden conjugados novedosos de cortisol reducido,
procedimientos para su preparación y uso en inmunoensayos para
cortisol.
En otro aspecto, se refiere a conjugados de
cortisol reducido como inmunógenos o haptenos para generar
anticuerpos anti-cortisol o
anti-cortisol reducido.
Inesperadamente se encontró que conjugados de
cortisol reducido de la presente invención compite eficazmente con
esteroides similares a cortisol para unirse a anticuerpos
anti-cortisol, por lo tanto mostrando
significativamente menos reactividad cruzada comparada con los
conjugados de cortisol marcados de la técnica anterior. Los
inmunoensayos para cortisol que comprenden conjugados de cortisol
reducido marcado de la presente invención muestran tanto
especificidad mejorada como sensibilidad para la determinación de
cortisol.
De acuerdo con lo anterior, la presente invención
proporciona un conjugado de cortisol reducido de fórmulas IA, IB e
ID, que se pueden producir mediante compuestos de fórmula IC.
en las que X es O, S, sulfonilo, o
fosfono; X_{1} es un polímero natural o sintético, marcado o no
marcado o una marca; Y_{1} es un grupo de unión o un enlace;
X_{2} es un polímero natural o sintético, marcado o no marcado o
una marca; Y_{2} es un grupo de unión o un enlace; A_{1} y
A_{2} son cada uno hidrógeno o A_{1} y A_{2} juntos forman un
enlace simple; B_{1} y B_{2} son cada uno hidrógeno o B_{1} y
B_{2} junto forman un enlace sencillo; E_{1} y E_{2} son cada
uno hidrógeno o E_{1} y E_{2} juntos forman un enlace sencillo
con tal que al menos uno de A_{1} y A_{2}, o B_{1} y B_{2},
o E_{1} y E_{2} sean cada uno
hidrógeno.
En otro aspecto, la presente invención se refiere
a procedimientos de preparación para la preparación de conjugados de
cortisol reducido. De acuerdo con lo anterior, los inventores
proporcionan un procedimiento para preparar un complejo de cortisol
reducido de fórmulas
en las que X, X_{1}, Y_{1},
X_{2}, Y_{2}, A_{1}, A_{2}, B_{1}, B_{2}, E_{1} y
E_{2} son como se han definido anteriormente,
comprendiendo:
hacer reaccionar un compuesto de fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
con un agente
reductor.
Se proporciona un procedimiento alternativo para
preparar un conjugado de cortisol reducido de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
en las que X, X_{1}, Y_{1}, X_{2}, Y_{2},
A_{1}, A_{2}, B_{1}, B_{2}, E_{1} y E_{2} son como se
han definido anteriormente, que comprende las etapas de:
(i) hacer reaccionar un compuesto de fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
con un agente reductor, formando
por lo tanto el compuesto IA o IC;
y
(ii) opcionalmente, hacer reaccionar el compuesto
IA o IC con un primer agente de acoplamiento, formando por lo tanto
un compuesto de fórmula
en la que G_{1} es un grupo de
acoplamiento;
(iii) opcionalmente, hacer reaccionar X_{2} con
un segundo agente de acoplamiento, formando por lo tanto
X_{2}-G_{2}, en la que G_{2} es un agente de
acoplamiento capaz de formar un enlace covalente con el grupo
G_{1} de acoplamiento, y en la que G_{1} y G_{2} pueden ser
iguales;
(iv) opcionalmente hacer reaccionar el compuesto
IA o IC con X_{2}-G_{2} en la que G_{2} es
capaz de formar un enlace covalente con un grupo funcional de X1,
formando por lo tanto el conjugado de cortisol reducido IB o ID;
(v) opcionalmente hacer reaccionar el compuesto
IIIA o IIIC con X_{2} en la que G_{1} es capaz de formar un
enlace covalente con un grupo funcional de X_{2}, formando por lo
tanto conjugado de cortisol reducido IB o ID;
(vi) opcionalmente hacer reaccionar el compuesto
IIIA o IIIC con X_{2}-G_{2}, formando por lo
tanto conjugado de cortisol reducido IB o ID.
Todavía en otro aspecto, la presente invención se
refiere a procedimientos para la determinación cualitativa o
cuantitativa de cortisol que utilizan los conjugados novedosos de
cortisol reducido marcado.
De acuerdo con lo anterior, los inventores
proporcionan un procedimiento para realizar un ensayo competitivo
para cortisol que comprende las etapas de:
- A)
- poner en contacto una muestra sospechosa de contener cortisol con
- (i)
- un receptor inmovilizado o inmovilizable que se une a cortisol, formando por lo tanto cortisol que está unido y cortisol que no está unido al receptor inmovilizado o inmovilizable,
- (ii)
- un conjugado de cortisol reducido marcado de fórmula IA, IB, IC o ID como se ha definido anteriormente, formando por lo tanto un conjugado de cortisol reducido marcado que está unido y un conjugado de cortisol reducido marcado que no está unido al receptor inmovilizado o inmovilizable;
- B)
- detectar o bien el conjugado de cortisol reducido marcado que está unido o el cortisol reducido marcado que no está unido al receptor inmovilizado o inmovilizable como una medida de la cantidad de cortisol en la muestra.
