DK172410B1 - Histaminderivat, histamin-immunogen-konjugat samt antistof fremstillet mod konjugatet - Google Patents

Description

DK 172410 B1

Den foreliggende opfindelse angår et histaminderivat, et histamin-immunogen-konjugat samt et antistof fremstillet mod konjugatet.

Histamin er en kraftig vasoaktiv formidler, 5 der frigøres fra specifikt sensibiliserede vævsmastceller og basofile efter eksposition for specifikke allergener , hvorved der udløses en allergisk reaktion hos et individ. Medens in-vivo-diagnose af en allergisk reaktion kan ske ved hjælp af en allergen hudprøve, kan en 10 sådan afprøvning være farlig på grund af muligheden for en anaphylaktisk reaktion, kan gøre patienten følsom over for allergenet og er i reglen ubehagelig. In vi-tra-prøvernetoder findes til måling af koncentrationen af allergen—specifikt IgE-antistof i serum, men man 15 mener, at en mere anvendelig bestemmelse ville være en bestemmelse af histaminfrigørélse, hvilket mere nøjagtigt kan afspejle allergireaktionen in vivo.

Den foreliggende opfindelse angår således histaminderivater, immunogen-konjugater omfattende hista-20 min eller histamindérivaterne koblet til immunogene bærermaterialer og antistoffer fremstillet mod sådanne im-munogenkonjugater. Sådanne antistoffer er anvendelige til immunanalyser til bestemmelse af mængden af histamin i biologiske væsker eller laboratorievæsker som f.

25 eks. efter eksposition for sensibiliserede basofiler med en række allergener.

Europa-patentansøgning nr. 110640 omhandler en på receptor baseret konkurrende inhiberingsprøve til bestemmelse af histaminniveauer i en kropsvæske eller 30 laboratorievæske. Der omtales også "histamin-indikator"--konjugater, såsom histamin/peberrodsperoxidase-konju-gat, idet sidstnævnte konjugeres til histamin ved omsætning med l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid. Ovennævnte offentliggjorte patentansøgning gennemgår 35 anden metodik til kvantitativ bestemmelse af histamin, 2 DK 172410 B1 såsom variationer i en artho-phthalaldehyd-konjugerings-prøve, en enzymatisk isotopprøve og chromatografiske metoder.

I Proc. Natl. Acad. Sci. USA, bd. 81, side 5 2572-2576 (april 1984) omtales anvendelse af et histamin- antiserum ved en immunhistokemisk undersøgelse af hi-staminholdige celler i rottehjerne. Denne undersøgelse blev foretaget for at fastslå, om histamin fungerer som neurotransmitter i pattedyrs centralnervesystem.

10 Mita m.fl., Agents and Actions, bd. 14, 5/6 (1984) omtaler forskellige hapten/bærer-konjugater, der anvendes i et forsøg på at dyrke et polyklont antistof mod histamin. Imidlertid bemærker forfatterne, at forsøget på at producere et specifikt antistof mod hista-15 min mislykkedes.

Den foreliggende opfindelse angår histaminderivater valgt blandt:

a) p=-1 CH2CH2NH — R — X

20 HNV^N

l*H2 b) r=-1—CH?CH — R — x HN 1 °9 25 CH2NH2

c) f~ i—CH — R — x HN A

30 hvor R er en forbindende gruppe, der er en lineær aliphatisk gruppe med 1-10 carbonatomer, og X er en endestillet funktionel gruppe valgt blandt carboxy, amino, thiol og hydroxy, idet dog i derivatet med formlen b) R ikke er en methylengruppe -CH2-, når X er hydroxy.

35 Opfindelsen angår endvidere et histamin-immunogen- -konjugat af et immuniserende bærermateriale, der er koblet DK 172410 B1 3 til de ovenfor angivne histaminderivater eller histamin, hvilket konjugat er ejendommeligt ved, at konjugaterne er valgt blandt a) — 5 j' ' i—CHgCHgNH — R — X1 ........ bærer

HN^^N

_ _ P

10 . . - - b> I - - I—CH2CH — R — X'--bærer

— _J P

15 C) Γ" CH0NH« I 2 2 —CH — R — Xr--bærer 20

_ _I P

hvor R er en forbindende gruppe, der er en lineær aliphatisk gruppe med 1-10 carbonatomer, og X' er resten af en ende-25 stillet funktionel gruppe X, der er valgt blandt carboxy, amino, thiol og hydroxy, idet dog i derivatet med formlen b) R ikke er en methylengruppe -CH2-, når X er hydroxy, og p er fra ca. 1 til ca. 120, og "bærer" er et immunogent bærermateriale.

30 Opfindelsen angår endvidere antistoffer, der er frem stillet mod de ovenfor beskrevne konjugater, herunder monospecifikke (dvs. monoklone) antistoffer, som kan anvendes i prøvesæt og ved immunologiske fremgangsmåder til bestemmelse af histamin i biologiske væsker og laboratorievæsker.

35 Histaminderivaterne ifølge opfindelsen kan fremstilles

således, at de omfatter en lang række forbindende grupper R

4 DK 172410 B1 og endestillede funktionelle grupper X. Således kan R være lineær eller forgrenede alkylener omfattende fra 1 og op til 10 eller derunder og i reglen mindre end 6 carbonatomer (dvs. methylen, ethylen, n-propylen, iso-propylen, n-butylen 5 osv.). Desuden kan sådanne alkylener indeholde andre sub-stituentgrupper, såsom cyano, amino (herunder substitueret amino), acylamino, halogen, thiol, hydroxyl, carbonylgrupper, carboxyl (herunder substituerede carboxyler, såsom estere, amider og substituerede amider). Den forbindende gruppe R 10 kan også indeholde eller bestå af substituerede eller usub-stituerede aryl-, aralkyl- eller heteroarylgrupper (f.eks. phenylen, phenethylen osv.). Desuden kan sådanne bindinger indeholde et eller flere heteroatomer valgt blandt nitrogen, svovl og oxygen i form af ether, ester, amido, amino, thio-15 ether, amidino, sulfon eller sulfoxid. Sådanne bindinger kan desuden omfatte umættede grupperinger, såsom olefiniske eller acetyleniske bindinger, imino- eller oximino-grupper. Fortrinsvis er R en kæde, i reglen aliphatisk, der omfatter mellem 1 og ca. 20 atomer, oftere mellem 20 1 og 10, undtagen hydrogen, hvoraf mellem 0 og 5 er he teroatomer valgt blandt nitrogen, oxygen og svovl.

