ES2350637T3 - Ensayos para anfetamina y metanfetamina. - Google Patents
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Abstract
Compuesto de fórmula: **(Ver fórmula)** en la que: R1 es hidrógeno o un grupo protector, R2 es hidrógeno, alquilo inferior o un grupo protector, L1 es un grupo conector, Y1 es un enlace, un grupo funcional o un grupo conector y se une a L1 en un punto equidistante entre el punto de unión a cada uno de los grupos fenilo, Z1 es un poli(aminoácido), un marcador distinto de poli(aminoácido) o un grupo funcional; y t' es 1 cuando Z1 es un grupo funcional o un marcador distinto de poli(aminoácido) o, cuando Z1 es un poli(aminoácido), t' es un número entero entre 1 y el peso molecular de un poli(aminoácido) dividido entre aproximadamente 500; y sales del mismo.
Description
Ensayos para anfetamina y metanfetamina.
Esta invención se refiere a métodos,
composiciones y kits para detectar la presencia y/o las cantidades
de anfetamina y/o metanfetamina en muestras que se sospecha que
contienen las mismas. En particular, la invención se refiere a
conjugados de haptenos bivalentes que comprenden un resto de
anfetamina y un resto de metanfetamina. El conjugado puede
emplearse en ensayos para anfetamina y/o metanfetamina.
El campo del diagnóstico clínico ha presenciado
una gran expansión en los últimos años, tanto en cuanto a la
variedad de materiales de interés que pueden determinarse de manera
fácil y precisa, así como en los métodos para la determinación.
Durante la última década, se han convertido en habituales las
pruebas para detectar drogas. Estas pruebas no sólo son para la
monitorización de delincuentes y drogadictos, sino también las usan
los empleadores para examinar a sus trabajadores. En los últimos
años, se han investigado exhaustivamente inmunoensayos basados en
la reacción de un anticuerpo con un antígeno para este fin.
Normalmente, los inmunoensayos emplean un
anticuerpo cuya estructura reconoce un analito de una manera
específica. El inmunoensayo se realiza con sistema productor de
señales que produce un cambio detectable en la señal tras la unión
del analito al anticuerpo. Por consiguiente, cuando se somete a
prueba un analito en una muestra, se toma como un resultado
positivo para determinar la presencia del analito en la muestra un
cambio detectable en la señal con respecto a la que se produjo con
una muestra negativa de un calibrador.
La anfetamina y metanfetamina estimulan el
sistema nervioso central y se han usado en medicina para tratar la
hipotensión, la narcolepsia y la obesidad. Debido a sus efectos
estimulantes, se ha abusado de los fármacos y derivados. Como
resultado, los ensayos para la detección de anfetamina y/o
metanfetamina en muestras son de interés.
Existe un problema cuando se emplean las
técnicas de ensayo mencionadas anteriormente para someter a ensayo
anfetaminas en una muestra que se sospecha que contiene anfetamina
y/o metanfetamina. El problema surge porque estos ensayos emplean
un único antisuero o anticuerpo que puede reconocer tanto anfetamina
como metanfetamina. Con el fin de que este anticuerpo reconozca
tanto anfetamina como metanfetamina, es necesario que éste pueda
reconocer una organización espacial y polar particular común para
anfetamina y metanfetamina y que carezca de reconocimiento
específico para aquellas características estructurales de anfetamina
y metanfetamina que sean diferentes. Dado que un anticuerpo de este
tipo reconoce características estructurales que son comunes para
estos dos compuestos pero carece de reconocimiento específico de las
características estructurales que son diferentes, puede reconocer
ambos compuestos y el ensayo producirá y un resultado positivo para
una muestra que contiene anfetamina y/o metanfetamina. Sin embargo,
se ha encontrado que los anticuerpos que reconocen ambos compuestos
reconocen moléculas distintas de anfetamina y metanfetamina que
comparten algunas pero no todas las características espaciales y
polares comunes de anfetamina y metanfetamina.
El problema anterior se resolvió en las patentes
estadounidenses n.º^{s} 5.135.863 y 5.328.828 (Hu, et
al.), que dan a conocer un inmunoensayo para determinar la
presencia de anfetaminas en una muestra que se sospecha que
contiene anfetamina y/o metanfetamina empleando cuatro reactivos
primarios. Dos de estos reactivos son dos conjugados, cada uno
compuesto de un marcador funcionalmente similar unido a un análogo
de anfetamina y un análogo de metanfetamina, respectivamente. Los
otros dos reactivos son un anticuerpo contra anfetamina y un
anticuerpo contra metanfetamina.
Sin embargo, existe una necesidad de ensayos
para la detección de anfetamina y/o metanfetamina en los que el
número de reactivos empleados se reduzca con respecto al mencionado
anteriormente y que el ensayo mantenga el mismo nivel de
sensibilidad, especificidad, velocidad y precisión que el ensayo
dado a conocer en las patentes estadounidenses n.º^{s} 5.135.863
y 5.328.828 que utiliza cuatro reactivos.
\newpage
Una realización de la presente invención es un
compuesto de fórmula:
en la
que:
R_{1} es hidrógeno o un grupo protector,
R_{2} es hidrógeno, alquilo inferior o un
grupo protector,
L_{1} es un grupo conector,
Y_{1} es un enlace, un grupo funcional o un
grupo conector y se une a L_{1} en un punto equidistante entre el
punto de unión a cada uno de los grupos fenilo,
Z_{1} es un poli(aminoácido), un
marcador distinto de poli(aminoácido) o un grupo funcional;
y
t' es 1 cuando Z_{1} es un grupo funcional o
un marcador distinto de poli(aminoácido) o, cuando Z_{1}
es un poli(aminoácido), t' es un número entero entre 1 y el
peso molecular de un poli(aminoácido) dividido entre
aproximadamente 500;
y sales del mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
Otra realización de la presente invención es un
compuesto de fórmula:
en la
que:
R_{1} y R_{2} son independientemente H o un
grupo protector,
X y X' son independientemente O, S o un
enlace;
D y D' son independientemente alquileno o
alquileno sustituido;
V y V' son independientemente O, S o un
enlace;
W es CH;
Y es NR_{3} en el que R_{3} es H o alquilo
inferior, O, S o un enlace;
T es alquileno, -(C=O)alquileno,
alquileno etéreo, acetamida o un enlace;
Y' es NR_{3} en el que R_{3} es H o alquilo
inferior, O, S o un enlace;
T' es alquileno, -(C=O)alquileno,
alquileno etéreo, acetamida o un enlace; y
Z' es un poli(aminoácido), un resto de
marcador distinto de poli(aminoácido), H, Br, Cl, F, I,
NH_{2}, acetamida, haloacetamida;
t'' es 1 cuando Z' es un grupo funcional o un
marcador distinto de poli(aminoácido) o, cuando Z' es un
poli(aminoácido), t'' es un número entero entre 1 y el peso
molecular de un poli(aminoácido) dividido entre
aproximadamente 500;
con la condición de que X y X' tienen
aproximadamente la misma longitud, D y D' tienen aproximadamente la
misma longitud y V y V' tienen aproximadamente la misma
longitud;
y sales del mismo.
Otra realización de la presente invención es un
compuesto de fórmula:
en la
que:
R_{1}' y R_{2}'son independientemente H o un
grupo protector,
X_{1}' y X_{1}'' son S u O;
Z'' es una enzima; H, Br, Cl, F, I, NH_{2},
acetamida, haloacetamida;
t''' es 1 cuando Z'' es distinto de una enzima
y, cuando Z'' es una enzima, t''' es un número entero entre 1 y el
peso molecular de la enzima dividido entre aproximadamente 500;
y
n, m, p, q, r y s son cada uno
independientemente de 0 a 5;
y sales del mismo.
Otra realización de la presente invención es un
compuesto de fórmula:
en la
que:
Z'' es una enzima; y
t''' es un número entero entre 1 y el peso
molecular de la enzima dividido entre aproximadamente 500.
Otra realización de la presente invención es un
sistema de reactivos que comprende un compuesto de fórmula V (en el
que el compuesto comprende un marcador enzimático), un anticuerpo
para anfetamina y un anticuerpo para metanfetamina.
Otra realización de la presente invención es un
método para determinar anfetamina y/o metanfetamina en una muestra
que se sospecha que contiene anfetamina y/o metanfetamina. Se
proporciona una combinación en un medio en el que la combinación
comprende la muestra y el sistema de reactivos mencionado
anteriormente. Se examina el medio para determinar la presencia de
un complejo que comprende el compuesto de fórmula V (en el que el
compuesto comprende un marcador enzimático) y el anticuerpo para
anfetamina y el anticuerpo para metanfetamina. La presencia de
tales complejos indica la presencia de la anfetamina y/o
metanfetamina en la muestra.
