ES2279544T3 - Conjugados de polisacaridos y biomoleculas. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A COMPUESTOS QUE SON POLISACARIDOS MODIFICADOS QUE TIENEN FUNCIONES ALDEHIDO PENDIENTES. CADA UNA DE LAS FUNCIONES ALDEHIDO ESTA UNIDA POR UN ENLACE A UNA POSICION QUE CORRESPONDE A UN ATOMO DE HIDROGENO DE UN GRUPO HIDROXILO DIFERENTE DE POLISACARIDO NO MODIFICADO. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UN PROCEDIMIENTO QUE PERMITE INTRODUCIR UNA FUNCION AMINORREACTIVA EN UN DEXTRANO. EL PROCEDIMIENTO CONSISTE (A) EN REACCIONAR EL DEXTRANO CON UN AGENTE ALQUILADOR QUE TIENE UNA FUNCION QUE REACCIONA CON UN GRUPO HIDROXILO, QUE FORMA ASI UN DEXTRANO ALQUILADO, TENIENDO EL AGENTE ALQUILADOR UN GRUPO OLEFINA. EL PROCEDIMIENTO CONSISTE A CONTINUACION (B) EN TRATAR EL DEXTRANO ALQUILADO PARA CONVERTIR EL GRUPO OLEFINA EN FUNCION AMINORREACTIVA. TAL POLISACARIDO PUEDE CONJUGARSE CON UNA MOLECULA. BASTA PARA ESTO EMPLEAR EL PROCEDIMIENTO DE LA INVENCION Y REACCIONAR LA FUNCION AMINORREACTIVA CON UNA FUNCION AMINA DE LA BIOMOLECULA PARA PRODUCIR POLISACARIDO CONJUGADO CON LA BIOMOLECULA.

Description

Conjugados de polisacáridos y biomoléculas.

Campo de la invención

En los campos de la medicina y la química clínica se llevan a cabo muchos estudios y determinaciones de especies fisiológicamente reactivas tales como células, proteínas, enzimas, cofactores, ácidos nucleicos, sustratos, antígenos, anticuerpos, etc., usando conjugados que incluyen miembros de pares de unión específica o marcadores o componentes similares. Se conocen diversas técnicas analíticas que implican la unión de miembros de pares de unión específica. Estas técnicas analíticas generalmente incluyen también un marcador usado en la parte de detección del ensayo.

Los polisacáridos, en particular el dextrano, se han conjugado con miembros de pares de unión específica para aumentar la estabilidad de ese miembro del par de unión específica. La conjugación de estos miembros con polisacáridos también aumenta el volumen de estas moléculas, lo cual puede incrementar su efectividad en ensayos en los que participan miembros de pares de unión específica, interfiriendo con la unión a miembros de pares de unión específica complementarios. Además, estos conjugados, cuando están presentes sobre una superficie, permiten la unión específica de un miembro complementario del par de unión específica a esa superficie con una unión inespecífica enormemente disminuida.

El aminodextrano o el carboximetildextrano se han utilizado frecuentemente para forman conjugados con miembros de pares de unión específica. El acoplamiento del dextrano a una proteína, por ejemplo, se puede luego llevar a cabo a través de la formación de una amida. Sin embargo, los aminodextranos y carboximetildextranos tienen una carga que muchas veces debe ser neutralizada para controlar la unión inespecífica. Esa neutralización es difícil de hacer sin que se formen derivados de la biomolécula del conjugado al mismo tiempo.

Un método de conjugación alternativo consiste en primero oxidar parcialmente el polisacárido con peryodato para introducir grupos aldehído. Después se puede llevar a cabo el acoplamiento de ligandos y receptores que contienen aminas mediante una aminación reductora. Aunque los dextranos que están parcialmente oxidados no tienen carga, la oxidación es difícil de controlar con precisión y los productos presentan una estabilidad sustancialmente disminuida frente a la hidrólisis. Por lo tanto, se necesita un procedimiento para introducir grupos aldehído en polisacáridos, que no comprometa su estabilidad, que sea más fácil de realizar y que permita una rápida conjugación.

Descripción de la técnica relacionada

Lauritzen y col., tratan sobre la inmunounión y la inmunotransferencia puntual de cantidades de picogramos y nanogramos de péptidos pequeños sobre nitrocelulosa activada, en Journal of Immunological Methods (1990) 131:257-267.

Inmunoadsorbentes eficaces que tienen como base bolitas de micro esferas de agarosa-polialdehídos, su síntesis y una cromatografía de afinidad se encuentran descritos en Margel y col., Analytical Biochemistry (1983), 128:342-350.

La Patente de EE. UU. Núm. 4.264.766 (Fisher) describe reactivos inmunológicos para diagnóstico.

La Patente de EE. UU. Núm. 4.801.504 (Burdick y col.) trata sobre marcadores fluorescentes que contienen un polisacárido unido a partículas poliméricas.

En la Patente europea Núm. 0 315 456 B1 se trata sobre inmunoglobulinas modificadas con polisacáridos que presentan un menor potencial inmunogénico o una farmacocinética mejorada.

Wang y col. describen una síntesis fácil de un análogo aldehídico del factor de activación de las plaquetas y su uso en la producción de anticuerpos específicos, en Chemistry and Physics of Lipids (1990) 55:265-273.

El documento "A new approach to aldehydic dextrans" E. Dellacherie y col., Polymer Bulletin, Vol. 31, Núm. 2, 2 de agosto de 1.993, DE, págs. 145-149, XP000385692, describe dextranos cuyos grupos hidroxilo están sustancialmente sustituidos con un resto que contiene un grupo enlazador y un grupo aldehído terminal (Estructuras III-V de la página 146). El dextrano modificado con aldehído se une a proteínas, anticuerpos y enzimas, pero en este documento no se menciona un agente alquilante que reacciona con un polisacárido, agente alquilante que contiene un grupo olefínico y que como funcionalidad contiene un epóxido o un radical alquilo que comprende un grupo
lábil.

El documento "A new approach to dextran derivatives with pendent aldehyde groups", D. Callant y col., Reactive Polymers, Vol. 8, 1988, Amsterdam, págs. 120-136, XP002048123, describe derivados solubles de dextrano que contienen grupos laterales aldehído que se prepararon haciendo reaccionar un éster de dextrano y de 4-nitrofenil-carbonato con 2,3-dihidroxipropilamina y posterior oxidación selectiva con peryodato de los grupos diólicos colgantes. El dextrano modificado se puede usar para la inmovilización de enzimas, es decir, de polipéptidos. Este documento no describe un métodos para conjugar un polisacárido con un polipéptido haciendo reaccionar el polisacárido con un agente alquilante que contiene un grupo olefínico y convirtiendo el grupo olefínico en una funcionalidad reactiva con aminas que reacciona con un funcionalidad amina presente en el polipéptido para producir un polisacárido conjugado con el polipéptido.

Sumario de la invención

En uno de los aspectos la presente invención concierne a un método para conjugar un polisacárido con un polipéptido, que comprende:

(a) hacer reaccionar dicho polisacárido con un agente alquilante que contiene una funcionalidad que reacciona con un grupo hidroxi de dicho polisacárido, formándose así un polisacárido alquilado, en el que dicho agente alquilante contiene un grupo olefínico y en el que dicho agente alquilante contiene como dicha funcionalidad un epóxido o un radical alquilo que comprende un grupo lábil.

(b) tratar dicho polisacárido alquilado para convertir dicho grupo olefínico en una funcionalidad reactiva con aminas, y

(c) hacer reaccionar dicha funcionalidad reactiva con aminas, con una funcionalidad amina presente en dicho polipéptido para producir un polisacárido conjugado con dicho polipéptido.

Otro aspecto de la presente invención es un método en el que el polisacárido es un compuesto que comprende un polímero que tiene una secuencia de unidades monosacáridas que se repiten, cada una de las cuales se selecciona independientemente entre unidades monosacáridas de la fórmula:

1

en la que una de las A es un enlace con el carbono glicosídico C1 de otra de dichas unidades y las otras A se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H y QL, en donde L es un grupo enlazador que enlaza O y Q, y Q es C(Z)=D, en donde D es CR^{1}R^{2}, en donde R^{1} y R^{2} son independientemente H, alquilo o arilo, y Z es H o C(Y)=O, en donde Y es R^{3}, OR^{3} o NR^{3}R^{4}, en donde R^{3} y R^{4} son independientemente H, alquilo o arilo, y en donde cualquiera de los L, R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} se pueden agrupar para formar un anillo con la condición de que al menos dos de las A de dicho polímero sean QL. También están incluidos compuestos producidos mediante reacción del polímero anteriormente mencionado con una biomolécula tal como un polipéptido.

Descripción de las realizaciones específicas

La presente invención proporciona un método sencillo y económico para conjugar una macromolécula con un polisacárido para usar en un inmunoensayo. Funcionalidades reactivas con aminas, tal como un aldehído, se introducen en el polisacárido para enlazarlo a una macromolécula. Una de las ventajas de la presente invención es que, a diferencia de métodos anteriores, se puede controlar el número de funcionalidades reactivas con aminas introducidas en el polisacárido.

Antes de proseguir con la descripción de las realizaciones específicas de la presente invención, se definirán varios términos y expresiones.

Monosacárido: carbohidrato que no puede ser hidrolizado en compuestos más sencillos tales como un alcohol aldehídico o un alcohol cetónico, p. ej., una hexosa o una pentosa.

Polisacárido: carbohidrato que contiene tres o más unidades monosacáridas; el polisacárido puede ser hidrolizado en las unidades monosacáridas más sencillas. Ejemplos de polisacáridos, a modo de ilustración y no de limitación, son dextrano, almidón, glucógeno, polirribosa.

Dextrano: polisacárido que consiste en unidades de glucosa lineales, unidas por enlaces 1-6 (98%); glucosa polimerizada.

Alquilo: radical monovalente, lineal o ramificado, derivado de un hidrocarburo alifático por retirada de uno de los átomos de hidrógeno; incluye tanto un alquilo inferior como un alquilo superior.

Alquilo inferior: alquilo que contiene de 1 a 5 átomos de carbono tales como, p. ej., metilo, etilo, propilo, butilo, isopropilo, isobutilo, pentilo, isopentilo, etc.

Alquilo superior: alquilo que contiene más de 6 átomos de carbono, usualmente de 6 a 20 átomos de carbono, tales como, p. ej., hexilo, heptilo, octilo, etc.

Alquilideno: radical orgánico divalente derivado de un hidrocarburo alifático, tal como, por ejemplo, etilideno, en el que se quitan 2 átomos de hidrógeno del mismo átomo de carbono.

Arilo: radical orgánico derivado de un hidrocarburo aromático por retirada de un átomo y que contiene uno o más anillos aromáticos, usualmente de uno a cuatro anillos aromáticos, tales como, p. ej., fenilo (derivado del benceno), naftilo (derivado del naftaleno), etc., p. ej., fenilo, naftilo, fenantrilo.

Aralquilo: radical orgánico que contiene un grupo alquilo al que está unido un grupo arilo, p. ej, bencilo, fenetilo, 3-fenilpropilo, 1-naftiletilo, etc.

Alcoxi: radical alquilo unido a la parte restante de una molécula por un átomo de oxígeno, p. ej., metoxi, etoxi, etc.

Ariloxi: radical arilo unido a la parte restante de una molécula por un átomo de oxígeno, p. ej., fenoxi, naftoxi, etc., p. ej. m-metoxifenilo.

Aralcoxi: radical aralquilo unido a la parte restante de una molécula por un átomo de oxígeno, p. ej., benzoxi, 1-naftiletoxi, etc.

Funcionalidad reactiva con aminas: funcionalidad reactiva con una funcionalidad amina, usualmente en virtud de la nucleofília o basicidad de la amina, tal como, por ejemplo, un aldehído, un ácido \alpha-ceto-carboxílico.

Agente alquilante que contiene una funcionalidad que reacciona con un grupo hidroxilo: compuesto que contiene una funcionalidad reactiva con un grupo hidroxilo, usualmente en virtud de la nucleofília del grupo hidroxilo neutro o ionizado, tal como, por ejemplo, un radical oxiranilo, un radical alquilo que comprende un grupo lábil tal como, por ejemplo, un haluro (bromo, cloro, yodo); sulfonatos de arilo; sulfonatos de alquilo; sulfatos de arilo; sulfatos de alquilo, tosilatos; derivados del ácido acrílico tales como acrilamida; vinil-sulfonas.

Biomolécula: polipéptido tal como, por ejemplo, avidina, estreptavidina, proteína A, proteína G, anticuerpos, etc.