Derfor er valget af den bindende gruppe R ikke kritisk for den foreliggende opfindelse og kan vælges af en fagmand, når han blot sørger for, at der produceres 25 stabile forbindelser. På lignende måde kan den endestillede funktionelle gruppe X variere stærkt, selv om amino, carboxyl, thiol og hydroxyl foretrækkes. Af de foretrukne derivater er det følgende særlig foretrukket: 30 I -|—CH^CH^NH — CH2CH2 — COOH (X) ΗΝ^,'Ν 35 5 DK 172410 B1

Repræsentative metoder til fremstilling af histaminderivaterne med forskellige forbindende R-grup-per og endestillede funktionelle X-grupper vil nu blive beskrevet.

5 Histaminderivater med formlen I, hvor X er carboxyl, kan fremstilles ved omsætning af histamin med omega-bromalkansyrer (dvs. Br -fCK^^COOH, hvor n er ca. 1 til ca. 10). Sådanne derivater med formlen I, hvor X er amino, kan syntetiseres ved omsætning af 10 histamin med omega-bromalkylphthalimider til fremstilling af et mellemprodukt med formlen 0

II

i: tt" i CH9CH9NH CH, -/ ΓΠ 15 I I 2 2 2 ^ (XI) ^ o hvor n har en værdi på ca. 1 til ca. 10.

Efterfølgende behandling af mellemproduktet 2o med formlen XI med hydrazin giver det tilsvarende ami-no-funktionaliserede histaminderivat med formlen I, (dvs. hvor R er X er am^no^ ·

Derivater med formlen I, hvor X er thiol, kan fremstilles ved at omsætte den tilsvarende aminoforbin-25 delse med N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat ifølge J. Carlson m.fl.'s metode i Biochem. J. 173, 723 (1978) . Fjernelse af den opnåede beskyttende gruppe giver et derivat af forbindelsen med formlen I, der har formlen

30 1 I CH-CH-'NH CH2 NH - C - CH2CH2 - SH

(XII) hvor n har en værdi fra ca. 1 til ca. 10.

35 Alternativt kan de derivater med formlen I, hvor X er thiol, også fremstilles ved at omsætte den 0 DK 172410 B1 6 tilsvarende aminoforbindelse med SAMSA-reagens som beskrevet af Klotz og Heiney, Arch. Biochem. Biophys. 95, 605 (1964). Efterfølgende fjernelse af den beskyttende gruppe giver et derivat af forbindelsen med formlen I, som har formlen 5

0 COOH

Γ" i—CH-ChLNH —f- CH« NH — C — CHL--CH

I \ c c c n 2 i (yttt\ HV^N SH ( 10 hvor n kan være ca. 1 til ca. 10.

Histaminderivater med formlen I, hvor X er hydroxyl, kan let fremstilles, f.eks. ved hjælp af li-thiumaluminiumhydrid-reduktion af det tilsvarende carb-oxylderivat, f.eks.

1 o I — j—CH2CH2NH -4” CH2 —COOH Li Al HN^j-N *

Γ~—I ch2ch2nh -4- CR, -^-OH

20 HN Λ hvor m kan være fra ca. 1 til ca. 10,

Histaminderivater med formlen II kan fremstilles, f.eks. ved kemisk transformering af L-histidi-25 nol [Isn og Casy, J. Med. Chem. 13, 1027 (1970)] ved hjælp af følgende repræsentative reaktionsskema: 0 ^h2 nhcoc(ch3)3

p-, 1 CH2CH~CH20H r==rp-CH2—CH-CH20CH2CH2CN

(XIV) (XV) 35 0 DK 172410 B1 7 ΪΗ2 I-------1- CH2CH — CH20CH2CH2CH2NH2

* HN>V^N

5 (XVI) L-histidinols (XIV) aminofunktionalitet beskyttes som t-boc-derivatet, og hydroxylgruppen omsættes med acrylonitril, hvilket giver et mellemprodukt med formlen 10 XV (R.T. Buckler og F.E. Ward, USA patentskrift nr.

4.495.281). Katalytisk reduktion af cyanogruppen efterfulgt af fjernelse af den t-boc-beskyttende gruppe med fortyndet HCl giver forbindelsen med formlen XVI (dvs. en type histaminderivat med formlen II, hvor R er 15 -CH2OCH2CH2CH2-, og X er NH2).

Funktionaliserede histaminderivater med formlen III [c) i.krav 1] kan f.eks. fremstilles ud fra N-triphenyl-methyl (dvs. trityl-)-derivatet af imidazol-4-acetonitril med formlen XVII [J.I. DeGrawm.fi., J. Med. Chem. 20, 1671 20 (1977) ] ved hjælp af følgende repræsentative reaktionsskema:

CN

p- i CFLCN p=|-C)HCH2f4C00C2H5 25 tr1ty/-v^N NaH/HMPTA trl

bkouTcoocThJ

(XVII) ά H c 5 (XVIII) ch9nh9 30 | | CH4CH2f4C00 ° NH4 ® 1. NaOH (fort.) N Λ -> trityl Hf 2. H2,NH3,Ni, ^ 150 atm· (XIX, 35 0 DK 172410 B1 8 CH2NH2

p==T-CH4CH2f4COOH

5 (XX)

Forbindelsen med formlen XVII alkyleres med ethyl-5-bromvalerat (Aldrich Chemical Co., Milwaukee,

Wisconsin) i nærvær af natriumhydrid og hexamethylphos-phorsyretriamid (HMPTA). Produktet med formlen XVIII reduceres efter hydrolyse med fortyndet alkali af esterfunktionen til mellemproduktet med formlen XIX. Der kan anvendes en række forskellige betingelser ved denne reduktion, såsom ved Raney-nikkel-ammoniak-hydrogen ved 150 atm. tryk (f.eks. G.J. Durant m.fl., engelsk patentskrift nr. 1.341.376, Chem. Abs. 80P, 95958g, 1974).