Otra realización de la presente invención es un
método para determinar anfetamina y/o metanfetamina en una muestra
que se sospecha que contiene anfetamina y/o metanfetamina. Se
proporciona una combinación en un medio en el que la combinación
comprende (i) la muestra, (ii) un anticuerpo para anfetamina, (iii)
un anticuerpo para metanfetamina y (iv) un compuesto de fórmula
III, que comprende una enzima y en el que R_{1}' y R_{2}' son
H. Se examina el medio para determinar la presencia de un complejo
que comprende el compuesto de fórmula III y el anticuerpo para
anfetamina o el anticuerpo para metanfetamina. En un enfoque, el
complejo se detecta por medio de la enzima. La presencia de tales
complejos indica la presencia de la anfetamina y/o metanfetamina en
la muestra.
Otra realización de la presente invención es un
método para determinar anfetamina y/o metanfetamina en una muestra
que se sospecha que contiene anfetamina y/o metanfetamina. Se
proporciona una combinación en un medio en el que la combinación
comprende (i) la muestra, (ii) un anticuerpo para anfetamina, (iii)
un anticuerpo para metanfetamina y (iv) un compuesto de fórmula IV,
que comprende una enzima y en el que R_{1}' y R_{2}' son H. Se
examina el medio, habitualmente determinando la actividad
enzimática, para determinar la presencia de un complejo que
comprende el compuesto y el anticuerpo para anfetamina o un complejo
que comprende el compuesto y el anticuerpo para metanfetamina. La
presencia de los complejos indica la presencia de la anfetamina y/o
metanfetamina en la muestra.
Otra realización de la presente invención es un
kit que comprende en combinación envasada (i) un anticuerpo para
anfetamina, (ii) un anticuerpo para metanfetamina, y (iii) un
compuesto de fórmula IV en el que el compuesto comprende una enzima
y R_{1}' y R_{2}' son H.
La figura 1 es un esquema de reacción que
representa un ejemplo de una síntesis de determinados compuestos
según la presente invención.
La figura 2 es un esquema de reacción que
representa un ejemplo de una síntesis de determinados compuestos
según la presente invención.
La figura 3 es un gráfico que representa la
inhibición del conjugado de hapteno bivalente enzimático por
anticuerpos contra anfetamina y metanfetamina.
La figura 4 es un gráfico que representa una
curva patrón para anfetamina con un conjugado de hapteno bivalente
enzimático según la presente invención.
La figura 5 es un gráfico que representa una
curva patrón para la detección de metanfetamina con un conjugado de
hapteno bivalente enzimático según la presente invención.
Figura 6 es un gráfico que representa los
resultados de la detección de anfetamina y metanfetamina en un
sistema de tres componentes.
La figura 7 es un esquema de reacción que
representa un ejemplo de una síntesis de determinados compuestos
usados en la síntesis de compuestos según la presente invención.
La figura 8 es un esquema de reacción que
representa un ejemplo de una síntesis de determinados compuestos
usados en la síntesis de compuestos según la presente invención.
La presente invención permite examinar de manera
eficaz muestras para determinar la presencia de una anfetamina o
una metanfetamina usando un menor número de reactivos que los
empleados en los métodos de las patentes estadounidenses n.º^{s}
5.135.863 y 5.328.828. Los métodos que utilizan los compuestos de la
invención logran sustancialmente el mismo nivel de sensibilidad,
especificidad, precisión y velocidad que el método conocido.
Las composiciones de ensayo que comprenden los
compuestos de esta invención son útiles en una amplia variedad de
métodos de ensayo empleados anteriormente tales como, por ejemplo,
métodos de inmunoensayo, tanto homogéneos como heterogéneos. Las
condiciones en las que se han llevado a cabo estos ensayos
normalmente podrán aplicarse a ensayos que emplean los presentes
compuestos. Por tanto, pueden usarse las composiciones en
inmunoensayos de la técnica anterior de modo que se proporcione un
medio para determinar la presencia de anfetamina y/o metanfetamina
en una muestra que se sospecha que contiene anfetamina y/o
metanfetamina. Mediante la elección apropiada de los componentes
para producir una señal detectable, puede observarse la señal
detectable de manera visual o por medio de diversos aparatos, es
decir, medios de detección, tales como espectrofotómetros,
fluorómetros, contadores de centelleo, etc.
La composición de ensayo incluye los presentes
compuestos que comprenden un marcador y también incluye reactivos
auxiliares necesarios para producir una señal a partir de los
presentes compuestos. Un reactivo clave en el sistema productor de
señales es un único conjugado que comprende un resto de anfetamina y
un resto de metanfetamina conectados entre sí y conectados además a
un marcador, o bien un poli(aminoácido) tal como una enzima o
bien un compuesto distinto de poli(aminoácido) tal como un
compuesto fluorescente. La elección del ensayo o protocolo de
ensayo determina habitualmente si un aumento o una disminución de la
cantidad de señal generada por el sistema productor de señales
determinan la cantidad de anfetaminas en la muestra de ensayo.
En la presente invención, se emplea un sistema
de reactivos de tres componentes según la reivindicación 7. Puede
usarse el sistema de reactivos en los métodos para detectar los
fármacos mencionados anteriormente en muestras que se sospecha que
contienen los fármacos. En los ensayos, las anfetaminas, es decir,
anfetamina y metanfetamina, que van a medirse son los analitos. En
general, un analito es un ligando y es un miembro de un par de
unión específico, que puede ser, por ejemplo, el ligando o el
analito y un anticuerpo correspondiente para el ligando o el
analito.
En la técnica se conocen bien tipos adecuados de
grupos protectores y se han descrito en detalle en numerosas
patentes y artículos en la bibliografía técnica. Véase, por ejemplo,
"Principles of Peptide Synthesis" (M. Bodanszky, Springer
Verlag, Berlín, Heidelberg, Nueva York, Tokio (1984). Tales grupos
protectores incluyen, a modo de ejemplo y sin limitación,
t-butoxicarbonilo (t-Boc),
fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), acetaminometilo (Acm),
trifenil-metilo (Trt), benciloxicarbonilo,
bifenilisopropiloxicarbonilo, 1-amiloxicarbonilo,
isobornil-oxicarbonilo,
alfa-dimetil-3,5-dimetoxibenciloxicarbonilo,
o-nitrofenilsulfenilo,
2-ciano-1,1-dimentil-etoxicarbonilo,
bromobenciloxilo, carbamilo, formilo, y similares.
En todas las realizaciones, el resto de
anfetamina y el resto de metanfetamina están conectados al primer
grupo conector de manera simétrica. En otras palabras, los dos
restos se conectan al primer grupo conector desde las mismas
posiciones correspondientes en los restos respectivos. De esta
manera, los restos se disponen en el conjugado bivalente de tal
manera que son esencialmente imágenes especulares entre sí excepto
por la presencia de un grupo metilo en el resto de metanfetamina,
en vez de hidrógeno, en el grupo amina. En todas las realizaciones,
los restos se conectan desde los grupos fenilo respectivos y, en
todas las realizaciones, desde las posiciones 3 en los grupos
fenilo respectivos. Para ensayos homogéneos, debe haber una
competencia suficiente entre los anticuerpos respectivos y el resto
de anfetamina y el resto de metanfetamina del conjugado, por un
lado, y la anfetamina y metanfetamina analito, por otro lado, para
producir un ensayo fiable.
Además, debe haber una inhibición suficiente del
marcador tal como un marcador enzimático para lograr un ensayo
preciso y sensible.
En todas las realizaciones, el resto de
anfetamina y el resto de metanfetamina son cada uno
estereoespecíficos. Mediante esto se quiere decir que el resto de
anfetamina y el resto de metanfetamina sean los estereroisómeros
respectivos que son fisiológicamente activos.
El primer grupo conector contiene una
funcionalidad para la conexión a un segundo grupo conector. El resto
de anfetamina y el resto de metanfetamina se disponen en el primer
grupo conector de modo que están separados sustancialmente por
igual de la funcionalidad para la conexión al segundo grupo
conector. En algunas realizaciones, los restos están separados por
igual. Por "separados sustancialmente por igual" quiere decir
que sólo es necesario que la separación sea suficiente de modo que
los restos en el conjugado de marcador bivalente posterior los
reconozcan sus anticuerpos respectivos en el grado necesario para
producir un ensayo preciso y sensible. Por tanto, en algunas
circunstancias la separación de la funcionalidad para la conexión al
segundo grupo conector no puede ser igual siempre que se logren los
anteriores criterios. De esta manera, la distancia del resto de
anfetamina y el resto de metanfetamina desde el punto de conexión
del segundo grupo conector al primer grupo conector es
"aproximadamente la misma". Para los presentes conjugados, la
separación es de aproximadamente 10 \ring{A} a aproximadamente 80
\ring{A}, de aproximadamente 10 \ring{A} a aproximadamente 70
\ring{A}, de aproximadamente 10 \ring{A} a aproximadamente 60
\ring{A}, de aproximadamente 10 \ring{A} a aproximadamente 50
\ring{A}, de aproximadamente 10 \ring{A} a aproximadamente 40
\ring{A}, de aproximadamente 10 \ring{A} a aproximadamente 30
\ring{A}, de aproximadamente 10 \ring{A} a aproximadamente 20
\ring{A}, de aproximadamente 12 \ring{A} a aproximadamente 18
\ring{A}, de aproximadamente 12 \ring{A} a aproximadamente 16
\ring{A}.