Conjugado: molécula que comprende dos o más subestructuras unidas entre sí, generalmente a través de un grupo enlazador, para formar una estructura única.

Grupo enlazador: porción de una estructura que conecta dos o más subestructuras. El grupo enlazador puede variar desde un enlace a una cadena de 1 a 30 o más átomos, usualmente de aproximadamente 1 a 20 átomos, preferiblemente de 1 a 10 átomos, cada uno de ellos seleccionados independientemente entre el grupo que normalmente consiste en carbono, oxígeno, azufre, nitrógeno y fósforo, usualmente carbono y oxígeno. El número de heteroátomos presentes en el grupo enlazador normalmente varía de aproximadamente 0 a 8, usualmente de aproximadamente 1 a 6, más preferiblemente de 2 a 4. El número de átomos presentes en la cadena se determina contando el número de átomos distintos de hidrógeno u otros átomos monovalentes por el camino más corto entre las subestructuras que están siendo conectadas. Los átomos del grupo enlazador pueden estar sustituidos con átomos distintos de hidrógeno, tales como carbono, oxígeno, etc, en forma de, p. ej., alquilo, arilo, aralquilo, hidroxilo, alcoxi, ariloxi, aralcoxi. Como regla general, la longitud de un grupo enlazador particular se puede seleccionar de manera arbitraria para que proporcione facilidad de la síntesis, con la condición de que el grupo enlazador ocasione una interferencia mínima con la capacidad de los presentes polímeros para unirse a una biomolécula.

El grupo enlazador puede ser un grupo alifático o aromático. Cuando están presentes heteroátomos, el oxígeno normalmente estará presente en forma oxi u oxo, unido a carbono, azufre, nitrógeno o fósforo; el azufre estará presente en forma de tioéter o tiono; el nitrógeno normalmente estará presente en forma nitro, nitroso o amino, normalmente unido a carbono, oxígeno, azufre o fósforo; el fósforo estará unido a carbono, azufre, oxígeno o nitrógeno, usualmente en forma de fosfonato y de monoéster o diéster de fosfato. Las funcionalidades presentes en el grupo enlazador pueden incluir ésteres, tioésteres, amidas, tioamidas, éteres, ureas, tioureas, guanidinas, grupos azo, tioéteres, carboxilato, etc.

Ejemplos, a modo de ilustración y no de limitación, de diferentes grupos enlazadores que son útiles en la presente invención, se encuentran en la Patente de EE. UU. Núm 3.817.837, en particular desde la columna 30, línea 69, hasta la columna 36, línea 10.

Los grupos enlazadores preferidos incluyen alquileno, es decir, (CH_{2})_{p} en el que p es un número entero en el intervalo de 1 a 10, preferiblemente de 1 a 5, en el que uno o más de los hidrógenos, usualmente uno solo de los hidrógenos, presente en uno o más de los carbonos, usualmente en uno de los carbonos de los alquilenos, puede estar sustituido con OR^{9}, en el que R^{9} es H, alquilo o arilo, p. ej., metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, fenileno, p-bencileno, etc.; alquilenoxialquileno, es decir, (CH_{2})_{q}X(CH_{2})_{r}, en el que q y r son iguales o diferentes y son números enteros en el intervalo de 1 a 5, preferiblemente, de 1 a 3, y en el que uno más de los hidrógenos, usualmente uno solo de los hidrógenos, presente en uno o en ambos de los alquilenos, usualmente en uno solo, de los alquilenos, puede estar sustituido con OR^{9}, en el R^{9} es H, alquilo o arilo, preferiblemente H, p. ej., metilenoximetileno, metilenoxietileno, etilenoxietileno, 1-metilenoxi-2-hidroxietileno, etc. y X es independientemente O o S, preferiblemente O.

Miembro de un par de unión específica ("miembro sbp") (del inglés, " specific binding pair member"): una de dos moléculas diferentes que presentan un área sobre la superficie o en una cavidad, que se une específicamente a, y por ello se define como complementaria con, una organización espacial y polar particular de la otra molécula. Los miembros de este par de unión específica se denominan ligando y receptor (antiligando). Estos miembros usualmente serán miembros de un par inmunológico, tal como un par antígeno-anticuerpo, aunque otros pares de unión específica tales como biotina-avidina, hormonas-receptores de hormonas, dúplex de ácidos nucleicos, IgG-proteína A, pares de polinucleótidos tales como DNA-DNA, DNA-RNA, no son pares inmunológicos pero están incluidos en la definición de miembro de sbp para los fines de describir esta invención.

Analito: compuesto o composición que se ha de detectar. El analito puede comprender un miembro de un par de unión específica (sbp) y puede ser un ligando, que usualmente es monovalente (monoepitópico), usualmente es apténico, y es un compuesto individual o es una pluralidad de compuestos que comparten al menos un sitio epitópico común o un sitio de determinante.

Los analitos que son ligandos monoepitópicos generalmente tendrán un peso molecular desde aproximadamente 100 hasta 2.000, más usualmente, un peso molecular desde 125 a 1.000. Estos analitos incluyen fármacos, metabolitos, pesticidas, contaminantes. Analitos representativos, a modo de ejemplo y no de limitación, incluyen (i) alcaloides tales como alcaloides morfínicos, que incluyen morfina, codeína, heroína, dextrometorfano, sus derivados y sus metabolitos; alcaloides de tipo cocaína, que incluyen cocaína y bencil-ecgonina, sus derivados y sus metabolitos; alcaloides ergóticos, que incluyen la dietilamida del ácido lisérgico; alcaloides esteroideos, alcaloides iminazoílicos; alcaloides derivados de quinazolina; alcaloides isoquinolínicos; alcaloides quinolínicos, que incluyen quinina y quinidina; alcaloides diterpénicos, sus derivados y sus metabolitos; (ii) esteroides, que incluyen los estrógenos, andrógenos, esteroides adrenocorticales, ácidos biliares, glicósidos cardiotónicos y agliconas, que incluyen digoxina y digoxigenina, saponinas y sapogeninas, sus derivados y sus metabolitos; sustancias miméticas de esteroides, tales como dietilestibestrol; (iii) lactamas que contienen de 5 a 6 miembros en forma de anillo, que incluyen los barbituratos, p. ej., fenobarbital y secobarbital, difenilhidantoína, primidona, etosuximida, y sus metabolitos; (iv) aminoalquilbencenos, con un alquilo de 2 a 3 átomos de carbono, que incluyen las anfetaminas; catecolaminas, que incluyen efedrina, L-dopa, epinefrina; narceína; papaverina; y metabolitos de los anteriores aminoalquilbencenos; (v) compuestos benzoheterocíclicos que incluyen oxazepam, clorpromazina, tegretol, sus derivados y sus metabolitos, en los que los anillos heterocíclicos son azepinas, diazepinas y fenotiazinas; (vi) purinas, que incluyen teofilina, cafeína, sus metabolitos y sus derivados; (vii) fármacos derivados de la marihuana, que incluyen canabinol y tretrahidrocanabinol; (viii) hormonas tales como tiroxina, cortisol, triyodotironina, testosterona, estradiol, estrona, progesterona, polipéptidos tales como angiotensina, LHRH e inmunosupresores tales como ciclosporina, FK506, ácido micofenólico (MPA) (del inglés, " MycoPhenolic Acid"), etc.; (ix) vitaminas tales como A, B por ejemplo B_{12}, C, D, E y K, ácido fólico, tiamina; (x) prostaglandinas, que difieren en el grado y en los sitios de hidroxilación e insaturación; (xi) antidepresivos tricíclicos, que incluyen imipramina, desmetilimipramina, amitriptilina, nortriptilina, protriptilina, trimipramina, clomipramina, doxepina y desmetildoxepina; (xii) compuestos antineoplásicos, que incluyen metotrexato; (xiii) antibióticos, que incluyen penicilina, cloromicetina, actinomicetina, tetraciclina, terramicina, sus metabolitos y sus derivados; (xiv) nucleósidos y nucleótidos, que incluyen ATP, NAD, FMN, adenosina, guanosina, timidina y citidina, con sus sustituyentes de tipo azúcar y fosfato apropiados; (xv) fármacos individuales misceláneos que incluyen metadona, meprobamato, serotonina, meperidina, lidocaína, procainamida, acetilprocainamida, propanolol, griseofulvina, ácido valproico, butirofenonas, antihistaminas, cloranfenicol, fármacos anticolinérgicos tales como atropina, sus metabolitos y sus derivados; (xvi) metabolitos relacionados con estados patológicos, que incluyen espermina, galactosa, ácido fenilpirúvico y porfirina de Tipo 1; (xvii) aminoglucósidos, tales como gentamicina, kanamicina, tobramicina y amikacina; y (xviii) pesticidas tales como bifenilos polihalogenados, ésteres de fosfato, tiofosfatos, carbamatos, sulfenamidas polihalogenadas, sus metabolitos y sus derivados.

Los analitos polivalentes normalmente son poli(aminoácidos), es decir, polipéptidos y proteínas, polisacáridos, ácidos nucleicos y sus combinaciones. Esas combinaciones incluyen componentes de bacterias, virus, cromosomas, genes, mitocondrias, núcleos, membranas celulares. Por lo general, los analitos que son ligandos poliepitópicos tendrán un peso molecular de al menos aproximadamente 5.000, más usualmente de al menos aproximadamente 10.000. En la categoría de los poli(aminoácidos), los poli(aminoácidos) de interés generalmente tendrán pesos moleculares desde aproximadamente 5.000 hasta 5.000.000, más usualmente tendrán pesos moleculares desde aproximadamente 20.000 hasta 1.000.000; entre las hormonas de interés, los pesos moleculares usualmente variarán en el intervalo de pesos moleculares desde aproximadamente 5.000 hasta 60.000.

Una amplia variedad de proteínas pueden considerarse como de una familia de proteínas que tienen características estructurales similares, proteínas que tienen funciones biológicas particulares, proteínas relacionadas con microorganismos específicos, en particular con microorganismos causantes de enfermedades, etc. Esas proteínas incluyen, por ejemplo, inmunoglobulinas, citoquinas, enzimas, hormonas, antígenos relacionados con cáncer, marcadores nutricionales, antígenos específicos de tejidos, etc. Esas proteínas incluyen, a modo de ilustración y no de limitación, protaminas, histonas, albúmina, globulinas, escleroproteínas, fosfoproteínas, mucoproteínas, cromoproteínas, lipoproteínas, nucleoproteínas, glicoproteínas, receptores de células T, proteoglicanos, HLA, proteínas no clasificadas, p. ej., somatotropina, prolactina, insulina, pepsina, proteínas encontradas en plasma humano, factores de coagulación de la sangre, hormonas proteicas tales como, p. ej., hormona estimulante del folículo, hormona luteinizante, luteotropina, prolactina, gonadotropina coriónica, hormonas tisulares, citoquinas, antígenos relacionados con cáncer tales como, p. ej., PSA, CEA, \alpha-fetoproteína, fosfatasa ácida, CA 19,9 y CA 125, antígenos específicos de tejido tales como, p. ej.,, fosfatasa alcalina, mioglobina, CPK-MB y calcitonina, y hormonas peptídicas. Otros materiales poliméricos de interés son los mucopolisacáridos y polisacáridos.

En cuanto a los analitos que son receptores, los pesos moleculares generalmente variarán desde 10.000 hasta 2 x 10^{8}, más usualmente desde 10.000 hasta 10^{6}. En cuanto a las inmunoglobulinas, IgA, IgG, IgE e IgM, los pesos moleculares generalmente variarán desde aproximadamente 160.000 hasta aproximadamente 10^{6}. Las enzimas normalmente variarán desde aproximadamente 10.000 hasta aproximadamente 1.000.000 de peso molecular. Los receptores naturales varían ampliamente, tienen en general pesos moleculares de al menos aproximadamente 25.000 y pueden tener pesos moleculares de 10^{6} o más altos, e incluyen materiales tales como avidina, DNA, RNA, globulina de unión a tiroxina, prealbúmina de unión a tiroxina, transcortina, etc.

El término analito incluye además analitos de tipo oligonucleótidos y polinucleótidos tales como m-RNA, r-RNA, t-RNA, DNA, dúplex de DNA-RNA, etc.