En una realización alternativa, el procedimiento
de ensayo descrito anteriormente se puede combinar con una etapa en
la que el conjugado de cortisol reducido marcado que está unido se
separa del conjugado de cortisol reducido marcado que no está unido
al receptor inmovilizado o inmovilizable;
También se proporciona un procedimiento
alternativo para realizar un ensayo competitivo para cortisol usando
un elemento analítico seco, el elemento analítico seco que
comprende
a) una zona de dispersión,
b) una o más zonas de reactivos,
c) un soporte, y
junto o de manera separada en una o más de las
zonas, un receptor inmovilizado que se une al cortisol y
opcionalmente, un conjugado de cortisol reducido marcado de fórmula
IA, IB, IC o ID definido anteriormente, en el que el procedimiento
comprende las etapas de:
- A)
- poner en contacto la zona de dispersión del elemento analítico seco con
- i)
- una muestra sospechosa de contener cortisol, formando por lo tanto cortisol que está unido y cortisol que no está unido al receptor inmovilizado,
- ii)
- conjugado de cortisol reducido marcado si no está presente en el elemento analítico seco, formando por lo tanto conjugado de cortisol reducido marcado que está unido y conjugado de cortisol reducido marcado que no está unido al receptor inmovilizado,
- B)
- opcionalmente, separar el conjugado de cortisol reducido marcado que está unido del conjugado de cortisol reducido marcado que no está unido al receptor inmovilizado; y
- C)
- detectar o bien el conjugado de cortisol reducido marcado que está unido o el conjugado de cortisol reducido marcado que no está unido al receptor inmovilizado como una medida de la cantidad de cortisol en la muestra.
En otra realización, la presente invención se
refiere a haptenos o inmunógenos de fórmula IA, IB, IC o ID como se
ha definido anteriormente y las composiciones que comprenden los
inmunógenos. También se refiere a procedimientos de producción de
anticuerpos anti-cortisol que usan inmunógenos de la
presente invención, inmunizando un animal huésped, retirando sangre
del huésped, y separando anticuerpos que se unen a cortisol del
suero o plasma de la sangre del animal huésped. En otro
procedimiento relacionado, el bazo, timo u otro órgano que se puebla
con las células productoras de anticuerpo se retira del animal
huésped inmunizado, los hibridomas que secretan anticuerpos se
preparan usando células productoras de anticuerpos del bazo, timo u
otro órgano así retirado, y anticuerpos que se unen a cortisol se
seleccionan a partir de ellos.
Todavía en otro sentido, la presente invención se
refiere a procedimientos de reducción de reactividad cruzada en
inmunoensayos para cortisol usando conjugados de cortisol reducido
marcado de fórmula IA, IB, IC o ID.
Los conjugados de cortisol reducido marcado de la
presente invención, como se ha establecido, efectivamente compiten
con los esteroides de tipo cortisol para unión a anticuerpos
anti-cortisol, por lo tanto mostrando
significativamente menos reactividad cruzada comparada con los
conjugados de cortisol marcado de la técnica anterior.
La invención se describe en detalle con respecto
a un conjugado de cortisol reducido específico que comprende
albúmina sérica bovina y peroxidasa de rábano picante. Esto se ha
hecho para ilustrar la presente invención y no se pretende que
limite la invención de ninguna forma a este ejemplo específico.
También se contemplan oros conjugados de cortisol reducido, sus
síntesis y uso como inmunógenos, o como marcas de cortisol reducido
en inmunoensayo competitivo y no competitivo y en otros aspectos que
son evidentes de las enseñanzas presentadas en esta memoria
descriptiva o serían conocidos por los expertos en la técnica.
Un "polímero natural" para el propósito de
la presente invención se define en esta memoria descriptiva como el
que se origina de una fuente biológica incluyendo pero sin
limitación a:
microorganismos, hongos, virus, ser humano, vaca,
cerdo, ratón, gato, perro, rata, o insecto. Tales polímeros
naturales incluyen proteínas, péptidos, glicoproteínas,
lipoproteínas y especies recombinantes y químicamente modificadas de
los mismos, polisacáridos, celulosas, colágenos, y látex. Los
ejemplos algo más específicos incluyen, dextranos, porcino, ser
humano, ratón, rata y albúmina sérica bovina o globulinas,
estreptavidina, anticuerpos, enzimas tales como peroxidasa,
\beta-galactosidasa, y fosfatasa alcalina.
Un "polímero sintético" se define en esta
memoria descriptiva como un polímero que no se origina
necesariamente directamente de una fuente biológica. Es una que se
prepara mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en
la técnica. Por ejemplo, por medio de una condensación de monómeros
usando polimerización en emulsión, polimerización de cadena iónica,
polimerización de carbonilo, polimerización de cadena radical y
similares. Incluye, homopolímeros tales como poliacrilamidas,
polimetacrilatos, poliestirenos, poliacrilamidas sustituidas,
polimetacrilatos, y poliestirenos, y copolímeros que comprenden dos
o más unidades monoméricas diferentes, tales como archilamida o
archilamida sustituida, estireno y estireno sustituido, y similares,
como conocerán los expertos en la técnica. Incluye copolímeros de
bloque, copolímeros de injerto, polímeros acuosos solubles y acuosos
insolubles y las combinaciones covalentes y no covalentes con
polímeros naturales.
El término "marca" como se define en esta
memoria descriptiva incluye: elementos químicos, compuestos, y
enzimas que son capaces de detectarse directamente o indirectamente
usando, por ejemplo, espectrometría de absorción, fluorescencia, o
de reflectancia, o procedimientos de detección por radiación. Una
marca puede ser un polímero natural o sintético. Por ejemplo, la
peroxidasa de rábano picante es tanto una marca como un polímero
natural. Pero una marca no es necesariamente un polímero natural o
sintético.