Fjernelse af den trityl-beskyttende gruppe giver en forbindelse med formlen XX, et histaminderivat med formlen III, hvor R er og X er carboxyl.

20 2 4

Repræsentative histaminderivater med formlen IV kan f.eks. fremstilles ved hjælp af den fremgangsmåde, der er beskrevet af L.K. Kesztyus m.fl. i engelsk patentskrift nr. 1.017.479 og i Chem. Abst. 64, Pl2470j. Denne 25 metode giver et repræsentativt derivat af forbindelsen med formlen IV med følgende formel H2N“\ /y-N=N“-]===pCH2CH2NH2 (XXI) 30 ^

Histaminderivaterne kan derpå anvendes til at koble derivaterne til et immunogent bærermateriale ved hjælp af forbindelsensgruppen R og den endestillede funktionelle gruppe X i derivaterne. Det immunogene bærer-

wO

materiale kan vælges blandt de alment kendte. I de fleste tilfælde er bæreren et protein eller polypeptid, men 0 DK 172410 B1 9 også andre materialer, såsom carbonhydrater, polysacchari-der, lipopolysaccharider, nucleinsyrer og lignende med tilstrækkelig størrelse og immungeneicitet, kan an-' vendes. Overvejende har immunogene proteiner og poly-5 peptider molekylvægte mellem 5.000 og 10.000.000, fortrinsvis over 15.000 og mere almindeligt over 50.000. Almindeligvis vil proteiner taget fra én dyreart være immunogene, når de indføres i blodstrømmen på andre arter.

Særlig anvendelige proteiner er sådanne som albuminer, 10 globuliner, enzymer, hæmocyaniner, gluteliner eller proteiner med signifikante ikke-proteinagtige bestanddele, f.eks. glycoproteiner og lignende. Yderligere kendt teknik angående gængse immunogene bærermaterialer og metoder til kobling af haptener dertil kan findes følgende 15 steder: Parker, Radioimmunoassay of Biologically Active Compounds, Prentice-Hall (Englewood Cliffs, New Jersey, USA, 1976) ? J. Butler, J. Immunol. Meth. 7, 1-24 (1975), og Pharmacol. Rev. 29(2), 103-163 (1978)? Weinryb og Shroff, Drug Metab. Rev. 10, 271-283 (1975)? Broughton 20 and Strong, Clin. Chem. 22, 7.26-732 (1976), og Playfair m.fl., Br. Med. Bull. 30, 24-31 (1974). Foretrukne immunogene bærermaterialer til brug ved den foreliggende opfindelse er okseserumalbumin og nøglehulsklæberhæmocy-anin. Særlig foretrukket til brug ved opfindelsen er 25 nøglehulsklæberhæmocyanin. Følgelig er et særligt foretrukket immunogenkonjugat et konjugat dannet ved kobling af histaminderivatet med formlen X til nøglehulsklæberhæmocyanin .

Histaminderivaterne kan kobles til de immu-30 nogene bærermaterialer ifølge velkendte metoder.Når f.eks. således den endestillede funktionelle gruppe X i histaminderivatet er amino, kan derivatet fastgøres direkte på bæreren på følgende måde. Aminogruppen i histamin-molekyldelen kan fastgøres til amino-holdige bærere 35 (f.eks. protein- eller polypeptidbærere) ved hjælp af toluen-2,4-diisocyanat (A.F. Schick og S.J. Singer, J.

10 DK 172410 B1 o

Biol. Chem. 244, 406 (1969)]? glutaraldehyd [L.A. Froh-man m.fl., Endocrinol. 87, 1055 (1979)]; bis-imidater [A. Dutton m.fl., Biochem. Biophys. Res. Comm. 23, 730 (1966)]? og chlortriazin [T. Lang m.fl., J.C.S. Perkin 5 4, 2189 (1977)]. Disse aminogrupper kan også kobles til carboxyl-bærende bærere (f.eks. igen protein- eller polypeptidbærere) ved hjælp af almindelige peptid-bindings-dannende reaktioner ved hjælp af blandede an-hydrider, aktiverede estere, acylaziddannelse, carbodi-10 imider og lignende. Jfr. Peptides, udg. Goodman og Meinhofer, John Wiley & Sons, (New York, 1977), side 6 pp, og The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, bd. 1, Academic Press (New York, 1979). Samme fremgangsmåder gælder ligeledes for fastgørelse af carboxylerede 15 derivater (dvs. sådanne histaminderivater, hvor den endestillede funktionelle gruppe X er carboxyl) på amino--bærende bærere.

Thiolerede histaminderivater (dvs. sådanne histaminderivater, hvor den endestillede funktionelle grup-20 pe er thiol) kan fremstilles ud fra de tilsvarende amino-forbindelser ved hjælp af I.M. Klotz og R.E. Heiney's metode, Arch. Biochem. Biophys. 95, 605 (1962), og disse fastgøres på thiol-holdige polymere (IgG eller thiolerede proteiner) ved hjælp af disulfid-bytter-metoden [J.