El analito puede ser una molécula encontrada directamente en una muestra tal como un tejido biológico, incluidos fluidos corporales, procedente de un hospedador. La muestra se puede estudiar directamente o se puede pretratar para hacer que el analito sea más fácilmente detectable retirando materiales no deseados. La muestra se puede pretratar para separar o lisar las células; para precipitar, hidrolizar o desnaturalizar proteínas; para hidrolizar lípidos;, para hacer soluble al analito; o pretratamientos similares. Estos pretratamientos pueden incluir, sin carácter de limitación: centrifugación; tratamiento de la muestra con un disolvente orgánico, por ejemplo, un alcohol, tal como metanol; y tratamiento con detergentes. La muestra se puede preparar en cualquier medio que convenga y que no interfiera con un ensayo. Se prefiere un medio acuoso.

El analito de interés se puede determinar detectando un agente probatorio del analito de interés, tal como un miembro de un par de unión específica que sea complementario al analito de interés, cuya presencia se detectará solamente cuando el analito de interés se encuentre presente en una muestra. De este modo, el agente probatorio del analito se convierte en el analito que se detecta en un ensayo.

El tejido biológico incluye tejido extirpado de un órgano o de otra parte del cuerpo de un hospedador y fluidos corporales, por ejemplo, orina, sangre completa, plasma, suero, saliva, semen, heces, esputos, líquido cefalorraquídeo, lágrimas, moco. Preferiblemente la muestra es plasma o suero.

Polinucleótido: compuesto o composición que es un nucleótido polimérico que en estado natural tiene aproximadamente de 50 a 500.000 o más nucleótidos y que en estado aislado tiene aproximadamente de 15 a 50.000 o más nucleótidos, usualmente aproximadamente de 15 a 20.000 nucleótidos, más frecuentemente de 15 a 10.000 nucleótidos. El término polinucleótido incluye ácidos nucleicos de una fuente cualquiera, en forma purificada o no purificada, presentes en la naturaleza o producidos mediante métodos de síntesis, que incluyen DNA (dsDNA y ssDNA) y RNA, usualmente DNA, y pueden ser t-RNA, m-RNA, r-RNA, DNA y RNA mitocondriales, DNA y RNA de cloroplastos, híbridos de DNA-RNA, o sus mezclas, genes, cromosomas, plásmidos, genomas de materiales biológicos tales como microorganismos, p. ej., bacterias, levaduras, virus, viroides, mohos, hongos, plantas, animales, seres humanos, y sus fragmentos.

Ligando: todo compuesto orgánico para el que existe un receptor en la naturaleza o para el que se puede preparar un receptor.

Hapteno: compuesto capaz de unirse específicamente a los correspondientes anticuerpos, pero que por sí mismo no actúa como inmunógeno (o como antígeno) para la preparación de los anticuerpos. Los anticuerpos que reconocen un hapteno se pueden preparar contra compuestos que comprenden ese hapteno unido a una molécula portadora inmunogénica o antigénica). Los haptenos son un subgrupo de los ligandos.

Análogo de ligando: ligando modificado, análogo de un radical orgánico o de un analito, usualmente con un peso molecular mayor que 100, que es capaz de competir con el ligando análogo por un receptor, y la modificación proporciona medios para unir un análogo de ligando a otra molécula. El análogo de ligando usualmente diferirá del ligando en más de la sustitución de un hidrógeno por un enlace que une el análogo del ligando a un centro o a un marcador, pero no es necesario. El análogo de ligando se une al receptor de una manera similar a como lo hace el ligando.
El análogo pudiera ser, por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra el idiotipo de un anticuerpo contra el ligando.

Receptor ("antiligando"): todo compuesto o composición capaz de reconocer una organización espacial y polar particular de una molécula, p. ej., un sitio epitópico o un sitio de determinante. Receptores ilustrativos incluyen receptores presentes en la naturaleza, p. ej., globulina de unión a tiroxina, anticuerpos, enzimas, fragmentos Fab, lectinas, ácidos nucleicos, proteína A, componente C1q del complemento.

Unión específica: reconocimiento específico de una de las moléculas de dos moléculas diferentes con respecto a la otra molécula, en comparación con el reconocimiento sustancialmente menor de otras moléculas. Generalmente, las moléculas presentan áreas sobre sus superficies o en cavidades, también denominadas "sitios de unión", que dan lugar al reconocimiento específico entre las dos moléculas. Ejemplos de unión específica son las interacciones antígeno-anticuerpo, interacciones enzima-sustrato, interacciones entre polinucleótidos, etc.

Unión inespecífica: unión no covalente entre moléculas que es relativamente independiente de estructuras específicas de sus superficies. La unión inespecífica puede ser el resultado de varios factores que incluyen interacciones hidrófobas entre moléculas.

Anticuerpo: inmunoglobulina que se une específicamente a, y se define por lo tanto como complementaria con, una organización espacial y polar particular de otra molécula. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal, y se puede preparar mediante métodos que son muy conocidos en la técnica, tales como inmunización de un hospedador y recogida del suero (anticuerpo policlonal) o preparación de líneas continuas de células híbridas y recogida de la proteína secretada (anticuerpo monoclonal), o clonación y expresión de secuencias de nucleótidos o de sus versiones mutageneizadas que codifican al menos las secuencias de aminoácidos requeridas para la unión específica de los anticuerpos naturales. El término anticuerpos puede incluir una inmunoglobulina completa o sus fragmentos, inmunoglobulinas que incluyen las diferentes clases e isotipos, tales como IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3, IgM, etc. Sus fragmentos pueden incluir Fab, Fv y F(ab')_{2}, Fab'. Además, se pueden usar agregados, polímeros y conjugados de inmunoglobulinas o sus fragmentos cuando sea conveniente siempre y cuando se mantenga la afinidad de unión por una molécula particular.

Sustituido: significa que un átomo de hidrógeno de una molécula ha sido reemplazado por otro átomo, que puede ser un átomo individual tal como un halógeno, etc., o parte de un grupo de átomos que constituyen una funcionalidad según se ha descrito en lo que antecede. Este sustituyente puede ser un grupo o una funcionalidad que confiere hidrofília o lipofília. La hidrofília se puede obtener con un grupo funcional que tenga uno o más átomos tales como oxígeno, nitrógeno, azufre, fósforo, etc.; esos grupos incluyen sulfonato, sulfato, fosfato, amidina, fosfonato, carboxilato, hidroxilo, en particular, polioles, amino, éter, amido. Grupos funcionales ilustrativos son carboxialquilo, sulfonoxialquilo, CONHOCH_{2}COOH, CO-(glucosamina), azúcares, dextrano, ciclodextrina, SO_{2}NHCH_{2}COOH, SO_{3}H, CONHCH_{2}CH_{2}SO_{3}H, PO_{3}H_{2}, OPO_{3}H_{2}, hidroxilo, carboxilo, cetona y sus combinaciones. La lipofília se puede obtener con un grupo funcional tal como átomos de carbono sustituidos con hidrógeno o con un halógeno y pueden incluir alquilo, alquilideno, arilo y aralquilo. El grupo o la funcionalidad lipófila normalmente tendrá de uno a seis grupos alifáticos de cadena lineal o ramificada, de al menos 6 átomos de carbono, más usualmente de al menos 10 átomos de carbono, y preferiblemente de al menos 12 átomos de carbono, usualmente de no más de 30 átomos de carbono.

Soporte o superficie: fase sólida, típicamente un soporte o superficie, que es un material poroso o no poroso, insoluble en agua, que puede presentar una cualquiera de varias formas, tales como tira, varilla, placa, pocillo, partícula o bolita. Una amplia variedad de soportes adecuados se describen en Ullman y col., Patente de EE. UU. Núm. 5.185.243, columnas 10-11, Kurn y col., Patente de EE. UU. Núm. 4.868.104, columna 6, líneas 21-42, y Milburn y col., Patente de EE. UU. 4.959.303, columna 6, líneas 14-31.

La superficie puede ser hidrófila o capaz de convertirse en hidrófila e incluye polvos inorgánicos tales como sílice, sulfato de magnesio y alúmina; materiales poliméricos naturales, en particular, materiales celulósicos y materiales derivados de la celulosa, tales como papeles que contienen fibras, p. ej., papel de filtro, papel cromatográfico, etc.; polímeros sintéticos o polímeros presentes en la naturaleza y modificados, tales como, nitrocelulosa, acetato de celulosa, poli(cloruro de vinilo), poliacrilamida, dextrano reticulado, agarosa, poliacrilato, polietileno, polipropileno poli(4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(tereftelato de etileno), nilón, poli(butirato de vinilo), etc.; ya sea usados ellos solos o junto con otros materiales; vidrio disponible en forma de Bioglass, materiales cerámicos, metales, etc. También se pueden utilizar asociaciones naturales o sintéticas tales como liposomas, vesículas fosfolipídicas y células.

La unión de miembros de sbp a un soporte o superficie, de otra manera que no sea mediante el uso de los compuestos de la presente invención, se puede llevar a cabo mediante técnicas muy conocidas, comúnmente disponibles en la literatura. Véanse p. ej., "Immobilized Enzymes", Ichiro Chibata, Halsted Press, Nueva York (1978) y Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245:3059 (1970).

Sistema productor de señales ("sps"): uno o más componentes, al menos un componente, que es un marcador detectable, que genera una señal detectable que está en relación con la cantidad de marcador unido y/o no unido, es decir, con la cantidad de marcador unido o no unido al compuesto que se está detectado. El marcador es cualquier molécula que produce una señal, o que es capaz de ser inducido para que produzca una señal, y puede ser, por ejemplo, un compuesto fluorescente, un marcador radiactivo, una enzima, un compuesto quimioluminiscente o un compuesto fotosensibilizador. De esta manera, la señal se detecta y/o se mide detectando una actividad enzimática, luminiscencia, absorbancia de luz o radioactividad, según sea el caso.

Los marcadores adecuados incluyen, a modo de ilustración y no de limitación, enzimas tales como fosfatasa alcalina, glucosa-6-P-deshidrogenasa (G6PDH'') (del inglés, " Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase") y peroxidasa de rábano; ribozima; un sustrato de una replicasa tal como la QB replicasa; promotores; colorantes; compuestos fluorescentes tales como compuestos de fluoresceína, isotiocianato y rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina; compuestos quimioluminiscentes tales como isoluminol; compuestos fotosensibilizadores; coenzimas; sustratos de enzimas, marcadores radioactivos tales como ^{125}I, ^{131}I, ^{14}C, ^{3}H, ^{57}Co y ^{75}Se; partículas tales como látex y partículas de carbono; disolución coloidal que contiene metal; cristalito; liposomas; células, etc., que pueden estar además marcadas con un colorante, catalizador u otro grupo detectable. Enzimas y coenzimas adecuadas se encuentran descritas en Litman y col., Patente de EE. UU. Núm. 4.275.149, columnas 19-28, y Boguslaski, y col., Patente de EE. UU. Núm. 4.318.980, columnas 10-14; compuestos fluorescentes y quimioluminiscentes adecuados se encuentran descritos en Litman y col., Patente de EE. UU. Núm. 4.275.149, en las columnas 30
y 31.

Existen numerosos métodos por medio de los cuales el marcador es capaz de producir una señal detectable por medios externos, convenientemente mediante examen visual, por ejemplo, con radiación electromagnética, calor y reactivos químicos. El marcador u otros miembros de sps, también se pueden unir a un miembro de sbp, a otra molécula o a un soporte.

Los marcadores incluyen grupos detectables por medio de radiación electromagnética o mediante detección electroquímica, e incluyen colorantes, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes e isótopos radiac-
tivos.

El marcador es capaz de producir directamente una señal, y por lo tanto, no se requieren componentes adicionales para producir una señal. Numerosas moléculas orgánicas, por ejemplo, compuestos fluorescentes, son capaces de absorber luz ultravioleta y luz visible, en cuyo caso, la absorción de luz transfiere energía a estas moléculas y las eleva a un estado de energía excitado, esta energía absorbida, es luego disipada por medio de la emisión de luz a una segunda longitud de onda. Los marcadores que producen directamente una señal incluyen isótopos radioactivos y
colorantes.

Como alternativa, el marcador puede necesitar otros componentes para producir una señal, y el sistema que produce la señal incluiría entonces todos los componentes requeridos para producir una señal medible, sistema que puede incluir sustratos, coenzimas, intensificadores de la señal, enzimas adicionales, sustancias que reaccionan con productos enzimáticos, catalizadores, activadores, cofactores, inhibidores, depuradores, iones metálicos y una sustancia de unión específica requerida para la unión de sustancias que generan las señales. Un análisis detallado de sistemas productores de señales adecuados se puede encontrar en Ullman, y col., Patente de Patente de EE.UU. Núm. 5.185.243, columnas 11-13.