Una marca capaz de detección directa es una que
es intrínsecamente capaz de producir una señal detectable. Tales
marcas incluyen sustancias orgánicas e inorgánicas capaces de
fluorescencia, o fosforescencia, tal como pero no limitados a
fluoresceína, y derivados de los mismos, y
N-(3-fluorantil)maleimida, radionucleídos,
tal como carbono 14, tritio y fósforo 32, y similares. Se incluyen
sustancias que tienen absorción espectral tal como pero sin
limitación a, tintes de azo-oxo,
azo-tetrazo, azina, oxazina, tiamina, quinolina,
indamina, pirona y pirazolona.
Una marca que es capaz de detección indirecta
requiere la presencia de una o más sustancias adicionales para la
producción de la señal detectable. Tales marcas incluyen típicamente
pero no se limitan a enzimas que requieren la presencia de
un(os) sustrato(s), cofactor(es),
metal(es) y similares. Las peroxidasas, más particularmente,
peroxidasa de rábano picante, una marca común, requiere un dador de
electrones y un agente oxidante, tal como luminol, leucotintes de
di- o triarilimidazol y peróxido de hidrógeno para producir un
producto quimioluminiscente o tinte, respectivamente. También se
contemplan otras enzimas, tales como
\beta-galactosidasa, glucosa oxidasa y fosfatasa
alcalina, y similares.
En general, las marcas incluyen etiquetas
radiactivas, enzimas, cromóforos, fluoróforos radicales libres
estables, y cofactores de coenzimas, inhibidores y efectores
alostéricos.
Un "agente reductor", para el propósito de
la presente invención, es cualquier compuesto o mezcla de reactivo
que es capaz de hidrogenar un doble enlace, tal como dobles enlaces
carbono-carbono, carbono-nitrógeno,
carbono-oxígeno y
carbono-azufre.
Los agentes reductores útiles incluyen pero no se
limitan a: hidruro de aluminio, hidruro de aluminio y litio,
boorohidruro y las sales de los mismos. También se pueden usar
hidrogenación catalítica sobre paladio, platino o níquel u otros
procedimientos de hidrogenación. El borohidruro de sodio es un
agente reductor preferido.
Un "grupo de unión" se define en esta
memoria descriptiva, como un grupo químico que comprende uno o más
átomos. Un grupo de unión conecta una molécula a otra, tal como un
polímero natural a un polímero natural, un polímero sintético a un
polímero sintético, un polímero natural a un polímero sintético, una
marca a un polímero natural o sintético, una marca a cortisol
reducido, una marca a cortisol, y así sucesivamente, a través de la
formación de un enlace covalente con cada una de las moléculas se
une.
El grupo de unión puede comprender un
heteroalquilo sustituido o no sustituido de cadena lineal o
ramificada, tal como oxalilo, tioalquilo, aminoalquilo, alquenilo
sustituido o no sustituido, uno o más anillos heterocíclicos
hidrocarburos sustituidos o no sustituidos, uno o más anillos arilo
o heteroarilo sustituidos o no sustituidos tales como pero no
limitados a, imidazolilo, isoxazolilo, piridilo, piperidilo,
piperazinilo, pirazolilo, triazolilo, oxadiazolilo, piridazinilo,
quinolinilo, y quinazolinilo.
Las macromoléculas de unión o acoplamiento, tales
como polímeros naturales o sintéticos a otras moléculas, o pequeñas
moléculas de unión, tal como cortisol o análogos de cortisol, a
macromoléculas se conoce bien en la técnica. Específicamente con
respecto a cortisol, carbono 3 (C3) es reactivo con nucleófilos que
incluyen, aminas, oximas, y tioximas y otros conocidos en la
técnica. Las especies nucleófilas pueden ser un agente de
acoplamiento (unión), una marca, un polímero natural o sintético. Si
es un agente de acoplamiento u otra especie que tiene un grupo
funcional reactivo (una marca, etc.), tras enlace covalentemente al
C3 de cortisol se puede hacer reaccionar con otro agente de
acoplamiento u otras especies que tienen un grupo funcional reactivo
de manera apropiada. El cortisol así derivatizado se puede usar como
el punto de partido para preparar los compuestos de cortisol
reducido de al presente invención. Los detalles de química de
acoplamiento y grupos de unión se pueden encontrar en numerosas
publicaciones, que incluyen, las patentes de Estados Unidos números,
3.654.090; 3.791.932; 3.875.011; 4.016.043; 4.040.907; 4.092.479;
4.213.894; 4.243.749; 4.376.165; 4.410.643; 4.752.658; 4.828.978;
4.879.249; 4.997.772; 5.053.497; 5.106.732; 5.147.777;
5.155.166; 5.162.219; 5.177.023; 5.284.948; 5.298.403; 5.308.749; 5.374.516; 5.391.483; 5.397.695; 5.401.633;
5.527.709; 5.543.311; 5.578.457; 5.652.346; 5.763.588; 5.770.390 y las referencias identificadas en esos documentos; Yoshitake y col., Eur. J. Biocehm., 101, 395, (1979) y Tjssen, en Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, p. 221-278 (1985) y las referencias en esos documentos.
5.155.166; 5.162.219; 5.177.023; 5.284.948; 5.298.403; 5.308.749; 5.374.516; 5.391.483; 5.397.695; 5.401.633;
5.527.709; 5.543.311; 5.578.457; 5.652.346; 5.763.588; 5.770.390 y las referencias identificadas en esos documentos; Yoshitake y col., Eur. J. Biocehm., 101, 395, (1979) y Tjssen, en Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, p. 221-278 (1985) y las referencias en esos documentos.
En resumen, un grupo de unión y molécula al que
se une de manera covalente se puede conectar a través de enlaces
amida, éster, éter, tioéster, y disulfuro. Por ejemplo, la química
de acoplamiento o de unión que incluye hacer reaccionar las
moléculas a acoplar con agentes de condensación tales como
carbodiimidas, maleimidas, etilcloroformiato, y glutaraldehído se
conocen bien en la técnica.