El primer grupo conector puede comprender de
aproximadamente 3 a aproximadamente 15 átomos, o de aproximadamente
3 a aproximadamente 10 átomos, sin contar el hidrógeno o la
funcionalidad para la conexión al segundo grupo conector.
Habitualmente, el primer grupo conector comprende una cadena de 3,
4, 5, 6, 7 u 8 o más átomos, por ejemplo, desde aproximadamente 3
hasta aproximadamente 8 átomos, desde aproximadamente 3 hasta
aproximadamente 7 átomos, desde aproximadamente 3 hasta
aproximadamente 6 átomos, desde aproximadamente 4 hasta
aproximadamente 8 átomos, seleccionados cada uno independientemente
del grupo que consiste normalmente en carbono, oxígeno, azufre,
nitrógeno, halógeno y fósforo, etc. La cadena comprende,
habitualmente, un átomo central, pero no necesariamente, un átomo
de carbono, al que se une la funcionalidad para la conexión al
segundo grupo conector. El número de heteroátomos en el primer
grupo conector, excluyendo la funcionalidad para la conexión al
segundo grupo conector, habitualmente oscila desde aproximadamente
0 hasta aproximadamente 6, habitualmente desde aproximadamente 2
hasta aproximadamente 5. Aunque no se requiere, las partes de los
grupos conectores que se encuentran a cada lado del átomo central
son, en algunas realizaciones, sustancialmente simétricas. En otras
palabras, los átomos que se extienden alejándose del átomo central
hacia el punto de unión del resto de anfetamina o metanfetamina son
los mismos para cada parte respectiva del primer grupo conector.
El primer grupo conector puede ser alifático o
aromático. Cuando están presentes heteroátomos, el oxígeno
habitualmente estará presente como oxo o éter unido a carbono; el
azufre habitualmente está presente como tioéter u otra
funcionalidad que corresponde a una funcionalidad de oxígeno
análoga; el nitrógeno habitualmente está presente como nitro,
nitroso o amino, normalmente unido a carbono; el fósforo
habitualmente está unido a carbono, azufre, oxígeno o nitrógeno,
habitualmente como mono o diéster de fosfonato y fosfato. Las
funcionalidades comunes en la formación de un enlace covalente
entre el grupo conector y la molécula que va a conjugarse,
concretamente, anfetamina y metanfetamina, incluyen alquilamina,
amidina, tioamida, éter, urea, tiourea, guanidina, azo, tioéter y
carboxilato, sulfonato, y ésteres de fosfato, amidas y
tioésteres.
Para la mayor parte, la funcionalidad para la
conexión al segundo grupo conector puede ser un grupo distinto de
oxocarbonilo incluyendo análogos de nitrógeno y azufre, un grupo
fosfato, un grupo amino, un grupo tiol, un grupo hidroxilo, un
agente alquilante tal como halo o tosilalquilo, oxi (hidroxilo o el
análogo de azufre, mercapto) oxocarbonilo (por ejemplo, aldehído o
cetona), u olefina activa tal como una vinilsulfona o éster
\alpha,\beta-insaturado, estas funcionalidades
se conectarán a los grupos amina, grupos carboxilo, olefinas
activas, agentes alquilantes, por ejemplo, bromoacetilo. Cuando se
conectan una amina y un ácido carboxílico o su derivado de
nitrógeno o ácido fosfórico, se formarán amidas, amidinas y
fosforamidas. Cuando se conectan mercaptano y olefina activada, se
formarán tioéteres. Cuando se conectan mercaptano y un agente
alquilante, se formarán tioéteres. Cuando se conectan aldehído y
una amina en condiciones reductoras, se formará una alquilamina.
Cuando se conectan un ácido carboxílico o ácido de fosfato y un
alcohol, se formarán ésteres. En la técnica se conocen bien
diversos grupos conectores y funcionalidades de conexión; véase, por
ejemplo, Cautrecasas, J. Biol. Chem. (1970) 245:3059.
Tal como se mencionó anteriormente, un segundo
grupo conector depende del primer grupo conector. El primer grupo
conector proporciona la unión de un resto que puede unirse tal como,
por ejemplo, un poli(aminoácido) o un marcador distinto de
poli(aminoácido), para formar un conjugado según la presente
invención. Por tanto, el segundo grupo conector contiene una
funcionalidad para la conexión a un resto que puede unirse. La
funcionalidad para la conexión al resto que puede unirse puede ser,
por ejemplo, cualquiera de los grupos mencionados anteriormente
para la funcionalidad para la conexión al segundo grupo conector,
tal como, por ejemplo, un grupo amina, un grupo carbonilo, un grupo
hidroxilo, un grupo tiol, grupo maleimida, haloacetamida y
similares.
El segundo grupo conector puede ser simplemente
un enlace a un resto que puede unirse. El segundo grupo conector
puede ser un resto de unión de carácter similar al primer grupo
conector. Una consideración importante para la naturaleza y
longitud del segundo grupo conector es que no interfiera con el
reconocimiento, por los anticuerpos respectivos, de los restos de
anfetamina y metanfetamina en el conjugado de marcador bivalente
hasta el grado de que no se obtenga un ensayo preciso y sensible.
El segundo grupo conector puede comprender de aproximadamente de 1
a aproximadamente 30 átomos, habitualmente, de aproximadamente 2 a
aproximadamente 25 átomos, de aproximadamente 2 a aproximadamente
20 átomos, de aproximadamente 4 a aproximadamente 15 átomos, de
aproximadamente 5 a aproximadamente 10 átomos, sin contar el
hidrógeno o una funcionalidad para la conexión a un resto que puede
unirse. El segundo grupo conector habitualmente comprende una
cadena de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 15 átomos,
desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 12 átomos, desde
aproximadamente 3 hasta aproximadamente 10 átomos, desde
aproximadamente 4 hasta aproximadamente 8 átomos seleccionados cada
uno independientemente del grupo que consiste normalmente en
carbono, oxígeno, azufre, nitrógeno, halógeno y fósforo, etc. La
funcionalidad para la conexión de un resto que puede unirse
habitualmente está en el extremo terminal de la cadena de átomos
aunque no es necesario. El número de heteroátomos en el segundo
grupo conector, excluyendo la funcionalidad para la conexión al
resto que puede unirse, habitualmente oscila desde aproximadamente 0
hasta 10, habitualmente desde aproximadamente 2 hasta
aproximadamente 8, desde aproximadamente 3 hasta aproximada-
mente 7.
mente 7.
También están incluidos en los compuestos
anteriores las sales de los mismos, particularmente, sales que
implican el grupo amina de la anfetamina y/o metanfetamina. En una
realización, las sales son sales de ácido, es decir, sales formadas
con ácidos tales como ácidos minerales, por ejemplo, ácido
clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fluorhídrico, ácido
yodhídrico, ácido fosfórico, y similares, ácidos orgánicos, por
ejemplo, ácido trifluoroacético, ácido tartárico, ácido acético,
etcétera.
Tal como se mencionó anteriormente, uno de los
restos que pueden unirse es un poli(aminoácido). Están
incluidos diversos tipos de proteínas dentro del término
"poli(aminoácido)", tanto naturales como sintéticas.
Estas proteínas incluyen, por ejemplo, enzimas, albúminas,
proteínas del suero, por ejemplo, globulinas, lipoproteínas, y
similares. El peso molecular de los poli(aminoácidos)
generalmente será de al menos aproximadamente 5.000 y no tendrá
límite superior, siendo normalmente inferior a 10.000.000, y no
siendo habitualmente superior a aproximadamente 600.000.
Habitualmente habrá diferentes intervalos dependiendo del tipo de
proteína implicada. Con las enzimas, el intervalo será de desde
aproximadamente 10.000 hasta 600.000, y más habitualmente desde
aproximadamente 10.000 hasta 300.000 de peso molecular. Con los
antígenos, el intervalo será de desde aproximadamente 5.000 hasta
10.000.000, habitualmente desde aproximadamente 20.000 hasta
600.000, y más habitualmente desde aproximadamente 25.000 hasta
250.000 de peso molecular. Habitualmente existe al menos
aproximadamente un grupo análogo de anfetamina y metanfetamina por
200.000 de peso molecular, al menos uno por 50.000 de peso
molecular, al menos uno por 30.000 de peso molecular. En el caso de
las enzimas, el número de grupos análogos de anfetamina y
metanfetamina habitualmente es de desde aproximadamente 1 hasta
aproximadamente 20, desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente
15, desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 12 o desde
aproximadamente 6 hasta aproximada-
mente 10.
mente 10.