El marcador y/u otro miembro del sps se puede unir a un miembro del sbp o a un soporte utilizando los compuestos y composiciones de la presente invención. Como alternativa, el marcador se puede unir covalentemente a un miembro del sbp tal como, por ejemplo, un anticuerpo; un receptor para un anticuerpo, un receptor que es capaz de unirse a una molécula pequeña que está conjugada con un anticuerpo, o un análogo del ligando. La unión del marcador al miembro del sbp se puede llevar a cabo mediante reacciones químicas que dan como resultado la sustitución de un átomo de hidrógeno del marcador por un enlace al miembro del sbp o puede incluir un grupo enlazador entre el marcador y el miembro del sbp. Otros miembros del sps se pueden también unir covalentemente a los miembros del sbp. Por ejemplo, dos miembros del sps tales como un compuesto fluorescente o un agente de extinción se pueden cada uno de ellos unir a un anticuerpo diferente que forma un complejo específico con el analito. La formación del complejo acerca el compuesto fluorescente al agente de extinción, permitiendo así que el agente de extinción interaccione con el compuesto fluorescente para producir una señal. Los métodos de conjugación son muy conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Rubenstein, y col., Patente de EE. UU 3.817.837.

Ensayo: método para determinación de la presencia o cantidad de un analito.

Medir la cantidad de un analito: los métodos cuantitativos, semicuantitativos y cualitativos, así como todos los demás métodos para determinar un analito, se consideran métodos para medir la cantidad de un analito. Por ejemplo, un método que simplemente detecta la presencia o ausencia de un analito en una muestra de la que se sospecha que contiene el analito, se considera que está incluido en el alcance de la presente invención. Los términos "detectar" y "determinar", así como otros sinónimos de medir comunes, se contempla que están incluidos en el alcance de la presente invención.

Materiales auxiliares: Con frecuencia se utilizarán materiales auxiliares en el ensayo de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, en el medio del ensayo normalmente habrá tampones, así como agentes estabilizantes del medio del ensayo y los componentes del ensayo. Frecuentemente, además de estos aditivos, se pueden incluir proteínas tales como albúminas; disolventes orgánicos tales como formamida; sales de amonio cuaternarias; polianiones tales como sulfato de dextrano; tensioactivos; tensioactivos particularmente no iónicos; mejoradores de la unión, p. ej., polialquilenglicoles; o aditivos similares.

Por orden de sucesión total o parcial: cuando distintos agentes se mezclan no de manera concomitante (no simultáneamente), uno o más de esos agentes se puede mezclar con uno o más de los restantes agentes para formar una submezcla.

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En uno de los aspectos, la presente invención concierne a polímeros que comprenden una secuencia de unidades monosacáridas que se repiten, cada una de las cuales se selecciona independientemente entre unidades monosacáridas de la fórmula:

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en la que una de las A es un enlace al carbono glicosídico C1 (indicado en la fórmula anterior) de otra de las unidades y las otras A se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H y QL, en donde L es un grupo enlazador que enlaza O y Q, y Q es C(Z)=D, en donde D es CR^{1}R^{2}, en donde R^{1} y R^{2} son independientemente H, alquilo o arilo, y Z es H o C(Y)=O, en donde Y es R^{3}, OR^{3} o NR^{3}R^{4}, en donde R^{3} y R^{4} son independientemente H, alquilo o arilo, y en donde cualquiera de los L, R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4}, pueden agruparse para formar un anillo, con la condición de que al menos dos de las A presentes en dicho polímero, sean QL. Usualmente, cuando un anillo está presente, es un anillo de 3 a 8 miembros, preferiblemente, un anillo de cinco a siete miembros, que puede contener una o más insaturaciones. El anillo puede ser arilo o aralquilo. Uno o más de los átomos del anillo pueden estar sustituidos con un sustituyente diferente de hidrógeno para constituir una o más funcionalidades. Los átomos del anillo diferentes de hidrógeno usualmente son carbono pero también pueden incluir oxígeno, azufre, boro, silicio y/o nitrógeno. Ejemplos de esos anillos son benceno, naftaleno, antraceno, fenantreno, piridina, pirimidina, furano, indeno, indano, pirrol, tiofeno, imidazol.

El polímero anteriormente mencionado generalmente contiene desde aproximadamente 3 hasta 50.000, preferiblemente, desde 25 hasta 10.000, más preferiblemente, desde 50 hasta 1.000 unidades monosacáridas que se repiten. Preferiblemente, existen al menos dos A en QL en al menos una de las unidades monosacáricas de cada 20 unidades, más preferiblemente, en al menos una de cada 10 unidades monosacáridas del polímero.

A continuación vienen ejemplos a modo de ilustración y no de limitación, de polímeros de acuerdo con la presente invención.

L es alquileno, p. ej., metileno (-CH_{2}-), etileno (-CH_{2}-CH_{2}-), etc.; o alquilenoxihidroxialquileno, p. ej., 1-metilenoxi-2-hidroxietileno (-CH_{2}-O-CH_{2}-C(OH)H-), etc.

Q es (i) -CH=CR^{1}R^{2}, (ii) (R^{1}R^{2})C=C-C(O)-R^{3}, (iii) (R^{1}R^{2})C=C-C(O)-OR^{3} y (iv) (R^{1}R^{2})C=C-C(O)-NR^{3}R^{4}.

R^{3} y R^{4} son un alquilo inferior, preferiblemente metilo.

Polímeros particularmente preferidos de acuerdo con la presente invención son aquellos en los que el polímero es un dextrano modificado en el que la A que está junto al oxígeno metilenoxi de una de las unidades del polímero es un enlace al carbono glicosídico C1 de otra de las unidades del polímero, y QL es HC(O)CH_{2}- o HC(O)CH_{2}OCH_{2}C(OH)HCH_{2}-.

Los polímeros de la invención se pueden preparar de diferentes modos. El siguiente análisis de uno de los ejemplos de una preparación de los anteriores polímeros se hace a modo de ilustración y no de limitación. El método que se describe a continuación es fácil de llevar a cabo y no compromete la estabilidad del polisacárido. El método comprende hacer reaccionar el polisacárido con un agente alquilante que contiene una funcionalidad que reacciona con un grupo hidroxilo de dicho polisacárido, formándose así un polisacárido alquilado, en el que el agente alquilante contiene un grupo olefínico, y tratar después el polisacárido alquilado para convertir el grupo olefínico en una funcionalidad reactiva con aminas.

El agente alquilante puede comprender la estructura:

L^{3}(Z^{1})C=CR^{5}R^{6}

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en la que L^{3} es un grupo que comprende una funcionalidad reactiva con un grupo hidroxilo del polisacárido, R^{5} y R^{6} son independientemente H, alquilo, arilo, o se pueden agrupar entre sí o con L^{3} para formar un anillo, y Z^{1} es H o C(W)=O, en donde W es R^{7}, OR^{7} o NR^{7}R^{8}, en donde R^{7} y R^{8} son independientemente H, alquilo o arilo. Usualmente, un anillo, cuando está presente, es un anillo de tres a ocho miembros, preferiblemente, un anillo de cinco a siete miembros, que puede contener una o más insaturaciones. El anillo puede ser arilo o aralquilo. Uno o más de los átomos del anillo pueden estar sustituidos con un sustituyente diferente de hidrógeno para constituir una o más funcionalidades. Los átomos del anillo diferentes de hidrógeno usualmente son carbono pero también pueden incluir oxígeno, azufre, boro, silicio y/o nitrógeno. Ejemplos de esos anillos son benceno, naftaleno, antraceno, fenantreno, piridina, pirimidina, furano, indeno, indano, pirrol, tiofeno, imidazol.

El polímero que se elija determinará el agente alquilante particular que se ha de utilizar. Por ejemplo, para construir el polímero anteriormente descrito en el que QL es HC(O)CH_{2}-, se utiliza un agente alquilante en el que L^{3} es un metileno que lleva un grupo lábil tal como bromo, Z^{1}, R^{5} y R^{6} son H. Para construir el polímero anteriormente descrito en el que QL es HC(O)CH_{2}OCH_{2}C(OH)HCH_{2}-, se utiliza un agente alquilante en el que L^{3} es CH_{2}OCH_{2}(C_{2}H_{3}O) en donde (C_{2}H_{3}O) es un radical oxiranilo. Este último agente alquilante es preferido cuando se desea obtener un polímero soluble en agua. El mantenimiento de la solubilidad del dextrano en agua, se puede conseguir generalmente incorporando un grupo que confiere hidrofília al dextrano durante la introducción del grupo aldehído. Por consiguiente, un agente alquilante preferido es CH_{2}=CHCH_{2}OCH_{2}(C_{2}H_{3}O), que da como resultado la introducción de un QL que contiene átomos de oxígeno adicionales, es decir, HC(O)CH_{2}OCH_{2}C(OH)HCH_{2}-.

Por ejemplo, el dextrano se trata con un alilglicidil-éter (CH_{2}=CHCH_{2}OCH_{2}(C_{2}H_{3}O)) en un medio acuoso ácido. Se emplea una apertura del anillo epóxido, catalizada por ácido, que da como resultado la adición de un grupo hidroxilo situado en uno de los átomos de carbono del dextrano, a uno de los dos átomos de carbono del anillo epóxido para dar lugar a aliloxidextrano. En esta etapa, el pH del medio es aproximadamente de 1 a 4, preferiblemente de 1,5 a 2,5. Usualmente, es conveniente llevar a cabo la reacción en presencia de un ácido de Lewis, tal como por ejemplo, Zn(BF_{4})_{2}, H_{2}SO_{4}, SnCl_{2}. Por consiguiente, el pH de la reacción no debe ser ni demasiado bajo ni demasiado alto como para que afecte a los enlaces de la molécula de dextrano, o como para que produzca otros efectos deletéreos en ella. En los casos en los que se utiliza un ácido de Lewis, el pH no debe ser tan alto como para que produzca un efecto deletéreo sobre el ácido de Lewis, tal como producir la precipitación de materiales de la reacción no deseados. La cantidad del ácido de Lewis utilizada es aproximadamente de 10%-30% (peso/peso) de la cantidad de dextrano. El control del pH permite controlar el número de grupos aldehído introducidos en el dextrano; por ello, el control del pH es importante.

El período de tiempo de la reacción es normalmente de unas 6 a 18 horas, preferiblemente de unas 10 a 15 horas. Es preferible llevar a cabo la reacción en atmósfera de un gas inerte, tal como por ejemplo, argón, neón, nitrógeno. La temperatura de la mezcla de reacción generalmente es de 70ºC a 90ºC aproximadamente, usualmente de 75ºC a 85ºC aproximadamente, preferiblemente de 80ºC aproximadamente.

El orden de adición de los reactivos usualmente implica disolver el dextrano, el ácido de Lewis y un agente alquilante tal como alilglicidil-éter en agua, calentando a aproximadamente de 60ºC a 80ºC, preferiblemente a de 68ºC a 72ºC aproximadamente. Después del período de tiempo determinado, la mezcla de reacción se enfría y el producto aliloxi-dextrano resultante se purifica, por ejemplo, mediante filtración, ultrafiltración o un método similar.

El procedimiento anterior introduce por término medio aproximadamente un grupo aliloxi por cada de 5 a 20, usualmente por cada de 7 a 12, preferiblemente por cada de 8 a 10 unidades polisacáridas de la molécula de dextrano. Usualmente, se introduce un solo grupo aliloxi en una unidad polisacárida que está alquilada, generalmente, en el grupo hidroxilo de la posición 2, 3 ó 4.

El aliloxi-dextrano se trata para introducir una funcionalidad aldehído. Para este fin, el doble enlace se oxida mediante medios adecuados para escindir el doble enlace e introducir un grupo aldehído terminal. La oxidación se puede llevar a cabo mediante cualquier medio que produzca un grupo aldehído terminal pero que no afecte a otras partes de la molécula de dextrano. Una manera cómoda de oxidar el doble enlace del aliloxi-dextrano es someter el aliloxi-dextrano a una ozonolisis seguida de un tratamiento reductor tal como con sulfuro de dimetilo. Con este fin, se genera ozono en la mezcla de reacción a una temperatura de aproximadamente 15ºC a 30ºC, usualmente de aproximadamente 20ºC a 28ºC, preferiblemente de aproximadamente 24ºC a 27ºC. En esta etapa el pH del medio es aproximadamente de 5 a 8, preferiblemente de 6 a 7. La cantidad de ozono usada generalmente es la cantidad suficiente para oxidar todos los grupos alilo a grupos aldehído. El período de tiempo de la reacción usualmente es de aproximadamente 5 a 10 horas, preferiblemente de aproximadamente 5 a 7 horas. Es preferible llevar a cabo la reacción en atmósfera de un gas inerte. Después del periodo de tiempo determinado, la mezcla de reacción se enfría y el ozónido se reduce, por ejemplo, mediante la adición de un agente reductor tal como, por ejemplo, un sulfuro, una fosfina tio-sustituida o un agente reductor similar. El producto aldehído-dextrano resultante se purifica mediante precipitación con un disolvente orgánico, diálisis o mediante un procedimiento similar.

