ES2712487T3 - Estabilización de reactivos de ensayo en soporte sólido - Google Patents

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ES2712487T3 ES09700484T ES09700484T ES2712487T3 ES 2712487 T3 ES2712487 T3 ES 2712487T3 ES 09700484 T ES09700484 T ES 09700484T ES 09700484 T ES09700484 T ES 09700484T ES 2712487 T3 ES2712487 T3 ES 2712487T3
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Abstract

Un reactivo de ensayo seco, comprendiendo dicho reactivo un soporte sólido en partículas y una o más moléculas de un receptor inmovilizado en el soporte sólido en partículas, en donde el receptor comprende de 2 a 7 sitios de unión para un ligando y en donde una porción de un número total de los sitios de unión está unida a un conjugado que comprende el ligando unido covalentemente a un miembro del par de unión específico (sbp) y una parte del número total de los sitios de unión está libre para capturar el conjugado miembro-ligando sbp no específicamente unido al soporte sólido y/o disociado del soporte sólido, en donde la relación molar del número total de sitios de unión del receptor al número de moléculas de ligando es de 1.5 a 4 y en donde el miembro del par de unión específico es un asociado de unión para un analito o un análogo de analito.

Description

DESCRIPCION
Estabilizacion de reactivos de ensayo en soporte solido
Antecedentes
La invencion se refiere a reactivos de soporte solido que se emplean en metodos y kits para la determinacion de analitos en muestras, tales como muestras de pacientes, que se sabe o se sospecha que contienen uno o mas de los analitos.
En los campos de la medicina y la quimica clinica, muchos estudios y determinaciones de especies o analitos fisiologicamente reactivos se llevan a cabo utilizando conjugados que implican miembros de pares de union especificos y soportes y/o etiquetas o similares. Se conocen diversas tecnicas de ensayo que implican la union de miembros de pares de union especificos. Los propios analitos son normalmente miembros de pares de union especificos, lo que permite su deteccion empleando un miembro correspondiente del par de union especifico al que pertenece el analito en cuestion.
Se puede diagnosticar y controlar una variedad de afecciones clinicas detectando la presencia y/o la cantidad de un analito de miembro de par de union especifico en una muestra. Los resultados de los ensayos quimicos, bioquimicos y biologicos se utilizan para tomar decisiones importantes; y, por lo tanto, la precision y fiabilidad del resultado es de suma importancia. Hasta ahora, las muestras de control de concentracion conocida se analizan periodicamente, o incluso simultaneamente con la muestra que se va a medir, para calibrar y verificar el funcionamiento del ensayo en la muestra desconocida. Este proceso reduce, pero no elimina, la posibilidad de error en el ensayo de interes.
A medida que ha aumentado la importancia de medir la presencia de un analito en una muestra, se han desarrollado varios medios para detectar tales analitos. Un metodo implica la conjugacion de un marcador a un miembro de par de union especifico que se emplea como reactivo de ensayo para unirse al analito. En otras metodologias, un miembro de par de union especifico para la deteccion del analito se conjuga con un soporte, que se emplea como un reactivo de ensayo de diversas maneras junto con otros reactivos para detectar el analito en cuestion.
Tambien se utilizan combinaciones de las metodologias anteriores.
Ensayos en los que una muestra y uno o mas reactivos reaccionan de diversas maneras para formar un complejo como un anticuerpo/antigeno o un complejo similar, que luego se pueden observar para medir la presencia o el nivel de un analito o uno o mas de varios analitos en la muestra, son bien conocidos. Tipicamente, en algunas realizaciones se usa un anticuerpo para analizar la presencia y/o la cantidad de un hapteno o un antigeno para el cual el anticuerpo es especifico. Los haptenos y los antigenos incluyen, por ejemplo, peptidos, proteinas, hormonas, alcaloides, esteroides, anticuerpos, acidos nucleicos y fragmentos de los mismos, enzimas, receptores de superficie celular y similares.
La utilidad del reactivo de ensayo, sin embargo, dependera de la especificidad del miembro del par de union especifica para el otro miembro, y tambien dependera del nivel de union no especifica del reactivo de ensayo o de los componentes del reactivo. La union no especifica a menudo reduce la sensibilidad del ensayo. El grado de union no especifica limita la utilidad de un reactivo de ensayo. Cuanto mayor sea la union no especifica en un reactivo de ensayo particular, menor sera la sensibilidad de la determinacion.
En un enfoque para reactivos que implican soportes solidos, un miembro de par de union especifico tal como, por ejemplo, un analogo de analito, esta unido directamente al soporte solido por union covalente. Desafortunadamente, con tales reactivos, esta presente una cantidad no insignificante de union no especifica del miembro de par de union especifica a la superficie del soporte solido. Durante el almacenamiento y/o uso de dicho reactivo, el conjugado unido no especificamente se lixivia del soporte solido y esta presente en un medio de ensayo liquido. La presencia de dicho miembro del par de union especifica no unida especificamente conduce a imprecisiones en los metodos de ensayo empleados usando el reactivo. La union no especifica se refiere a la union no covalente entre moleculas que es relativamente independiente de las estructuras de superficie especificas. La union no especifica puede resultar de varios factores que incluyen, por ejemplo, interacciones hidrofobas entre moleculas, adsorcion fisica a la superficie porosa del soporte solido, y similares.
El documento US 2004072262 A1 describe placas recubiertas con avidina cargadas con monomeros MHC biotinilados en un complejo con un peptido.
Persiste una necesidad de reactivos de ensayo, que exhiban una union no especifica reducida cuando se usan en ensayos para la deteccion de uno o mas analitos. En particular, persiste la necesidad de un reactivo de ensayo que comprenda un soporte solido en donde un analito analogo que pueda unirse no especificamente al soporte solido no interfiera en un ensayo realizado con dicho reactivo.
Resumen
Una realizacion de la presente invencion es un reactivo de ensayo seco, que comprende un soporte solido en particulas y una o mas moleculas de un receptor inmovilizado en el soporte solido. El receptor comprende de 2 a 7 sitios de union para un ligando. Una porcion de un numero total de los sitios de union se une a un conjugado que comprende el ligando unido a un miembro de par de union especifico y una porcion del numero total de los sitios de union esta libre para capturar el conjugado miembro-ligando sbp no especificamente unido a el soporte solido y/o disociarse del soporte solido. La relacion molar del numero total de sitios de union del receptor al numero de moleculas del ligando es de 1.5 a 4. El miembro del par de union especifica es un asociado de union para un analito o un analogo de analito. En una realizacion preferida de la presente invencion se trata un reactivo de ensayo seco, que comprende un soporte solido en particulas y una o mas moleculas de un asociado de union a biotina inmovilizado sobre el soporte solido en particulas. Una porcion de un numero total de sitios de union de un asociado de union a biotina se une a un conjugado que comprende biotina unida a un miembro de par de union especifico y una porcion del numero total de los sitios de union de el asociado de union de biotina esta libre.
Otra realizacion de la presente invencion es un metodo para determinar la presencia y/o cantidad de un analito en una muestra sospechosa de contener el analito. Se proporciona una combinacion en un medio acuoso, la muestra y los reactivos para detectar el analito, en donde al menos uno de los reactivos comprende el reactivo de ensayo seco mencionado anteriormente. La combinacion se incuba bajo condiciones para la union del analito a uno o mas de los reactivos. La presencia y/o la cantidad de union del analito a uno o mas de los reactivos se detecta cuando la presencia y/o cantidad de la union esta relacionada con la presencia y/o cantidad del analito en la muestra.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 es una representacion de las estructuras de la ciclosporina A y la ciclosporina C.
La Figura 2 es una representacion del Esquema 1, preparacion de los Compuestos (2) y (3).
La Figura 3 es una representacion del Esquema 2, preparacion de Compuestos de Rapa-C26/C32-PEO4-Biotina (4) y (5).
La Figura 4 es una representacion del Esquema 3, la preparacion de Rapa-C26-PEO4-Biotina (4) y la preparacion de Rapa-C32-PEO4-Biotina (5).
La figura 5 es una representacion de la preparacion de dioxido de cromo Siro-Dexal preformado (10).
La Figura 6 es una representacion del Esquema 5, preparacion de Tacrolimus-PEO4-Biotina (12).
La Figura 7A es una representacion de la estructura de un conjugado de anticuerpo para la ciclosporina A y la biotina. La Figura 7B es una representacion de la estructura de otro conjugado de anticuerpo para la ciclosporina A y la biotina. La Figura 8 es una representacion de la estructura de un conjugado de un anticuerpo para la ciclosporina A y particulas quimioluminiscentes.
La Figura 9 es una representacion de la estructura de un conjugado de ciclosporina A y bis-biotina.
La Figura 10 es una representacion de la preparacion de un conjugado de un anticuerpo para la ciclosporina A y una particula quimioluminiscente.
La Figura 11 es una representacion de la preparacion de bis-biotina que tiene un grupo de enlace.
La Figura 12 es una representacion de la preparacion de un intermedio de ciclosporina A.
La Figura 13 es una representacion de la preparacion de un conjugado de ciclosporina A y bis-biotina.
La Figura 14 es una representacion grafica de los resultados de otro ensayo para CsA de las presentes realizaciones que usan los siguientes reactivos: anticuerpo para particulas quimioluminiscentes de CsA y un reactivo preformado que comprende particulas sensibilizadoras de CsA-bis-biotina y estreptavidina.
Descripcion detallada de realizaciones especificas
Discusion General
Los reactivos y metodos de la presente invencion se refieren a metodos analiticos simples y especificos para detectar la presencia en una muestra de uno o mas analitos. Los metodos actuales comprenden reactivos y formatos de ensayo que logran no solo la generacion de senal suficiente, sino tambien una buena sensibilidad.
Realizaciones de reactivos de ensayo en seco
Las realizaciones de los presentes reactivos son reactivos secos que estan en una forma que se disuelve facilmente en un medio de ensayo acuoso. Los reactivos son estables durante la formacion, en estado seco y cuando se formulan en un medio de ensayo. Los reactivos secos comprenden un miembro de par de union especffico (sbp) que esta asociado con un soporte solido en partfculas. En lugar de unirse covalentemente al soporte solido, el miembro sbp esta unido covalentemente a un ligando para formar un conjugado miembro-ligando sbp y el soporte comprende un receptor para un ligando al que esta unido el conjugado. El miembro sbp esta asociado con el soporte por la union entre el ligando y el receptor para el ligando. Se proporciona un exceso de sitios de union del receptor sobre el soporte, de manera que una porcion de los sitios de union del receptor esta libre. Los sitios de union libres capturan el conjugado miembro-ligando sbp que podrfa unirse no especfficamente al soporte solido y/o que podrfa disociarse de un complejo del conjugado y el receptor en el soporte durante la formacion del reactivo, durante un proceso para secar el reactivo o despues de que el reactivo seco se disuelva en un medio de ensayo acuoso durante un ensayo. Como resultado, poco o nada de conjugado de ligando miembro sbp disociado o no unido esta disponible para unirse a el asociado de union del miembro sbp, que se emplea como uno de los reactivos en la determinacion del ensayo. Por lo tanto, la sensibilidad del ensayo se ve aumentada por la reduccion de los componentes no especfficamente unidos y/o disociados del reactivo que de otro modo podrfan distorsionar la medicion de la cantidad de analito que se va a determinar. La reduccion de la union y disociacion no especfficas se logra mediante un reequilibrio del conjugado miembro-ligando sbp de la union a los sitios de union no especffica en el soporte solido a la union a los sitios de union especffica vacantes de los receptores en el soporte solido. Tal como se usa en el presente documento, el termino "asociado" debe entenderse ampliamente y comprende, por ejemplo, un enlace covalente o un enlace no covalente, un enlace directo y un enlace indirecto, la absorcion a una superficie y un recinto en una cavidad, etc.
Ademas, la presente invencion evita un problema observado por los presentes inventores en un proceso tal como, por ejemplo, la liofilizacion, para preparar reactivos secos que implican complejos inmovilizados de receptor-ligando, particularmente con respecto a moleculas hidrofobas. Los presentes inventores observaron que podrfa ocurrir una cierta cantidad de disociacion de tales complejos durante el proceso de secado. Como se menciono anteriormente, en los presentes reactivos, un miembro sbp esta unido covalentemente a un ligando para formar un conjugado miembroligando sbp y el soporte comprende un receptor para un ligando al que esta unido el conjugado. El miembro sbp esta asociado con el soporte por la union entre el ligando y el receptor para el ligando. Se proporciona un exceso de sitios de union del receptor sobre el soporte de modo que una parte de los sitios de union del receptor este libre para capturar componentes no especfficamente unidos y/o disociados del reactivo.
Como se menciono anteriormente, una realizacion de la presente invencion es un reactivo de ensayo seco, que comprende un soporte solido y una o mas moleculas de un receptor inmovilizado sobre el soporte solido. El receptor comprende uno o mas sitios de union para un ligando. Una porcion de un numero total de los sitios de union esta unida a un conjugado que comprende el ligando unido, generalmente de manera covalente, a un miembro de par de union especffico y una porcion del numero total de los sitios de union esta libre. Un conjugado es una molecula compuesta por dos o mas subestructuras unidas entre sf, ya sea directa o indirectamente a traves de un grupo de enlace, para formar una estructura unica.
El soporte puede comprender un material insoluble en agua, organico o inorganico, solido o fluido, que puede ser transparente o parcialmente transparente. El soporte puede tener cualquiera de una serie de formas, tales como partfculas que incluyen perlas y partfculas, pelfcula, membrana, tubo, pozo, tira, varilla, superficies planas como, por ejemplo, placa, tipo papel, etc., fibras y similares. Dependiendo del tipo de ensayo, el soporte puede o no ser suspendible en el medio en donde se emplea. Ejemplos de soportes suspendibles son materiales polimericos tales como latex, bicapas lipfdicas o liposomas, gotitas de aceite, celulas e hidrogeles, partfculas magneticas y similares. Otras composiciones de soporte incluyen polfmeros, tales como nitrocelulosa, acetato de celulosa, poli(cloruro de vinilo), poliacrilamida, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(tereftalato de etileno), nylon, poli(etil butirato), etc.; ya sea por sf mismos o en conjunto con otros materiales.