25 Marin m.fl., Biochem. 20, 4229 (1981)]. Alternativt kan en amino-holdig polymer omsættes med reagenset MBS og produktet kobles til thiol-holdige derivater ved hjælp af den metode, der er beskrevet af T. Kitagawa og T. Ai-kawa, J. Biochem. 79, 233 (1976)]. Forskellige andre kob-30 lingsmetoder står til rådighed for fagfolk på området til at forbinde de forskellige histaminderivater ifølge opfindelsen med gængse immunogene bærermaterialer.

Resten X' i konjugatet vil naturligvis variere afhængigt af den endestillede funktionelle gruppe X 35 i det bestemte histaminderivat,· der anvendes, dvs. den kan være imino, sulfo, oxy og lignende.

11 DK 172410 B1 o

Alternativt kan den endestillede aminogruppe i histaminmolekylet per se kobles direkte med immunogene bærer-materialer (f.eks. okse- eller humanserumalbumin, nøglehusklæberhæmocyanin og lignende) uden en forbinden-5 de mellemgruppe R eller andre endestillede funktionelle grupper X som tidligere beskrevet for histaminderivaterne ifølge opfindelsen. Ved dannelsen af disse konjuga-ter skal imidlertid den endestillede aminogruppes basiske karakter bibeholdes, når der anvendes et konjugat af denne 10 type (dvs. en type, der ikke indeholder en bindende mellemgruppe R eller andre endestillede funktionelle grupper X) ved dannelsen af antistoffer med tilstrækkelig specificitet for histamin uden krydsreaktivitet af betydning med histidin. Hvis imidlertid denne endestillede 15 aminofunktions basiske karakter går tabt under kobling, kan konjugaterne af denne type stadig anvendes til forskellige af de nedenfor beskrevne immunanalyser til andre formål end at producere antistoffer derimod. Kobling til disse konjugater kan udføres ved hjælp af gæng-20 se metoder som beskrevet ovenfor, såsom ved hjælp af almindelige peptidbindings-dannende reaktioner ved hjælp af blandede anhydrider, aktiverede estere, acylaziddan-nelse, carbodiimider og lignende. Fortrinsvis er koblingsreagenset til disse konjugater et carbodiimid, i-25 sær l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydro-chlorid (EDAC).

Det skal påpeges, at som det anvendes i de formler, der beskriveir de her omtalte immunogenkonjuga-ter, er "p" antallet af histaminmolekyIdele, der er kon-30 jugeret til bæreren. Tallet p omtales sommetider som immunogenets epitopiske densitet og vil sædvanligvis ligge på gennemsnitlig ca. 1 til ca. 120, mere almindeligt fra 1 til ca. 50. Disse densiteter kan imidlertid variere stærkt afhængigt af det særlige bærermateriale, der 35 anvendes.

0 DK 172410 B1 12

Fremstilling af specifikke antistoffer ved hjælp af de omtalte immunogen-konjugater kan ske ved hjælp af en hvilken som helst gængs metode. Der findes talrige litteratursteder, der beskriver de fundamentale 5 aspekter ved fremkaldelse af antistofdannelse; således Parker, Radioimmunoassay of Biologically Active Compounds, Prentice-Hall (Englewood Cliffs, New Jersey, USA, 1976). Almindeligvis injiceres et værtsdyr, såsom en kanin, ged, mus, marsvin eller hest et eller flere 10 af en række forskellige steder med det immunogene konju-gat, ofte blandet med et adjuvans. Yderligere injektioner foretages på samme sted eller forskellige steder med regelmæssige eller uregelmæssige mellemrum, hvorefter der tages blodprøver for at bedømme antistoftiter, 15 indtil det afgøres, at den optimale titer er nået.

Værtsdyret tappes for blod, så at der fås et passende volumen specifikt antiserum. Når det er ønskeligt, kan der foretages rensningstrin for at fjerne uønsket materiale, såsom ikke-specifikke antistoffer, før antiserum-20 met anses for egnet til brug til gennemførelse af virkelige analyser.

Ved en foretrukken udførelsesform fås antistofferne ved hjælp af somatisk-cellehybridiseringsmetoder, idet sådanne antistoffer almindeligvis omtales som mono-25 klone antistoffer. Fremstillingen af monoklont antistof vil blive eksemplificeret detaljeret nedenfor, men der kan findes en gennemgang af sådanne monoklont-antistof-metoder i følgende publikationer: Lymphocyte Hybridomas, udg. Melchers m.fl., Springer-Verlag (New York 1978); 30 Nature 266, 495 (1977); Science 208, 692 (1980), og Methods in Enzymology 73 (del B), 3-46 (1981).

Antistofferne fremstillet ud fra immunogenerne ifølge opfindelsen kan anvendes ved forskellige immunana-lysemetoder, og de tilsvarende reagensmidler til bestem-35 melse af histamin, herunder agglutineringsmetoder, ra-dioiimunanalyser, heterogene enzym-immunanalyser (f.eks.

0 DK 172410 B1 13 USA patentskrift nr. 3.654.090), heterogene fluorescerende inununanalyser (f.eks. USA patentskrifter nr. 4.201.763, 4.171.311, 4.133.639 og 3.992.631) og homogene (separationsfri) immunanalyser. Sådanne homogene immunanalyser _ omfatter metoder, såsom fluorescensafbrydelse eller -for-

O

øgelse (f.eks. USA patentskrift nr. 4.160.016), fluorescenspolarisering (J. Exp. Med. 122, 1029 (1965), enzym-substrat-mærket immunanalyse (USA patentskrift nr.