Las enzimas de interés particular son las
enzimas redox, particularmente deshidrogenasas tales como
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
lactato deshidrogenasa, etc., y enzimas que implican la producción
de peróxido de hidrógeno y el uso del peróxido de hidrógeno para
oxidar un precursor de colorante para dar un colorante. Las
combinaciones particulares incluyen sacárido oxidasas, por ejemplo,
glucosa y galactosa oxidasa, u oxidasas heterocíclicas, tales como
uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea el
peróxido de hidrógeno para oxidar el precursor de colorante, es
decir, una peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante,
lactoperoxidasa o microperoxidasa. Cuando se usa una única enzima
como un marcador, otras enzimas pueden encontrar uso tales como
hidrolasas, transferasas y oxidorreductasas, preferiblemente
hidrolasas tales como fosfatasa alcalina y
beta-galactosidasa. Alternativamente, pueden usarse
las luciferasas tales como luciferasa de luciérnaga y luciferasa
bacteriana.
Las coenzimas ilustrativas que encuentran uso
incluyen NAD[H], NADP[H], fosfato de piridoxal,
FAD[H], FMN[H], etc., habitualmente coenzimas que
implican reacciones de ciclación. Véase, por ejemplo, la patente
estadounidense n.º 4.318.980.
La expresión "marcadores distintos de
poli(aminoácido)" no incluye marcadores enzimáticos. Un
marcador distinto de poli(aminoácido) puede ser un miembro
de un sistema productor de señales. El marcador distinto de
poli(aminoácido) puede detectarse directamente o puede
detectarse mediante una reacción de unión específica que produce una
señal detectable. Los marcadores distintos de
poli(aminoácido) generalmente son radioisotópicos,
luminiscentes, particulados, polinucleotídicos o similares. Más
particularmente, el marcador puede ser isotópico o no isotópico,
habitualmente no isotópico, y puede ser un polinucleótido que
codifica para un catalizador, promotor, colorante, molécula
fluorescente, molécula quimioluminiscente, coenzima, sustrato de
enzima, grupo radiactivo, una molécula orgánica pequeña, secuencia
de polinucleótido amplificable, una partícula tal como partícula de
carbón o látex, sol metálico, cristalita, liposoma, célula, etc.,
que puede estar o puede no estar marcado además con un colorante,
catalizador u otro grupo detectable, y similares.
El sistema productor de señales puede tener uno
o más componentes, siendo al menos un componente el marcador, ya
sea poli(aminoácido) o distinto de poli(aminoácido).
El sistema productor de señales genera una señal que se relaciona
con la presencia de una anfetamina y/o metanfetamina en una muestra.
El sistema productor de señales incluye todos los reactivos
requeridos para producir una señal medible. Pueden incluirse otros
componentes del sistema productor de señales en una disolución de
revelado y pueden incluir sustratos, potenciadores, activadores,
compuestos quimioluminiscentes, cofactores, inhibidores,
eliminadores, iones metálicos, sustancias de unión específica
requeridas para la unión de sustancias generadoras de señales, y
similares. Otros componentes del sistema productor de señales
pueden ser coenzimas, sustancias que reaccionan con productos
enzimáticos, otras enzimas y catalizadores, y similares. El sistema
productor de señales proporciona una señal detectable mediante
medios externos, mediante el uso de radiación electromagnética, de
manera deseable mediante examen visual. Sistemas productores de
señales a modo de ejemplo se describen en la patente estadounidense
n.º 5.508.178 (Rose, et al.).
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Tal como se mencionó anteriormente, un aspecto
de la presente invención se refiere a compuestos de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
R_{1} es hidrógeno, grupo protector;
R_{2} es hidrógeno, alquilo inferior, grupo
protector;
L_{1} es un grupo conector,
Y_{1} es un enlace, un grupo funcional o un
grupo conector y se une a L_{1} en un punto equidistante entre el
punto de unión a cada uno de los grupos fenilo,
Z_{1} es un resto de poli(aminoácido)
tal como, por ejemplo, una enzima, un resto de marcador distinto de
poli(aminoácido) o un grupo funcional; y
t'' es 1 cuando Z_{1} es un grupo funcional o
un resto de marcador distinto de poli(aminoácido) o, cuando
Z_{1} es un poli(aminoácido), t' es un número entero entre
1 y el peso molecular de un resto de poli(aminoácido)
dividido entre aproximadamente 500.
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También están incluidas dentro de la fórmula
anterior las sales de los compuestos anteriores.
Por la expresión "alquilo inferior" se
entiende un radical hidrocarbonado monovalente saturado ramificado
o no ramificado que contiene de 1 a 10, habitualmente, de 1 a 5,
átomos de carbono, tales como metilo, etilo, propilo, butilo y
pentilo, y que incluye las formas, normal, secundaria, terciaria y
similares de los mismos cuando sea apropiado.
Otra realización de la presente invención se
refiere a compuestos de fórmula:
en la
que:
R_{1} y R_{2} son independientemente H o un
grupo protector,
X y X' son independientemente O, S o un
enlace;
D y D' son independientemente alquileno o
alquileno sustituido;
V y V' son independientemente O, S o un
enlace;
W es CH;
Y es NR_{3} en el que R_{3} es H o alquilo
inferior, O, S, un enlace;
T es alquileno, -(C=O)alquileno,
alquileno etéreo, acetamida o un enlace;
Y' es NR_{3} en el que R_{3} es H o alquilo
inferior, O, S o un enlace;
T' es alquileno, -(C=O)alquileno,
alquileno etéreo, acetamida o un enlace; y
Z' es un poli(aminoácido), un resto de
marcador distinto de poli(aminoácido), H, halógeno (Br, Cl,
F, I), NH_{2}, acetamida, haloacetamida;
t'' es 1 cuando Z' es un grupo funcional o un
resto de marcador distinto de poli(aminoácido) o, cuando Z'
es un poli(aminoácido), t'' es un número entero entre 1 y el
peso molecular de un resto de poli(aminoácido) dividido
entre aproximadamente 500; con la condición de que X y X' tienen
aproximadamente la misma longitud, D y D' tienen aproximadamente la
misma longitud y V y V' tienen aproximadamente la misma
longitud;
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También están incluidas las sales de los
compuestos anteriores.
"Aproximadamente la misma longitud"
significa que las longitudes de los restos en cuestión son tales que
el resto de anfetamina y el resto de metanfetamina se disponen de
tal manera que están separados sustancialmente por igual, o
espaciados por igual. En una realización, los restos están separados
por igual.
"Alquileno" significa un radical de
hidrocarbonado divalente saturado ramificado o no ramificado que
contiene de 1 a 30 o más átomos de carbono, tales como metileno,
etileno, propileno, 2-metilpropileno,
1,2-dimetilpropileno, pentileno, y similares. El
término abarca alquileno inferior (de 1 a 10 átomos de carbono) y
alquileno superior (de 11 a 30 átomos de carbono).
"Alquileno etéreo" significa alquileno que
tiene de 1 a 10, de 1 a 9, de 1 a 8, de 1 a 7, de 1 a 6, de 1 a 5,
de 1 a 4, de 1 a 3, de 1 a 2, funciones éter en la cadena de
alquileno. Un ejemplo, a modo de ilustración y no de limitación, es
-[(CH_{2})_{a}-O-(CH_{2})_{a}]_{c}-
en el que a y b son independientemente de 1 a 5, de 2 a 4, de 1 a
3, de 1 a 2, ó 1, 2, 3, 4 ó 5 y en el que c es de 1 a 15, de 2 a 14,
de 3 a 13, de 4 a 12, de 5 a 11, de 6 a 10, de 7 a 9, ó 1, 2, 3, 4,
5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15, en particular,
-[(CH_{2})_{a}-O-(CH_{2})_{a}]_{c}-
en el que a y b son 2 y c es tal como se definió anteriormente.
"Haloacetamida" significa
-XCH_{2}-CO-NH_{c}- en el que X
es halógeno (bromo, cloro, flúor o yodo, habitualmente, bromo o
cloro).
"Sustituido" significa que se reemplaza un
átomo de hidrógeno de una molécula por otro átomo, que puede ser un
único átomo tal como un halógeno, o heteroátomo, o parte de un grupo
de átomos que forman, por ejemplo, grupos alquilo, grupos alquilo
sustituidos con heteroátomo, estructuras cíclicas o estructuras
heterocíclicas.