En algunas realizaciones, los soportes empleados son partfculas. Las partfculas deben tener un diametro promedio de al menos aproximadamente 0.02 micrones y no mas de aproximadamente 100 micrones. En algunas realizaciones, las partfculas tienen un diametro promedio de aproximadamente 0.05 micrometros a aproximadamente 20 micrometros, o de aproximadamente 0.3 micrometros a aproximadamente 10 micrometros. En algunas realizaciones, las partfculas tienen un intervalo de area superficial de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 m2/g y en algunas realizaciones las partfculas tienen un area superficial en el intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 m2/g. La partfcula puede ser organica o inorganica, hinchable o no hinchable, porosa o no porosa, preferiblemente de una densidad de agua aproximada, generalmente de aproximadamente 0.7 g/mL a aproximadamente 1.5 g/mL, y compuesta de material que puede ser transparente, parcialmente transparente, u opaco. Las partfculas pueden tener una forma regular o irregular. Pueden ser, por ejemplo, esferas, esferoides o esferas que poseen cavidades o poros de mayor o menor tamano. Las partfculas pueden comprender varias capas, como las denominadas partfculas de nucleo y cubierta, que tienen un nucleo y una o mas capas envolventes. Las partfculas pueden ser materiales biologicos tales como celulas y microorganismos, por ejemplo, eritrocitos, leucocitos, linfocitos, hibridomas, estreptococos, Staphylococcus aureus, E. coli, virus y similares. Las partfculas tambien pueden ser partfculas compuestas de polfmeros organicos e inorganicos, liposomas, partfculas de latex, partfculas magneticas o no magneticas, vesfculas de fosfolfpidos, quilomicrones, lipoprotefnas, cristales de tinte, soles metalicos, partfculas de sflice, partfculas de vidrio, partfculas magneticas, gotas de aceite, partfculas lipfdicas, dextrano y agregados de protefnas y similares.
En algunas realizaciones, las particulas son microparticulas, que son particulas que tienen un diametro aproximado de al menos 20 nm y no mas de 20 micrones, o entre 40 nm y 10 micrones, o entre 0.1 y 10 micrones, o entre 0.1 y 5 micras, o entre 0.15 y 2 micras. En muchas realizaciones, las microparticulas son particulas que pueden suspenderse en soluciones acuosas.
Las particulas de polimero pueden estar formadas por polimeros de adicion o condensacion. Las particulas seran facilmente dispersables en un medio acuoso y pueden ser adsorbentes o funcionalizables para permitir la conjugacion a un miembro de un sbp, ya sea directa o indirectamente a traves de un grupo de enlace. Las particulas tambien pueden derivarse de materiales naturales, materiales naturales que se modifican sinteticamente y materiales sinteticos. Entre los polimeros organicos de particular interes estan los polisacaridos, particularmente los polisacaridos reticulados, como la agarosa, que esta disponible como sefarosa, dextrano, disponible como Sephadex y Sephacryl, celulosa, almidon y similares; polimeros de adicion, tales como poliestireno, alcohol polivinilico, homopolimeros y copolimeros de derivados de acrilato y metacrilato, particularmente esteres y amidas que tienen funcionalidades hidroxilo libres, y similares.
En algunas realizaciones, las particulas son particulas magneticas. Cuando las particulas son magneticas, el material magnetico contenido en las particulas puede ser cualquier material magnetico susceptible de atraccion por un iman permanente o un electroiman. Ejemplos de tales materiales magneticos incluyen oxidos de hierro magneticos, dioxidos de cromo magneticos (CrO2), MnFeO4, ZnFeO4, CoFe2O4 y materiales magneticos similares.
Un ejemplo particular de realizaciones de particulas magneticas incluye aquellas que tienen un nucleo magnetico rodeado por un material polimerico. El material polimerico puede ser cualquier material polimerico adecuado para uso en ensayos tales como, por ejemplo, inmunoensayos; se prefieren el poliestireno y el poliestireno-divinilbenceno por su facil disponibilidad. Ademas, el material polimerico preferiblemente tiene grupos funcionales reactivos con grupos aldehido o puede modificarse por metodos conocidos en la tecnica para contener dichos grupos reactivos aldehido. Ejemplos de tales grupos funcionales incluyen amina, hidrazina, hidrazida, aminooxi, cianuro, grupos alcohol y similares.
Otro ejemplo de particulas magneticas que pueden usarse para poner en practica la invencion son las particulas magneticas de dioxido de cromo (particulas de cromo) que tienen grupos de superficie colgantes que son reactivos al aldehido o que pueden modificarse para contener tales grupos reactivos aldehido. Dichas particulas de oxido de cromo magnetico incluyen aquellas que comprenden un nucleo de CrO2 que tiene una superficie reducida, que luego se recubre con silice y se recubre ademas con un silano como se describe en la Patente de los Estados Unidos No.
4,661,408. La capa exterior de silano es capaz de unir proteinas, incluyendo anticuerpos y especies de antigenos, ligandos, haptenos o compuestos de enlace directamente o a traves de agentes de acoplamiento intermedios al nucleo recubierto. Agentes de enlace y/o acoplamiento utiles en componentes de enlace incluyen acidos dicarboxilicos y anhidridos, poliaminas, polialdehidos y agentes heterobifuncionales tales como clorhidrato de 2-iminotiolano, sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1 -carboxilato, m-maleimidosuccinimida ester, N-succinimidil-(4-yodoacetil)aminobenzoato, y especies similares conocidas por los expertos en la tecnica. Otras realizaciones particulares de particulas magneticas y no magneticas que pueden emplearse en los presentes reactivos son las descritas en la Patente de los Estados Unidos No. 6,231,982.
Se inmovilizan una o mas moleculas de un receptor sobre el soporte solido. El receptor comprende uno o mas sitios de union para un ligando. Los terminos ligando y receptor se usan en este documento para disenar moleculas que estan implicadas en la union de un conjugado de miembro ligando-sbp a un receptor que esta asociado con un soporte solido. Los ligandos y receptores son miembros sbp, pero se distinguen en el presente documento con el proposito de describir los metodos y reactivos presentes. El termino miembro sbp se usa en este documento para denotar un reactivo que esta involucrado en la deteccion de un analito en lugar de en la union de una unidad estructural al soporte solido, para el cual se usan los terminos ligando y receptor. Un receptor es cualquier molecula capaz de reconocer una organizacion espacial y polar particular de otra molecula, por ejemplo, un sitio epitopico o determinante. En general, las moleculas tienen areas en sus superficies o en cavidades que dan lugar a un reconocimiento especifico entre las dos moleculas. El sitio de reconocimiento en el receptor que se une especificamente a un sitio en el ligando se denomina aqui como un sitio de union. El termino union especifica como se usa en este documento es el reconocimiento especifico de una de dos moleculas diferentes para la otra en comparacion con el reconocimiento sustancialmente menor de otras moleculas. Un ligando es cualquier compuesto organico para el cual un receptor existe naturalmente o se puede preparar. Ejemplos de receptores que pueden emplearse en los presentes reactivos incluyen asociados de union a biotina, por ejemplo, estreptavidina y avidina, anticuerpos, acidos nucleicos antisentido monocatenarios, aptameros, receptores de hormonas, enzimas, etc.
Una unica molecula de receptor puede tener uno o mas sitios de union para un ligando. El numero de sitios de union del receptor para el ligando puede ser 1, o 2, o 3, o 4, o 5, o 7, y asi sucesivamente en los que el rango es de 1 a aproximadamente 8, o de 1 a aproximadamente 7, o 1 a aproximadamente 6, o 1 a aproximadamente 5, o 1 a aproximadamente 4, o 1 a aproximadamente 3, o 1 a 2, o 2 a aproximadamente 7, o 2 a aproximadamente 6, o 2 a aproximadamente 5, o 2 a aproximadamente 4, o 2 a aproximadamente 3, o 3 a aproximadamente 7, o 3 a aproximadamente 6, o 3 a aproximadamente 5, o 3 a aproximadamente 4, y asi sucesivamente.
En muchas realizaciones, el ligando del conjugado de miembro ligando-sbp es una molecula pequena o un residuo de una molecula pequena. Las moleculas pequenas tienen un peso molecular de aproximadamente 100 a aproximadamente 2000, o aproximadamente 150 a aproximadamente 1000, y existe o puede prepararse un receptor para la molecula pequena. Ejemplos de moleculas pequenas incluyen biotina y derivados de biotina como, por ejemplo, bis-biotina, etc., acido lisergico, fluoresceina y derivados de fluoresceina, dinitrofenol, digoxigenina, acidos nucleicos monocatenarios, vitamina B12, inhibidores de enzimas suicidas y similares. Los receptores correspondientes para las pequenas moleculas mencionadas anteriormente son, respectivamente, un asociado de union a biotina, por ejemplo, avidina o estreptavidina, anti-acido lisergico, anti-fluoresceina, anti-dinitrofenol, anti-digoxigenina, acidos nucleicos monocatenarios antisentido, factores intrinsecos, y enzimas.
Como se menciono anteriormente, ademas de las interacciones ligando-receptor, los presentes reactivos y metodos tambien involucran miembros sbp a diferencia de las moleculas de ligando y receptor discutidas anteriormente. Un miembro de un par de union especifico (miembro "sbp") es una de dos moleculas diferentes que tienen un area en la superficie o en una cavidad que se une especificamente y, por lo tanto, se define como complementaria con una organizacion espacial y polar particular de la otra molecula. Los miembros sbp complementarios se unen entre si. Con respecto a dos miembros sbp complementarios, uno puede ser referido como el "asociado vinculante" para el otro. Ejemplos de miembros sbp incluyen interacciones anticuerpo-antigeno, interacciones enzima-sustrato, interacciones polinucleotidicas, etc. Los miembros sbp ilustrativos incluyen receptores de origen natural, por ejemplo, globulina de union a tiroxina, anticuerpos, enzimas, fragmentos Fab, lectinas, acidos nucleicos, proteina A, componente del complemento C1q y similares. Al menos uno de los miembros sbp de los presentes reactivos y metodos es uno que se une especificamente a un analito como, por ejemplo, un anticuerpo para el analito, o uno que se une a un miembro sbp especifico para el analito, como un analogo de analito. y, por lo tanto, puede competir con el analito para unirse al miembro sbp especifico para el analito, que puede ser, por ejemplo, un anticuerpo para el analito.
Las moleculas pequenas, en particular, y los ligandos, en general, pueden unirse a un miembro sbp para formar un conjugado de miembro ligando-sbp que tiene al menos una, o 2 a aproximadamente 20, moleculas pequenas por miembro sbp dependiendo de la naturaleza del miembro sbp. Los miembros de sbp mas grandes, tales como, por ejemplo, anticuerpos, tienen 1 a aproximadamente 20 moleculas pequenas unidas a ellos. La union de la molecula pequena al miembro sbp se puede lograr mediante la union covalente, que generalmente involucra reacciones quimicas que resultan en la sustitucion de un atomo de hidrogeno de la molecula pequena con un enlace al miembro sbp, o por un grupo de enlace entre la molecula pequena y el miembro sbp de cualquier tamano, pero preferiblemente no mayor que el necesario para permitir la union al conjugado de un receptor para la molecula pequena y el miembro sbp.
En algunas realizaciones, el grupo de enlace puede comprender aproximadamente 2 a aproximadamente 50 atomos, o 4 a aproximadamente 30 atomos, sin contar el hidrogeno y puede comprender una cadena de 2 a aproximadamente 30 atomos, o 3 a aproximadamente 20 atomos, cada uno seleccionado independientemente del grupo que normalmente consta de carbono, oxigeno, azufre, nitrogeno y fosforo. Parte o la totalidad del grupo de enlace puede ser una porcion de la molecula que esta unida a otra molecula tal como, por ejemplo, un residuo de aminoacido en un poli(aminoacido) y similares.
El numero de heteroatomos en los grupos de enlace normalmente oscilara entre aproximadamente 0 y aproximadamente 20, o 1 a aproximadamente 15, o aproximadamente 2 a aproximadamente 10. Los grupos de enlace pueden ser alifaticos o aromaticos. Cuando hay heteroatomos, el oxigeno normalmente esta presente como oxo u oxi, unido a carbono, azufre, nitrogeno o fosforo, el nitrogeno normalmente esta presente como nitro, nitroso o amino, normalmente unido a carbono, oxigeno, azufre o fosforo; el azufre es analogo al oxigeno; mientras que el fosforo esta unido a carbono, azufre, oxigeno o nitrogeno, generalmente como fosfonato y fosfato mono o diester. Las funcionalidades comunes para formar un enlace covalente entre el grupo de enlace y la molecula por conjugar son alquilamina, amidina, tioamida, eter, urea, tiourea, guanidina, azo, tioeter y carboxilato, sulfonato y esteres de fosfato, amidas y tioesteres. Una realizacion especifica de un grupo de enlace que comprende heteroatomos es una funcionalidad oxima como se menciono anteriormente.
En su mayor parte, cuando un grupo de enlace tiene una funcionalidad de enlace (funcionalidad para reaccionar con una unidad estructural) tal como, por ejemplo, un grupo no oxocarbonilo que incluye analogos de nitrogeno y azufre, un grupo fosfato, un grupo amino, agente de alquilacion como halo o tosilalquilo, oxi (hidroxilo o analogo de azufre, mercapto) oxocarbonilo (por ejemplo, aldehido o cetona), u olefina activa como una vinil sulfona o un ester a-, pinsaturado, estas funcionalidades estan vinculadas a grupos amina, grupos carboxilo, olefinas activas, agentes alquilantes, por ejemplo, bromoacetilo. Cuando se unen una amina y un acido carboxilico o su derivado de nitrogeno o acido fosforico, se forman amidas, amidinas y fosforamidas. Cuando el mercaptano y la olefina activada estan vinculados, se forman tioeteres. Cuando se unen un mercaptano y un agente alquilante, se forman tioeteres. Cuando el aldehido y una amina se unen en condiciones reductoras, se forma una alquilamina. Cuando se unen una cetona o un aldehido y una hidroxilamina (incluidos los derivados de la misma donde un sustituyente esta en lugar del hidrogeno del grupo hidroxilo), se forma una funcionalidad oxima (=N-O-). Cuando se unen un acido carboxilico o un acido fosfato y un alcohol, se forman esteres. En la tecnica son bien conocidos diversos grupos de enlace; vease, por ejemplo, Cautrecasas, J. Biol. Chem. (1970) 245: 3059.
Como se menciono anteriormente, una porcion de un numero total de los sitios de union del receptor esta unido a un conjugado que comprende el ligando unido covalentemente, ya sea directamente o a traves de un grupo de enlace, a un miembro sbp y una porcion del numero total de los sitios la union del receptor esta libre. El numero de sitios de union libres, es decir, el numero de sitios de union del receptor que estan libres para unirse al ligando es suficiente para capturar todas las moleculas de conjugado que pueden unirse no especificamente al soporte solido y/o que pueden disociarse del soporte solido. La relacion molar del numero total de sitios de union del receptor al numero de moleculas de ligando del conjugado de miembro ligando-sbp depende de la naturaleza del receptor, la naturaleza del ligando y similares. La relacion molar del numero total de sitios de union del receptor al numero de moleculas de ligando es de 1,5 a 4. Como se menciono anteriormente, un receptor particular comprende de 2 a 7 sitios de union para el ligando por molecula de receptor.