4.279.992 og engelsk patentskrift nr. 1.552.607), med ^ prosthetisk gruppe mærket immunanalyse (USA patentskrift nr. 4.238.565), med enzym-modulator mærket immunanalyse, f.eks. ved hjælp af inhibitor-mærkestoffer (USA patentskrifter nr. 4.134.792 og 4.273.866), enzym-mærket immunanalyse (f.eks. USA patentskrift nr. 3.817.837), ener-15 gi-overførsels-immunanalyse (USA patentskrift nr. 3.996.345), kemisk-eksciteret fluorescens-immunanalyse (USA patentskrift nr. 4.238.195) og dobbelt-antistof-sterisk hindret immunanalyse (USA patentskrifter nr. 3.935.074 og 3.998.943). Desuden kan derivaterne ifølge opfindelsen 20 anvendes til fremstilling af de mærkede konjugater, der er nødvendige for at udføre visse af de ovenfor beskrevne immunanalyser. Passende derivater kan f.eks. være radiomærkede, mærkede med fluorescens-molekyIdele, kemi-luminescerende molekyldele og lignende ifølge standard-25 metoder. På lignende måde kan en molekyldel, der er passende mærket til homogene metoder, f.eks. et enzymsubstrat, en prosthetisk gruppe, en enzymmodulator eller et enzym (som er et protein og på lignende måde kan kobles på den immunogene bærer som beskrevet ovenfor) kob-30 les til derivaterne, så at der fås mærkede konjugater.

Ved en foretrukken udførelsesform udføres histaminfri-gørelses-immunanalysen på passende måde via en enzym-im-munanalyse, hvor antistoffet (fortrinsvis et monoklont antistof) er koblet til et enzym, såsom peberrods-per-35 oxidase, alkalisk phosphatase, lysozym, glucose-6-phos-phat-dehydrogenase og lignende. Koblingen sker ved 0 DK 172410 B1 14 hjælp af gængse metoder, idet der anvendes forskellige tværbindingsmidler, såsom glutaraldehyd, dimaleinimid eller thiolreagenser, som beskrevet af J.W. Freytag m.fl.,

Clin. Chem. 30, 417-420 (1984). Der fås så enzymsub-5 strat (såsom et chromogent enzymsubstrat), og antigenkoncentration kan let korreleres med standard-antigen-koncentrationer.

Sådanne analyser gennemføres i reglen på biologiske eller laboratoriemæssige væsker. Udtrykket "bi-10 ologiske eller laboratoriemæssige væsker", som det anvendes her, refererer til flydende præparater, såsom f. eks. ekstrakter fremstillet af en række forskellige biologiske stoffer, såsom ost, fisk, vin og lignende, samt naturlige biologiske materialer, såsom blod, urin, spyt 15 og lignende. Udtrykket refererer også til et hvilket som helst stof eller materiale, hvis histaminindhold skal bestemmes, herunder områder inden for histokemien, hvor det kan være ønskeligt at bestemme, hvor histamin befinder sig i en bestemt prøve.

2Q Opfindelsen kan anvendes til fremstilling af et prøve sæt, såsom en enhed, der fås i handelen, til udførelse af en immunanalyse for histamin. Sådanne sæt vil omfatte en eller flere beholdere, såsom mikrotiterplader, faste understøtninger, reagensglas, bakker og lignende, samt antisera, 25 f.eks. i frysetørret form. Sættet kan også indeholde standardmænger histamin, hvorved der kan konstrueres en standardkurve, beholdere til eventuelle nødvendige reagenser til fremkaldelse af en observerbar eller på anden måde målelig reaktion osv. Det er åbenbart, at fagmanden 30 kan fremstille et sæt, der er egnet til brug i en hvilken som helst specifik immunanalyse, hvis præcise fysiske udførelsesform vil afhænge af den påtænkte type analyse.

Et foretrukket prøvesæt er ligeledes en enhed i handelen fremstillet til at bestemme fremkaldt hi-35 staminfrigørelse fra celler i biologiske væsker, såsom 0 DK 172410 B1 15 helblod, basophile, urin, spyt og lignende. Komponenterne i et sådant sæt kan f.eks. omfatte et eller flere midler til fremkaldelse af histaminfrigørelse, forskellige fortyndingsmidler og puffere foruden antiseraene, 5 mikrotiterplader, histaminstandarder, reagenser og lignende som tidligere beskrevet. Dette sæt kan også indeholde et histaminkonjugat eller antistof bundet til en fast understøtning samt et mærket antistof eller mærket histaminkonjugat.

10 De følgende eksempler skal belyse den forelig gende opfindelse og skal ikke fortolkes som en begrænsning heraf.

15 20 25 30 35 0 DK 172410 B1 16

Eksempel 1

Fremstilling af histamin-propionsyrederivat

En opløsning af 1,11 g histamin (fri base) og 3,02 ml triethylamin i 10 ml dimethylformamid (DMF) 5 sættes til en opløsning af 1,53 g 3-brom-propionsyre i 5 ml DMF. Denne opløsning omrøres ved stuetemperatur i to timer og opvarmes derpå ved 80°C i 2,5 timer, hvorefter opløsningsmidlerne fjernes ved afdampning, hvilket efterlader en gummiagtig remanens. Remanensen opløses 10 i 10 ml af en puffer fremstillet af en blanding af CHCl^/MeOH/NH^OH = 10:5:1 og påføres på en 60 g silica-gelkolonne (pakket i den samme puffer). Kolonnen elue-res med denne puffer med en hastighed på ca. 25 ml pr. fraktion. Det ønskede produkt kombineres (fraktioner 15 33-63) og inddampes til tørhed. Remanensen krystalli seres med 10 ml ethanol, hvilket giver 600 mg af den i overskriften nævnte forbindelse (ovenfor gengivet med formlen X), smeltepunkt 190-191°C.

Analyse: Beregnet for CgH-^N^Oj·l/2Ho0: 20 C 49,99, H 7,34, N 21,87

Fundet: C 50,62, H 7,51, N 21,89.