El término "muestra" se refiere a cualquier
sustancia que pueden contener el analito de interés. Una muestra
puede ser un fluido biológico, tal como fluido cerebro espinal,
semen, secreciones vaginales, esputo, fluido de ascitos, fluido
lacrimal, sudor, suero, plasma, orina, sangre entera o componentes
de sangre entera incluyendo glóbulos rojos y blancos, plaquetas, y
otros fluidos o tejidos del cuerpo que puede contener el analito de
interés. Opcionalmente, las muestras se pueden obtener de agua,
suelo y plantas.
Los inmunoensayos, que pueden tener ventaja de
reacciones inmunológicas naturales, han encontrado uso amplio como
técnicas analíticas en la química clínica. Debido a la especificidad
de las reacciones, son particularmente ventajosos en la
cuantificación de los analitos biológicos, que están presentes en
muy baja concentración en fluidos biológicos. Tales analitos
incluyen, por ejemplo, anticuerpos, fármacos terapéuticos,
narcóticos, enzimas, hormonas, proteínas, etc.
En inmunoensayos de unión competitiva, un
analítico marcado (el término incluye análogos inmunocompetentes del
analito) se coloca en competición con analito no marcado para
reacción con una cantidad fija de un receptor apropiado, que a
menudo se inmoviliza sobre un sustrato sólido, o es capaz de
inmovilización de los mismos. El analito marcado que se une al
receptor se separar del analito marcado libre. Las concentraciones
no conocidas del analito se pueden determinar a partir de la señal
medida de o bien el analito marcado o libre. La reacción procede
como sigue:
Analito + analito marcado + receptor
\leftrightarrow analito-receptor +
analito-receptor marcado.
Los inmunoensayos se pueden llevar a cabo en
solución, en dispositivos de de ensayo en los que se pueden separar
los componentes solubles e insolubles, o en elementos analíticos
secos. Los inmunoensayos pueden ser heterogéneos u homogéneos como
se conocen estos términos en al técnica. En los ensayos heterogéneos
los inmunorreactivos marcados unidos o libres (analito marcado o
receptor marcado para un analito) se separan antes de la medición de
la señal; mientras que, en la separación de los ensayos homogéneos
no se requiere la separación de inmunorreactivo marcado libre del
unido. Los conjugados de cortisol reducidos de la presente invención
se pueden usar tanto en ensayos homogéneos como heterogéneos.
Numerosas publicaciones con relación a
inmunoensayos y procedimientos de inmunoensayos, que incluyen muchas
de las publicaciones relacionadas a grupos de unión y química de
acoplamiento, están disponibles para el medico. Las publicaciones
adicionales incluyen: las patentes de Estados Unidos números
4.382.745; 4.670.381; 4.483.921; 4.517.288; 4.822.747; 4.824.778;
4.829.012; 4.839.299; 4.847.194; 4.847.195; 4.853.335; 4.855.226;
4.857.453;
4.857.454; 4.859.610; 4.863.876; 4.868.106; 4.868.130; 4.879.219; 5.663.054; 5.776.933 y todas las referencias citadas en esos documentos; e Immunoassays in The Clinical Laboratory, Nakamura y col., eds., Alan R. Liss, Inc., (1979); Quantitative Enzyme Immunoassay, Engvall y col., eds. Blackwell Scientific Publications, (1978; Clinical Chemistry, Sommer y col., v. 32, p. 1770-1774, (1986); Clinical Chemistry, Sommeret y col., p 201-2206 (1990); A Primer for Multilayer Immunoassay, Berke, American Chemical Society Conference Proceeding, p. 303-312, PLenum Press, (1988); y todas las referencias citadas en esos documentos.
4.857.454; 4.859.610; 4.863.876; 4.868.106; 4.868.130; 4.879.219; 5.663.054; 5.776.933 y todas las referencias citadas en esos documentos; e Immunoassays in The Clinical Laboratory, Nakamura y col., eds., Alan R. Liss, Inc., (1979); Quantitative Enzyme Immunoassay, Engvall y col., eds. Blackwell Scientific Publications, (1978; Clinical Chemistry, Sommer y col., v. 32, p. 1770-1774, (1986); Clinical Chemistry, Sommeret y col., p 201-2206 (1990); A Primer for Multilayer Immunoassay, Berke, American Chemical Society Conference Proceeding, p. 303-312, PLenum Press, (1988); y todas las referencias citadas en esos documentos.
En los inmunoensayos competitivos el analito
marcado y la muestra que contiene el analito libre se pueden añadir
de manera simultánea o separada a una mezcla que comprende receptor
inmovilizado o inmovilizable que se une al analito.
En el caso de elementos analíticos secos, el
analito marcado y receptor inmovilizado cuando están presentes
juntos en el elemento antes de ponerse en contacto con la muestra,
están preferiblemente presentes en zonas separadas.
Los materiales y medios convencionales para
ensamblar los elementos analíticos de película seca se describen,
por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos números 3.867.258;
3.992.158; 4.042.435; 4.050.898; 4.066.403; 4.153.668; 4.258.001;
4.292.272 y 4.430.436.
Se conocen bien los procedimientos para obtener
anticuerpos que se unen a una molécula específica mediante
inmunización de animales huésped adecuados. Tales procedimientos
están bien documentados y se describen, por ejemplo, en las
siguientes publicaciones: Methods in Immunology, Garvey, J.