Otra realización de la presente invención es un
compuesto de fórmula:
en la
que:
R_{1}' y R_{2} son independientemente H, un
grupo protector,
X_{1}' y X_{1}'' son S u O;
Z'' es una enzima; H, Br, Cl, Fl, I, NH_{2},
acetamida, haloacetamida;
t''' es 1 cuando Z'' es distinto de una enzima
y, cuando Z'' es una enzima, t''' es un número entero entre 1 y el
peso molecular de la enzima dividido entre aproximadamente 500;
y
n, m, p, q, son cada uno independientemente de 1
a 5 y r y s son cada uno independientemente de 0 a 5.
La fórmula anterior también incluye sales de los
mismos.
Otra realización de la presente invención es un
compuesto de fórmula:
en la
que:
Z'' es una enzima; y
t''' es un número entero entre 1 y el peso
molecular de la enzima dividido entre aproximadamente 500.
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La síntesis de ejemplos representativos de los
compuestos anteriores se trata en el presente documento a modo de
ilustración y no de limitación. Se sugerirán otros procedimientos
sintéticos a los expertos en la técnica en vista de la descripción
del presente documento. Pueden prepararse otros compuestos dentro
del alcance de la presente invención usando variantes adecuadas de
los reactivos empleados a continuación.
Puede sintetizarse hapteno bivalente de
anfetamina-metanfetamina esteroespecífico conectado
a una enzima, por ejemplo, mediante los procedimientos explicados
resumidamente en la figura 1 y la figura 2. Se hace reaccionar el
derivado de anfetamina protegido (11) con el derivado de
metanfetamina protegido (18) en condiciones para el desplazamiento
del bromo del derivado (11) por el azufre del derivado (18) para dar
el compuesto bivalente (19). Estas condiciones generalmente son
condiciones básicas (pH de aproximadamente 8,0 a aproximadamente
14,0). Las bases adecuadas incluyen mono-, di-, y
tri-alquilaminas tales como, por ejemplo,
diisopropiletilamina, etilamina, dietilamina, trietilamina, y
similares. Habitualmente se lleva a cabo la reacción en un
disolvente orgánico tal como, por ejemplo, una cetona, por ejemplo,
acetona y similares, un éter orgánico, por ejemplo, etil éter,
tetrahidrofurano (THF), dioxano, y similares, un alcohol, por
ejemplo, metanol, etanol, propanol, y similares. La temperatura de
reacción habitualmente es de aproximadamente 0ºC a aproximadamente a
50ºC, más habitualmente, de aproximadamente 10ºC a aproximadamente
30ºC, preferiblemente, temperatura ambiente. Se lleva a cabo la
reacción durante un período de aproximadamente 10 minutos a
aproximadamente 3 horas o más, habitualmente, de aproximadamente 30
minutos a aproximadamente 60 minutos.
La funcionalidad ceto del compuesto (19) se
convierte por aminación reductora a una funcionalidad amina para
producir el compuesto (20). Se lleva a cabo la reacción en un
disolvente orgánico tal como alcohol acuoso. El reactivo adecuado
incluye acetato de amonio y similares. Puede emplearse un agente
reductor tal como un hidruro metálico, por ejemplo, NaBH_{3}CN y
similares. La temperatura de reacción habitualmente es de
aproximadamente 0ºC a aproximadamente 50ºC, más habitualmente, de
aproximadamente 10ºC a aproximadamente 30ºC, preferiblemente,
temperatura ambiente. Se lleva a cabo la reacción durante un periodo
de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 16 horas o más.
Para la preparación del compuesto (21), se hace
reaccionar el compuesto (20) con un éster activado de ácido
bromoacético, concretamente, el éster de
N-hidroxisuccinimida de ácido bromoacético en este
ejemplo, en condiciones básicas, que incluyen incorporar en la
mezcla de reacción una alquilamina tal como, por ejemplo,
diisopropiletilamina, etilamina, trietilamina, y similares. Se
lleva a cabo la reacción en un disolvente orgánico tal como, por
ejemplo, un éter, por ejemplo, THF, dioxano, dietil éter, etcétera.
Habitualmente se lleva a cabo la reacción a una temperatura de
aproximadamente 0ºC a aproximadamente 50ºC, más habitualmente, de
aproximadamente 10ºC a aproximadamente 30ºC, preferiblemente,
temperatura ambiente. Se lleva a cabo la reacción durante un periodo
de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 5 horas o más,
habitualmente, de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 3 horas
o más.
Puede eliminarse el grupo protector del
compuesto (21) en condiciones ácidas en un disolvente orgánico para
dar el compuesto (22). En el ejemplo representado, se trata el
compuesto (21) con ácido trifluoroacético (TFA) en cloruro de
metileno. En general, la eliminación del grupo protector depende de
la naturaleza del grupo protector. En la técnica se conocen bien
las condiciones adecuadas para la eliminación de grupos protectores
y no se tratarán en detalle en el presente documento.
También puede convertirse el compuesto (20) en
el compuesto (23) mediante la reacción con un éster activado de
bromoacetilglicina, concretamente, el éster de
N-hidroxisuccinimida en el ejemplo mostrado en la
figura 2. Se lleva a cabo la reacción en condiciones básicas con un
disolvente orgánico. Las condiciones básicas incluyen incorporar en
la mezcla de reacción una alquilamina tal como, por ejemplo,
diisopropiletilamina, etilamina, trietilamina, y similares. Se
lleva a cabo la reacción en un disolvente orgánico tal como, por
ejemplo, un éter, por ejemplo, THF, dioxano, dietil éter, etcétera.
Habitualmente se lleva a cabo la reacción a una temperatura de
aproximadamente 0ºC a aproximadamente 50ºC, más habitualmente, de
aproximadamente 10ºC a aproximadamente 30ºC, preferiblemente,
temperatura ambiente. El tiempo de reacción es un periodo de
aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 5 horas o más,
habitualmente, de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 3 horas
o más. Pueden eliminarse los grupos protectores del compuesto (23)
tal como se trató anteriormente para producir el compuesto
(24).
Puede purificarse cualquiera de los compuestos
tratados anteriormente mediante técnicas conocidas tales como, por
ejemplo, diálisis, cromatografía, HPLC, y combinaciones de las
mismas.
Pueden prepararse conjugados enzimáticos a
partir de los compuestos según la presente invención. En general,
los grupos funcionales adecuados para unir el compuesto a la enzima
habitualmente son un éster activado o un agente alquilante cuando
el/los aminoácido(s) que va(n) a conjugarse en la
enzima tienen grupos amino o hidroxilo y son habitualmente agentes
alquilantes o similares cuando el/los aminoácido(s) que
va(n) a conjugarse en la enzima compren-
de(n) un átomo de azufre tal como, por ejemplo, una cisteína. Está disponible un gran número de grupos funcionales adecuados para la unión a grupos amino y alcoholes tales como ésteres activados incluyendo ésteres imídicos, ésteres sulfónicos y ésteres de fosfato, nitritos activados, aldehídos, cetonas, agentes alquilantes y similares. En la técnica se conoce bien la conjugación de haptenos a proteínas usando estos y otros grupos de unión y se describe en revisiones tales como, por ejemplo, Maggio, E.T. "Enzyme-Inmunoassay" (CRC Press, Boca Ratón, Fla., 1980), capítulo 4, que contiene una variedad de técnicas de conjugación; cuyas páginas 81-88 se incorporan al presente documento como referencia.
de(n) un átomo de azufre tal como, por ejemplo, una cisteína. Está disponible un gran número de grupos funcionales adecuados para la unión a grupos amino y alcoholes tales como ésteres activados incluyendo ésteres imídicos, ésteres sulfónicos y ésteres de fosfato, nitritos activados, aldehídos, cetonas, agentes alquilantes y similares. En la técnica se conoce bien la conjugación de haptenos a proteínas usando estos y otros grupos de unión y se describe en revisiones tales como, por ejemplo, Maggio, E.T. "Enzyme-Inmunoassay" (CRC Press, Boca Ratón, Fla., 1980), capítulo 4, que contiene una variedad de técnicas de conjugación; cuyas páginas 81-88 se incorporan al presente documento como referencia.
Tras la reacción de la enzima con un compuesto
tal como se trató anteriormente para formar un conjugado, entonces
se purifica opcionalmente el producto tal como pueda requerirse. La
purificación y caracterización de conjugados de
poli(aminoácido)-hapteno se ha descrito en
detalle en Maggio, et al.;
"enzyme-inmunoassay" (CRC Press, Boca Ratón,
Fla., 1980), capítulo 4, cuyas páginas 86-88 se
incorporan al presente documento como referencia. Por ejemplo, si
el conjugado es un conjugado de G6PDH-hapteno
mutante, la purificación puede ser mediante diálisis frente a
disoluciones acuosas/orgánicas y acuosas tales como agua/DMF o agua,
o mediante cromatografía de filtración en gel sobre soportes tales
como Sephadex, y similares.