Eksempel 2

Fremstilling af histamin-propionsyre/okseserumalbumin-im-25 munogen-konjugat 68 mg histaminpropionsyre (fremstillet som beskrevet i eksempel 1) og 100 mg okseserumalbumin opløses i 15 ml H^O. Den opnåede opløsning afkøles i isbad, og pH justeres til 4,5 med IN HCl. Hertil sættes under om-30 røring 320 mg l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbo-diimid-hydrochlorid (EDAC) i små portioner. Denne reaktionsblandings pH holdes på 4,5-5,0 (med IN HCl) under tilsætningen af EDAC, og derefter omrøres blandingen ved 0°C i 3 timer og derpå natten over ved 5°C. Blan-35 dingens pH justeres derpå til 7,0 ved tilsætning af IN NaOH, og blandingen påføres derpå på en "P-10"-kolonne 0 DK 172410 B1 17 (2,5 x 40 cm, bragt i ligevægt med en 0,025 molær phos-phatpuffer, pH 7,0). Den samme phosphatpuffer anvendes derpå til at eluere kolonnen. Den første UV-absorp-tionsproteinspids opsamles, og proteinkoncentrationen 5 bestemmes ved absorption ved 280 nm, dvs. A2qq nm = 0,66 for en mg/ml-opløsning. Mængden af histamin bestemmes ved hjælp af den residualfri-NH9-gruppe på immunoge-net ved hjælp af Habeeb's TNBS-metode. Ved hjælp af denne metode udvindes ca. 80-90% af okseserumalbuminet.

10 Molforholdet histamin:okseserumalbumin viser sig at være mellem 13 og 21.

Eksempel 3

Fremstilling af histamln-propionsyre/nøglehulsklæberhæmo-15 cyaninimmunogen-konjugat 200 mg rå nøglehulsklæberhæmocyanin (fås hos Cal-Biochem) blandes med 4 ml 50 mmolær carbonatpuffer (pH 9,6) og omhvirvles i kort tid og lydbølgebehandles.

Den opnåede suspensions pH justeres til pH 9,6 med 2N 20 NaOH og omrøres derpå ved stuetemperatur natten over. Blandingen centrifugeres derpå ved 10.000 omdr./min. i 15 minutter, hvorefter overfasen udvindes, og den totale proteinkoncentration bestemmes ved absorption ved 280 nm (20 mikroliter af opløsningen fortyndes med 2,0 ml vand, 25 og A2ggnm = 1,66 anvendes til en mg/ml-opløsning; der udvindes ca. 100 mg protein). 82 mg histaminpropionsy-re (fremstillet som beskrevet i eksempel 1) sættes til ovennævnte overfase, og pH justeres til pH 5,0 ved tilsætning af IN HCl. Derpå anvendes vand til at bringe 30 det samlede volumen på 7,5 ml, og opløsningen afkøles i isbad. Der sættes 155 mg l-ethyl-3-(3-dimethylaminopro-pyl)-carbodiimid til den afkølede opløsning under omrøring, og pH holdes mellem 4,7 og 4,9 i to timer (0°C).

Derpå justeres opløsningens pH til 5,5 og omrøres natten 35 O

over ved 5 C. Blandingen overføres til dialysesystem (afskæringsgrænse 12.000-14.000 Dalton) og dialyseres mod 1 liter phosphatpufret saltvandsopløsning ved 5°C.

0 DK 172410 B1 18

Efter 5 skift (7 dage) udvindes suspensionen i systemet, hvoraf en lille del centrifugeres ved 10.000 omdr./min. i 15 minutter. Overfasen anvendes til at bestemme proteinkoncentrationen ved absorption ved 280 nm, og hista-5 minmængden bestemmes ved hjælp af den residua]fri-NH0-gruppe på immunogenet ved hjælp af Habeeb's TNBS-meto-de. Alle materialerne kombineres og fortyndes til ca.

50 ml med phosphatpufret saltvandsopløsning til opnåelse af det ønskede immunogenkonjugat. Molforholdet mel-10 lem histamin og nøglehulsklæberhæmocyanin viser sig at ligge mellem 83 og 116.

Eksempel 4

Fremstilling af histamin/okseserumalbumin-.imipunogenkon-15 jugat 75 mg okseserumalbumin (BSA), 38,4 mg 1-ethyl--3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid og 184 mg histamin blandes i en 1 molær borsyreopløsning til et samlet volumen på 4,0 ml (pH holdes på 4-5). Efter omrøring · 20 natten over (stuetemperatur) dialyseres blandingen udtømmende mod phosphatpufret saltvandsopløsning. Absor-bans ved 280 nanometer (nm) måles, og proteinkoncentrationer beregnes. Histaminepitopdensitet bestemmes ved scintillationstælling ved hjælp af tritieret histamin-25 sporstof, hvor to repræsentative cykler har epitopden- siteter på 17 og 53. Konjugaterne fra de to cykler kombineres og anvendes som beskrevet ved analysemetoden i-følge eksempel 6.

30 Eksempel 5

Antistoffremstilling

Ved hjælp af standardmetoder immuniseres BALB/C-hunmus med histamin/propionsyre/okseserumalbumin- og/el-ler histamin/propionsyre/nøglehulsklæberhæmocyanin-immuo-35 genkonjugater (fremstillet som beskrevet i eksemplerne hhv. 2 og 3) og tappes for blod periodevis i et tidsrum 0 DK 172410 B1 19 på ca. 4 måneder, fliltceller fra immuniserede mus blandes med den ikke-udskillende myelom-cellelinie X63.Ag8 653 (tilgængelig hos The American Type Culture Collection med deponeringsnummer CRL 1580) i forholdet 2:1 og 5 sammensmeltes med 50% polyethylenglycol (1.500 molekylvægt) i nærvær af RPMI-1640-mediumf der ikke indeholder kalvefosterserum. De opnåede hybridomer udsåes i mikro-titerplader med 96 fordybninger sammen med musethymo*-cytter som fødeceller. Det grundlæggende vævskulturme-10 dium er sammensat af 15% kalveforsterserum og RPMI 1640 indeholdende hypoxanthin og thymidin. Hybrider udvælges ved at sætte aminopterin til dyrkningsmediet.