El numero total de sitios de union mencionado anteriormente es el numero total de sitios de union para todas las moleculas del receptor que estan presentes en la superficie solida. Por ejemplo, la estreptavidina tiene cuatro sitios de union para la biotina. Por lo tanto, el numero total de sitios de union para estreptavidina en un soporte solido es el numero total de moleculas de estreptavidina en el soporte solido por el numero de sitios de union para cada molecula de estreptavidina, es decir, cuatro. En este ejemplo particular en donde esta implicada la union de estreptavidinabiotina, una realizacion deseable del presente reactivo tiene una molecula de estreptavidina por dos moleculas de biotina, de modo que la relacion molar del numero total de sitios de union a las moleculas de biotina es 4:2 o 2:1. Se ha descubierto que dicha relacion estabiliza la estructura tetramerica de estreptavidina al tiempo que permite la captura de conjugado no unido y/o disociado de forma no especifica por los sitios de union restantes del tetramero de estreptavidina.
Las reacciones involucradas en la preparacion del reactivo de ensayo discutido anteriormente generalmente se llevan a cabo en un medio liquido. Despues de la preparacion del reactivo de ensayo en un medio liquido, el producto resultante se seca mediante tecnicas convencionales, que incluyen, por ejemplo, liofilizacion, aplicacion de calor, aplicacion de vacio, desecacion, absorcion de humedad, vaporizacion del solvente y similares, o una combinacion de las tecnicas anteriores. Dependiendo de la naturaleza del soporte solido de los presentes reactivos, el reactivo seco se puede preparar en forma de comprimido, polvo y similares. Para un soporte tal como papel, placa de microtitulacion, virutas y similares, la superficie del soporte puede comprender, en una forma seca, moleculas de receptor con sitios de union que estan libres y sitios de union que se unen al conjugado de miembro ligando-sbp. El reactivo seco se almacena a aproximadamente 0°C a aproximadamente 35°C, o aproximadamente 2°C a aproximadamente 30°C, o aproximadamente 5°C a aproximadamente 25°C, o a temperatura ambiente o del entorno, o en algunas realizaciones por debajo de 0°C, hasta que se utiliza en un metodo de ensayo para la determinacion de un analito. El reactivo de ensayo se prepara y se seca de una manera que hace que el reactivo seco resultante pueda reconstituirse facilmente en un medio de ensayo, que generalmente es un medio acuoso. El reactivo de ensayo seco puede contener una o mas sustancias o excipientes que promueven la reconstitucion del reactivo seco en un medio de ensayo. Tales sustancias incluyen, por ejemplo, trehalosa, polietilenglicol 8000 y similares.
Metodos que emplean los presentes reactivos de ensayo en seco.
Como se menciono anteriormente, los presentes reactivos de ensayo en seco pueden emplearse en metodos para determinar la presencia y/o la cantidad de un analito en una muestra sospechosa de contener el analito. Los metodos de ensayo empleados miden la cantidad de analito en la muestra y pueden ser cuantitativos, semicuantitativos o cualitativos. Por ejemplo, un metodo, que simplemente detecta la presencia o ausencia de un analito en una muestra sospechosa de contener el analito, se considera que esta incluido dentro del alcance de la presente invencion. Los terminos "deteccion" y "determinacion", asi como otros sinonimos comunes para medicion, se contemplan dentro del alcance de la presente invencion.
La muestra y los reactivos para detectar el analito se combinan en un medio acuoso. Al menos uno de los reactivos comprende el reactivo de ensayo seco descrito anteriormente. Otros reactivos empleados dependen de la naturaleza del analito, la naturaleza del metodo de ensayo particular, la naturaleza de la molecula de senalizacion, la naturaleza del sistema de deteccion y similares, cuyos ejemplos se analizan a continuacion. La combinacion se incuba bajo condiciones para la union del analito a uno o mas de los reactivos. La presencia y/o la cantidad de union del analito a uno o mas de los reactivos se detecta cuando la presencia y/o cantidad de la union esta relacionada con la presencia y/o cantidad del analito en la muestra.
El analito es un compuesto o composicion que se va a detectar. El analito puede comprender un miembro de un par de union especifico (sbp) donde el miembro complementario del par de union especifico se usa en la deteccion del analito. Los analitos de ligando monoepitopicos generalmente tendran un peso molecular de aproximadamente 100 a 2000, mas generalmente de peso molecular 125 a 1000. Los analitos incluyen medicamentos, metabolitos, pesticidas, contaminantes y similares. Analitos representativos, a modo de ejemplo y no limitativos, incluyen (i) alcaloides tales como alcaloides de morfina, que incluyen morfina, codeina, heroina, dextrometorfano, sus derivados y metabolitos; alcaloides de cocaina, que incluyen cocaina y bencilecgonina, sus derivados y metabolitos; alcaloides del ergot, que incluyen la dietilamida del acido lisergico; alcaloides esteroides; alcaloides de iminazoilo; alcaloides de quinazolina; alcaloides de isoquinolina; alcaloides de quinolina, que incluyen quinina y quinidina; alcaloides diterpenicos, sus derivados y metabolitos; (ii) esteroides, que incluyen los estrogenos, androgenos, esteroides andreocorticales, acidos biliares, glucosidos cardiotonicos y agliconas, que incluyen digoxina y digoxigenina, saponinas y sapogeninas, sus derivados y metabolitos; sustancias mimeticas esteroides, tales como dietilestilbestrol; (iii) lactamas que tienen de 5 a 6 miembros anulares, que incluyen barbituricos, por ejemplo, fenobarbital y secobarbital, difenilhidantoina, primidona, etosuximida y sus metabolitos; (iv) aminoalquilbencenos, con alquilo de 2 a 3 atomos de carbono, que incluyen las anfetaminas; catecolaminas, que incluyen efedrina, L-dopa, epinefrina; narceina papaverina; y metabolitos de los anteriores; (v) benzheterociclicos que incluyen oxazepam, clorpromazina, tegretol, sus derivados y metabolitos, los anillos heterociclicos que son azepinas, diazepinas y fenotiazinas; (vi) purinas, que incluyen teofilina, cafeina, sus metabolitos y derivados; (vii) drogas derivadas de la marihuana, que incluyen cannabinol y tetrahidrocannabinol; (viii) hormonas como tiroxina (T4), triyodotironina (T3), cortisol, triyodotironina, testosterona, estradiol, estrona, progesterona, polipeptidos como la angiotensina, LHRH e inmunosupresores como la ciclosporina (A, B, C, D, E, F, G, etc.), FK506, acido micofenolico (MPA), etc. (ix) vitaminas tales como A, B, por ejemplo, B12, C, D, E y K, acido folico, tiamina; (x) prostaglandinas, que difieren segun el grado y los sitios de hidroxilacion e insaturacion; (xi) antidepresivos triciclicos, que incluyen imipramina, desmetilimipramina, amitriptilina, nortriptilina, protriptilina, trimipramina, clomipramina, doxepina y desmetildoxepina; (xii) antineoplasticos, que incluyen metotrexato; (xiii) antibioticos, que incluyen penicilina, cloromicetina, actinomicetina, tetraciclina, terramicina, los metabolitos y derivados; (xiv) nucleosidos y nucleotidos, que incluyen ATP, NAD, FMN, adenosina, guanosina, timidina y citidina con sus sustituyentes de azucar y fosfato apropiados; (xv) medicamentos individuales variados que incluyen metadona, meprobamato, serotonina, meperidina, lidocaina, procainamida, acetilprocainamida, propranolol, griseofulvina, acido valproico, butirofenonas, antihistaminicos, cloranfenicol, farmacos anticolinergicos, como la atropina, sus metabolitos y derivados. (xvi) los metabolitos relacionados con estados de enfermedad incluyen espermina, galactosa, acido fenilpiruvico y porfirina Tipo 1; (xvii) aminoglucosidos, tales como gentamicina, kanamicina, tobramicina y amikacina; y (xviii) pesticidas tales como bifenilos polihalogenados, esteres de fosfato, tiofosfatos, carbamatos, sulfenamidas polihalogenadas, sus metabolitos y derivados.
Los analitos polivalentes son normalmente poli(aminoacidos), es decir, polipeptidos y proteinas, polisacaridos, acidos nucleicos y combinaciones de los mismos. Tales combinaciones incluyen componentes de bacterias, virus, cromosomas, genes, mitocondrias, nucleos, membranas celulares y similares. En su mayor parte, los analitos de los ligandos poliepitopicos tendran un peso molecular de al menos aproximadamente 5000, mas generalmente al menos aproximadamente 10 000. En la categoria de poli(aminoacidos), los poli(aminoacidos) de interes generalmente seran de aproximadamente 5000 a 5000 000 de peso molecular, mas generalmente de aproximadamente 20000 a 1000000 de peso molecular; entre las hormonas de interes, los pesos moleculares generalmente oscilaran entre aproximadamente 5000 y 60000 de peso molecular.
El analito incluye una amplia variedad de proteinas que pueden ser de una familia de proteinas que tienen caracteristicas estructurales similares, proteinas que tienen funciones biologicas particulares, proteinas relacionadas con microorganismos especificos, particularmente microorganismos causantes de enfermedades, etc. Dichas proteinas incluyen, por ejemplo, inmunoglobulinas, citoquinas, enzimas, hormonas, antigenos del cancer, marcadores nutricionales, antigenos especificos de tejidos, etc. Dichas proteinas incluyen, a modo de ilustracion y no de limitacion, protaminas, histonas, albuminas, globulinas, escleroproteinas, fosfoproteinas, mucoproteinas, cromoproteinas, lipoproteinas, nucleoproteinas, glicoproteinas, receptores de celulas T, proteoglicanos, HLA, proteinas no clasificadas, por ejemplo, somatotropina, prolactina, insulina, pepsina, proteinas que se encuentran en el plasma humano, factores de coagulacion de la sangre, hormonas proteicas como, por ejemplo, hormona estimulante del foliculo, hormona luteinizante, luteotropina, prolactina, gonadotropina corionica, hormonas tisulares, citoquinas, antigenos del cancer como, por ejemplo, PSA, CEA, a-fetoproteina, fosfatasa acida, CA19.9 y CA125, antigenos especificos de tejidos, como, por ejemplo, fosfatasa alcalina, mioglobina, CPK-MB y calcitonina, y hormonas peptidicas. Otros materiales polimericos de interes son los mucopolisacaridos y los polisacaridos. El termino analito incluye ademas analitos de oligonucleotidos y polinucleotidos tales como m-ARN, r-ARN, t-ARN, ADN, ADN-ARN duplex, etc.
La muestra por analizar es una de la que se sospecha que contiene el analito. El analito puede ser una molecula que se encuentra directamente en una muestra como un tejido biologico, incluidos los fluidos corporales, de un huesped. Las muestras son preferiblemente de humanos o animales e incluyen fluidos biologicos como sangre entera, suero, plasma, esputo, fluido linfatico, semen, moco vaginal, heces, orina, fluido espinal, saliva, excrementos, fluido cerebroespinal, lagrimas, moco y similares; tejido biologico, como cabello, piel, cortes o tejidos extirpados de organos u otras partes del cuerpo; etc. En muchos casos, la muestra es sangre entera, plasma o suero y, en una realizacion particular, la muestra es sangre entera.
La muestra puede prepararse en cualquier medio conveniente. Convenientemente, la muestra puede prepararse en un medio de ensayo, que se explica mas detalladamente a continuacion. En algunos casos, se puede aplicar un tratamiento previo a la muestra como, por ejemplo, para someter a lisis celulas sanguineas y similares. La muestra se puede examinar directamente o se puede tratar previamente para hacer que el analito sea mas facilmente detectable mediante la eliminacion de materiales no deseados. La muestra puede pretratarse para separar o someter a lisis celulas; precipitar, hidrolizar o desnaturalizar proteinas; hidrolizar los lipidos; solubilizar el analito; o similares. Tales tratamientos previos pueden incluir, sin limitacion: centrifugacion; tratamiento de la muestra con un disolvente organico, por ejemplo, un alcohol, como el metanol; y tratamiento con detergentes. Dicho pretratamiento generalmente se realiza en un medio que no interfiere posteriormente con un ensayo.
La muestra se puede preparar en cualquier medio conveniente que no interfiera con un ensayo. Se prefiere un medio acuoso y tipicamente es uno que puede ser unicamente agua o puede incluir de 0.1 a aproximadamente 40 por ciento en volumen de un cosolvente tal como, por ejemplo, un disolvente organico, que puede ser un alcohol, eter, ester, amida y similares. Se pueden emplear diversos materiales auxiliares en un ensayo. El medio puede comprender uno o mas conservantes como se conocen en la tecnica, tales como, por ejemplo, azida de sodio, sulfato de neomicina, PROCLIN® 300, estreptomicina y similares. Ademas, los estabilizadores para el medio de ensayo y los componentes del ensayo pueden estar presentes en el medio de ensayo. Con frecuencia, ademas de estos aditivos, se pueden incluir proteinas, como las albuminas. Otros materiales auxiliares incluyen, por ejemplo, sales de amonio cuaternario, polianiones tales como sulfato de dextrano, tensioactivos, particularmente tensioactivos no ionicos, potenciadores de la union, por ejemplo, polialquilenglicoles y similares.
El pH para el medio estara generalmente en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 11, mas habitualmente en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, y preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 9.5. Se pueden usar varios reguladores para lograr el pH deseado y mantener el pH durante el periodo de incubacion. Reguladores ilustrativos incluyen borato, fosfato, carbonato, tris, barbital, PIPES, HEPES, m Es , ACES, MOPS, BICINE y similares. El medio tambien puede comprender agentes para prevenir la formacion de coagulos de sangre. Tales agentes son bien conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, EDTA, EGTA, citrato, heparina y similares.
En los metodos de ensayo descritos en el presente documento, se emplea un sistema de produccion de senales ("sps") para la deteccion de un analito. Los sps comprenden uno o mas componentes, siendo al menos un componente una etiqueta detectable, que genera una senal detectable que se relaciona con la cantidad de etiqueta unida y/o no unida, es decir, la cantidad de etiqueta unida o no unida al compuesto que se esta detectando, es decir, el analito. La etiqueta es cualquier molecula que produce o puede inducirse para producir una senal, y puede ser, por ejemplo, un fluorescente, radiomarcador, enzima, quimioluminiscente o fotosensibilizador. Por lo tanto, la senal se detecta y/o se mide detectando la actividad enzimatica, la luminiscencia, la absorbancia de la luz o la radioactividad, segun sea el caso.