Como alternativa al método anterior para preparar los presentes polímeros, el anterior agente alquilante se puede sustituir por CH(O)CH_{2}OCH_{2}(C_{2}H_{3}O). El producto resultante de este agente alquilante es el aldehído-dextrano deseado. Por consiguiente, el aldehído-dextrano deseado se puede obtener mediante alquilación directa aunque se prefiere usar el agente alquilante anteriormente mencionado porque el aldehído libre experimenta reacciones secundarias en condiciones ácidas.

Como realización alternativa, la funcionalidad reactiva con aminas introducida es una funcionalidad ácido alfa-ceto-carboxílico. También esta vez, el polímero que se elija determinará el agente alquilante particular que se ha de utilizar. Por ejemplo, para construir el polímero anteriormente descrito en el que QL es HC(O)CH_{2}OCH_{2}C(OH)HCH_{2}-, se puede utilizar un agente alquilante en el que L^{3} es CH_{2}OCH_{2}(C_{2}H_{3}O) en donde (C_{2}H_{3}O) es un radical oxiranilo y Z^{1} es C(O)OH. Por ejemplo, el dextrano se trata con un agente alquilante de la fórmula CH_{2}=C(COOH)CH_{2}OCH_{2}(C_{2}H_{3}O) en un medio acuoso ácido. Según se ha descrito en lo que antecede, se realiza una apertura del anillo epóxido, catalizada por ácido, que da como resultado la adición de un grupo hidroxilo del dextrano a un átomo de carbono del anillo epóxido para dar lugar a un aliloxi-dextrano. En esta etapa el pH del medio es aproximadamente de 1 a 4, preferiblemente de 1,5 a 2,5. Usualmente, es conveniente llevar a cabo la reacción en presencia de un ácido de Lewis en condiciones similares a las anteriormente descritas. Después del período de tiempo determinado, la mezcla de reacción se enfría y el producto resultante se purifica mediante filtración, ultrafiltración o un procedimiento similar. El producto se trata para introducir una funcionalidad aldehído. Con este fin, el doble enlace se oxida mediante medios adecuados para escindir el doble enlace e introducir una funcionalidad oxo para obtener un producto alfa-ceto-ácido. La oxidación se puede llevar a cabo mediante cualquier medio que produzca una funcionalidad oxo pero que no afecte a otras partes de la molécula. Una manera cómoda de oxidar el doble enlace de este producto para introducir una funcionalidad oxo, es someter el producto a una ozonolisis según se ha descrito anteriormente. El producto alfa-ceto-ácido resultante se purifica mediante filtración, ultrafiltración o un procedimiento similar.

Como alternativa al método anterior para preparar los presentes polímeros, el anterior agente alquilante se puede sustituir por C(O)(COOH)CH_{2}OCH_{2}(C_{2}H_{3}O). El producto directo obtenido con este agente alquilante es dextrano sustituido con un alfa-ceto-ácido.

En otra estrategia ilustrativa de acuerdo con la presente invención, se puede preparar un polímero aldehído-dextrano en el que QL es HC(O)CH_{2}-. En esta estrategia se utiliza un agente alquilante que contiene un grupo lábil, tal como por ejemplo, bromuro de alilo. La reacción comprende el desplazamiento del bromo del agente alquilante producido por un átomo de oxígeno de una de las unidades polisacáridas del dextrano, en presencia de una base tal como hidróxido sódico, hidróxido potásico o una base similar. El dextrano se mezcla con el bromuro de alilo en un medio acuoso y en una atmósfera inerte, en presencia de una cantidad de una base suficiente para obtener el desplazamiento anteriormente mencionado. En esta etapa, el pH del medio es aproximadamente de 10 a 14, preferiblemente de 11 a 14. El pH de la reacción no debe ser ni demasiado bajo ni demasiado alto como para que afecte a los enlaces de la molécula de dextrano, o como para que produzca otros efectos deletéreos en ella. El control del pH permite controlar el número de grupos aldehídos introducidos en el dextrano; por ello, el control del pH es importante.

El período de tiempo de la reacción normalmente es de 2 a 8 horas aproximadamente, preferiblemente de 3 a 5 horas aproximadamente. Es preferible llevar a cabo la reacción en atmósfera de un gas inerte.

El orden de adición de los reactivos no es crítico. Preferiblemente, el dextrano se disuelve en agua calentando a de 50ºC a 80ºC aproximadamente, preferiblemente a de 60ºC a 70ºC aproximadamente. Después el pH del medio se ajusta al nivel deseado. A continuación se añade el bromuro de alilo a la mezcla de reacción y la temperatura se eleva hasta la temperatura de reacción deseada en caso necesario. Después del período de tiempo determinado, la mezcla de reacción se enfría y el producto aliloxi-dextrano resultante se purifica mediante precipitación con un disolvente orgánico, ultrafiltración o un procedimiento similar.

El anterior procedimiento introduce por término medio aproximadamente un grupo alilo por cada de 3 a 20, usualmente de 7 a 15, preferiblemente de 8 a 12 unidades polisacáridas de la molécula de dextrano.

El alil-dextrano se trata para introducir una funcionalidad aldehído según se ha descrito anteriormente en el caso del aliloxi-dextrano. El producto aldehído-dextrano resultante se purifica mediante precipitación con un disolvente orgánico, ultrafiltración o un procedimiento similar, según se ha descrito anteriormente.

Otro aspecto de la presente invención es un método para conjugar los presentes polímeros con una biomolécula tal como un polipéptido. Un polisacárido se hace reaccionar con un agente alquilante que contiene una funcionalidad que reacciona con un grupo hidroxi del polisacárido formándose así un polisacárido alquilado como se ha descrito en lo que antecede. El polisacárido alquilado se trata para obtener una funcionalidad reactiva con aminas según se ha descrito en lo que antecede. El polisacárido que contiene una funcionalidad reactiva con aminas se hace reaccionar con una funcionalidad amina presente en la biomolécula para producir el polímero conjugado con la biomolécula. Las condiciones de reacción para llevar a cabo esta reacción dependen en cierta medida de la naturaleza de la funcionalidad reactiva con aminas. Por ejemplo, un polisacárido que contiene una funcionalidad aldehído se hace reaccionar con una amina de la biomolécula. Generalmente, esta reacción se lleva a cabo en condiciones ligeramente ácidas y en presencia de un agente reductor tal como un cianoborohidruro o un agente reductor similar. El pH del medio de reacción que contiene los reaccionantes debe ser lo suficientemente bajo para permitir que un número apreciable de los grupos amino estén protonados, pero no tan bajo como para producir una cantidad insuficiente de los compuestos con grupos amino libres. El pH normalmente es aproximadamente de 4 a 6, preferiblemente de 5,0 a 5,5. El período de tiempo de la reacción normalmente es de 10 a 20 horas aproximadamente, preferiblemente de 14 a 18 horas aproximadamente. La temperatura de la mezcla de reacción generalmente es de 15ºC a 30ºC aproximadamente; usualmente, de 20ºC a 25ºC aproximadamente. Muchas veces es conveniente bloquear todas las funcionalidades aldehído que no han reaccionado con el polipéptido. Con este fin, el conjugado anteriormente producido se trata con un reactivo bloqueante adecuado que formará un producto estable con los grupos aldehído libres restantes. Ese agente bloqueante puede ser, por ejemplo, hidroxilamina, semicarbazida, fenilhidrazina, hidrazina, cianuro sódico, preferiblemente hidroxilamina. El producto resultante se purifica mediante medios convencionales tales como, por ejemplo, ultrafiltración, precipitación, diálisis y medios similares.

Los compuestos polisacáridos de la presente invención, conjugados con un polipéptido, se pueden utilizar en ensayos de determinación de analitos. Los métodos de ensayo usualmente incluyen una muestra de la que se sospecha que contiene un analito, que se mezcla en un medio de ensayo con los reactivos para llevar a cabo el ensayo. Esos reactivos pueden incluir una pareja de unión para el analito, análogos del analito, superficies sólidas a las que se une uno de los anteriores reactivos, parejas de unión de miembros del sbp. Uno o más de los reactivos puede estar marcado. Los reactivos se eligen de manera que se obtenga una señal procedente de un marcador, que guarda relación con la presencia o con la cantidad del analito presente en la muestra. El ensayo se puede realizar sin la separación (ensayo homogéneo) o con la separación (ensayo heterogéneo) de cualquiera de los componentes o productos del ensayo.

Ejemplos de inmunoensayos homogéneos son los productos analíticos EMIT® assay products (Syva Company, San José, CA) descritos en Rubenstein y col., Patente de EE. UU. Núm. 3.817.837, desde la columna 3, línea 6, hasta la columna 6, línea 64; en Maggio, E.T., infra, se analizan métodos de inmunofluorescencia como los descritos en Ullman y col., Patente de EE. UU. Núm. 3.996.345, desde la columna 17, línea 59, hasta la columna 23, línea 25; técnicas enzimáticas de canalización tales como las descritas en Maggio y col., Patente de EE. UU. Núm. 4.233.402, desde la columna 6, línea 25, hasta la columna 9, línea 63; y otros inmunoensayos enzimáticos tales como el ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima (ELISA) (del inglés, " Enzime Linked Immunosorbant Assay"). Ejemplos de inmunoensayos heterogéneos son los radioinmunoensayos, descritos en Yalow, y col., J. Clin. Invest., 39: 1157 (1960). Otro método que tiene aplicación en la presente invención se describe en Ullman y col., Patente de EE. UU. Núm. 4.857.453, desde la columna 11, línea 21, hasta la columna 21, línea 55.

Los ensayos heterogéneos usualmente implican una o más etapas de separación y pueden ser competitivos o no competitivos. Diversos formatos de ensayos heterogéneos, competitivos y no competitivos, se encuentran descritos en Davalian y col., Patente de EE. UU. Núm. 5.089.390, desde la columna 14, línea 25, hasta la columna 15, línea 9. En un ensayo heterogéneo competitivo típico, un soporte que lleva unido a él un anticuerpo específico para el analito, se pone en contacto con un medio que contiene la muestra y un análogo del analito conjugado con un marcador detectable tal como una enzima (el "conjugado"). El analito presente en la muestra compite con el conjugado por su unión al anticuerpo. Después de separar el soporte y el medio, la actividad del marcador presente en el soporte o en el medio se determina mediante técnicas convencionales y se relaciona con la cantidad de analito presente en la muestra.

Un ensayo no competitivo típico en sándwich es un ensayo descrito en David y col., Patente de EE. UU. Núm. 4.486.530, desde la columna 8, línea 6, hasta la columna 15, línea 63. En este método, se forma un inmunocomplejo de tipo sándwich en el medio del ensayo. El complejo comprende el analito, un primer anticuerpo (monoclonal o policlonal) que se une al analito y un segundo anticuerpo que se une al analito o a un complejo del analito y el primer anticuerpo. Posteriormente, el inmunocomplejo de tipo sándwich se detecta y se relaciona con la cantidad de analito presente en la muestra. El inmunocomplejo de tipo sándwich se detecta en virtud de la presencia en el complejo de un marcador, en el caso de que uno solo o ambos del primer anticuerpo y del segundo anticuerpo contengan marcadores o sustituyentes capaces de unirse con los marcadores.

Los análisis en sándwich son útiles por lo general en la detección de analitos de tipo antígeno y de analitos de tipo receptor. En este ensayo, al analito se unen dos anticuerpos específicos para el analito y por ello el ensayo se denomina también ensayo inmunométrico basado en dos sitios. En una de las estrategias, una primera incubación del anticuerpo no marcado acoplado a un soporte, también conocido como anticuerpo insoluble, se pone en contacto con un medio que contiene una muestra de la que se sospecha que contiene el analito. Después de una etapa de lavado y de separación, el soporte se pone en contacto con un medio que contiene el segundo anticuerpo, que generalmente contiene un marcador, durante un segundo período de incubación. El soporte se lava de nuevo y se separa del medio, y, o bien el medio o bien el soporte, se examinan con respecto a la presencia del marcador. La presencia y la cantidad del marcador se relaciona con la presencia o la cantidad del analito. Para un análisis más detallado de esta estrategia, véanse las Patentes de EE. UU. Núms. 29.169 y 4.474.878.