S., Cremer, N. E. y Sussdorf, D. H., W. A. Benjamin, Inc., tercera
edición (1977) y Handbook of Experimental Immunology, editado
por Weir, D. M., Blackwell Scientific Publications, tercera
edición., (1978).
Los procedimientos de producción de las líneas
celulares de hibridoma para secreción de anticuerpos también se
conocen bien, y se proporcionan, por ejemplo, en las patentes de
Estados Unidos números 4.950.592; 5.338.671; y 5.650.324.
Se proporciona un procedimiento más adelante que
ilustra la preparación de un conjugado de cortisol reducido marcado
con peroxidasa de rábano picante (HRP). En este procedimiento la
reducción d conjugado de oxima de cortisol de albúmina sérica bovina
(cortisol-3-CMO-BSA)
con borohidruro de sodio se llevó a cabo antes de al conjugación con
HRP; sin embargo, la reducción de cortisol se puede llevar a cabo
después de acoplarse a HRP.
Existen tres sitios para la reducción de
cortisol-3-CMO-BSA
que se marcan mediante un asterisco en la estructura mostrada más
adelante.
Cualquiera o todos estos sitios se pueden reducir
mediante tratamiento con un agente reductor o mezcla reductora que
es capaz de hidrogenar un doble enlace, produciendo productos que
tienen un solo sitio reducido como en las estructuras mostradas más
adelante.
así como, los compuestos que tienen
dos de los sitios reducidos, produciendo tres especies reducidas
diferentes, y los tres sitios reducidos, como es fácilmente evidente
para los expertos en la técnica. Otros conjugados que comprenden
cortisol, que tras reducción producen los compuestos genéricamente
definidos en las estructuras 1A, 1B, 1C y 1D, de manera análoga
formarán especies de cortisol reducido diferentes como se ha
ejemplificado anteriormente con
cortisol-3-CMO-BSA.
Los compuestos que tienen un enlace covalente a C3 de cortisol que
no es capaz de hidrogenarse se reducirán solamente en en el doble
enlace carbono-carbono del anillo y/o y el doble
enlace carbono-oxígeno (grupo carbonilo) de
cortisol. Todas las formas reducidas individualmente o en cualquier
combinación se contemplan en al presente
invención.
Albúmina sérica bovina
(cortisol-3-CMO-BSA)
se preparó como se describe más adelante. Como alternativa, se puede
comprar de Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri.
Una solución madre de
N-hidroxisuccinimida (NHS) se preparó disolviendo 20
mg de NHS en 3,0 ml de dioxano. Una solución madre de
diciclohexilcarbodiimida (DCC) también se preparó disolviendo 30 mg
de DCC en 2,50 ml de dioxano. A un vial de vidrio que contenía 40 mg
de oxima de cortisol-3-carboximetilo
(cortisol-3-CMO) se añadieron 1,744
ml de la solución madre de NHS y 1,744 ml de la solución madre de
DCC. La mezcla se agitó y se incubó durante tres horas a la
temperatura ambiente de la habitación. A 1,00 gramos de albúmina
sérica bovina (BSA) se añadieron 12 ml de solución de carbonato
ácido de sodio 0,1 M. La solución se mezcló hasta transparencia y al
final de las tres horas de incubación, se añadieron 3,0 ml del
cortisol-3-CMO activado a la
solución de BSA. La mezcla se agitó y se incubó a temperatura
ambiente durante dos horas. Después de las dos horas de incubación,
se añadieron 15 ml tampón de fosfato sódico 0,1 M, cloruro sódico
0,3 M (pH 6,0). La mezcla se filtró a través de Sartorius Minisarts
de 5,0 \mum y 0,45 \mum y después de cromatografió sobre una
columna de 5 x 70 cm Superdex 200 PG a un caudal de 8,0 ml/min. El
primer tubo correspondiente al pico principal y las diez fracciones
siguientes (un minuto) s recogieron y se combinaron. Combinación de
las fracciones. Las fracciones combinadas se dializaron contra agua
durante aproximadamente quince minutos. Se repitió la diálisis. El
dializado se filtró través de un Sartorius Minsart de 0,2 \mum y
se liofilizó en pequeñas alícuotas y se mantuvieron congeladas hasta
necesidad.
Cortisol-3-CMO-BSA
(24 mg) se disolvió en 4 ml de una solución de carbonato de sodio 50
mM y cloruro sódico 100 mM a pH 9,5. Una alícuota, 0,60 ml, de una
solución acuosa de borohidruro de sodio (4 mg por ml) se añadió a la
solución de
Cortisol-3-CMO-BSA,
que después se mezcló de manera continua durante treinta minutos a
20ºC. Después el pH se ajustó, usando aproximadamente 200 \mul de
una solución de fosfato sódico 0,5 M, hasta un valor en un intervalo
entre pH 7,2 y 7,5 para descomponer cualquier exceso de borohidruro.
La solución se mezcló cuidadosamente hasta que cesó la efervescencia
y se dejó en reposo durante aproximadamente quince minutos. Después
al mezcla de reacción se filtró a través de un filtro de 0,45 \mu
y se cromatografía sobre una columna de Sephadex D25 1,6 x 14,5 cl
preequilibrada con fosfato 0,02 M, pG 7,0, a un caudal de
aproximadamente 40 ml/hora. El tamaño de fracción recogida era
aproximadamente 0,67 ml (1 minuto). Se combinaron quince de las
fracciones más concentradas, es decir, las fracciones que tienen una
gran absorción a 280 nm.