Tal como se mencionó anteriormente, la
conjugación puede implicar la unión de un hapteno a un grupo tiol
libre presente en una cadena lateral de aminoácido de la enzima
(por ejemplo, cisteína). Tal conjugación implica la alquilación del
átomo de azufre de tiol mediante el tratamiento con un compuesto
electrófilo tal como una alfa- o beta-amida
insaturada, cetona, éster, o similares, o un agente alquilante tal
como un haluro reactivo, por ejemplo, bromuro, o sulfonato o
similares o la reacción con un disulfuro activo tal como un
disulfuro de
2-nitro-4-carboxifenilo.
Los ejemplos específicos a modo de ilustración y no de limitación
incluyen alfa-bromoamidas, maleimidas,
vinilsulfonas, alfa-yodocetonas, y similares.
Varios factores pueden afectar a las reacciones
de conjugación con enzimas. Estos incluyen, pero no se limitan a,
pH, temperatura, tampón, fuerza iónica, sustancias que pueden
proteger el sitio activo de la enzima, cantidad y tipo de
codisolvente, tiempo de reacción y química de activación.
Habitualmente puede usarse un intervalo de valores de pH de desde
aproximadamente 5,0 hasta aproximadamente 9,5 para reacciones de
conjugación. Estas reacciones generalmente se llevan a cabo a de
aproximadamente 0 a aproximadamente 40ºC, preferiblemente de
aproximadamente 4 a aproximadamente 20ºC.
Pueden usarse varios tampones y sales, tanto
solos como en combinación, para tales reacciones. Estos incluyen
Tris, bicarbonato, fosfato, pirofosfato, EDTA, KCl, NaCl, y muchos
otros. Puede protegerse el sitio activo con sustratos (es decir
glucosa-6-fosfato para
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa),
cofactores (NAD^{+}, NADH, NADP^{+}, NADPH) y análogos de
cofactores (tio-NAD^{+}, tio-NADH,
tio-NADP^{+} o tio-NADPH), y
compuestos que reaccionan de manera reversible con lisina (es
decir, piridoxal) para reducir la desactivación de la enzima
durante la conjugación.
Los codisolventes que pueden potenciar la
solubilidad del hapteno incluyen, pero no se limitan a,
dimetilformamida, carbitol, dimetilsulfóxido,
1-metil-2-pirrolidinona
y
1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2(1H)-pirimidinona.
Estos pueden ser útiles de aproximadamente el 1 a aproximadamente
el 30% del volumen de reacción. Las reacciones pueden variar desde
aproximadamente 15 minutos hasta muchos días, dependiendo de la
química de activación. Los compuestos carboxílicos pueden activarse
para formar ésteres con N-hidroxisuccinimida o su
sulfo-análogo, o para dar anhídridos mixtos
mediante la reacción con cloroformiato de carbitol o cloroformiato
de t-butilo, o pueden acoplarse directamente usando
carbodiimidas tales como EDAC. Para la reacción con tioles de
cisteína en la enzima, el hapteno debe contener un buen grupo
saliente tal como I, Br o tosilo; alternativamente, el hapteno
puede contener un tiol, preferiblemente activado con
2,2'-ditiodipiridina o DTNB.
Otro método de conjugación, descrito en Rowley,
G. L., D. Leung y P. Singh (patente estadounidense n.º 4.220.722)
implica la modificación de la enzima con reactantes que contienen
bromoacetilo; posteriormente se hacen reaccionar los grupos bromo
con haptenos que contienen tiol. Las reacciones de la enzima con
modificador de bromoacetilo y la bromoacetil-enzima
y el hapteno tiolado se someten a las mismas variables de
condiciones de reacción descritas anteriormente.
Pueden prepararse conjugados enzimáticos usando
el compuesto (22) o el compuesto (24). Por ejemplo, pueden
prepararse conjugados que comprenden
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
mediante procedimientos conocidos en la técnica. Estos
procedimientos generalmente implican desplazamiento del bromo del
compuesto (22) o el compuesto (24) por un azufre de un grupo
cisteína de la enzima. Dado que la enzima tiene múltiples grupos
cisteína, más de una molécula del compuesto (22) o el compuesto
(24) habitualmente se conjuga a la enzima.
Pueden emplearse los conjugados de marcador de
la presente invención en diversos formatos de ensayo. Tales ensayos
habitualmente implican reacciones entre parejas de unión tales como
un analito de anfetamina y/o un analito de metanfetamina y un
anticuerpo correspondiente o la unión entre un anticuerpo y una
pareja de unión correspondiente tal como un segundo anticuerpo que
se une al primer anticuerpo. Por consiguiente, la pareja de unión
puede ser una proteína, que puede ser un anticuerpo o un antígeno.
La pareja de unión puede ser un miembro de un par de unión
específico ("miembro sbp"), que es una de dos moléculas
diferentes, que tienen una zona en la superficie o en una cavidad,
que se une específicamente a y se define así como complementaria
con una organización espacial y polar particular de la otra
molécula. Los miembros del par de unión específico habitualmente
serán miembros de un par inmunológico tal como
antígeno-anticuerpo, aunque otros pares de unión
específicos tales como biotina-avidina,
hormonas-receptores de hormonas,
enzima-sustrato, dúplex de ácidos nucleicos,
IgG-proteína A, pares de polinucleótidos tales como
ADN-ADN, ADN-ARN, y similares no son
pares inmunológicos pero están incluidos dentro del alcance de
miembro sbp.
Por consiguiente, la unión específica implica el
reconocimiento específico de una de dos moléculas diferentes por la
otra en comparación con el reconocimiento sustancialmente menor de
otras moléculas. Por otro lado, la unión no específica implica la
unión no covalente entre las moléculas que es relativamente
independiente de las estructuras de superficie específicas. La
unión no específica puede resultar de varios factores incluyendo
interacciones hidrófobas entre moléculas. Parejas de unión
preferidas son los anticuerpos.
Pueden emplearse los reactivos mencionados
anteriormente en todos los tipos de inmunoensayos para determinar
la presencia y/o la cantidad de analitos de anfetamina y/o analitos
de metanfetamina en una muestra que se sospecha que contiene tales
analitos. Tales ensayos incluyen, por ejemplo, inmunoensayos
enzimáticos, inmunoensayos de polarización por fluorescencia,
radioinmunoensayo, inmunoensayo de inhibición turbidimétrica
potenciado con partículas, etcétera.
Un grupo general de inmunoensayos incluye
inmunoensayos que usan los conjugados marcados de la invención con
una concentración limitada de anticuerpo. Otro grupo de
inmunoensayos implica el uso de un exceso de todos los reactivos
principales. Tales ensayos incluyen dos ensayos de tipo
sándwich de dos sitios, por ejemplo, ensayos
inmunorradiométricos, ensayos inmunofluorométricos, ensayos
inmunoquimioluminométricos, ensayos de ELISA, etcétera. Otro grupo
de inmunoensayos son ensayos homogéneos sin separación en los que
los reactivos marcados modulan la señal del marcador tras las
reacciones de unión antígeno-anticuerpo. Otro grupo
de ensayos incluye ensayos competitivos limitados en cuanto al
reactivo de anticuerpo marcado para hapteno o antígeno que evitan
el uso de antígenos o haptenos marcados problemáticos. En este tipo
de ensayo, es importante que el analito inmovilizado en fase sólida
esté presente en una cantidad limitada, constante. El reparto de un
marcador entre el analito inmovilizado y el analito libre depende de
la concentración del analito en la muestra.
Pueden emplearse los conjugados de marcador de
la invención con anticuerpos contra anfetamina y metanfetamina para
llevar a cabo un inmunoensayo para detectar los analitos de
anfetamina y metanfetamina. Los ensayos pueden realizarse o bien
sin separación (homogéneos) o bien con separación (heterogéneos) de
cualquiera de los componentes o productos de ensayo. Se pone como
ejemplo de los inmunoensayos homogéneos el ensayo EMIT® (Syva
Company, San José, CA) dado a conocer en Rubenstein, et al.,
patente estadounidense n.º 3.817.837, de la columna 3, línea 6 a la
columna 6, línea 64; métodos de inmunofluorescencia tales como los
dados a conocer en Ullman, et al., patente estadounidense
n.º 3.996.345, de la columna 17, línea 59, a la columna 23, línea
25; inmunoensayos de canalización enzimática ("ECIA") tal como
los dados a conocer en Maggio, et al., patente estadounidense
n.º 4.233.402, de la columna 6, línea 25 a la columna 9, línea 63;
el inmunoensayo de polarización por fluorescencia ("FPIA") tal
como se da a conocer, por ejemplo, en, entre otros, la patente
estadounidense n.º 5.354.693; etc.