Las etiquetas adecuadas incluyen, a modo de ilustracion y no de limitacion, enzimas tales como fosfatasa alcalina, pgalactosidasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa ("G6PDH") y peroxidasa de rabano picante; ribozima; un sustrato para una replicasa tal como la replicasa QB; promotores; tintes; fluorescentes, tales como fluoresceina, isotiocianato, compuestos de rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehido y fluorescamina; quimioluminiscentes tales como isoluminol; sensibilizadores; coenzimas; sustratos enzimaticos; radiomarcadores tales como 125l, 131l, 14C, 3H, 57Co y 75Se; particulas tales como latex o particulas de carbono; sol de metal; cristalita; liposomas; celulas, etc., que pueden marcarse adicionalmente con un tinte, catalizador u otro grupo detectable. Las enzimas y coenzimas adecuadas se describen en Litman, et al., Patente de los Estados Unidos No. 4,275,149, columnas 19-28, y Boguslaski, et al., Patente de los Estados Unidos No. 4,318,980, columnas 10-14; fluorescentes y quimioluminiscentes adecuados se describen en Litman et al., Patente de los Estados Unidos No. 4,275,149, en las columnas 30 y 31.
Hay numerosos metodos mediante los cuales la etiqueta puede producir una senal detectable por medios externos, deseablemente por examen visual, por ejemplo, por radiacion electromagnetica, calor y reactivos quimicos. La etiqueta u otros miembros de sps tambien pueden asociarse con un miembro de sbp, otra molecula o un soporte. Las etiquetas incluyen grupos detectables por medio de radiacion electromagnetica o por deteccion electroquimica incluyendo colorantes, fluorescentes, quimioluminiscentes e isotopos radiactivos.
La etiqueta puede producir directamente una senal y, por lo tanto, no se requieren componentes adicionales para producir una senal. Numerosas moleculas organicas, por ejemplo, los fluorescentes, son capaces de absorber la luz ultravioleta y visible, donde la absorcion de luz transfiere energia a estas moleculas y las eleva a un estado de energia excitada. Esta energia absorbida se disipa luego por la emision de luz en una segunda longitud de onda. Otras etiquetas que producen directamente una senal incluyen isotopos y colorantes radioactivos.
Alternativamente, la etiqueta puede necesitar otros componentes para producir una senal, y el sistema productor de senales incluiria todos los componentes requeridos para producir una senal medible, que puede incluir sustratos, coenzimas, potenciadores, enzimas adicionales, sustancias que reaccionan con productos enzimaticos, catalizadores, activadores, cofactores, inhibidores, eliminadores, iones metalicos y una sustancia de union especifica requerida para la union de sustancias que generan senales. Una discusion detallada de los sistemas adecuados para la produccion de senales se puede encontrar en la Patente de los Estados Unidos No. 5,185,243, columnas 11-13.
La etiqueta y/u otro miembro sps pueden estar asociados con un miembro sbp, un soporte, otra molecula, etc. Por ejemplo, la etiqueta se puede unir covalentemente a un miembro sbp tal como, por ejemplo, un anticuerpo; un receptor para un anticuerpo, un receptor que es capaz de unirse a una molecula pequena conjugada a un anticuerpo, o un analogo de ligando. La union de la etiqueta al miembro sbp se puede lograr mediante reacciones quimicas como se discutio anteriormente, lo que puede implicar una union directa o union a traves de un grupo de enlace entre la etiqueta y el miembro sbp o similar. Otros miembros de sps tambien pueden estar vinculados covalentemente a miembros de sbp. Por ejemplo, dos miembros sps, como un fluorescente y un extintor, pueden unirse a un anticuerpo diferente que forma un complejo especifico con el analito. La formacion del complejo acerca el fluorescente y el extintor, lo que permite que el extintor interactue con el fluorescente para producir una senal. Los metodos de conjugacion son bien conocidos en la tecnica e incluyen los descritos anteriormente. Ademas, vease, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 3,817,837.
En algunas realizaciones, el sps tiene al menos el primer y segundo miembros sps. La designacion "primero" y "segundo" es completamente arbitraria y no pretende sugerir ningun orden o clasificacion entre los miembros sps ni ningun orden de adicion de los miembros sps en los metodos actuales. En este sistema, los miembros sps estan relacionados en cuanto la activacion de un miembro sps produce un producto tal como, por ejemplo, la luz, que resulta en la activacion de otro miembro sps. El segundo miembro sps generalmente genera una senal detectable que se relaciona con la cantidad de analito en la muestra.
En algunas realizaciones, el primer miembro sps es un sensibilizador, tal como, por ejemplo, un fotosensibilizador y el segundo miembro sps es una composicion quimioluminiscente que se activa como resultado de la activacion del primer miembro sps. El sensibilizador puede ser cualquier unidad estructural que, al activarse, produce un producto que activa la composicion quimioluminiscente, que a su vez genera una senal detectable. En muchas realizaciones, el sensibilizador es capaz de generar oxigeno singlete tras la activacion. Ejemplos de fotosensibilizantes y composiciones quimioluminiscentes que pueden utilizarse son los que se exponen en las Patentes de los Estados Unidos Nos.
5,340,716 y 6,153,442.
Para los inmunoensayos, los metodos emplean al menos un anticuerpo para el analito. Por la frase "anticuerpo para el analito" se entiende un anticuerpo que se une especificamente al analito y/o analogo del analito y no se une en ningun grado significativo a otros componentes del ensayo o componentes de la muestra, de manera que el analisis para el analito seria distorsionado. Un analogo de analito es un analito modificado que puede competir con el analito por un receptor, proporcionando la modificacion medios para unir un analogo de analito a otra molecula. El analogo del analito generalmente diferira del analito en mas que el reemplazo de un hidrogeno con un enlace que une el analogo del analito a un centro o etiqueta, pero no es necesario. El analogo del analito se une al receptor de una manera similar a la union del analito al receptor. El analogo del analito puede ser, por ejemplo, el analito conjugado con otra molecula a traves de un grupo de enlace, un anticuerpo dirigido contra el idiotipo de un anticuerpo al analito, y asi sucesivamente.
Los anticuerpos especificos para un analito para uso en inmunoensayos pueden ser monoclonales o policlonales. Dichos anticuerpos pueden prepararse mediante tecnicas que son bien conocidas en el arte, como la inmunizacion de un huesped y la recoleccion de sueros (policlonales) o preparando lineas celulares hibridas continuas y recolectando la proteina secretada (monoclonal) o clonando y expresando secuencias de nucleotidos o versiones mutagenizadas de los mismos que codifican al menos las secuencias de aminoacidos requeridas para la union especifica de anticuerpos naturales.
Los anticuerpos pueden incluir una inmunoglobulina completa o un fragmento de la misma, cuyas inmunoglobulinas incluyen las diversas clases e isotipos, tales como IgA, IgD, IgE, IgGl, IgG2a, IgG2b e IgG3, IgM, etc. Sus fragmentos pueden incluir Fab, Fv y F(ab')2 , Fab', y similares. Ademas, pueden usarse agregados, polimeros y conjugados de inmunoglobulinas o sus fragmentos cuando sea apropiado, siempre que se mantenga la afinidad de union a una molecula particular.
El antisuero que contiene anticuerpos (policlonales) se obtiene mediante tecnicas bien establecidas que involucran la inmunizacion de un animal, como un conejo, cobaya o cabra, con un inmunogeno apropiado y obteniendo antisueros de la sangre del animal inmunizado despues de un periodo de espera apropiado. Las revisiones del estado de la tecnica son proporcionadas por Parker, radioinmunoanalisis de compuestos biologicamente activos, Prentice-Hall (Englewood Cliffs, N.J., U.S., 1976), Butler, J. Immunol. Meth 7: 1-24 (1975); Broughton and Strong, Clin. Chem. 22: 726-732 (1976); y Playfair, et al., Br. Med. Bull. 30: 24-31 (1974).
Los anticuerpos tambien pueden obtenerse mediante tecnicas de hibridacion de celulas somaticas, denominandose dichos anticuerpos comunmente como anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se pueden producir segun las tecnicas estandar de Kohler and Milstein, Nature 265: 495-497, 1975. Las revisiones de las tecnicas de anticuerpos monoclonales se encuentran en Lymphocyte Hybridomas, ed. Melchers, et al. Springer-Verlag (Nueva York 1978), Nature 266: 495 (1977), Science 208: 692 (1980) y Methods of Enzymology 73 (Part B): 3-46 (1981).
En otra metodologia para la preparacion de anticuerpos, la secuencia que codifica los sitios de union del anticuerpo puede escindirse del ADN del cromosoma e insertarse en un vector de clonacion, que puede expresarse en bacterias para producir proteinas recombinantes que tienen los sitios de union del anticuerpo correspondientes.
Como se menciono anteriormente, la muestra y los reactivos se proporcionan en combinacion en el medio. Aunque el orden de adicion al medio puede variar, habra ciertas preferencias para algunas realizaciones de los formatos de ensayo descritos en este documento. El orden de adicion mas simple, por supuesto, es agregar todos los materiales simultaneamente y determinar el efecto que el medio de ensayo tiene sobre la senal como en un ensayo homogeneo. Alternativamente, los reactivos pueden combinarse secuencialmente. Cuando se combinan diversos agentes distintos a los concomitantes (simultaneamente), uno o mas pueden combinarse con uno o mas de los agentes restantes para formar una subcombinacion. El reactivo de ensayo seco de las presentes realizaciones puede anadirse directamente al medio de ensayo o puede reconstituirse en un medio apropiado antes de la adicion al medio de ensayo.
Se pueden aplicar uno o mas periodos de incubacion al medio de ensayo en uno o mas intervalos que incluyen cualquier intervalo entre las adiciones de varios reactivos mencionados anteriormente. El medio generalmente se incuba a una temperatura y durante un tiempo suficiente para que se produzca la union de diversos componentes de los reactivos. Las temperaturas moderadas se emplean normalmente para llevar a cabo el metodo y, por lo general, a una temperatura constante, preferiblemente a temperatura ambiente, durante el periodo de medicion. Las temperaturas de incubacion varian de aproximadamente 5° a aproximadamente 99°C, o de aproximadamente 15°C a aproximadamente 70°C, o de 20°C a aproximadamente 45°C. El periodo de tiempo para la incubacion es de aproximadamente 0.2 segundos a aproximadamente 24 horas, o de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 6 horas, o de aproximadamente 2 segundos a aproximadamente 1 hora, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 15 minutos. El periodo de tiempo depende de la temperatura del medio y la velocidad de union de los diversos reactivos, que esta determinada por la constante de velocidad de asociacion, la concentracion, la constante de union y la constante de velocidad de disociacion. Las temperaturas durante las mediciones generalmente oscilaran entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50°C, o entre aproximadamente 15 y aproximadamente 40°C.
La concentracion de analito que puede analizarse generalmente varia de aproximadamente 10-5 a aproximadamente 10-17 M, mas generalmente de aproximadamente 10-6 a aproximadamente 10-14 M. Consideraciones, por ejemplo, si el ensayo es cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo (en relacion con la cantidad de analito presente en la muestra), la tecnica de deteccion particular y la concentracion del analito determinan normalmente las concentraciones de los diversos reactivos.
Las concentraciones de los diversos reactivos en el medio de ensayo generalmente se determinaran por el rango de concentracion de interes del analito, la naturaleza del ensayo y similares. Sin embargo, la concentracion final de cada uno de los reactivos normalmente se determina empiricamente para optimizar la sensibilidad del ensayo en el rango. Es decir, una variacion en la concentracion de analito que sea importante deberia proporcionar una diferencia de senal medible con precision. Consideraciones tales como la naturaleza del sistema que produce la senal y la naturaleza de los analitos normalmente determinan las concentraciones de los diversos reactivos.
Despues de cualquier periodo de incubacion para la union de los reactivos respectivos, se lleva a cabo un examen del medio o el soporte. En muchas realizaciones, el examen del medio implica la deteccion de una senal del medio o del soporte solido. La presencia y/o cantidad de la senal esta relacionada con la presencia y/o cantidad del analito en la muestra. El modo particular de deteccion depende de la naturaleza de los sps. Como se discutio anteriormente, existen numerosos metodos por los cuales una etiqueta de un sps puede producir una senal detectable por medios externos, deseablemente por examen visual, e incluye, por ejemplo, radiacion electromagnetica, electroquimica, calor, deteccion de radioactividad, reactivos quimicos, etc.
La activacion de un sistema productor de senales depende de la naturaleza de los miembros del sistema que producen senales. Para un miembro sps que es un sensibilizador que se activa con la luz, el miembro sps se irradia con luz. A los expertos en la tecnica se les sugeriran otros metodos de activacion en vista de las divulgaciones de este documento.
El examen de la presencia y/o cantidad de la senal tambien incluye la deteccion de la senal, que generalmente es simplemente una etapa en donde se lee la senal. La senal se lee normalmente usando un instrumento, cuya naturaleza depende de la naturaleza de la senal. El instrumento puede ser un espectrofotometro, fluorometro, espectrometro de absorcion, luminometro, quimioluminometro, actinometro, instrumento fotografico y similares. La presencia y la cantidad de senal detectada estan relacionadas con la presencia y la cantidad del analito presente en una muestra. Las temperaturas durante las mediciones generalmente varian de aproximadamente 10° a aproximadamente 70°C, o de aproximadamente 20° a aproximadamente 45°C, o de aproximadamente 20° a aproximadamente 25°C. En una metodologia, se conforman curvas estandar utilizando concentraciones conocidas de los analitos que se van a examinar. Como se menciono anteriormente, tambien se pueden usar calibradores y otros controles.
Ejemplos de ensayos que emplean realizaciones del reactivo de ensayo seco
Como se menciono anteriormente, los reactivos de ensayo seco discutidos anteriormente se pueden utilizar en ensayos de union para analitos. Los reactivos de ensayo seco se aplican a todos los ensayos descritos a continuacion, asi como a otros ensayos que incluyen reactivos de soporte no mencionados especificamente en este documento. Los metodos de ensayo generalmente involucran una muestra sospechosa de contener un analito, que se combina en un medio de ensayo con reactivos para llevar a cabo el ensayo. Tales reactivos incluyen un soporte o reactivo en fase solida. Otros reactivos de ensayo pueden incluir un asociado de union para el analito si el miembro sbp en el soporte solido no es un asociado de union para el analito, analogos de analito, otros soportes solidos a los que esta unido uno de los reactivos, asociados de union para miembros de sbp, y asi sucesivamente. Uno o mas de los reactivos pueden ser parte de un sistema productor de senales donde al menos uno de los reactivos puede estar marcado. Los reactivos se eligen de modo que se obtenga una senal de una etiqueta en relacion con la presencia o la cantidad de analito en la muestra. El ensayo se puede realizar sin separacion (homogenea) o con separacion (heterogenea) de cualquiera de los compuestos o productos del ensayo. Dado que se utilizan soportes solidos, el ensayo suele ser heterogeneo, aunque se conocen formatos homogeneos que utilizan dichos reactivos.