4-(N-Maleimidometil)
ciclohexano-1-carboxilato de
succidinimilo (SMCC) se disolvió en
N,N-diemtilformamida (DMF) a una concentración final
de 9,6 mg/ml. A 10 ml del
cortisol-3-CMO-BSA
reducido recogido de la cromatografía de la etapa anterior, se
añadieron 186 \mul de al solución de SMCC. La solución se mezcló
cuidadosamente después se incubó durante una hora a 20ºC. la
reacción se inactivó con 800 \mul de una solución acuosa de
glicina (10 por ciento, peso 7 volumen). La mezcla de reacción
inactivada se cromatografió después sobre una columna de 3,22 x 10
cm cargada con Sephadex G25 perequilibrada con una solución de
fosfato 0,1 M y ácido etilendiaminotetraacético 5 mM (EDTA), pH 6,0,
a un caudal de aproximadamente 161 ml/h. Se recogieron las
fracciones de 1 mililitro. Ochos de las fracciones más concentradas
(que tienen una absorción mayor a 280 nm) se combinaron y se usaron
para conjugación a HRP activada.
Se disolvió peroxidasa de rábano picante en
fosfato o,1 M, pH 7,5, a una concentración final de HRP de 10 mg/ml.
Cinco mililitros de la solución de HRP se transfirieron a un vial de
reacción de 20 ml, Una alícuota de 0,5 ml de ácido
S-acetiltioacético,
N-hidroxisuccidinimil éster (SATA) en DMF (25 mg/ml)
se añadió al vial de reacción que contenía la solución de HRP. La
solución se mezcló cuidadosamente después se incubó a 20ºC durante
sesenta minutos. Una alícuota (500 \mul) de una solución que
contenía EDTA 0,05 M e hidroxilamina 2,5 M a pH 7,0 se añadió ala
mezcla de reacción, se mezcló cuidadosamente, y se incubó después a
20ºC durante 15 minutos. Después al mezcla se cromatografió sobre
una columna de 2,0 x 10 cm de Sephadex G25 preequilibrada con una
solución de fosfato 0,1 M y EDTA 5 mM a pH 6,0, usando un caudal de
aproximadamente 63 ml por hora. Se recogieron las fracciones de un
minuto. Se combinaron once de las fracciones más concentradas (que
tenían una gran absorción a 403 nm).
21,47 ml del
cortisol-3-CMO-BSA
reducido, activado se combinaron con 11,55 ml de HRP activado. La
solución se mezcló cuidadosamente, y se incubó a 20ºC durante 20
horas. Una alícuota (224 \mul) de una solución que contenía
mercaptoetanol en agua (1 por ciento de tiol por volumen) se añadió
a al mezcla de reacción y al solución se mezcló cuidadosamente y se
dejó en reposo durante aproximadamente 15 minutos. Una alícuota de
476 \mul de una solución que contenía 10 mg/ml de
N-metilmaleimida en DMF, se añadió después a la
mezcla de reacción, y se incubó veinte minutos adicionales después
de la mezcla. La mezcla de reacción de cromatografía después sobre
una columna de 4,4 x 50 cm que contenía Superdex 200 preequilibrado
con una solución de fosfato 0,1 M y NaCl 0,3 M a pH 6,0 usando una
caudal de aproximadamente 344 ml por hora. Se recogieron las
fracciones de un minuto. Se combinaron veintiséis de las fracciones
más concentradas alrededor de los primeros eluatos que tienen una
absorción máxima de 280 nm.
La absorción de la combinación conjugada (cj) y
al solución de HRP (en el ejemplo 2 anterior, antes de la activación
y diluida suficientemente en tampón fosfato para obtener una
medición de la absorción exacta) se determinaron a 280 nm y 403 nm,
A_{403}cj, A_{280}cj y A_{403} HRP, A_{280} HRP
respectivamente. La concentración del conjugado de
cortisol-3-CMO-BSA-HRP
reducido basándose en al concentración de BSA se determinó a partir
de estas mediciones usando la fórmula siguiente:
BSA (mg/ml) =
A_{280}cj - (A_{403}cj / [A_{403} HRP/A_{280} HRP]) /
0,76
La evaluación del
cortisol-3-CMO-BSA
reducido marcado con HRP (de aquí en adelante denominado conjugado
HRP-RC) se evaluó usando una metodología de ensayo
basado en quimioluminiscencia de Ortho-Clinical
Diagnostic VITROS Eci.
Se prepararon los siguientes reactivos para uso
con el sistema VITROS Eci.