En una variación del anterior ensayo en sándwich, la muestra presente en un medio adecuado, se pone en contacto con un anticuerpo marcado específico para el analito y se incuba durante un período de tiempo. Después el medio se pone en contacto con un soporte al que está unido un segundo anticuerpo específico para el analito. Después de un período de incubación, el soporte se separa del medio y se lava para retirar los reactivos no unidos. El soporte o el medio se estudian con respecto a la presencia del marcador, que se relaciona con la presencia o con la cantidad del analito. Para un análisis más detallado de esta estrategia, véase la Patente de EE. UU. 4.098.876.

En otra variación del ensayo anterior, la muestra, el primer anticuerpo unido a un soporte y el anticuerpo marcado se mezclan en un medio y se incuban en una única etapa de incubación. La separación, las etapas de lavado y el estudio con respecto a la presencia del marcador se realizan según se ha descrito en lo que antecede. Para un análisis más detallado de esta estrategia, véase la Patente de EE. UU. 4.244.940.

La presente invención tiene aplicación en todos los ensayos anteriores. Un ejemplo concreto de un ensayo de acuerdo con la presente invención se describe más adelante a modo de ilustración y no de limitación. El ensayo se dirige a la detección de un anticuerpo en una muestra de la que se sospecha que contiene ese anticuerpo y se encuentra descrito con más detalle en la solicitud de Patente de EE. UU, núm. de serie 08/310.028, presentada el 21 de septiembre de 1.994. En este método, se crea un medio de ensayo acuoso que comprende la muestra, un antígeno que se une al anticuerpo formando así un complejo antígeno:anticuerpo, y un primer agente de unión que se une al complejo y que no se une al antígeno cuando el antígeno no forma parte del complejo. La cantidad de antígeno añadido al medio es Z, estando Z en el intervalo de X a nX, y siendo Z menor que Y, en donde n es 5 - 1.000, preferiblemente 10 - 100. X es la cantidad mínima de antígeno que puede ser detectada con precisión cuando no existen anticuerpos en la muestra e Y es la cantidad máxima esperada de anticuerpos en la muestra. Un segundo agente de unión que se une selectivamente al antígeno en relación con la unión al complejo cuando el complejo está unido al primer agente de unión, se mezcla con el medio del ensayo. Se detecta el antígeno unido al segundo agente de unión. Su presencia o su cantidad se relaciona con la presencia o la cantidad de anticuerpos presentes en la muestra.

Una característica crítica del método anterior es que el primer agente de unión se une al complejo antígeno:anticuer-
po de una manera que impide la unión del segundo agente de unión al complejo. Los agentes de unión son miembros de un spb y la unión del segundo agente de unión al complejo unido al primer agente de unión se puede prevenir mejor cuando el primer agente de unión está unido a un polímero soluble o a una fase sólida que puede estar en suspensión. Esto proporciona la ventaja añadida de que el complejo unido al primer agente de unión no necesita ser separado del medio antes de la adición del segundo agente de unión, porque el complejo unido al primer complejo de unión no interfiere con la medida del antígeno libre.

El miembro del spb que constituye el primer agente de unión se selecciona de manera que se una al complejo antígeno:anticuerpo y que no se una al antígeno cuando el antígeno no forma parte del complejo, es decir, el primer agente de unión no se une de manera significativa al antígeno libre o no unido presente en el medio. El miembro del sbp se puede también unir a otras sustancias presentes en la muestra, p. ej., a anticuerpos que no son el analito. Esto es aceptable con la condición de que el primer agente de unión no se una al antígeno excepto cuando el antígeno está unido al anticuerpo que es el analito.

Miembros de un sbp adecuados para primeros agentes de unión incluyen, sin carácter de limitación, anticuerpos dirigidos contra inmunoglobulinas; el factor de complemento, C1q; factor reumatoide; proteína G y/o proteína A. Algunos de estos materiales se unen a inmunoglobulinas de manera no selectiva, por ejemplo, los anticuerpos anti-Fab y la proteína A, algunos de ellos se unen selectivamente a inmunoglobulinas relativamente específicas tales como los anticuerpos anti-Fc y el factor reumatoide, y algunos de ellos se unen selectivamente a inmunocomplejos, por ejemplo C1q. Según se ha indicado anteriormente, con el fin de prevenir la unión del segundo agente de unión al complejo antígeno:anticuerpo, es preferible que el primer agente de unión comprenda además una fase sólida que puede estar en suspensión o un polímero soluble, es decir, que el agente de unión esté unido a una fase sólida que puede estar en suspensión o a un polímero soluble. De acuerdo con la presente invención, uno de los primeros agente de unión anteriormente mencionados, p. ej., la proteína A, se conjuga con el aldehído-dextrano como se ha descrito en lo que antecede y el conjugado se utiliza en el ensayo según se ha descrito en lo que antecede.

El segundo agente de unión es un miembro de un sbp que es capaz de unirse al antígeno. Puede ser un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, u otro receptor del antígeno; un ligando al que el antígeno se une, como por ejemplo, un inhibidor irreversible si el antígeno es una enzima; o uno de los miembros de un sbp cuando el otro miembro está unido al antígeno. En los casos en los que el segundo agente de unión es un polipéptido, p. ej., un anticuerpo, puede estar conjugado con el aldehído-dextrano de la presente invención para formar un polímero soluble.

Después de la adición del segundo agente de unión, se detecta el antígeno unido al segundo agente de unión y su presencia o su cantidad se relaciona con la presencia o la cantidad de los anticuerpos presentes en la muestra. Esta relación es inversamente proporcional ya que cuanto mayor es la concentración de anticuerpos presentes en la muestra, menor es la cantidad de antígeno libre, es decir la cantidad de antígeno que se une al segundo agente de unión. La detección del antígeno libre se puede llevar a cabo de diferentes maneras. En formatos heterogéneos, el segundo agente de unión está unido a un soporte separable, es decir, a una fase sólida que puede estar en suspensión o que puede no estar en suspensión. Por ejemplo, el segundo agente de unión puede ser un anticuerpo anti-antígeno o un receptor tal como estreptavidina que se une a un ligando que está unido al antígeno. En estos formatos, la muestra y el antígeno se mezclan primero y el primer agente de unión se añade luego. Después de la adición del segundo reactivo de unión unido a un soporte, el soporte se separa de la mezcla. La cantidad de antígeno que se ha unido al segundo agente de unión-soporte se puede medir directamente o indirectamente. Cuando el antígeno lleva un marcador unido, se puede detectar la presencia del marcador en el soporte. Con determinados soportes, en particular con dispositivos que contienen indio, silicio y con dispositivos acústicos, incluso un antígeno no marcado se puede medir de manera directa. Como alternativa, el antígeno se puede medir de manera indirecta añadiendo un reactivo que haga que el antígeno se marque de manera específica, p. ej., añadiendo un agente de marcaje tal como un anticuerpo marcado dirigido contra el antígeno. Ese marcador, puede luego ser detectado mediante métodos muy conocidos por los expertos en técnica.

La detección de anticuerpos es una herramienta útil en el diagnóstico de enfermedades infecciosas. La detección de autoanticuerpos es también útil en el diagnóstico de enfermedades autoinmunitarias. El anterior método de ensayo se puede usar para detectar numerosos anticuerpos, tales como anticuerpos contra el virus de la inmunodeficiencia humana ("HIV"), anticuerpos contra la rubeola o contra herpes, y autoanticuerpos tales como autoanticuerpos contra la insulina, contra la ácido glutámico-descarboxilasa ("GAD"), tanto contra la isoforma de 65 kDa como contra la isoforma de 67 kDa, pero más en particular contra la GAD_{65}; y contra otros antígenos de las células de los islotes.

Se han realizado gran cantidad de investigaciones relacionadas con la detección de autoanticuerpos como factor de riesgo en pacientes que han desarrollado una diabetes mellitus insulinodependiente ("IDDM"). Existen varios autoanticuerpos que se piensa que son indicativos de la IDDM, que se conoce también como Diabetes de Tipo I o diabetes juvenil. Estos autoanticuerpos incluyen: autoanticuerpos contra antígenos de las células de los islotes pancreáticos, tales como contra la insulina, y más recientemente autoanticuerpos contra la isoforma de 65 kDa de la ácido glutámico-descarboxilasa ("GAD_{65}") y contra IA-2. Se ha sugerido que las autoanticuerpos contra GAD_{65} son uno de los marcadores más tempranos en el desarrollo de la IDDM. Estos autoanticuerpos se presentan varios años antes de la manifestación clínica de la IDDM, momento en el que se podrían tomar medidas para impedir la progresión de la enfermedad.

Por consiguiente, un ensayo ilustrativo del método anterior es el siguiente. Una GAD_{65} recombinante se marca con biotina para obtener bGAD. Este conjugado se incuba después con muestras de suero de pacientes. Un conjugado de proteína A y aldehído-dextrano de la presente invención se añade luego y se continúa la incubación. La suspensión se transfiere a un pocillo de microtitulación que ha sido revestido con estreptavidina. Después de una incubación para que la bGAD libre se una, el pocillo se lava y se incuba con un anticuerpo monoclonal de ratón, dirigido contra GAD, que o está conjugado con un marcador tal como peroxidasa de rábano ("HRP"), o está no conjugado. Cuando se usan anticuerpos no conjugados, el pocillo se lava de nuevo y después se incuba con anticuerpos IgG anti-ratón marcados. En cada uno de los casos, después de haber añadido los anticuerpos marcados, el pocillo se lava una última vez y se incuba con miembros adicionales de sps. Por ejemplo, si el marcador es HRP, la última incubación podría incluir una disolución que contuviera peróxido de hidrógeno y tetrametilbenzidina y el desarrollo del color se leería después de la incubación.

En un ensayo realizado siguiendo este formato de la presente invención, las muestras que se sabía que eran anti-GAD_{65} negativas, mostraron una supresión mínima de la señal. Las muestras que se sabía que eran anti-GAD_{65} positivas, presentaron supresión del desarrollo del color.

La invención se demuestra más ampliamente por medio de los siguientes ejemplos demostrativos.

Ejemplos

Las partes y los porcentajes que aquí aparecen se expresan en peso salvo que se indique lo contrario. Las temperaturas se expresan en grados centígrados (ºC).

Ejemplo 1 Preparación de un conjugado de dextrano-Proteína A Materiales y equipo

Dextrano T-500, procedente de Pharmacia, Núm. de catálogo 17-0320-02.

Alilglicidil-éter, procedente de Aldrich, Núm. de catálogo A3.260-8.

Tetrafluoroborato de zinc, Zn(BF_{4})_{2}, disolución al 40% en peso, procedente de Aldrich, Núm. de catálogo 33.386-7.

Se usó hidróxido sódico, procedente de Mallinckrodt AR (lote 7707 KMRT) para preparar disoluciones de NaOH 10 M y 1,0 M en agua.

El sulfuro de dimetilo (CH_{3})_{2}S procedió de Aldrich, Núm. de catálogo M8.163-2.

El 1-heptanol se obtuvo procedente de Aldrich, Núm. de catálogo H280-5.

El agua (desionizada) se obtuvo procedente de una Unidad de filtración de Millipore.

Los espectros de UV-Visible se registraron en un espectrofotómetro de diodos en fila, Hewlett Packard 8452A.

El ozonizador utilizado fue el Polyozone Modelo T-816, Serie 3641, procedente de Polymetrics, Colorado Springs, CO.

Minikros Lab System (Microgon Inc. Núm. de catálogo SYLS 121 01N) y los módulos de flujo tangencial Minikros (M25S 300 01N, M25S 600 01N, M21M-300-01N) procedieron también de Microgon Inc. Laguna Hills, CA.

El oxígeno (extra seco) usado para generar ozono se obtuvo procedente de Altair Gases and Equipment, San Ramón, CA.

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El cianoborohidruro sódico, NaCNBH_{3}, procedió de Aldrich Chemical Company (Núm. de catálogo 15.615-9).

El hidrocloruro de hidroxilamina, NH_{2}OH\cdotHCl procedió de Mallinckrodt (grado AR, Núm. de lote 5258 KVEN).

La Proteína A procedió de Repligen Corporation (Código del producto 15001-10-00, lote del producto RC7151) y fue suministrada en forma de disolución en agua con una concentración de 50 mg/ml.

El acetato sódico, NaOAc, procedió de Mallinckrodt (grado AR, Núm. de lote 7364 KPNJ).

Tampón de acetato, 0,1 M, pH 5,0.