Los ensayos heterogeneos implican habitualmente uno o mas pasos de separacion y pueden ser competitivos o no competitivos. Una variedad de formatos de ensayos heterogeneos competitivos y no competitivos se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 5,089,390, columna 14, linea 25 a columna 15, linea 9. En un ensayo heterogeneo competitivo tipico, se contacta un soporte que tiene un anticuerpo para el analito unido al mismo con un medio que contiene la muestra y el analogo del analito conjugado a un marcador detectable, como una enzima (el "conjugado"). El analito en la muestra compite con el conjugado para unirse al anticuerpo. Despues de separar el soporte y el medio, la actividad de la etiqueta del soporte o el medio se determina mediante tecnicas convencionales y se relaciona con la cantidad de analito en la muestra. El reactivo de ensayo seco de acuerdo con las presentes realizaciones puede emplearse como el reactivo de soporte mencionado anteriormente. En este caso, el soporte tiene un receptor como, por ejemplo, estreptavidina, unido a el y un ligando-anticuerpo, por ejemplo, biotina-anticuerpo, conjugado se une al soporte mediante la union de la estreptavidina en el soporte y la biotina del conjugado.
Un ensayo en sandwich no competitivo tipico es un ensayo descrito en la Patente de los Estados Unidos No.4,486,530, columna 8, linea 6 a columna 15, linea 63. En este metodo, se forma un complejo inmune en sandwich, en un medio de ensayo. El complejo comprende el analito, un primer anticuerpo (monoclonal o policlonal) que se une al analito y un segundo anticuerpo que se une al analito o un complejo del analito y el primer anticuerpo. Posteriormente, el complejo inmune en sandwich se detecta y se relaciona con la cantidad de analito en la muestra. El complejo inmune, en sandwich, se detecta en virtud de la presencia en el complejo de un marcador en donde uno o ambos, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo contienen marcadores o sustituyentes capaces de combinarse con marcadores. En este caso, el reactivo de ensayo seco de acuerdo con la presente divulgacion comprende un soporte al cual se une un receptor, por ejemplo, estreptavidina, y un conjugado-ligando, por ejemplo, biotina-anticuerpo, conjugado se une al soporte por la union de la estreptavidina sobre el soporte y la biotina del conjugado. El anticuerpo es uno de los primeros o segundos anticuerpos mencionados anteriormente.
Los ensayos en sandwich encuentran uso en su mayor parte en la deteccion de antigenos y analitos de anticuerpos. En el ensayo, el analito esta unido por dos anticuerpos especificos para el analito y, por lo tanto, el ensayo tambien se conoce como el ensayo inmunometrico de dos sitios. En una metodologia, una primera incubacion de un anticuerpo no marcado acoplado a un soporte, tambien conocido como el anticuerpo insolubilizado, se pone en contacto con un medio que contiene una muestra sospechosa de contener el analito. Despues de una etapa de lavado y separacion, el soporte se pone en contacto con un medio que contiene el segundo anticuerpo, que generalmente contiene una etiqueta, durante un segundo periodo de incubacion. El soporte se lava nuevamente y se separa del medio y se examina el medio o el soporte para detectar la presencia de una etiqueta. La presencia y la cantidad de etiqueta estan relacionadas con la presencia o la cantidad del analito. Para una discusion mas detallada de esta metodologia, consultense las Patentes de los Estados Unidos Nos. Re. 29,169 y 4,474,878. En este caso, el reactivo de ensayo seco de acuerdo con la presente divulgacion comprende un soporte al cual se une un receptor, por ejemplo, estreptavidina, y un conjugado-ligando, por ejemplo, biotina-anticuerpo, conjugado se une al soporte por la union de la estreptavidina sobre el soporte y la biotina del conjugado. El anticuerpo es el anticuerpo no marcado mencionado anteriormente.
En una variacion del ensayo en sandwich anterior, la muestra en un medio adecuado se pone en contacto con el anticuerpo marcado para el analito y se incuba durante un periodo de tiempo. Luego, el medio se pone en contacto con un soporte al que se une un segundo anticuerpo para el analito. Despues de un periodo de incubacion, el soporte se separa del medio y se lava para eliminar los reactivos no unidos. El soporte o el medio se examina para detectar la presencia de la etiqueta, que esta relacionada con la presencia o la cantidad de analito. Para una discusion mas detallada de este enfoque, consultese la Patente de los Estados Unidos No. 4,098.876. En este caso, el reactivo de ensayo seco de acuerdo con la presente divulgacion comprende un soporte al cual se une un receptor, por ejemplo, estreptavidina, y un conjugado-ligando, por ejemplo, biotina-anticuerpo, conjugado se une al soporte por la union de la estreptavidina sobre el soporte y la biotina del conjugado. El anticuerpo es el segundo anticuerpo para el analito mencionado anteriormente.
En otra variacion de lo anterior, la muestra, el primer anticuerpo unido a un soporte y el anticuerpo marcado se combinan en un medio y se incuban en una unica etapa de incubacion. La separacion, los pasos de lavado y el examen de la etiqueta son los descritos anteriormente. Para una discusion mas detallada de este enfoque, consultese la Patente de los Estados Unidos No. 4,244,940. En este caso, el reactivo de ensayo seco de acuerdo con la presente divulgacion comprende un soporte al cual se une un receptor, por ejemplo, estreptavidina, y un conjugado-ligando, por ejemplo, biotina-anticuerpo, conjugado se une al soporte por la union de la estreptavidina sobre el soporte y la biotina del conjugado. El anticuerpo es el primer anticuerpo mencionado anteriormente.
Otro ejemplo especifico de una realizacion de un formato de ensayo en donde se puede emplear el presente reactivo de ensayo seco es ACMIA (inmunoensayo de afinidad mediado por dioxido de cromo) (vease, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 7,186,518). Para el formato de ensayo ACMIA, el reactivo de ensayo seco de acuerdo con la divulgacion en este documento comprende particulas de cromo a las que se une un receptor, por ejemplo, estreptavidina. Un ligando, por ejemplo, biotina, conjugado, que comprende biotina unida a un analito o analogo de analito se une a la estreptavidina. La relacion molar del numero de sitios de union de las moleculas de estreptavidina a la biotina es mayor que 1. Los reactivos tambien incluyen un anticuerpo para el analito. Este anticuerpo esta reticulado a una enzima informadora (por ejemplo, beta-galactosidasa) y se agrega a un recipiente de reaccion en exceso. El conjugado anticuerpo-enzima se mezcla con una muestra para permitir que el analito se una al anticuerpo. A continuacion, se agrega el reactivo de cromo seco mencionado anteriormente para unir cualquier exceso de conjugado anticuerpo-enzima. Luego, se aplica un iman, que extrae todo el cromo y el exceso de anticuerpo-enzima de la suspension, y el sobrenadante se transfiere a un recipiente de reaccion final. El sustrato de la enzima informadora se agrega al recipiente de reaccion final, y la actividad de la enzima se mide espectrofotometricamente como un cambio en la absorbancia a lo largo del tiempo. La cantidad de esta senal esta relacionada con la presencia de cantidad de rapamicina en la muestra.
En otro ejemplo especifico de un formato de ensayo en sandwich, el reactivo de ensayo seco comprende particulas de cromo a las que se une un receptor, por ejemplo, estreptavidina. Un ligando, por ejemplo, biotina, conjugado que comprende biotina unida a un anticuerpo para el analito se une a la estreptavidina. La relacion molar del numero de sitios de union de las moleculas de estreptavidina a la biotina es mayor que 1. Se emplea un segundo anticuerpo (o proteina de union) especifico para el analito conjugado con una enzima informadora. En este formato, el reactivo de ensayo seco se agrega a un medio de ensayo junto con la muestra. El medio se incuba para que todo el analito en la muestra se una a las particulas de cromo. Las particulas de cromo se lavan, utilizando un iman para separar el analito unido del sobrenadante. Luego, se agrega el segundo anticuerpo conjugado a la beta-galactosidasa y se incuba el medio de manera que se forme un sandwich que comprende el analito, la particula de cromo y el segundo anticuerpo. Despues del lavado, se mide la cantidad de enzima que se une a las particulas de cromo y se relaciona con la presencia y/o la cantidad del analito en la muestra.
Otro ejemplo especifico de un formato de ensayo en donde se puede emplear el presente reactivo de ensayo seco es un ensayo de luminiscencia inducida como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,340,716. En un enfoque, el ensayo utiliza una particula que incorpora un fotosensibilizador y una particula etiquetada que incorpora un compuesto quimioluminiscente. La particula marcada se conjuga con un miembro sbp que es capaz de unirse a un analito para formar un complejo, o a un segundo miembro sbp para formar un complejo, en relacion con la presencia del analito. Si el analito esta presente, el fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente se acercan mucho. El fotosensibilizador genera oxigeno singlete y activa el compuesto quimioluminiscente cuando las dos etiquetas estan muy cerca. El compuesto quimioluminiscente activado produce posteriormente luz. La cantidad de luz producida se relaciona con la cantidad del complejo formado, que a su vez se relaciona con la cantidad de analito presente. En este caso, el reactivo de ensayo seco de acuerdo con la presente divulgacion comprende una particula marcada a la que se une un receptor, por ejemplo, estreptavidina, y un conjugado-ligando, por ejemplo, biotina-anticuerpo, conjugado se une al soporte mediante la union de la estreptavidina sobre el soporte y la biotina del conjugado. El miembro sbp es el referido anteriormente que es capaz de unirse al analito.
Descripcion general de la preparacion de compuestos
El Chemibead EPRM se prepara de una manera similar al metodo descrito en la Patente de los Estados Unidos No.
6,153,442. El Chemibead EPRM comprende una capa interna de aminodextrano y una capa externa Dexal que tiene funcionalidades de aldehido libre. El Dexal es aldehido dextrano; veanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,929,049 y 7,172,906. La reaccion se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 0 a aproximadamente 40°C, durante un periodo de aproximadamente 16 a aproximadamente 64 horas a un pH de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.0, o aproximadamente 6, en un medio acuoso regulado que emplea un regulador adecuado, tales como, por ejemplo, MES o similares. La reaccion se detiene mediante la adicion de un agente de extincion adecuado tal como, por ejemplo, carboximetoxioxima (CMO), o similar y posterior lavado de las particulas.
El Chemibead APRM es una perla de poliestireno con europio quelado y tioxeno como la composicion quimioluminiscente. El Chemibead APRM se prepara de una manera similar al metodo descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 6,153,442. El Chemibead APRM comprende una capa de aminodextrano que tiene funcionalidades de amina libre.
Preparación de reactivo de particulas quimioluminiscentes de anticuerpo CsA. La preparacion de conjugados de anticuerpo CsA y particulas se puede llevar a cabo de acuerdo con las siguientes realizaciones. Por ejemplo, EPRM-anti-CsA-anticuerpos-quimiotipo (19) se prepara en regulador (por ejemplo, MES, pH = 6.0, Neo Water (83%) y regulador MES (50 mM), o similar) con aminacion reductiva de grupos de amina libre del anticuerpo con grupos aldehido de Chemibead EPRM en presencia de NaBH3CN (Figura 10, Esquema 6) en condiciones de aminacion reductiva como se discutio anteriormente. Cualquier grupo aldehido restante de ERPM se extingue como se describio anteriormente y las particulas resultantes se lavan como se discutio anteriormente.
Preparación de conjugados CsA-bis-biotina. En algunas realizaciones, puede prepararse una CsA-bis-biotina (31) a modo de ilustracion y no de limitacion. La preparacion de CsA-bis-biotina (31) se puede lograr, por ejemplo, utilizando dos asociados de union, el enlazante de bis-biotina (26) y el derivado de CsA (30) (Figuras 20-22, Esquemas 11 -13). Una ruta sintetica para la preparacion de 26 se lleva a cabo en un total de cinco pasos. (Una preparacion del compuesto (26) se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 6,153,442. Sin embargo, la sintesis previa de 26 requirio diez etapas de reaccion. La metodologia de sintesis descrita en este documento es mas eficiente y economica que la sintesis previa). En las presentes realizaciones, la sintesis de 26 comienza con la proteccion selectiva de una amina en DA-10 con un agente de proteccion adecuado tal como, por ejemplo, t-butilo anhidrido, o similar para dar el compuesto (23) (Figura 11, Esquema 7). La reaccion se lleva a cabo en un disolvente organico tal como, por ejemplo, cloruro de metileno, DMF o similares, a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 5°C, durante un periodo de aproximadamente 1 a aproximadamente 24 horas a una temperatura ambiente, pH de aproximadamente 7.5 a aproximadamente 13. Acilacion de 23 con N-benciloxicarbonil-5-aminopentanoico anhidrido en condiciones basicas. La reaccion se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 0 a aproximadamente 80°C, durante un periodo de aproximadamente 3 a aproximadamente 16 horas en condiciones basicas a un pH de aproximadamente 7.5 a aproximadamente 11, tal como, por ejemplo, en presencia de trietilo. amina (Et3N), diisopropiletilamina, y similares en un disolvente organico tal como, por ejemplo, cloruro de metileno, acetonitrilo (AcCN), DMF, THF, eter dietilico y similares. La reduccion de los grupos nitro a amina se lleva a cabo utilizando un agente reductor adecuado como, por ejemplo, NaBH4 o Cu (I) acetil acetona o NaBH4, HCl o 10% de Pd en carbono, o similar, da un compuesto de diamina (24). Se eligen las condiciones de reaccion que sean apropiadas para el agente reductor particular empleado. La reaccion de la diamina (24) con un enlazante comercialmente disponible, por ejemplo, sulfo-NHS-LC-Biotina, NHS-PEO4-biotina o similares, proporciona el compuesto (25). La desproteccion selectiva del grupo protector t-Boc de 25 en condiciones acidas tales como, por ejemplo, acido trifluoroacetico, un acido mineral, por ejemplo, HCl, etc., o similares en un disolvente organico tal como, por ejemplo, cloruro de metileno. DMF, o similar, proporciona el enlazante de bis-biotina deseado (26) (Figura 11, Esquema 7).
La sintesis de 30 se representa en la Figura 12, Esquema 8. El compuesto 27 se trata para obtener un ester activado usando un agente de activacion tal como, por ejemplo, isocianooacetato de etilo, o similares, en condiciones apropiadas para el agente de activacion. Por ejemplo, con isocianooacetato de etilo como agente de activacion, la reaccion se lleva a cabo con etoxido de tributilestano en tolueno a una temperatura de aproximadamente 0 a aproximadamente 40°C, durante un periodo de aproximadamente 2 a aproximadamente 16 horas, para dar el ester (28). La hidrolisis del ester etilico y la desproteccion del grupo protector de silicio en 28 se logra en una reaccion de una etapa para dar acido (29) por tratamiento en condiciones basicas como, por ejemplo, carbonato de sodio, carbonato de potasio, hidroxido de sodio o como, en un disolvente organico tal como, por ejemplo, un alcohol, por ejemplo, metanol, etanol, etc., o por tratamiento en condiciones acidas como, por ejemplo, acido mineral diluido como se discutio anteriormente.