Anti-histamin-aktiviteten i hel serum påvises ved hjælp af polyethylenglycol-(PEG)-fældning. 10 .uli-15 ter) H-histamin (New England Nuclear) indeholdende 70.000-100.000 tællinger pr. minut (cpm) inkuberes med enten lOO^uliter museserum (1:10 fortynding med phosphat-pufret saltvandsopløsning) eller lOO^uliter vævskultur-overfase i 2-3 timer ved stuetemperatur. Når det drejer 20 sig om vævskulturoverfaser tilsættes lOO^uliter oksegam-maglobulin (2 mg/ml). Antistof fældes med 600^uliter polyethylenglycol (PEG) 6000 (20% væ/vo). Pellet'en vaskes to gange med 20% PEG, resuspenderes i destilleret vand og tages op i 3 ml flydende scintillationstællings-25 væske med henblik på scintillationstælling

Kulturer af hybridomceller, der er postive ved PEG-fældningsanalysen, ekspanderes og klones ved en enkeltcelle-udvælgelsesmetode. Ved hjælp af et spejlvendt mikroskop trækkes enkeltceller fra en fortyndet celle-30 suspension over i en aflang Pasteur-pipette. Enkeltcellen udsåes i en mikrotiterfordybning indeholdende muse-thymocytfødeceller.

Klonede hybridomer (107 celler/mus) ekspanderes i ascites i med "Pristan" igangsatte BALB/C-mus.

35 Antistof fra ascites renses ved hjælp af caprylsyrefæld-ninge på følgende måde. To volumendele acetatpuffer (60 i 0 DK 172410 B1 20 mmolær, pH 4) blandes en volumendel ascites, og pH justeres til 4,8. Der tildryppes 0,74 ml caprylsyre pr.

10 ml ascites ved stuetemperatur, og den opnåede suspension omrøres i 30 minutter. Efter centrifugering ved 5 4.000 x G opsamles overfasen og dialyseres udtømmende mod phosphatpufret saltvandsopløsning ved 4°C til opnåelse af en Ig-fraktion. Højtydende væskechromatogra-fi af den rensede Ig-fraktion afslører en overvejende spids ved en molekylvægt, der svarer til muse-IgG. Un-10 derklasse- og isotypeanalyseved hjælp af et "Chemicon"-museisotypebestemmelsessæt konstaterer, at hver af de ekspanderede hybrider producerer IgG^. Antistofaffini-teter måles ved hjælp af RIA-inhiberingsanalysen som beskrevet af Mueller i Methods in Enzymology 92, 589-15 601 (1983), Academic Press. Denne metode indebærer be stemmelse af den fraktion antistofopløsning, der er nødvendig for at binde en bestemt mængde 3H-histamin (bestemt ved hjælp af PEG-fældningsanalysen). Derpå bestemmes den mængde kold histamin, der er nødvendig for at 20 inhibere 50% af sporstofbindingen. Affinitetskonstanter for de udvalgte kloner bestemmes til ca. 2 x 10^M Det er signifikant, at antistof produceret ved hjælp af denne metode, ikke udviser væsentlig krydsreaktivitet med histidin (metabolisk histaminforstadie) eller 1-me-25 thyl-histamin, hvilket gør antistoffet anvendeligt til en helblodsanalyse for histamin. Hybridomet, der producerer antistoffet, er blevet deponeret hos The American Type Culture Collection og har fået nummeret HB 8831.

30 Eksempel 6

Histaminfrigørelsesanalyse

Histamin/okseserumalbumin-konjugatet ifølge eksempel 4 sættes til 0,1 molært NaHCO^, pH 9,6, til en koncentration på 75^ug/ml. 50^,uliter alikvote mængder 35 af denne opløsning anbringes i fordybningerne i en rund-bundet mikrotiterbakke (omtalt som en "coating plate").

0 DK 172410 B1 21

Nogle få fordybninger forbliver enten åbne eller fyldes med SO^uliter okseserumalbumin (75^ug/ml) i 0,1 molær NaHCO^-puffer som kontrol. Et låg med 96 tapper (såsom "Nunc TSP'^ eller "Falcon FAST'®-låg) anbringes derpå 5 på dækpladen og inkuberes i ca. en time ved stuetemperatur. Låget med tappene fjernes derpå og vaskes med 400 ml af en blanding af 0,05% "Tween 20" i destilleret vand.

En anden mikrotiterbakke (omtalt som "frigørelsespladen" forberedes derpå til histaminfrigørelsesmetoden på 10 følgende måde. Der fremstilles en histamin-standardkur-ve ved at anbringe 5,5^uliter histamin-standardopløsnin-ger i duplikatfordybninger efter hinanden. Disse standardopløsninger indeholder 10.000, 3.333, 1.111, 370, 123 og 41 nanomolær (nM) histamin i destilleret vand 15 eller Tris-ACM-fortyndingsmiddel (dvs. en puffer af 25 mmolær, mM Tris (pH 7,6); 0,2 molær NaCl2; 5 mmolær KC1; 0,3 mg humanserumalbumin, 1 mmolær CaCl2 og 0,5 mmolær MgCl2) . I løbet af analysen fortyndes histaminfortyndingernes koncentrationer yderligere 10 fold. Stambe- 20 holdningsallergen i 50% glycerol fortyndes i syv serievis 10-fold fortyndinger ved hjælp af Tris-ACM eller destilleret vand som fortyndingsmiddel. Alikvote’mængder (5,5^uliter) fra hver fortynding (ikke medregnet stam-beholdning) anbringes i rækker af duplikatfordybninger «c på frigørelsespladen. Denne fremgangsmåde gentages for hvert allergen, der ønskes afprøvet, indtil den afsluttede frigørelsesplade har 5,5^,uliter af hver histaminstandard, allergenfortyndinger eller Tris-ACM-puffer (til kontrolfordybninger) i alle ønskede fordybninger.

30

Frigørelsespladen er derpå parat til brug.