- -
- 100 ng/ml de cortisol-3-CMO-BSA-HRP reducido (o 20 ng/ml de una marca de conjugado HRP-cortisol comparativo, que no es una marca conjugada de al presente invención, pero que se llevó a cabo a través del mismo procedimiento como la marca de la invención excepto para la etapa de reducción)
- -
- 2,86 g/l de fosfato sódico dibásico, anhidro
- -
- 7,3 g/l de fosfato sódico monobásico, anhidro
- -
- 0,01 g/l de ferricianuro potásico
- -
- 2,5 g/l de ácido 8-anilino-1-naftalenosulfónico
- -
- 20 g/l de albúmina sérica bovina
- -
- 0,03 g/l de apo-peroxidasa de rábano picante
- -
- alfa globulina bovina al 0,2% (Cohn fracción IV-I)
- -
- 1 g/l de gamma globulina bovina
- -
- 5 g/l de suero de oveja normal
- -
- 100 g/l de plasma humano depurado con carbón
- -
- 20 g/l de Kathon (un conservante que comprende 5-cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-ona y 2-metil-4-isotiazolin-3-ona)
- -
- pH 6,4
- -
- 1,5 \mug/ml de anti-cortisol gamma globulina de oveja biotinilada
- -
- 21 g/l de fosfato sódico dibásico, anhidro
- -
- 1,8 g/l de cloruro sódico
- -
- 1,1 g/l de ácido cítrico
- -
- 20 g/l de albúmina sérica bovina
- -
- 20 g/l de catón
- -
- pH 5,4
- -
- 0,39 g/l de ácido bórico
- -
- 0,35 g/l de tetraborato de disodio
- -
- 0,58 g/l de cloruro sódico
- -
- 0,50 g/l de TRITON X -100 (octilfenoxipolietoxi etanol)
- -
- 0,5 p/p de BRONIDOX (un conservante que comprende 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxano)
- -
- pH 8,4
Parte
A
- -
- 3,88 g/l de ácido bórico
- -
- 14,2 g/l de tetraborato de sodio
- -
- 1,06 g/l de citrato de sodio
- -
- 0,08 g/l de benzoato de sodio
- -
- 0,10 g/l de azida sódica
- -
- 0,008 g/l de ácido dietilentriaminopentaacético
- -
- 0,58 g/l de glicina
- -
- 0,40 g/l de luminol
\newpage
Parte
B
- -
- 0,90 g/l de ácido cítrico
- -
- 1,68 g/l de citrato de sodio
- -
- 0,08 g/l de benzoato de sodio
- -
- 0,62 g/l de perborato de sodio
- -
- 0,06 g/l de 3-cloro-4-hidroxiacetanilida
- -
- 5,84 g/l de cloruro sódico
Una alícuota (75 \mul) de anticuerpo de oveja
biotinilado anti-cortisol, 30 \mul de muestra,
suero que comprende cortisol o un esteroide estructuralmente similar
a cortisol ((más adelante), y 75 \mul de conjugado
HRP-RC se añadieron a un recipiente de muestra
VITROS ECi al que se había preañadido estreptavidina. La solución se
incubó a 37ºC durante 30 minutos, después se lavó usando el reactivo
de lavado indicado anteriormente.
Una alícuota de 200 \mull de la solución de
reactivo de señal indicada anteriormente (100 \mull de la parte A
y 100 \mull de la parte B combinadas justo antes de uso) se añadió
después al recipiente de muestra. La solución se incubó durante 5
minutos a 37ºC, después se determinó la intensidad de
quimioluminiscencia.
El procedimiento anterior se usó para determinar
al concentración de reactivo cruzado potencial (esteroide que es
estructuralmente similar al cortisol:
11-desoxicortisol, prednisolona, corticosterona y
cortisona) que desplazaba cincuenta por ciento de una cantidad fija
de un conjugado de cortisol marcado con HRP comparativo (cortisol no
reducido, HRP-NRC) o conjugado
HRP-RC unido a una cantidad fija de anticuerpo
anti-cortisol.
Se añadieron niveles variados del reactivo
cruzado potencial a los recipientes de muestra o bien el conjugado
de cortisol marcado comparativo (cortisol no reducido,
HRP-NRC) o conjugado HRP-RC de la
presente invención, como se ha descrito anteriormente.
La concentración de reactivo cruzado que da como
resultado un medición de señal luminosa que corresponde a 50% del
máximo alcanzable (todo el conjugado desplazado) se determinó y se
usó para calcular el porcentaje de reactividad cruzada como se
describe más adelante y cuyos resultados se enumeran en la tabla
1.
El porcentaje de reactividad cruzada se define
como la concentración de cortisol que desplazaba el 50% del
conjugado comparativo de HRP-NRC (o el conjugado
HRP-RC) dividido por la concentración de
reactivo-cruzado que desplazaba el 50% del conjugado
comparativo HRP-NRC (o el conjugado
HRP-RC) multiplicado por 100 como se determina por
el procedimiento de ensayo descrito en esta memoria descriptiva
anteriormente.
| Compuesto | Marca comparativa de | Marca de la invención |
| HRP-NRC | de HRP-RC | |
| cortisol | 100 | 100 |
| prednisolona | 34,8 | 24,6 |
| 11-desoxicortisolo | 28,4 | 2,2 |
| cortisona | 5,5 | 1,8 |
| corticosterona | 4,4 | 3,3 |
Estos datos muestran claramente que el conjugado
HRP-RC representativo de la presente invención
proporciona significativamente menos reactividad cruzada en un
inmunoensayo para cortisol. De acuerdo con lo anterior, los ensayos
de cortisol que utilizan cortisol reducido marcado como se describe
en la presente invención mostrará una precisión mejorada; dando como
resultado diagnosis mejorada, tratamiento y seguimiento.
La presente invención se ha descrito en detalle
con referencia particular a ciertas realizaciones de la misma.
Claims (13)
1. Un conjugado de cortisol reducido de
fórmula
en las que X es O, S, sulfonilo, o
fosfono;
X_{1} es un polímero natural o sintético,
marcado o no marcado o una marca;
Y_{1} es un grupo de unión o un enlace;
X_{2} es un polímero natural o sintético,
marcado o no marcado o una marca;
Y_{2} es un grupo de unión o un enlace;
A_{1} y A_{2} son cada uno hidrógeno o
A_{1} y A_{2} juntos forman un enlace simple;
B_{1} y B_{2} son cada uno hidrógeno o
B_{1} y B_{2} junto forman un enlace sencillo; y
E_{1} y E_{2} son cada uno hidrógeno o
E_{1} y E_{2} juntos forman un enlace sencillo;
con tal que al menos uno de A_{1} y A_{2}, o
B_{1} y B_{2}, o E_{1} y E_{2} sean cada uno hidrógeno.
2. El conjugado de la reivindicación 1, en el que
X es O y X_{1} es albúmina sérica bovina.
3. El conjugado de la reivindicación 2, en el que
Y_{1} es metilencarboniloxi.