Otros inmunoensayos enzimáticos son el
inmunoensayo mediado por modulador enzimático ("EMMIA") tratado
en Ngo y Lenhoff, FEBS Lett. (1980) 116:285-288; el
inmunoensayo de fluorescencia de sustrato marcado ("SLFIA")
dado a conocer en Oellerich, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. (1984)
22:895-904; los inmunoensayos de
enzima-donante clonada ("CEDIA") dados a
conocer en Khanna, et al., Clin. Chem. Acta (1989)
185:231-240; inmunoensayos de partículas marcadas
homogéneos tales como inmunoensayos de inhibición turbidimétricos
mejorados de partículas ("PETINIA"), inmunoensayo
turbidimétrica potenciado con partículas ("PETIA"), etc.; y
similares.
Ensayos heterogéneos a modo de ejemplo son el
ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas ("ELISA") tratado
en Maggio, E.T. citado anteriormente; el radioinmunoensayo, dado a
conocer en Yalow, et al., J. Clin. Invest. 39:1157 (1960)
etc.
Pueden emplearse también los reactivos
anteriores en inmunoensayos de múltiples analitos en el que los
analitos de anfetamina y/o metanfetamina pueden ser objeto de
detección junto con uno o más de otros analitos tales como otras
drogas y similares. Tales sistemas de múltiples analitos se tratan,
por ejemplo, en un artículo de Microgenics Corporation, titulado
"Multiplex assay of amphetamine, metamphetamine and ecstasy drug
using CEDIA technology" (J Anal. Toxicol., 2002, vol, 26,
página, 267).
Los ensayos homogéneos y heterogéneos,
particularmente inmunoensayos enzimáticos e inmunoensayos de
polarización por fluorescencia, normalmente se llevan a cabo en un
medio tamponado acuoso a un pH moderado, generalmente aquél que
proporciona una sensibilidad de ensayo óptima. El medio acuoso puede
ser solamente agua o puede incluir desde aproximadamente el 0 hasta
aproximadamente el 40 por ciento en volumen de un codisolvente. El
pH para el medio habitualmente estará en el intervalo de
aproximadamente 4 a aproximadamente 11, más habitualmente en el
intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, y
preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 6,5 a
aproximadamente 9,5. El pH habitualmente será un equilibrio entre la
unión óptima de los miembros de unión de cualquier par de unión
específico, el pH óptimo para otros reactivos del ensayo tales como
miembros del sistema productor de señales, etcétera.
Pueden usarse diversos tampones para lograr el
pH deseado y mantener el pH durante la determinación. Los tampones
ilustrativos incluyen borato, fosfato, carbonato, Tris, barbital y
similares. El tampón particular empleado no es crítico para esta
invención, pero en un ensayo individual puede preferirse un tampón u
otro. Pueden emplearse diversos materiales auxiliares en el método
según la presente invención. Por ejemplo, además de tampones el
medio puede comprender estabilizadores para el medio y para los
reactivos empleados. Frecuentemente, además de estos aditivos,
pueden incluirse proteínas, tales como albúminas; disolvente
orgánicos tales como formamida; sales de amonio cuaternario;
polianiones tales como sulfato de dextrano; tensioactivos,
particularmente tensioactivos no iónicos; potenciadores de la
unión, por ejemplo, polialquilenglicoles; o similares.
Pueden aplicarse al medio uno o más periodos de
incubación a uno o más intervalos incluyendo cualquier intervalo
entre la adición de los diversos reactivos mencionados
anteriormente. Habitualmente el medio se incuba a una temperatura y
durante un tiempo suficiente para que se produzca la unión de
diversos componentes de los reactivos. Normalmente se emplean
temperaturas moderadas para llevar a cabo el método y habitualmente
temperatura constante, preferiblemente, temperatura ambiente,
durante el periodo de la medición. Normalmente las temperaturas de
incubación oscilan desde aproximadamente 5º hasta aproximadamente
99ºC, habitualmente desde aproximadamente 15ºC hasta
aproximadamente 70ºC, más habitualmente de 20ºC a aproximadamente
45ºC. El periodo de tiempo para la incubación es aproximadamente de
0,2 segundos a aproximadamente 6 horas, habitualmente, desde
aproximadamente 2 segundos hasta aproximadamente 1 hora, más
habitualmente, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 minutos. El
periodo de tiempo depende de la temperatura del medio y la velocidad
de unión de los diversos reactivos, que se determina mediante la
constante de velocidad de asociación, la concentración, la constante
de unión y la constante de velocidad de disociación. Las
temperaturas durante las mediciones generalmente oscilarán desde
aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50ºC, más habitualmente
desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 40ºC.
La concentración del analito que puede someterse
a ensayo generalmente varía desde aproximadamente 10^{-5} hasta
aproximadamente 10^{-17} M, más habitualmente desde
aproximadamente 10^{-6} hasta aproximadamente 10^{-14} M.
Consideraciones, tales como si el ensayo es cualitativo,
semicuantitativo o cuantitativo (en relación a la cantidad de
analito presente en la muestra), la técnica de detección particular
y la concentración del analito normalmente determinan las
concentraciones de los diversos reactivos.
La concentración de analitos que va a detectarse
generalmente variará desde aproximadamente 10^{-5} hasta
aproximadamente 10^{-17} M, más habitualmente desde
aproximadamente 10^{-6} hasta aproximadamente 10^{-14} M. En
general, se establece un nivel de punto de corte predeterminado para
cada analito que se sospecha que está en una muestra. Generalmente
el nivel de punto de corte predeterminado particular se determina
analito por analito. Los expertos en la técnica son muy conscientes
de los factores que se relacionan con la selección de niveles de
punto de corte predeterminados. Por ejemplo, para muchas drogas, los
niveles de punto de corte los determina SAEMA, una agencia del
Departamento de Salud y Servicios Sociales. La naturaleza del
sistema productor de señales puede ser una consideración en la
determinación de los niveles de punto de corte predeterminados de
algunos analitos. Otra consideración es que la variación esperada en
la concentración de los analitos que es de significación debe
proporcionar una diferencia de señal medible de manera precisa.
Las concentraciones de los diversos reactivos en
el medio de ensayo generalmente se determinarán mediante el
intervalo de concentración de interés de los analitos de anfetamina
y/o metanfetamina. Sin embargo, la concentración final de cada uno
de los reactivos normalmente se determina de manera empírica para
optimizar la sensibilidad del ensayo en el intervalo. Es decir, una
variación en la concentración del analito que es de significación
debe proporcionar una diferencia de señal medible de manera precisa.
Consideraciones tales como la naturaleza del sistema productor de
señales y la naturaleza de, y niveles de punto de corte
predeterminados para, los analitos normalmente determinan las
concentraciones de los diversos reactivos.
Aunque pueda variarse ampliamente el orden de
adición, habrá determinadas preferencias dependiendo de la
naturaleza del ensayo. El orden de adición más sencillo es añadir
todos los materiales simultáneamente y determinar el efecto que el
medio de ensayo tiene sobre la señal como en un ensayo homogéneo.
Alternativamente, los reactivos pueden combinarse de manera
secuencial. Opcionalmente, puede estar implicada una etapa de
incubación posterior a cada adición, generalmente que oscila desde
aproximadamente 30 segundos hasta aproximadamente 6 horas, más
habitualmente desde aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 1
hora.
Los siguientes ejemplos describen además las
realizaciones específicas de la invención a modo de ilustración y
no de limitación y están destinados a describir y no a limitar el
alcance de la invención.
En un ensayo homogéneo tras haberse combinado
todos los reactivos, se determina la señal y se relaciona con la
cantidad de analito en la muestra. Por ejemplo, en un ensayo de EMIT
para anfetamina y/o metanfetamina, se combina una muestra que se
sospecha que contiene analitos de anfetamina y/o metanfetamina en un
medio acuoso o bien simultáneamente o bien secuencialmente con un
conjugado enzimático de la invención y anticuerpo que puede
reconocer anfetamina y anticuerpo que puede reconocer metanfetamina,
en el que los anticuerpos también se unen a los restos de
anfetamina y metanfetamina respectivos del conjugado enzimático
preparado según la presente invención. Generalmente, se añade un
sustrato para la enzima, que da como resultado la formación de un
producto cromogénico o fluorogénico tras una reacción catalizada por
enzima. Las enzimas preferidas son
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y
fosfatasa alcalina pero pueden emplearse otras enzimas. Los analitos
y los restos del conjugado enzimático compiten por los sitios de
unión en el anticuerpo. Entonces, se determina la actividad
enzimática en el medio, habitualmente mediante medios
espectrofotométricos, y se compara con la actividad enzimática
determinada cuando se someten a prueba calibradores o muestras de
referencia en los que está presente una cantidad conocida de los
analitos. Normalmente, los calibradores se someten a prueba de una
manera similar a las pruebas de la muestra que se sospecha que
contiene los analitos. Los calibradores normalmente contienen
concentraciones diferentes, pero conocidas, del analito que va a
determinarse. Preferiblemente, los intervalos de concentración
presentes en los calibradores abarca el intervalo de concentraciones
de analito del que se sospecha en las muestras desconocidas.