El grupo acido en 29 se activa por tratamiento con un agente de activacion tal como, por ejemplo, NHS y DCC, carbodiimida, o similares, en un disolvente organico tal como, por ejemplo, un eter, por ejemplo, THF, DMF, o similar, para dar ester NHS (30) (Figura 12, Esquema 8). La reaccion anterior se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 0 a aproximadamente 40°C, durante un periodo de aproximadamente 3 a aproximadamente 16 horas. La reaccion de acoplamiento de 30 con 26 se lleva a cabo en condiciones basicas tales como, por ejemplo, trietilamina, diisopropiletilamina, o similares en un disolvente organico tal como, por ejemplo, un eter, por ejemplo, THF, DMF, diclorometano, o similar para dar el producto final, CsA-Bis-Biotina (31) (Figura 13, Esquema 9). La reaccion de acoplamiento se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 0 a aproximadamente 40°C, durante un periodo de aproximadamente 4 a aproximadamente 16 horas a un pH de aproximadamente 9 a aproximadamente 11.
Kits que comprenden reactivos para realizar ensayos para un analito
Los reactivos para realizar un ensayo particular pueden estar presentes en un kit util para realizar convenientemente un ensayo para la determinacion de un analito. En algunas realizaciones, un kit comprende en combinacion envasada un reactivo de ensayo seco como se describe anteriormente, asi como cualquier otro reactivo para realizar el ensayo, cuya naturaleza depende del formato de ensayo particular.
Los reactivos pueden estar cada uno en recipientes separados o se pueden combinar varios reactivos en uno o mas recipientes, dependiendo de la reactividad cruzada y la estabilidad de los reactivos. El kit puede incluir ademas otros reactivos empaquetados por separado para realizar un ensayo, como miembros sbp adicionales, reactivos auxiliares, etc.
Las cantidades relativas de los diversos reactivos en los kits se pueden variar ampliamente para proporcionar concentraciones de los reactivos que optimizan sustancialmente las reacciones que deben ocurrir durante el presente metodo y ademas para optimizar sustancialmente la sensibilidad del ensayo. El kit puede incluir ademas una descripcion escrita de un metodo de acuerdo con la presente invencion como se describe anteriormente.
Ejemplos
Comentarios generales
La cromatografia analitica de capa fina (TLC, silice) es el metodo de analisis habitual y se realizo utilizando placas de Analtech, Inc. (Newark, DE) con el disolvente especificado a continuacion. Las manchas de TLC se visualizaron mediante luz ultravioleta (onda corta y/u onda larga) y/o vapores de yodo. Las separaciones de cromatografia preparativa de capa fina (PTLC) se llevaron a cabo en placas de gel de silice recubiertas previamente, de Whatman Inc. (Clifton, NJ) y Analtech Inc. La cromatografia instantanea se llevo a cabo en gel de silice Whatman 60 A (malla 230-400) (Whatman Inc., Florham Park, NJ). Los reactivos y disolventes fueron de calidad comercial y se utilizaron sin purificacion adicional. El sirolimus (rapamicina) se obtuvo de BioAge Pharmaceuticals Inc., San Diego, CA. FK-506-CMO (11) se obtuvo de Glasgow Site, Siemens Medical Solutions Diagnostics. A menos que se especifique lo contrario, los reactivos se obtuvieron de Sigma Chemical Company (St. Louis MO), Aldrich Chemical Company (Milwaukee WI) o Fluka Chemical Corporation (Milwaukee WI) y se usaron tal como se recibieron. La perla sensibilizadora de estreptavidina se preparo de forma analoga a la descrita en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,153,442, 7,022,529 y 7,229.842. Los ensayos se realizaron utilizando el analizador DIMENSION® RxL disponible en Dade Behring Inc., Newark DE. El instrumento se empleo utilizando tecnologia de inmunoensayo de luminiscencia inducida y se equipo con un lector apropiado.
Preparación de compuestos
Preparación de los compuestos (2) y (3) (vease la figura 2, esquema 1). A una solucion de sirolimus (1) (1 g, 1.0545 mmol) y hemihidrocloruro de carboximetoxiamina (CMO) (823 mg, 3.16 mmol) en metanol (MeOH) (41 mL), se agrego acetato de sodio (263.0 mg, 3.18 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente bajo atmosfera de nitrogeno durante una noche y el avance de la reaccion se controlo por TLC (gel de silice) (MeOH/CH2Cl2 = 1/9) (MeOH es metanol). Se agregaron agua desionizada (40 mL) y cloruro de metileno (40 mL) a la mezcla. La capa acuosa se extrajo con cloruro de metileno (3 x 40 mL) y las capas organicas combinadas se lavaron con agua desionizada (20 mL), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron. Esto dio el producto crudo (1.0774 g). La purificacion del producto crudo (148.8 mg) con tres placas de TLC preparativa (gel de silice, 150 A0, 1000 pm, Whatman) (acetato de etilo (EtOAc)/Hexano/MeOH) = 5/2/1) se realizo para dar dos compuestos (2) (32.6 mg, 45% de rendimiento) y (3) (39.4 mg, 55%). (2).
Preparación de compuestos de biotina Rapa-C26/C32-PEO4 (4) y (5) (vease Figura 3, Esquema 2). A una solucion de los compuestos (2, 3) (50 mg, 0.05065 mmol) en tetrahidrofurano (THF) (5 mL) se agregaron N-hidroxisuccinimida (NHS) (26 mg, 0.226 mmol) y N,N-diciclohexil carbodiimida (DCC) (50 mg, 0.2422 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 16 horas y el producto rapamicina (Rapa)-NHS ester fue una mancha menos polar que el compuesto (2, 3). El avance de la reaccion se controlo por TLC (gel de silice, CH2Cl2/MeOH = 1/9). Se formo un solido blanco durante la reaccion y se separo por filtracion y el filtrado de THF se anadio con diisopropil etil amina (DIPEA) (0.06 ml) y una solucion de Biotin-PEO-LC-Amine (Pierce Chemical Company, Rockford, IL 61105) (50 mg, 0.119 mmol) en dimetilformamida (DMF) (3 ml). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. La mayor parte de THF y DMF se elimino mediante evaporacion rotatoria a alta presion. El residuo se disolvio en CH2Cl2 (0.5 ml) y la solucion resultante se aplico a placas de TLC preparativas (gel de silice, 2000 pm, 20 cm x 20 cm, Analtech). La purificacion del producto crudo con placas de PTLC (CH2Cl2/MeOH = 1/9) se realizo para dar los dos isomeros deseados (4) y (5) (48 mg): el analisis por HPLC de los isomeros mostro que la relacion molar de (4) a (5) es 1 a 1.5.
Preparación de Rapa-C26-PEO4-Biotina (4) (vease Figura 4, Esquema 3). A una solucion de (2) (12 mg, 0.0122 mmol) en THF (2 mL) se agregaron N-hidroxisuccinimida (NHS) (6 mg, 0.052 mmol) y N,N-diciclohexil carbodiimida (DCC) (8 mg, 0.0387 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 16 horas y el producto rapamicina (Rapa)-NHS ester fue una mancha menos polar que el compuesto (2). El avance de la reaccion se controlo por TLC (gel de silice, CH2Ch/MeOH = 1/9). Se formo un solido blanco durante la reaccion y se separo por filtracion y se anadio el filtrado de THF con DIPEA (0.02 ml) y una solucion de Biotin-PEO-LC-Amina (15 mg, 0.035 mmol) en d Mf (0.3 ml). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. La mayor parte del THF y el DMF se elimino mediante evaporacion rotatoria a alta presion. El residuo se disolvio en CH2CL (0.2 ml) y la solucion resultante se aplico a placas de TLC preparativas (gel de silice, 2000 pm, 20 cm x 20 cm, Analtech). La purificacion del producto crudo con placas de PTLC (CH2Cl2/MeOH) = 9/1 se realizo para dar los isomeros puros (4) (5,2 mg). El analisis de HPLC de 4 mostro que tiene un tiempo de retencion de 3.6 minutos.
Preparación de Rapa-C32-PEO4-Biotina (5) (vease Figura 4, Esquema 3). A una solucion de (3) (39 mg, 0.05065 mmol) en THF (3 ml) se agregaron N-hidroxisuccinimida (NHS) (12 mg, 0.104 mmol) y N,N-diciclohexil carbodiimida (DCC) (22 mg, 0.106 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 16 horas y el producto rapamicina (Rapa)-NHS ester es una mancha menos polar que el compuesto (3). El avance de la reaccion se controlo por TLC (gel de silice, CH2Ch/MeOH = 1/9). El solido blanco, que se formo durante la reaccion, se filtro y el filtrado de THF se anadio con DIPEA (0.04 ml) y una solucion de Biotin-PEO-LC-Amina (40 mg, 0.095 mmol) en DMF (0.4 ml). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. La mayor parte del THF y el DMF se elimino mediante evaporacion rotatoria a alta presion. El residuo se disolvio en CH2CL (0.4 ml) y la solucion resultante se aplico a placas de TLC preparativas (gel de silice, 2000 pm, 20 cm x 20 cm, Analtech). La purificacion del producto crudo con placas de PTLC (CH2Cl2/MeOH = 9/1) se realizo para obtener el isomero puro (5) (40 mg): el analisis por HPLC de 5 mostro que tiene un tiempo de retencion de 2.6 minutos. Espectro de masas para la formula: C71H114N6O19S (5) (FAB; m/e: MNa+, 1409.9).
Preparación de dioxido de cromo Siro-Dexal preformado (10) (vease la figura 5, esquema 4). CPRM (7) (preparado como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 4,661,408) (120 mL) se combino con una solucion reguladora MES (50 mM, pH 6.0; 3 x 200 mL) a 6000 rpm durante 2 minutos y se resuspendio hasta un volumen total de 120 mL con el mismo regulador. El CPRM se centrifugo a 3500 rpm durante 12 minutos despues de cada lavado. Se anadio una solucion de Dexal (180 mL) al CPRM (120 ml) y la suspension resultante se agito a temperatura ambiente durante 20 minutos y el pH se ajusto a 6.0 con HCl 1N en caso necesario. Se disolvio cianoborohidruro de sodio (614 mg) en 2 mL de agua desionizada y se ajusto con el agua desionizada hasta un volumen total de 3 ml. La solucion resultante (3 mL) se anadio gota a gota a la mezcla (120 ml CPRM 180 ml de Dexal) mientras se agitaba y la mezcla de reaccion se agito usando un Nutator ADAMS® a temperatura ambiente durante 64 ± 4 horas durante el fin de semana. El Dexal-cromo se centrifugo a 3500 rpm durante 12 minutos y se elimino el sobrenadante. El Dexalcromo se resuspendio en regulador de fosfato (200 ml, pH = 7, 100 mM) y se lavo a 6000 rpm durante 2 minutos (mezclador L4RT-W® (Silverson Machines Inc., East Longmeadow MA). El Dexal-cromo se centrifugo a 3500 rpm durante 12 minutos y se elimino el sobrenadante. Se repitio todo el proceso con el Dexal-cromo con regulador fosfato (100 mM, pH = 7, 4 x 200 ml), agua desionizada (5 x 200 mL) y luego regulador MES (5 x 200 ml, 50 mM, pH = 6.0). El producto de Dexal-dioxido de cromo (8) se suspendio en 100 mL del mismo regulador MES para la siguiente reaccion.
La estreptavidina (SA) (1200 mg, polvo liofilizado, 70% de pureza) se disolvio en 12 mL de agua desionizada y se anadio a la suspension del producto de Dexal-dioxido de cromo (8) (cromo) (100 ml) de arriba. La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se disolvio cianoborohidruro de sodio (300 mg) en agua desionizada (8 mL) y la solucion de cianoborohidruro de sodio se anadio gota a gota al producto de Dexal-dioxido de cromo (8) (100 ml) mientras se agitaba. La mezcla de reaccion se agito a 37°C durante 64 ± 4 horas durante el fin de semana. Se anadio una solucion de CMO 1M (1.2 ml) al cromo y la mezcla se agito a 37°C durante 2 horas. El producto de Dexaldioxido de cromo SA (9) se centrifugo a 3500 rpm durante 12 minutos y se elimino el sobrenadante. El producto de Dexal-dioxido de cromo SA (9) se resuspendio en regulador fosfato (200 ml, pH = 7.0, 100 mM) y se lavo (L4RT-W® Mixer) a 6000 rpm durante 2 minutos y luego se centrifugo a 3500 rpm durante 12 minutos y el sobrenadante fue eliminado. Todo el proceso se repitio con el regulador fosfato (14 x 200 ml, pH = 7.0, 100 mM) catorce veces. El producto de Dexal-dioxido de cromo SA (9) se resuspendio a un volumen total (120 ml) con el mismo regulador fosfato. En esta preparacion de cromo, se detectaron 7.53 x 10-9 moles (SA)/ml (5% de solido de cromo).
Sirolimus-biotina (4, 5) (2.1 mg, 0.0015 mmol) se disolvio en MeOH (0.5 ml) y se anadio a regulador fosfato (9.5 ml, pH = 7.0, 100 mM). La solucion de sirolimus-biotina (10 ml) se anadio gota a gota al Dexal-dioxido de cromo SA (9) (100 ml, 7.53 x 10-9, 0.000753 mmoles) mientras se agitaba y se empleo papel de aluminio para proteger la mezcla de la luz. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 48 ± 4 horas. La relacion molar de biotina a SA fue de 2 a 1. La biotina-Siro-Dexal-cromo preformada se centrifugo a 3500 rpm durante 12 minutos y se elimino el sobrenadante. El producto de biotina-Siro-Dexal-cromo se resuspendio en regulador fosfato (200 ml, pH = 7.0, 100 mM) y se lavo (L4RT-W® Mixer) a 6000 rpm durante 2 minutos. La biotina-Siro-Dexal-cromo se centrifugo a 3500 rpm durante 12 minutos y se elimino el sobrenadante. El proceso completo se repitio con el regulador fosfato (10 x 200 ml, pH = 7.0, 100 mM) y el regulador PIPES (5 x 200 ml, pH = 6.50, 50 mM). El producto resultante se suspendio hasta un volumen total (100 ml) con el mismo regulador PIPES. El volumen total se ajusto al 5% para obtener el Siro-biotina:: estreptavidina-Dexal- dioxido de cromo preformado (10) (referido en la Figura 5 como "SIRO CrO2 (10) precargado", que se uso para secar tabletas de cromo como se describe a continuacion.