4. El conjugado de la reivindicación 3, en el que
X_{2} es una peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante.
5. El conjugado de las reivindicaciones 1 a 4, en
una composición acuosa.
6. Un procedimiento para preparar un conjugado de
cortisol reducido como se ha definido en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 que comprende:
hacer reaccionar un compuesto de fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
con un agente
reductor.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el
que el agente reductor es borohidruro.
8. Un procedimiento para preparar un conjugado de
cortisol reducido como se ha definido en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4:
que comprende:
- (i)
- hacer reaccionar un compuesto de fórmula IIA como se ha definido en la reivindicación 6, con un agente reductor, formando por lo tanto un compuesto de la fórmula IA; y
- (ii)
- opcionalmente, hacer reaccionar un compuesto de la fórmula IA o IC, en la que IC es un compuesto que tiene la fórmula
en la que X_{1}, Y_{1},
B_{1}, B_{2}, y E_{2} son como se han definido en la
reivindicación
1;
con un primer agente de acoplamiento, formando
por lo tanto un compuesto de fórmula
o
en la que G_{1} es un grupo de
acoplamiento;
(iii) opcionalmente, hacer reaccionar X_{2} con
un segundo agente de acoplamiento, formando por lo tanto
X_{2}-G_{2}, en la que G_{2} es un agente de
acoplamiento capaz de formar un enlace covalente con el grupo
G_{1} de acoplamiento, y en la que G_{1} y G_{2} pueden ser
iguales;
(iv) opcionalmente hacer reaccionar el compuesto
IA o IC con X_{2}-G_{2} en la que G_{2} es
capaz de formar un enlace covalente con un grupo funcional de
X_{1}, formando por lo tanto el conjugado de cortisol reducido IB
o ID;
(v) opcionalmente hacer reaccionar el compuesto
IIIA o IIIC con X_{2} en la que G_{1} es capaz de formar un
enlace covalente con un grupo funcional de X_{2}, formando por lo
tanto conjugado de cortisol reducido IB o ID;
(vi) opcionalmente hacer reaccionar el compuesto
IIIA o IIIC con X_{2}-G_{2}, formando por lo
tanto conjugado de cortisol reducido IB o ID.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el
que el primer agente de acoplamiento es
N-hidroxisuccinimida éster del ácido
4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxílico
y el segundo agente de acoplamiento es
N-hidroxisuccinimidil éster del ácido
S-acetiltioacético.
10. Un procedimiento para realizar un ensayo
competitivo para cortisol que comprende las etapas de:
- A)
- poner en contacto una muestra sospechosa de contener cortisol con i) un receptor inmovilizado o inmovilizable que se une a cortisol, formando por lo tanto cortisol que está unido y cortisol que no está unido al receptor inmovilizado o inmovilizable, ii) un conjugado de cortisol reducido marcado de fórmula IA, IB, IC o ID como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la que al menos una de X_{1} y X_{2} es un polímero natural o sintético marcado o una marca, formando por lo tanto un conjugado de cortisol reducido marcado que está unido y un conjugado de cortisol reducido marcado que no está unido al receptor inmovilizado o inmovilizable;
- B)
- detectar o bien el conjugado de cortisol reducido marcado que está unido o el cortisol reducido marcado que no está unido al receptor inmovilizado o inmovilizable como una medida de la cantidad de cortisol en la muestra.
11. Un procedimiento para realizar un ensayo de
unión competitiva para cortisol usando un elemento analítico seco
que comprende: a) una zona de dispersión; b) una o más zonas de
reactivos; c) un soporte y d) juntos o separadamente en una o más de
las zonas, un receptor inmovilizado que se une a cortisol, y,
opcionalmente, un conjugado de cortisol reducido marcado como se ha
definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en las que
al menos X_{1} y X_{2} es un polímero natural o sintético
marcado o una marca, en las que el procedimiento comprende las
etapas de:
- A)
- poner en contacto la zona de dispersión del elemento analítico con
- i)
- una muestra sospechosa de contener cortisol, formando por lo tanto cortisol que está unido y cortisol que no está unido al receptor inmovilizado o inmovilizable,
- ii)
- el conjugado de cortisol reducido marcado si no está presenten el elemento analítico seco, formando por lo tanto un conjugado de cortisol reducido marcado que está unido y un conjugado de cortisol reducido marcado que no está unido al receptor inmovilizado o inmovilizable;
- B)
- detectar o bien el conjugado de cortisol reducido marcado que está unido o el cortisol reducido marcado que no está unido al receptor inmovilizado o inmovilizable como una medida de la cantidad de cortisol en la muestra.
12. El procedimiento de la reivindicación 10 o
reivindicación 11 que comprende además la separación del conjugado
de cortisol reducido marcado que está unido del conjugado de
cortisol reducido marcado que no está unido al receptor inmovilizado
o inmovilizable.
13. Un procedimiento para producir anticuerpos
anti-cortisol que comprende las etapas de:
- A)
- inmunizar un animal hospedador con un conjugado de cortisol reducido como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, por lo tanto produciendo anticuerpos que se unen a cortisol;
- B)
- aislar los anticuerpos que se unen a cortisol a partir del suero o plasma sanguíneo del animal hospedador; o
- C)
- retirar el bazo, tejido linfático u otros tejidos u órganos poblados con células productoras de anticuerpos.
- D)
- retirar las células productoras de anticuerpos;
- E)
- preparar hibridomas a partir de las células productoras de anticuerpos;
- F)
- seleccionar los hibridomas que producen anticuerpos que se unen a cortisol; y
- G)
- aislar los anticuerpos que se unen a cortisol.
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