Hepariniseret blod fra en patient blandes (1:1) med Tris-ACM-puffer (hver plade kræver ca. 2,5 ml blod blandet med 2,5 ml Tris-ACM). Der fremstilles et monoklont anti-histamin-antistof/peberrodsperoxidase-kon-35 jugat ved hjælp af periodat-borhydrid-koblingsmetoden, der er beskrevet af Paul Nakane i Immunoassays: Clini- 22 0 DK 172410 B1 cal Laboratory Techniques for the 1980's (R.M. Nakamura, W.R. Dito og E.S, Tucker, udg.) Alan R. Liss, Inc., New York (1978). En lille smule af dette antistof/enzym-kon-jugat sættes til Tris-ACM/blod-blandingen for at give 5 den rigtige forudbestemte konjugatkoncentration (ca. 0,5 ^ug/ml) . Alikvote mængder (50^,uliter/fordybning) af denne mængde anbringes derpå i hver fordybning i frigørelsespladen og inkuberes i 15 minutter ved 37°C, så at histaminfrigørelse kan finde sted. Derpå anbringes lå-1 get, der er prapareret som beskrevet ovenfor, med 96 tappe på frigørelsespladen, sådan at hver tap indføres i en fordybning. Denne kombination inkuberes derpå ved stuetemperatur i 30 minutter, hvorefter låget med tappene fjernes og vaskes med to 400 ml-portioner "Tween 20"/vand 15 som beskrevet ovenfor. Dette låg med tappe anbringes derpå på en tredje mikrotiterbakke (omtalt som "chroma-genpladen"), hvortil der er blevet sat 50^uliter/fordyb-ning af følgende opløsning: 0,8 mg/ml 2,2'-azino-di-(3--ethyl-benzthiazolon)-6-sulfonsyre (dvs. ABTS) og 2 mmo- 20 lær urinstofperoxid i 0,1 molær citratpuffer (pH 4,2).

Efter en passende inkubationstid (ca. 15 minutter ved stuetemperatur) fjernes tappene, og absorbenserne (415 nM) for indholdet i hver fordybning på chromagenpladen bestemmes ved hjælp af en ELISA-aflæser. Alternativt 25 kan der foretages en bedømmelse af histaminfrigørelsen ved visuel inspektion, især når tappene først i dækpladen er overtrukket med et histamin/protein-konjugat, fortrinsvis histamin/okseserumalbumin-konjugatet fremstillet ifølge eksempel 4. Faktiske koncentrationer af 30 frigjort histamin kan opnås fra standardkurven (fremstillet som beskrevet ovenfor) og afsættes som funktion af allergenfortyndingen, om ønsket. Ud fra sådanne afsætninger kan der foretages bedømmelser af en patients følsomhed over for et allergen. Histaminfrigørelse, der finder sted ved stærkt fortyndet allergenniveau, kan tyde på meget høj følsomhed og vice versa.

35 23 0 DK 172410 B1

De data, der ses i tabel I, fås ved hjælp af den ovenfor beskrevne histaminfrigørelsesprøve af en blodprøve taget hos en patient, som klinisk bestemt er følsom over for timothégræsekstrakt. Denne blodprøve 5 eksponeres for forskellige fortyndinger af timothégræsekstrakt, og den frigjorte mængde histamin bestemmes ved reference til en standard-histaminkurve, som beskrevet ovenfor.

10 Tabel I

Histaminfrigørelse efter eksposition for timothégraskestrakt

Relativ allergen- Histamin-kon-

Absorbansa^_koncentration*^_centration0^ 0,730 10-1 72 15 0,912 10“2 50 0,894 10"3 54 0,593 10“4 90 0,431 10"5 125 0,920 10-6 42 20 1,518 10-7 6 1,630 0 0 a) Gennemsnitlig absorbans ved to prøver ved 415 nM af indholdet i hver fordybning i chromagenpladen 25 efter inkubation med tappe fastgjort til låget.

De viste værdier er justeret for baggrundseffekt.

b) I forhold til en timothégræs-stamekstrakt, som er 1:20 (væ/vo) i 50% glycerol.

c) Koncentration udtrykt i nanomolaritet.

30 35

Claims (4)

24 DK 172410 B1

1. Histaminderivat, kendetegnet ved, at det er valgt blandt 5 a) r=rr-CH2CH2NH — R — X VH2 b, (=r°V" - R - x og

10 H^N ch2nh2 o r=r“ —R —x 15 hvor R er en forbindende gruppe, der er en lineær aliphatisk gruppe med 1-10 carbonatomer, og X er en endestillet funktionel gruppe valgt blandt carboxy, amino, thiol og hydr-20 oxy, idet dog i derivatet med formlen b) R ikke er en methylengruppe -CH2-, når X er hydroxy.

2. Histaminderivat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har formlen 25 ΓS! j CH2CH2NH — CH2CH2 — .COOH HN^N

3. Histamin-immunogen-konjugat af et immuniserende bærermateriale, der er koblet til histaminderivater ifølge 30 krav 1 eller histamin, kendetegnet ved, at kon-jugaterne er valgt blandt a) 1 1 CH-CH-NH — R - X'--bærer _ _|P 35 DK 172410 B1 25 NH9 I 2 b) j- | CH2CH — R — X'--bærer og 5 _ _ P CH2NH2 c) p———j— CH — R — X'--bærer

10 HNv^N _ _JP . ; hvor R er en forbindende gruppe, der er en lineær aliphatisk gruppe med 1-10 carbonatomer, og X1 er resten af en ende-15 stillet funktionel gruppe X, der er valgt blandt carboxy, amino, thiol og hydroxy, idet dog i derivatet med formlen b) R ikke er en methylengruppe -CH2-, når X er hydroxy, og p er fra ca. 1 til ca. 120.

4. Antistof, kendetegnet ved, at det er 20 fremstillet mod konjugatet ifølge krav 3.