Preparación de Tacrolimus-PEO4-Biotina (12) (vease Figura 6, Esquema 5). A una solucion de FK-506-CMO (11) (75 mg, 0.0855 mmol) en THF (5 mL) se agregaron N-hidroxisuccinimida (NHS) (20 mg, 0.173 mmol) y N,N-diciclohexil carbodiimida (DCC) (45 mg, 0.218 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 16 horas y el producto, tacrolimus-NHS ester, fue un punto menos polar que el compuesto (11). El avance de la reaccion se controlo por TLC (gel de silice, CH2Cl2/MeOH = 1/9). El solido blanco formado durante la reaccion se separo por filtracion y el filtrado de THF se anadio con DIPEA (0.02 ml) y una solucion de Biotin-PEO-LC-Amina (50 mg, 0.119 mmol) en DMF (0.5 ml). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. La mayor parte de THF y DMF se eliminaron mediante evaporacion rotatoria a alta presion. El residuo se disolvio en CH2Cl2 (0.2 ml) y la solucion resultante se aplico a placas de TLC preparativas (gel de silice, 2000 pm, 20 cm x 20 cm, Analtech). La purificacion del producto crudo con placas de PTLC (CH2Cl2/MeOH) = 9/1 se realizo para dar los isomeros puros (12) (124 mg).
Preparación de comprimidos de sirolimus biotinilado::estreptavidina Dexal dioxido de cromo a una relacion molar de 2 (biotina):1 (estreptavidina). El nucleo de las particulas de dioxido de cromo se recubrio primero con silice y luego se recubrio con un silano de acuerdo con el procedimiento descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 4,661,408. Los grupos amina en el silano se hicieron reaccionar primero con aldehido de dextrano (PM = 500 KD) en un regulador MES, pH 6.0 en presencia de NaBH3CN para formar una capa de dexal recubierta en la superficie de cromo (vease esquema 4). El Dexal-cromo se hizo reaccionar con estreptavidina en las mismas condiciones para formar cromo recubierto con estreptavidina como se describe anteriormente. El sirolimus biotinilado fabricado como se describe anteriormente se incubo luego en una relacion molar 2:1 con estreptavidina durante 48-64 horas. La suspension de cromo se lavo con regulador fosfato de Na 100 mM, pH 7.0 por 10 veces y luego en regulador PIPES 50 mM, pH 6.5 por 5 veces. La suspension de cromo lavada se dejo reposar durante 8 horas o hasta que el sobrenadante se aclaro. El sobrenadante se retiro cuidadosamente para recoger la suspension de cromo. Una solucion que contenia 8% (p/p) de carbowax (PEG 8000) y 84% (p/p) de trehalosa se anadio lentamente a la suspension de cromo, que se mezclo con un mezclador de helice. La solucion se mezclo durante 10 minutos antes de cargarla en un conjunto de aspersion (Patentes de los Estados Unidos No. 4,712,310, 4,678,812, 3,932,943, 3,721,725). La presion de nitrogeno liquido (LN2) para el Snow-gun se mantuvo para alcanzar una salida de temperatura del producto dentro del rango de -140°C a - 175°C (la presion esperada de LN2 fue de 22-32 psi). La solucion de pulverizacion se pulverizo a traves de boquillas Egg-Crate para formar gotitas finas uniformes (no todas estan congeladas). Las gotitas se recogieron y se terminaron para congelar en una bandeja, que contenia LN2. Despues de que se termino la pulverizacion de la solucion con Snow Gun, la mezcla resultante (gotitas congeladas o granulos) se transfirio y cargo inmediatamente en un secador de congelacion Hull previamente enfriado (<-35°C, SP Industries, Inc, Warminster, PA), donde se liofilizo durante 5 dias hasta que se convirtio en polvo de mezcla seca. Luego se recogio el polvo de la mezcla seca y se prenso en tabletas de cromo de 30 mg utilizando una prensa de tabletas de estacion unica (Advanced Machinery, MI 48035).
Preparación de suspension de Rapamicina-DAI 0-Dexal-Chrome. La suspension de rapamicina-DAI 0-Dexal-cromo se preparo de acuerdo con el procedimiento descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 7,189,582. La suspension de suspension de cromo lavada se dejo reposar durante 8 horas o hasta que el sobrenadante se aclaro. El sobrenadante se retiro cuidadosamente para recoger las particulas de cromo. Una solucion que contenia 8% (p/p) de carbowax (PEG 8000) y 84% (p/p) de trehalosa se anadio lentamente a la suspension de cromo, que se mezclo con un mezclador de helice. La solucion se mezclo durante 10 minutos y luego se liofilizo y se formo en tabletas como se describio anteriormente.
Preparación de EPRM-anti-CsA-Ab-Chemibead (19). Vease la Figura 10. A la suspension de Chemibead EPRM (2 ml, 100 mg/ml) se agregaron 2 ml de solucion de anticuerpo anti-CsA (2G4, IgG1) (20 mg/ml) en regulador MES (50 mM, 1 ml, pH = 6.0) en una sala verde evitando la luz del dia. A esta suspension se le agregaron 0.09 ml de solucion de NaCNBH3 (25 mg/ml). La mezcla de reaccion se agito en un Nutator ADAMS a 37°C durante 63 horas. Se anadio una solucion de 1M CMO (0.25 mL) a la mezcla, que se agito a 37°C durante 2.5 horas. La mezcla se centrifugo a 15000 rpm durante 25 minutos y el sedimento se resuspendio por sonicacion con 30 ml de regulador fosfato (50 mM, pH = 8.0). El proceso de lavado se repitio (13 x 30 ml) con el mismo regulador y (5 x 30 ml) con el regulador de suspension (HEPES 50 mM, NaCl 300 mM, EDtA 1 mM, BSA 1 mg/ml, TX-405 al 0.1%, Proclin 300 al 0.15%, 0.1 mg/ml de sulfato de neomicina, pH = 8.0). El compuesto quimico anti-CsA-Ab EPRM (19) se resuspendio en 5 ml del mismo regulador de suspension y se determino que el % de solido era de 28.3 mg/ml.
Preparación del compuesto (23). El Compuesto (23) se preparo mediante metodos similares a los descritos previamente en la Patente de los Estados Unidos No. 6,153,442.
Preparación del compuesto (24). El Compuesto (24) se preparo de la siguiente manera: Vease Figura 20. A una solucion de (23) (10 g, 40.7 mmol) en THF (100 ml) se anadio gota a gota Et3N (4.6 g) y cloruro de 3,5-dinitrobenzoilo (9.2 g, 39.9 mmol) en THF (100 ml). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. La mayor parte del THF se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida. El residuo se disolvio en CH2Cl2 (200 ml) y se anadio agua (120 ml). La mezcla se vertio en un embudo de separacion y se extrajo con HCl 0.2N (2 x 100 ml), carbonato de sodio 0.1N (2 x 50 ml) y agua (1 x 100 ml). La fase organica se seco sobre sulfato de sodio, se filtro y se evaporo a sequedad. El residuo se sometio a alto vacio para dar el intermedio (15.5 g) como un aceite viscoso. Este intermedio (486 mg, 1.1 mmol) se disolvio en etanol (EtOH) (30 ml) que contenia Pd al 10% sobre carbono (400 mg). La mezcla se burbujeo con nitrogeno durante 20 minutos para eliminar el oxigeno de la solucion. A esta solucion se anadio borohidruro de sodio (400 mg) bajo nitrogeno y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se anadio gota a gota HCl (1N, 1 ml) a la mezcla (Precaucion: se formo hidrogeno a partir de la reaccion) en atmosfera de nitrogeno (10 minutos). La mezcla se agito durante 30 minutos. Se anadio 1 ml adicional de HCl (1N) a la mezcla, que se agito durante 30 minutos adicionales, seguido de una adicion mas de 1 ml de HCl (1N). La mezcla se agito durante 120 minutos y se burbujeo con nitrogeno durante 10 minutos. El etanol se filtro con celite y el celite se lavo con etanol (2 x 10 ml). El etanol combinado se concentro a sequedad y el residuo se purifico por cromatografia instantanea en columna (gel de silice) usando MeOH/CH2Cl2 (1/9) para dar el producto deseado (24) (264 mg).
Preparación del compuesto (25). Vease la Figura 20. A una solucion de 24 (88 mg, 0.23 mmol) en THF (10 ml) se agrego Et3N (0.3 mL) y sulfo-NHS-LC-biotina (15) (260 mg, 0.467 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 5 horas. Se anadio a la mezcla sulfo-NHS-LC-biotina adicional (125 mg, 0.224 mmol) y Et3N (0.15 ml). La mezcla se agito durante 5 horas adicionales. La mayor parte del THF se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida. El residuo se disolvio en MeOH/CH2Cl2 (1/9) (0.3 ml) y la solucion se aplico a una placa de THC preparativa (Analtech, numero de catalogo: 02015, gel de silice, 2000 pm). La TLC se desarrollo en un disolvente mixto (MeOH/CH2Cl2 = 2/8) y la banda principal se recogio y se extrajo con (MeOH/CH2Cl2 = 3/7) (50 ml). El disolvente se evaporo a sequedad y el residuo se puso en alto vacio para dar el producto deseado (25) (39 mg).
Preparación del compuesto (26). Vease la Figura 20. A una solucion del compuesto (25) (39 mg, 0.0367 mmol) en CH2Cl2 (2 ml) se anadio acido trifluoroacetico (TFA) (1.5 mL). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 20 minutos. El analisis por TLC de la reaccion mostro que el material de partida (25) desaparecio y se mostro una nueva mancha mas polar (gel de silice, acetato de etilo). La mayor parte del CH2CL y TFA se eliminaron por evaporacion rotatoria a presion reducida. El residuo se puso en 20 ml de hexano y 15 ml de CH2CL. El disolvente se evaporo a sequedad nuevamente para eliminar un rastro de TFA y el residuo se puso a alto vacio durante 2 horas. Esto dio el producto deseado (26) usado para la siguiente reaccion sin purificacion adicional.
Preparación del intermedio CsA (28). Vease la Figura 21. A una solucion del compuesto (27) (240 mg, 0.1819 mmol) en tolueno (3 mL) se anadio etoxido de tributilestano (112 mg, 0.112 ml, 0.0969 mmol) bajo nitrogeno. La reaccion se agito a temperatura ambiente durante 5 minutos. A esta solucion se anadio isocianatoacetato de etilo (73 pL, 84 mg, 0.652 mmol). La reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. El analisis por TLC de la reaccion mostro que el material de partida (27) desaparecio y se mostro una nueva mancha menos polar (gel de silice, MeOH/acetato de etilo = 3/97). Se anadio agua (10 ml) y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 30 ml). La fase organica combinada se lavo con agua (30 ml) y salmuera (30 ml), se seco sobre Na2SO4, se filtro y se evaporo a sequedad. El residuo se purifico por cromatografia instantanea en columna (gel de silice) usando MeOH/acetato de etilo (3/97) para dar el producto deseado (28) (224 mg).
Preparación de intermedio CsA (29). Vease la Figura 21. A una solucion del compuesto (28) (112 mg, 0.0774 mmol) en MeOH (6.0 ml) y H2O (0.5 ml) se agrego K2CO3 (140 mg, 1.01 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 16 horas. Se anadio agua (10 ml) y se anadio HCl (1N) a la mezcla para ajustar el pH a 1. La mezcla de reaccion se agito durante 10 minutos. La fase acuosa se extrajo con CH2Cl2 (3 x 30 ml). La fase organica combinada se lavo con salmuera/agua (1/1) (50 ml). La fase organica se seco sobre Na2SO4, se filtro y se evaporo a sequedad. El residuo se puso a alto vacio durante 16 horas. El residuo se disolvio en CH2Cl2/MeOH (2/8) (0.5 ml) y la solucion se aplico a una placa de THC preparativa (Analtech, numero de catalogo: 02015, gel de silice, 2000 pm). La TLC se desarrollo en un disolvente mixto (MeOH/CH2Cl2 = 1/9) y la banda principal se recogio y se extrajo con (MeOH/CH2Cl2 = 3/7) (50 ml). El disolvente se evaporo a sequedad y el residuo se puso en alto vacio bajo P2O5 durante 16 horas para dar el producto deseado (29) (55.6 mg).
Preparación de CsA-Bis-Biotina (31). Veanse las figuras 21 -22. A una solucion del compuesto (29) (55.6 mg, 0.04125 mmol) en THF (5 mL) se anadio DCC (20 mg, 0.0969 mmol) y NHS ester (15 mg, 0.13 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente bajo argon durante 6 horas. El analisis por TLC de la mezcla mostro que se mostraba una mancha menos polar en comparacion con el compuesto (29) (MeOH/CH2Cl2 = 1/9). El precipitado de la reaccion se separo por filtracion y se lavo con THF anhidro (3 ml). La fase organica combinada se evaporo a sequedad para dar el hapteno activado (30), que se disolvio en DMF (1 ml) para la siguiente reaccion.
El Compuesto (26) (Figura 20) se disolvio en DMF (5 ml) y Et3N (0.1 ml). A esta solucion se anadio el hapteno activado (30) en solucion DMF (1 mL). La reaccion se agito a temperatura ambiente durante 4 horas. La mayor parte del DMF se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida. El residuo se sometio a alto vacio durante 2 horas para dar el producto crudo (31). El producto crudo se disolvio en 0.3 ml de MeOH/CH2Cl2 (1/9) y la solucion se aplico a dos placas de THC preparativas (Analtech, numero de catalogo: 02015, gel de silice, 2000 pm). La TLC se desarrollo utilizando un disolvente mixto (MeOH/CH2Cl2 = 1/9) y la banda principal se recogio de dos placas de TLC y se extrajo con (MeOH/CH2Cl2 = 2/8) (50 ml). El disolvente se evaporo a sequedad y el residuo se puso en alto vacio para dar el producto deseado (31) (54 mg).
Preparación de perlas sensibilizadoras preformadas con CsA-bis-biotina (34). CsA-Bis-Biotina (31) (1.15 mg) se disolvio en MeOH (0.2 ml) y se anadio en un regulador (49.8 ml, HEPES 50 mM, NaCl 300 mM, EDtA 1 mM, bSa 1 mg/ml, TX-405 al 0.1%)., Proclin 300 al 0.15%, 0.1 mg/ml de sulfato de neomicina, pH = 8.0). Esto hace 50 ml de 10 pM de solucion de CsA-Bis-Biotina. A 5 ml de perlas sensibilizadoras recubiertas con estreptavidina (SA) (veanse las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,153,442; 7022529; 7229842) (1 mg/ml, carga total de SA: 3.94 nmoles) se anadio solucion de CsA-bis-biotina. (49.3 pl, 10 pM, 0.493 nmoles). La relacion molar de SA a CsA-Bis-Biotina fue de 1:0.125. La perla sensibilizadora preformada se incubo a temperatura ambiente en una cabina evitando la luz del dia durante 1 hora. La perla se diluyo en un volumen total de 10 ml con el mismo regulador para tener una suspension de perlas de 0.5 mg/ml. Las perlas se almacenaron a 4°C. Este procedimiento se uso para preparar diferentes relaciones molares de SA a perlas sensibilizadoras preformadas con csA-bis-biotina (34) para su evaluacion.