Los espectros de ^{1}H-NMR y ^{13}C-NMR se ejecutaron en D_{2}O (procedente de Aldrich, 99,5%) en un espectrofotómetro Bruker WP-250 MHz. Los desplazamientos químicos de ^{1}H se registraron tomando el agua como pico de referencia a 4,67 ppm. Se usaron acetona y etanol como referencia interna en el espectro de ^{13}C NMR y el carbono anomérico a 99,1 ppm se usó posteriormente como pico de referencia.

La cromatografía de exclusión por tamaño se realizó en un sistema de FPLC de Pharmacia que consistía en una unidad de control LCC 500 plus de LKB, dos bombas P-500 y una válvula automática MV-7 motor valve. La columna utilizada fue Superose 6 HR 10/30 (Pharmacia, Núm. de catálogo 17-537-01). El aparato de registro usado fue un Rec-102 de LKD Pharmacia. El detector fue un refractómetro diferencial R401 procedente de Waters Associates.

La liofilización se realizó en un liofilizador 8L VirTis Benchtop Freeze Dryer (Scientific Products).

1) Preparación de aldehído-dextrano

El dextrano (400 g, 500 kDa) se disolvió en 1,5 litros de agua (Millipore), en un vaso de precipitados de 4 litros, calentando a 70ºC con agitación en superficie. El dextrano se añadió al agua a 70ºC, en porciones de 30 g - 50 g, añadiéndose cada porción una vez disuelta la porción anterior. El aparato de agitación en superficie se ajustó a 300 - 400 rpm.

La disolución de dextrano caliente se filtró a través de un embudo fritado (poro grueso) al interior de un matraz Erlenmeyer y la disolución filtrada se vertió en un matraz de 3 cuellos, pre-equilibrado a 70ºC. El vaso de precipitados se aclaró con 50 ml de agua caliente, agua que se filtró a través del embudo fritado y se recogió en el matraz Erlenmeyer. Este filtrado se añadió a la mezcla de reacción.

El embudo se retiró del cuello lateral del matraz y en su lugar se insertó un adaptador Claisen para destilación con entrada dual. El aparato de agitación en superficie se puso en marcha y se ajustó a 600 rpm - 700 rpm y se dejó que la temperatura de la disolución de dextrano alcanzara 70ºC. La temperatura del baño de aceite se ajustó a 72ºC-75ºC. La reacción se llevó a cabo en atmósfera de argón. La disolución de Zn(BF_{4})_{2}, (400 ml, al 25% en H_{2}O, pH 1,8 \pm 0,2) se vertió en el matraz que contenía la disolución de dextrano usando un embudo colocado en el adaptador Claisen. El embudo se retiró del adaptador Claisen y se sustituyó por un embudo de adición (de 500 ml de capacidad) con un brazo lateral igualador de presiones.

Se añadió alilglicidil-éter (500 ml de los 1,5 litros que se han de añadir) en el embudo de adición (en porciones de 3 x 500 ml), a una velocidad de 8-10 ml/min, mientras que la temperatura de la reacción se mantenía a 70ºC \pm 2ºC. La adición del alilglicidil-éter se continuó hasta que se hubieron añadido los 1,5 litros. A continuación, la temperatura de la mezcla de reacción se aumentó a 80ºC. Se dejó que la reacción prosiguiera durante 12 h - 13 h, a 80ºC y en atmósfera de argón, al tiempo que se agitaba de manera continua (600 rpm - 700 rpm).

El recipiente de la reacción se sacó del baño de aceite y la mezcla de reacción se dejó enfriar hasta 30ºC. La mezcla de reacción enfriada se vertió luego en un volumen de 6,0 litros de agua (bidón Nalgene con espita) y se agitó con la mano. La mezcla de reacción diluida se purificó mediante ultrafiltración usando un sistema de diafiltración de flujo tangencial de Microgon. El aliloxi-dextrano se concentró hasta un volumen de 1,0 - 1,5 litros.

Se extrajo un parte alícuota (50 ml) del filtrado y se liofilizó con fines analíticos. La disolución restante de aliloxi-dextrano en agua se almacenó a 4ºC y se usó en la siguiente etapa. Los espectros de resonancia magnética nuclear (NMR) de ^{1}H y ^{13}C del aliloxi-dextrano anteriormente mencionado concordaron con los del producto esperado.

El aliloxi-dextrano se sometió a ozonolisis en un vaso de precipitados de 4,0 litros equipado con un agitador de superficie. La mezcla se agitó a 300 rpm - 350 rpm y se dejó que alcanzara la temperatura ambiente. El ozono se generó en un ozonizador y se añadió por medio de un dispositivo de burbujeo sumergido en la disolución de aliloxi-dextrano, con una presión de 9,0 psi y con un caudal de 2,0 LPM (litros por minuto). Se añadieron 10 ml de heptanol como antiespumante. El seguimiento de la reacción se hizo por ^{13}C-NMR; la desaparición de las resonancias olefínicas a 118 ppm y a 134 ppm se usó como indicación de que la reacción se había completado. La adición de ozono se continuó durante 5 h - 6 h. La mezcla de reacción se enfrió a aproximadamente 10ºC. A ella se añadieron 50 ml de sulfuro de dimetilo y la agitación en atmósfera de argón se continuó durante 10 h. La mezcla de reacción se dejó que alcanzara la temperatura ambiente al mismo tiempo que era agitada (300 rpm - 350 rpm) durante este tiempo. El aldehído-dextrano resultante se purificó mediante una ultrafiltración con Microgon.

2) Conjugación de la Proteína A con aldehído-dextrano

Una disolución de aldehído-dextrano, 2 mg/ml, resultante del procedimiento anterior, se preparó en tampón de acetato 0,1 M (pH 5 \pm 0,1) y calentando a 65ºC - 70ºC. La disolución de aldehído-dextrano se enfrió hasta temperatura ambiente (22ºC - 25ºC) y 1 ml de la disolución de proteína A se añadió con agitación a la disolución de aldehído-dextrano. El pH de la mezcla se mantuvo en 5 \pm 0,1. Se preparó una disolución de cianoborohidruro sódico en agua (63 mg/ml) y 200 \mul de esta disolución se añadieron a una disolución en agitación de proteína A y aldehído-dextrano. La reacción se agitó toda la noche (16-18 horas). Se preparó una disolución de hidroxilamina 1,0 M en tampón de acetato (pH 5,0) y 1,0 ml de esta disolución se añadieron a la mezcla de reacción anterior. La agitación se continuó durante 3-4 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se purificó en un centriprep-100 de Amicon (MWCO, 100 kDa). Los filtrados se analizaron con respecto a la presencia de proteína A, registrando la OD a 280 nm. La fracción retenida después de la primera centrifugación se diluyó con agua y los tubos se sometieron a una centrifugación a 4 krpm durante 30 minutos. Los filtrados se analizaron de nuevo como se ha descrito anteriormente. Las anteriores etapas de purificación se repitieron ocho veces adicionales. Las fracciones retenidas se reunieron y el dextrano se determinó mediante medida de la rotación y la proteína A se determinó mediante medida de la absorbancia A_{280}.

La conjugación del aldehído-dextrano y la Proteína A también se llevó a cabo de una manera similar a la anteriormente descrita excepto en que se usó Proteína A sólida (viales de 500 mg, procedentes de Repligen Corporation) en lugar de la disolución comercial de Proteína A. La Proteína A sólida se disolvió en 10 ml de agua desionizada. La purificación del conjugado de Proteína A-Dextrano se llevó a cabo mediante ultrafiltración usando el sistema Minikros Lab System procedente de Microgon, Inc.

Ejemplo 2 Ensayo que utiliza un conjugado de Proteína A - aldehído-dextrano Abreviaturas

AET

Bromuro de 2-aminoetilisotiouronio

bGAD_{65}

GAD biotilinada

BSA

Albúmina de suero bovino

EDTA

Ácido etilendiaminotetraacético

ELISA

Ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima

GAD_{65}

Ácido glutámico-descarboxilasa humana recombinante, peso molecular 65.300

HRP

Peroxidasa de rábano

IDDM

Diabetes mellitus insulinodependiente

MAb

Anticuerpo monoclonal

PBS

Disolución salina tamponada con fosfato

PLP

Piridoxal-5-fosfato

RIA

Radioinmunoensayo

RT

Temperatura ambiente

SAV

Estreptavidina

SDS-PAGE

Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico

TCEP

Tris(carboxietil)fosfina

TMB

3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina.

Preparación de los materiales

Se prepararon placas revestidas con estreptavidina mediante técnicas estándar. Los anticuerpos anti-ratón marcados con HRP fueron anticuerpos procedentes de cabra y purificados por afinidad, dirigidos contra una IgG (específica de cadena \gamma) de ratón (Kirkegaard & Perry Laboratories). Los demás compuestos químicos fueron de grado reactivo y se encuentran comercialmente disponibles procedentes de fuentes tales como Sigma y Fisher Chemical. Todas las disoluciones se prepararon en H_{2}O y todas las reacciones se realizaron en condiciones ambientales salvo que se indique lo contrario.

Composición del tampón

La composición del Tampón de reacción fue la siguiente: Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, TRITON® X-100 al 0,5%, benzamidina 10 mM (15,7 mg/10 ml), Pefabloc (Pentapharm) en una concentración de 2,4 mg/10 ml, Aprotinina (Pentapharm, 229.500 KIU/ml) en una concentración de 50 \mul/10 ml y Pepstatina A (Sigma) en una concentración de 0,2 mg/10 ml.

Expresión y purificación de GAD_{65} humana recombinante

Células de baculovirus que expresan GAD_{65} humana recombinante se cultivaron en un fermentador y se recogieron. El sedimento se lisó usando un homogeneizador de vidrio. Después de la rotura, el lisado celular se centrifugó y se lavó, y el sedimento lavado se sometió a extracción para obtener la GAD_{65} unida a membranas. Este extracto procedente de membranas se cargó luego en una columna de Q-Sepharose y se eluyó con un gradiente de KCl. Las fracciones enzimáticamente activas se reunieron y se cargaron en una columna de fenil-Sepharose. La elución se realizó con un gradiente inverso de fosfato. Las fracciones eluidas se sometieron a análisis de la actividad enzimática y se determinó su pureza en una PAGE-SDS al 10%. Las fracciones con una pureza cercana al 95%, determinada por tinción de proteínas, se reunieron. El material reunido se concentró usando un Centriprep-30 (Amicon). La GAD_{65} concentrada se diluyó al 50% en glicerol y se congeló a -70ºC.

Yodación de GAD_{65}

El protocolo de yodación se basó en el kit Enzymobead (BioRad), comercialmente disponible, para obtener [^{125}I]GAD_{65}. Los contenidos del único vial de reacción, vendido con el kit, primero se rehidrataron. A este vial rehidratado se añadieron 2 \mul (1 \mug) de GAD_{65} purificada, 5 \mul (0,5 mCi) de ^{125}I, 25 \mul de \beta-D-glucosa al 1%, 50 \mul de tampón de fosfato sódico 0,2 M, pH 7,2, y 18 \mul de H_{2}O (150 \mul de volumen total), seguido de incubación. Después de la reacción con Enzymobeads, los contenidos del vial se cargaron directamente en una columna de gel para cromatografía de exclusión por tamaño y se eluyeron fracciones de 200 \mul con PBS, AET 1 mM y PLP 1 mM. Se identificaron las fracciones con contenía ^{125}I midiendo las cuentas de partes alícuotas de 1 \mul.

Antes de usar en el ensayo, la [^{125}I]GAD_{65} se preadsorbió usando una mezcla de sueros humanos normales. Un volumen de 200 \mul de [^{125}I]GAD_{65} se mezcló con 80 \mul del Tampón de reacción, con 100 \mul de una mezcla de 8 sueros de control IDDM-negativos y con 20 \mul de PBS. Después de una incubación de toda la noche a 4ºC, se añadió una suspensión de Proteína A-Sepharose al 50% en PBS y se incubó a 4ºC durante 1 h. Esta suspensión se sometió luego a microcentrifugación, el sobrenadante se recogió, el sedimento se lavó con 400 \mul de PBS y los dos sobrenadantes se reunieron y se guardaron en partes alícuotas a -70ºC.

Biotinilación de GAD_{65}

La GAD_{65} purificada, 282 \mug/450 \mul en tampón para GAD, pH 7,0, se ajustó a un pH entre 8,0 y 8,2 usando 1 \mul de NaOH 6 N. La composición del tampón para GAD fue de 20 ml de tampón de fosfato (pH 6,8-7,0), PLP 20 \muM, AET 1 mM, EDTA 1 mM, TRITÓN X-100 al 0,1% y glicerol al 10%. A continuación, se añadieron 4 \mul de PLP 10 mM y 5 \mul de una disolución de TCEP con una concentración de 41 mg/ml. Después de una incubación en hielo, la biotinilación se llevó a cabo añadiendo 5 \mul de yodoacetil-LC-biotina (Pierce) durante 3 horas, a 4ºC y en oscuridad. La biotina no reaccionada se separó mediante centrifugación. La proporción biotina:GAD_{65} se determinó que era de aproximadamente de 3 a 5 moles de biotina/mol de GAD_{65}.