Estudios de estabilidad
Comparacion de la estabilidad hidratada de las tabletas de cromo preformadas con la de la rapamicina-DA10-Dexalcromo en un periodo de 64 horas. El cartucho de reactivos DIMENSION® FLEX® para el ensayo ACMIA sirolimus contenia cuatro reactivos en pozos separados, 2.5 mL de reactivo de pretratamiento (R1), 1.8 mL de anticuerpo antisirolimus (conjugado de p-galactosidasa (R2), cuatro tabletas preformadas o rapamicina-DA10 de Dexal-cromo hidratadas con 1.9 mL de agua (R3) usando una sonda de ultrasonido y 1.8 mL de solucion de CPRG (R4). Cada prueba individual consumio 70 pL de R1,50 pL de R2, 50 pL de R3 (cromo) y se disenaron 155 pl de R4 y la cantidad de reactivo en cada pozo para 10 pruebas. El volumen adicional de reactivo en cada pozo proporciono el volumen muerto y tambien regulo el cambio de concentracion debido a la condensacion y la evaporacion despues de que los pozos fueron perforados por la sonda de reactivo (se abrieron bien) y las tabletas se hidrataron. Se empleo un protocolo de agotamiento lineal para realizar los estudios de estabilidad del cromo hidratado. En este protocolo, se utilizaron seis de las diez pruebas en cada pozo para generar los resultados de referencia en la hora 0 utilizando un material de control de calidad. (sangre entera QC nivel 2 de More Diagnostics Inc., Los Osos CA). Despues de que los pozos de reactivo se perforaron y las tabletas de cromo se hidrataron durante 64 horas, se utilizaron los ensayos sobrantes para medir la concentracion de sirolimus en el material de control de calidad. El cartucho de reactivos FLEX® que contiene las tabletas de cromo preformadas comparte los mismos otros reactivos que el que contiene las tabletas de rapamicina-DA10-Dexal-cromo. La Tabla 1 resume una comparacion de las recuperaciones de CC usando el cromo preformado en comparacion con el uso de la rapamicina-DA10-Dexal-cromo.
Tabla 1
Comparacion de la estabilidad hidratada Recuperacion de QC de CrO2 predecorado versus rapamicina-DA10-dexal-CrO2
Tabletas de CrO2 ng/mL Hora 0 ng/mL Hora 64 A
Tabletas PD CrO2 1967-88 11.3 10.9 -0.4
Rapamicina-DA10-Dexal-CrO2 Lote A 11.3 14.2 2.9
Rapamicina-DA10-Dexal-CrO2 Lote B 11.3 14.1 2.8
Los resultados en la tabla anterior demuestran que el cromo preformado hidratado era mas estable que la rapamicina-DA10-cromo hidratada.
Estudio de siete dias de la estabilidad hidratada de las tabletas de cromo preformadas en el analizador DIMENSION® VISTA®. El ensayo de sirolimus DIMENSION® VISTA® empleo el mismo formato y principio que el utilizado en los modulos DIMENSION® RxL HM como se describio anteriormente. El principio y el funcionamiento del metodo de sirolimus en el analizador DIMENSION® VISTA® fueron los siguientes: 32 pL de reactivo de pretratamiento que contiene los surfactantes y se agrego un compuesto de carbamato FK506 al recipiente de reaccion en el instrumento de quimica DIMENSION® RxL/HM. A continuacion, se anadieron 8.5 pL de sangre entera que contenia sirolimus. Se tomo una muestra de la sangre entera de una taza estandar mezclando primero la sangre dispuesta. La mezcla de la muestra de sangre entera con la solucion de pretratamiento que contiene los surfactantes y el compuesto de carbamato FK506 aseguro la lisis de la sangre entera y el desplazamiento de las moleculas de sirolimus unidas a proteinas de sus sitios de union por las moleculas de carbamato de sirolimus. A continuacion, se anadio conjugado de anticuerpo anti-sirolimus-p-galactosidasa (21.5 pL) y se dejo reaccionar con sirolimus en la muestra. Dos tabletas secas de 30 mg, cada una con 2.5 mg de particulas de cromo parcialmente preformadas descritas anteriormente, 8% (p/p) de trehalosa y 84% (p/p) carbowax (polietilenglicol 8000), se hidrataron con 950 pL de agua dispuesta con una sonda reactiva ultrasonica. Luego, se agregaron 21.5 pL de las particulas de cromo hidratadas a la mezcla de reaccion y se dejo que se uniera al conjugado no reaccionado. El conjugado de anticuerpo anti-sirolimus-p-galactosidasa unido a sirolimus no se unio al cromo, sino que permanecio en el sobrenadante cuando se aplico un campo magnetico a la mezcla de reaccion anterior para separar la solucion de las particulas de cromo. El conjugado unido a sirolimus se detecto transfiriendo el sobrenadante del recipiente de reaccion a una cubeta fotometrica y midiendo la velocidad enzimatica del conjugado en presencia de CPRG. La velocidad se midio bicromaticamente a 577 y 700 nm.
El cartucho de reactivos DIMENSION® VISTA® FLEX® para el ensayo ACMIA sirolimus contenia cuatro reactivos en pozos separados, 830 pL de reactivo de pretratamiento (R1), 720 pL de conjugado de anticuerpo anti-sirolimus-pgalactosidasa (R2) o tabletas de cromo directamente enlazadas hidratadas con 950 pL de agua (R3) usando una sonda de ultrasonido y 1350 pL de solucion de CPRG (R4). Cada prueba individual consumio 32 pL de R1, 21.5 pL de R2, 21.5 pL de R3 (cromo) y 60.5 pL de R4 y la cantidad de reactivo en cada pozo se diseno para 10 pruebas. El volumen de reactivo adicional en cada pozo es para proporcionar el volumen muerto y regular el cambio de concentracion debido a la condensacion y la evaporacion despues de que los pozos se perforen con la sonda de reactivo (se abre bien) y las tabletas se hidraten. Se empleo un protocolo de agotamiento lineal para realizar los estudios de estabilidad de cromo hidratado. En este protocolo, se utilizaron dos muestras de sangre entera humana que contenian aproximadamente 6 y 18 ng/mL de sirolimus como muestras de prueba. Las pruebas en cada pozo que contenia cromo preformado hidratado se agotaron linealmente el dia 0 (3 pruebas), el dia 5 (2 pruebas) y el dia 7 (3 pruebas). La Tabla 2 muestra las recuperaciones estables de los dos grupos de sangre total durante el periodo de 7 dias.
Tabla 2
Estabilidad hidratada del CrO2 preformado en el analizador DIMENSION® VISTA®
Dia/ng/mL Dia 0 Dia 5 Dia 7
Acumulado 1 5.9 5.4 5.6
Acumulado 2 17.2 17.0 17.7 Los resultados en la tabla anterior demuestran una buena estabilidad hidratada para el cromo preformado durante un periodo de 7 dias.
Ensayos
Los siguientes ensayos se realizaron usando reactivos como se describio anteriormente.
Ensayo de sirolimus. La medicion de sirolimus se llevo a cabo utilizando el formato de ensayo conocido como ACMIA. El principio y el funcionamiento del metodo de ensayo de sirolimus fueron los siguientes: se agregaron 70 pl de reactivo de pretratamiento que contiene los surfactantes y un compuesto de carbamato FK506 al recipiente de reaccion en el instrumento de quimica DIMENSION® RxL/HM con modulo HM. A continuacion, se anadieron 18 pL de sangre entera que contenia sirolimus. Se tomo una muestra de sangre entera de una taza estandar mezclando primero la sangre con la sonda de muestra ultrasonica. La mezcla de la muestra de sangre entera con la solucion de pretratamiento que contiene surfactantes y el compuesto de carbamato FK506 aseguro la lisis de la sangre entera y el desplazamiento de las moleculas de sirolimus unidas a proteinas de sus sitios de union por las moleculas de carbamato de sirolimus. A continuacion, se agrega conjugado de anticuerpo anti-sirolimus-p-galactosidasa (50 pL) y se deja reaccionar con sirolimus en la muestra. Cuatro tabletas secas de 30 mg de CrO2 preparadas como se describio anteriormente, cada una de las cuales contenia 2.5 mg de particulas de cromo preformadas parcialmente o las particulas de rapamicina-DA10-Dexal-cromo como se describio anteriormente, 8% (p/p) de trehalosa y 84% (p/p) carbowax (polietilenglicol 8000), se hidrataron con 1900 pL de agua a bordo con una sonda de reactivo ultrasonico. Luego, se agregaron cincuenta pL de las particulas de cromo hidratadas a la mezcla de reaccion y se dejo que se uniera al conjugado no reaccionado. El conjugado de anticuerpo anti-sirolimus-p-galactosidasa unido a sirolimus no se unio al cromo, sino que permanecio en el sobrenadante cuando se aplico un campo magnetico a la mezcla de reaccion anterior para separar la solucion de las particulas de cromo. El conjugado unido a sirolimus se detecto transfiriendo el sobrenadante del recipiente de reaccion a una cubeta fotometrica y midiendo la velocidad enzimatica del conjugado en presencia de rojo de clorofenol-p-D-galactopiranosido (CPRG). La velocidad se midio bicromaticamente a 577 y 700 nm. En la Figura 14 se muestra una curva estandar tipica para el ensayo DIMENSION® sirolimus.
Ensayo de ciclosporina A. En esta realizacion, se determino la cantidad de CsA en un medio sospechoso de contener CsA. Se proporciono una combinacion en un medio en donde la combinacion comprende (i) la muestra, (ii) un reactivo preformado que comprende un fotosensibilizador asociado con una primera particula y que es capaz de generar oxigeno singlete en donde la primera particula comprende un asociado de union a biotina unido a biotina como parte de un conjugado de ciclosporina A y biotina, y (iii) una composicion quimioluminiscente activable por oxigeno singlete y asociada con una segunda particula en donde la segunda particula comprende un anticuerpo para ciclosporina A. La combinacion se sometio a condiciones para la union de ciclosporina A al anticuerpo para la ciclosporina A. El fotosensibilizador se irradio con luz y se detecto la cantidad de luminiscencia generada por la composicion quimioluminiscente, relacionandose la cantidad de luminiscencia con la cantidad de ciclosporina A en la muestra.
Para el ensayo de ciclosporina A anterior, se emplearon los siguientes reactivos analizados anteriormente: perlas de fotosensibilizador de CsA-bis-biotina-estreptavidina como reactivo preformado (34) y Mab-Chemibeads anti-CsA (19). Las muestras fueron calibradores 1-5 como se discutio anteriormente. Los reactivos y las muestras apropiados se agregaron a un recipiente de reaccion del analizador DIMENSION RxL de la siguiente manera: en el recipiente de reaccion, se agregaron 20 pL de anti-CSA (2G4) Mab-Chemibeads seguido de 20 pL de diluyente (HEPES 50 mM pH 7.2, NaCl 300 mM, EDTA 1 mM, 1 mg/ml de Dextrano T-500, TRITON x-405 al 0.1%, Proclin 300 al 0.15%, neomicina al 0.1%) seguido de 15 pL de agua. Luego, se agregaron 10 pL de muestra seguido de 15 pL de agua. La combinacion se incubo durante 219 segundos y se agregaron 20 pl de perlas de fotosensibilizador de CsA-bis-biotina-estreptavidina (31) seguidas de 150 pL de agua. La combinacion se incubo durante 366 segundos o 713 segundos a una temperatura de 37°C. Luego, la combinacion se irradio con luz a 680 nM durante un periodo de 0.2 a 1 segundo y la senal (en los recuentos de fotones denominada senal LOCI en las tablas a continuacion) se leyo utilizando un lector (Perkin-Elmer CPM Detector). Los resultados se resumen a continuacion en la Tabla 3 y en la Figura 15.
Tabla 3
Perlas de CsA-bis-biotina-estreptavidina-fotosensibilizador (34)
Calibrador Senal LOCI
0.00 234
80.00 123
180.00 71
Perlas de CsA-bis-biotina-estreptavidina-fotosensibilizador (34)
Calibrador Senal LOCI
330.00 48
500.00 36
Como se puede ver en los datos anteriores, la cantidad de senal y una diferencia suficiente entre la senal para el calibrador 1 (0.00 ng/mL CsA) y el calibrador 2 (80.00 ng/mL CsA) se obtienen con el reactivo preformado. Esto da como resultado una buena sensibilidad en el rango de decision medica como se discutio anteriormente.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un reactivo de ensayo seco, comprendiendo dicho reactivo un soporte solido en particulas y una o mas moleculas de un receptor inmovilizado en el soporte solido en particulas, en donde el receptor comprende de 2 a 7 sitios de union para un ligando y en donde una porcion de un numero total de los sitios de union esta unida a un conjugado que comprende el ligando unido covalentemente a un miembro del par de union especifico (sbp) y una parte del numero total de los sitios de union esta libre para capturar el conjugado miembro-ligando sbp no especificamente unido al soporte solido y/o disociado del soporte solido, en donde la relacion molar del numero total de sitios de union del receptor al numero de moleculas de ligando es de 1.5 a 4 y en donde el miembro del par de union especifico es un asociado de union para un analito o un analogo de analito.
2. El reactivo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el receptor es un receptor para una molecula pequena.
3. El reactivo de acuerdo con la reivindicacion 2, en donde la molecula pequena es biotina, dinitrofenol, digoxigenina, fluoresceina, una hormona o una cadena de acido nucleico monocatenario.
4. El reactivo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicho reactivo comprende una o mas moleculas de un asociado de union a biotina inmovilizado en el soporte solido en particulas, en donde una porcion de un numero total de sitios de enlace del asociado de enlace de biotina esta unida a un conjugado que comprende biotina unida covalentemente a un miembro de par de union especifico y una porcion del numero total de sitios de union es libre, en donde la relacion molar del numero total de sitios de union del asociado de union a biotina al numero de moleculas de biotina es 1.5 a 4 y en donde el miembro de par de union especifico es un asociado de union para un analito o un analogo de analito.
5. El reactivo segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 4, en donde la particula es una particula magnetica.
6. El reactivo de acuerdo con la reivindicacion 4, en donde el asociado de union a biotina es estreptavidina.
7. Un metodo para determinar la presencia y/o la cantidad de un analito en una muestra sospechosa de contener el analito, comprendiendo el metodo:
(a) proporcionar en combinacion en un medio acuoso la muestra y los reactivos para detectar el analito, en donde al menos uno de los reactivos comprende el reactivo de ensayo seco de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 4, en donde el miembro de par de union especifica es un asociado de union para el analito o un analogo de analito,
(b) incubar la combinacion en condiciones para la union del analito a uno o mas de los reactivos, y
(c) detectar la presencia y/o cantidad de union del analito a uno o mas de los reactivos, estando la presencia y/o cantidad de la union relacionada con la presencia y/o cantidad del analito en la muestra.
8. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 7, en donde el miembro de par de union especifico es un analogo de analito.
9. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 7, en donde el miembro de par de union especifico es un anticuerpo para el analito.
10. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 8, en donde los reactivos incluyen un conjugado que comprende un anticuerpo para el analito unido a una enzima.
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