Anticuerpos anti-GAD_{65} de ratón

Se inmunizaron ratones con GAD_{65}, expresada y purificada como se ha descrito en lo que antecede, y se generaron los MAb conforme a procedimientos estándar tal como se describe en Milstein y Kohler, supra.

Los anticuerpos monoclonales (MAb) resultantes se sometieron a ensayo en un formato de ELISA estándar y los mejores MAb se seleccionaron en relación con su especificidad por GAD_{65}.

Una mezcla de seis MAb anti-GAD se usó en los primeros ensayos para detectar la bGAD_{65} unida a las placas revestidas con SAV, estando cada uno de los MAb en una concentración de 1 pmol/\mul en PBS más azida sódica al 0,2%. La concentración final de cada uno de los MAb fue 0,2 pmoles/100 \mul/pocillo.

En ensayos posteriores se utilizó sólo un MAb anti-GAD, que se marcó con HRP, eliminándose así la necesidad de los MAb anti-ratón marcados con HRP.

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Suspensión de Proteína A-Sepharose

Se preparó Proteína A-Sepharose (CL-4B, Sigma Chemical Company) en forma de una suspensión al 50% en PBS y azida al 0,1%.

Proteína A-Dextrano

Un conjugado de Proteína A-dextrano del anterior Ejemplo 1, se preparó en disolución salina tamponada con fosfato (BioWhittaker, Walkersville, MD).

Lavador y lector de placas MICROTRAK®

El lavador y el lector de placas de microtitulación son componentes del sistema MICROTRAK® EIA System (Syva Company). La disolución de lavado usada fue el tampón de lavado MICROTRAK® Chlamydia EIA: citrato trisódico 0,559 g/ml, ácido cítrico 0,002 g/ml, TWEEN® 20 0,0182 ml/ml, glicerol 0,3175 ml/ml, pH 6,5 - 6,9. Cada ciclo de lavado se fijó en 300 \mul/pocillo x 5.

Muestras de sueros humanos

Los sueros humanos usados en estos experimentos fueron muestras de control (ausencia de autoanticuerpos contra GAD_{65}) o sueros procedentes de pacientes con IDDM (presencia de autoanticuerpos contra GAD_{65}) y fueron proporcionados por el Dr. Noel Maclaren de la Universidad de Florida.

A) Radioinmunoensayo (RIA) (del inglés, "RadioImmunoAssay") de GAD_{65}

Para medir la [^{125}I]GAD_{65} unida a suero humano, se preparó una incubación de toda la noche, a 4ºC, con una mezcla que contenía 6 \mul de suero humano, 10 \mul (aproximadamente 150.000 cpm) de [^{125}I]GAD_{65} preadsorbida con suero humano negativo, en el Tampón de reacción y en un volumen total de 25 \mul. Después de la incubación de toda la noche, se añadieron 50 \mul de Proteína A-Sepharose al 50% y se continuó la incubación con agitación suave durante 1 h a 4ºC.

Después de la incubación con Proteína A-Sepharose, la suspensión se centrifugó a RT, se lavó 3 veces con 750 \mul de Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, TRITÓN X-100 al 0,5%, todo ello enfriado en hielo. Se midieron las cuentas de cada uno de los lavados en un contador gamma y las cuentas del sedimento se midieron después del último lavado.

La siguiente tabla resume las cuentas representativas encontradas en cada una de las 3 fracciones resultantes de los lavados o las cuentas unidas medidas en el sedimento con sueros negativos o sueros positivos:

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Debido a que el RIA usa un exceso de material marcado radiactivamente, un porcentaje muy pequeño de las cuentas introducidas se obtiene al final en la fracción unida. Esto se ilustra a continuación en forma del porcentaje de GAD_{65} radiactiva que se encuentra unida:

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El ensayo de disminución de un componente (del inglés, "depletion assay") de este ejemplo conlleva una reacción entre el antígeno y los anticuerpos y la posterior detección del antígeno que no está formando complejo con los anticuerpos. Se esperaba que la cantidad de anticuerpos anti-antígeno presentes en una muestra se correlacionaría de manera inversa con los valores de A_{450} en el ensayo de disminución de un componente de este ejemplo. Como resultado, en este ensayo se dictamina que una muestra es "positiva" cuando el valor de A_{450} está por debajo del valor de exclusión determinado por la media menos 2 ó 3 desviaciones estándar, de varios sueros normales de control. Esto contrasta con el ensayo RIA típico en el que una muestra con un valor de cpm más alto que las cpm medias de los controles + 2 ó 3 SD se dictamina que es "positiva". Esto se ilustra mejor en el ensayo que viene a continuación.

B) Inmunoensayo enzimático (EIA) (del inglés, "Enzyme ImmunoAssay") de GAD_{65} (sin centrifugación)

Se mezclaron 25 \mul de suero humano en un tampón con BSA (fosfato potásico 10 mM, pH 7,0, AET 0,1 mM, EDTA 1 mM, PLP 20 \muM, TRITÓN X-100 al 0,1%, glicerol al 10% y BSA libre de proteasas en concentración de 1 mg/ml) con 15 \mul de bGAD_{65} (1,5 fmoles por ensayo) y con 10 \mul del Tampón de reacción 5x hasta alcanzar un volumen final de 50 \mul. Esta mezcla se incubó 2 horas a RT.

Se añadieron 50 \mul de Proteína A - Dextrano (dilución en proporción 1 en 25 de la disolución de reserva en PBS) y se incubó 1 hora a RT.

Se extrajeron 80 \mul del fluido sobrenadante (que contenía la bGAD_{65} no unida) y se transfirieron a una placa revestida con SAV y prelavada. Después de una incubación de 1 hora a RT, con agitación, la placa se lavó utilizando el sistema MICROTRAK.

Se añadieron 100 \mul del conjugado de MAb(6G10)-HRP (dilución 1:320 en el diluyente para conjugados de Syva, precalentado a 37ºC) y se incubaron durante 1 hora a RT, con agitación, seguido de lavados utilizando el sistema MICROTRAK.

Se añadió el sustrato TMB y se dejó reaccionar a RT durante 30 minutos. El desarrollo del color se detuvo con H_{2}SO_{4} 1 N y la lectura se efectuó a 450 nm.

Los sueros de 7 de cada 9 pacientes fueron diagnosticados correctamente con este método. Esto contrasta con las técnicas convencionales de ELISA que proporcionaron un dictamen correcto en sólo dos de cada nueve muestras.

c) Comparación entre EIA y RIA

Con el fin de valorar la eficacia analítica del ensayo de la presente invención, se hizo una comparación sometiendo al ensayo sueros previamente analizados con el método de RIA. El objetivo principal fue determinar si los resultados obtenidos con los dos métodos guardarían correlación independientemente de la naturaleza de los sueros, es decir, de muestras procedentes de controles o muestras procedentes de pacientes con una variación en los títulos de autoanticuerpos contra GAD_{65}. El protocolo del ensayo fue como el anteriormente descrito en el apartado B) con las siguientes modificaciones: suero (24 \mul), bGAD_{65} (20 \mul que contienen 12 fmoles), Tampón de reacción 5x (20 \mul) y H_{2}O desionizada (36 \mul) se incubaron toda la noche a 4ºC. Se añadió Proteína A - Sepharose (200 \mul de una suspensión al 50%) y se incubó de nuevo a 4ºC durante 1 hora. Después se centrifugó durante 2 minutos a RT. El sobrenadante (180 \mul) se recogió cuidadosamente y dos partes alícuotas cada una de ellas de 90 \mul se añadieron a dos pocillos de una placa, revestidos con SAV, para generar valores duplicados. El resto del protocolo fue igual que el explicado en el anterior apartado B).

Los datos clínicos resultantes indicaron una excelente correlación entre los resultados del presente ensayo y los datos obtenidos en el ensayo RIA.

Claims (17)

1. Un método para conjugar un polisacárido con un polipéptido, comprendiendo dicho método:

(a) hacer reaccionar dicho polisacárido con un agente alquilante que contiene una funcionalidad que reacciona con un grupo hidroxi de dicho polisacárido, formándose así un polisacárido alquilado, en el que dicho agente alquilante contiene un grupo olefínico y en el que dicho agente alquilante contiene como dicha funcionalidad un epóxido o un radical alquilo que comprende un grupo lábil.

(b) tratar dicho polisacárido alquilado para convertir dicho grupo olefínico en una funcionalidad reactiva con aminas, y

(c) hacer reaccionar dicha funcionalidad reactiva con aminas, con una funcionalidad amina presente en dicho polipéptido para producir un polisacárido conjugado con dicho polipéptido.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que dicho polisacárido alquilado de la etapa (a) es un polímero que tiene una secuencia de unidades monosacáridas que se repiten, cada una de las cuales se selecciona independientemente entre unidades monosacáridas de la fórmula:

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en la que una de las A es un enlace con el carbono glicosídico C1 de otra de dichas unidades y las otras A se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H y QL, en donde L es un grupo enlazador que enlaza O y Q, y Q es C(Z)=D, en donde D es CR^{1}R^{2}, en donde R^{1} y R^{2} son independientemente H, alquilo o arilo, y Z es H o C(Y)=O, en donde Y es R^{3}, OR^{3} o NR^{3}R^{4}, en donde R^{3} y R^{4} son independientemente H, alquilo o arilo, y en donde cualquiera de los L, R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} se pueden agrupar para formar un anillo con la condición de que al menos dos de las A de dicho polímero sean QL.

3. Un método según la reivindicación 2, en el que dicho polímero contiene desde aproximadamente 50 hasta 50.000 unidades monosacáridas que se repiten.

4. Un método según la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en el que la A que está junto al oxígeno metilenoxi de una de las unidades del polímero es un enlace al carbono glicosídico C1 de otra de las unidades del polímero.

5. Un método según la reivindicación 1, en el que dicha funcionalidad reactiva con aminas es un aldehído.

6. Un método según la reivindicación 2 o la reivindicación 4, en el que en dicho polímero Q es C(Z)=D, en donde D es CR^{1}R^{2} y Z es H.

7. Un método según la reivindicación 2 o la reivindicación 4, en el que en dicho polímero al menos dos de las A son QL en al menos una de dichas unidades monosacáridas de cada 20 unidades monosacáridas de dicho polímero.

8. Un método según la reivindicación 5, en el que dicho método en la etapa (c) comprende la aminación reductora de la funcionalidad reactiva con aminas con un polipéptido.

9. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa (b) comprende la ozonolisis de dicho polisacárido alquilado.

10. El método de la reivindicación 1, en el que dicho polisacárido es dextrano.

11. El método de la reivindicación 1, en el que dicho agente alquilante tiene la estructura:

L^{3}(Z^{1})C=CR^{5}R^{6}

en la que L^{3} es un grupo reactivo con un grupo hidroxilo de dicho dextrano, R^{5} y R^{6} son independientemente H, alquilo, arilo, o se pueden agrupar entre sí o con L^{3} para formar un anillo, y Z^{1} es H o C(W)=O, en donde W es R^{7}, OR^{7} o NR^{7}R^{8}, en donde R^{7} y R^{8} son independientemente H, alquilo o arilo, y en la que L^{3} comprende un epóxido o un radical alquilo que comprende un grupo lábil.

12. El método de la reivindicación 11, en el que L^{3} es un radical alquilo que contiene un grupo lábil y dicho grupo lábil se selecciona entre el grupo que consiste en bromo, cloro, yodo, sulfonatos de arilo, sulfonatos de alquilo, sulfatos de arilo y sulfatos de alquilo.

13. El método de la reivindicación 11, en el que L^{3} es CH_{2}OCH_{2}(C_{2}H_{3}O) en donde (C_{2}H_{3}O) es un radical oxiranilo.

14. El método de la reivindicación 11, en el que L^{3} es CH_{2}Br.

15. El método de la reivindicación 1, en el que dicha funcionalidad reactiva con aminas es un aldehído.

16. El método de la reivindicación 15, en el que dicho olefina se somete a ozonolisis para obtener dicha funcionalidad aldehído.

17. El método de la reivindicación 1, en el que dicha funcionalidad reactiva con aminas es una funcionalidad ácido alfa-ceto-carboxílico.