Los anticuerpos específicos para anfetamina y
específicos para metanfetamina para su uso en inmunoensayos pueden
ser monoclonales o policlonales. Tales anticuerpos pueden prepararse
mediante técnicas que se conocen bien en la técnica tal como
immunización de un huésped y recogida de sueros (policlonales) o
preparando líneas celulares híbridas continuas y recogiendo la
proteína secretada (monoclonal) o clonando y expresando secuencias
de nucleótidos o versiones mutadas de las mismas que codifican para
al menos las secuencias de aminoácidos requeridas para la unión
específica de anticuerpos naturales.
Los anticuerpos también pueden incluir una
inmunoglobulina completa o un fragmento de la misma,
inmunoglobulinas que incluyen diversas clases e isotipos, tales
como IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b y IgG3, IgM, etc. Los
fragmentos de las mismas pueden incluir Fab, Fv y
F(ab')_{2}, Fab' y similares. Además, pueden usarse
agregados, polímeros y conjugados de inmunoglobulinas o sus
fragmentos cuando sea apropiado de modo que siempre que se mantenga
la afinidad de unión por una molécula particular.
Se obtienen antisueros que contienen anticuerpos
(policlonales) mediante técnicas bien establecidas que implican la
immunización de un animal, tal como un conejo, una cobaya o una
cabra, con un inmunógeno apropiado y obteniendo antisueros de la
sangre del animal inmunizado tras un periodo de espera apropiado. Se
proporcionan revisiones del estado de la técnica por Parker,
Radioimmunoassay of Biologically Active Compounds,
Prentice-Hall (Englewood Cliffs, N.J., EE.UU.,
1976), Butler, J. Immunol. Meth. 7: 1-24 (1975);
Broughton y Strong, Clin. Chem. 22: 726-732 (1976);
y Playfair, et al., Br. Med. Bull. 30: 24-31
(1974).
También pueden obtenerse anticuerpos mediante
técnicas de hibridación de células somáticas, denominándose
comúnmente tales anticuerpos como anticuerpos monoclonales. Pueden
producirse anticuerpos monoclonales según las técnicas
convencionales de Köhler y Milstein, Nature
265:495-497, 1975. Se encuentran revisiones de
técnicas de anticuerpos monoclonales en Lymphocyte Hybridomas, ed.
Melchers, et al. Springer-Verlag (Nueva York
1978), Nature 266: 495 (1977), Science 208: 692 (1980), y Methods of
Enzymology 73 (Parte B): 3-46 (1981). Se inyectan
muestras de una preparación de inmunógeno apropiada en un animal tal
como un ratón, tras un tiempo suficiente, se sacrifica el animal y
se obtienen células de bazo. Alternativamente, pueden sensibilizarse
las células de bazo de un animal no inmunizado frente al inmunógeno
in vitro. Los cromosomas de las células de bazo que
codifican para las secuencias de bases para las inmunoglobulinas
deseadas pueden condensarse fusionando las células de bazo,
generalmente en presencia de un detergente no iónico, por ejemplo,
polietilenglicol, con una línea celular de mieloma. Se dejan crecer
las células resultantes, que incluyen los hibridomas fusionados, en
un medio selectivo, tal como medio HAT, y se cultivan las células
inmortalizadas supervivientes en tal medio usando condiciones de
dilución limitantes. Se cultivan las células en un recipiente
adecuado, por ejemplo, pocillos de microtitulación, y se examinan
los sobrenadantes para determinar los anticuerpos monoclonales que
tienen la especificidad deseada.
Existen diversas técnicas para mejorar los
rendimientos de anticuerpos monoclonales, tales como la inyección
de las células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un huésped
mamífero, que acepta las células, y recoger el líquido ascítico.
Cuando se recoge una cantidad insuficiente del anticuerpo monoclonal
en el líquido ascítico, se recoge el anticuerpo de la sangre del
huésped. Alternativamente, puede cultivarse la célula que produce
el anticuerpo deseado en un dispositivo de cultivo celular de fibra
hueca o un dispositivo de matraz de agitación, conociéndose bien
ambos en la técnica. Existen diversas maneras convencionales para el
aislamiento y la purificación de los anticuerpos monoclonales de
otras proteínas y otros contaminantes (véase Köhler y Milstein,
anteriormente).
En un enfoque para la preparación de
anticuerpos, puede escindirse la secuencia que codifica para los
sitios de unión a anticuerpos del ADN cromosómico e insertarse en
un vector de clonación, que puede expresarse en bacterias para
producir proteínas recombinantes que tienen los sitios de unión a
anticuerpos correspondientes.
En general, los anticuerpos pueden purificarse
mediante técnicas conocidas tales como cromatografía, por ejemplo,
cromatografía DEAE, cromatografía ABx, y similares, filtración,
etcétera.
Los ensayos mencionados anteriormente pueden
llevarse a cabo usando
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
mutante como la enzima del conjugado enzimático. Esta enzima
mutante se describe en las patentes estadounidenses n.º^{s}
6.090.567 y 6.033.890, cuyas descripciones relevantes se incorporan
al presente documento como referencia. Además, el ensayo puede
llevarse a cabo usando anticuerpos contra anfetamina y anticuerpos
contra metanfetamina tal como se da a conocer en las patentes
estadounidenses n.º^{s} 5.328.828 y 5.135.863, cuyas descripciones
relevantes se incorporan al presente documento como referencia.
Los ensayos heterogéneos habitualmente implican
una o más etapas de separación y pueden ser competitivos o no
competitivos. Una variedad de formatos de ensayo competitivos y no
competitivos se dan a conocer en Davalian, et al., patente
estadounidense n.º 5.089.390, de la columna 14, línea 25 a la
columna 15, línea 9, incorporada al presente documento como
referencia. En un tipo de ensayo competitivo se pone en contacto un
soporte que tiene anticuerpos para anfetamina y para metanfetamina
unidos al mismo con un medio que contiene la muestra y un conjugado
enzimático de la invención. Tras separar el soporte y el medio, se
determina la actividad enzimática del soporte o el medio mediante
técnicas convencionales y se relaciona con la cantidad de anfetamina
y/o metanfetamina en la muestra.
El soporte puede estar compuesto por un material
insoluble en agua, sólido o fluido, orgánico u inorgánico, que
puede ser transparente o parcialmente transparente. El soporte puede
tener cualquiera de varias formas, tales como partícula, incluyendo
perla, película, membrana, tubo, pocillo, tira, varilla, placa y
similares. Dependiendo del tipo de ensayo, el soporte puede o puede
no suspenderse en el medio en el que se emplea. Ejemplos de
soportes que pueden suspenderse son materiales poliméricos, tales
como látex, bicapas lipídicas o liposomas, gotas de aceite, células
e hidrogeles. Otras composiciones de soporte incluyen polímeros,
tales como nitrocelulosa, acetato de celulosa, poli(cloruro
de vinilo), poliacrilamida, poliacrilato, polietileno,
polipropileno, poli(4-metilbuteno),
poliestireno, polimetacrilato, poli(tereftalato de etileno),
nailon, poli(butirato de vinilo), etc.; o bien se usan por
sí mismos o bien conjuntamente con otros materiales.
La unión de los componentes a la superficie de
un soporte puede ser directa o indirecta, covalente o no covalente
y puede lograrse mediante técnicas bien conocidas, disponibles
comúnmente en la bibliografía, tal como se trató anteriormente.
Véanse, por ejemplo, "Immobilized Enzymes", Ichiro Chibata,
Halsted Press, Nueva York (1978) y Cautrecasas, J. Biol. Chem.,
245:3059 (1970). La superficie del soporte es habitualmente
polifuncional o puede polifuncionalizarse o puede unirse a un
miembro sbp, o similar, a través de interacciones covalentes o
específicas o no covalentes no específicas. Tal unión es indirecta
cuando se usan interacciones no covalentes y es directa cuando se
emplean interacciones covalentes. Una gran variedad de grupos
funcionales están disponibles o pueden incorporarse. Los grupos
funcionales incluyen ácidos carboxílicos, aldehídos, grupos amino,
grupos ciano, grupos etileno, grupos hidroxilo, grupos mercapto y
similares. Se conoce bien la manera de conectar una gran variedad
de compuestos a superficies y se ilustran ampliamente en la
bibliografía (véase anteriormente).
La activación del sistema productor de señales
depende de la naturaleza de los miembros del sistema productor de
señales. Para aquellos miembros de un sistema productor de señales
que se activan con luz, se irradia el miembro con luz. Para los
miembros de los sistemas productores de señales que están en la
superficie de una partícula, la adición de una base puede dar como
resultado la activación. Otros métodos de activación se les
ocurrirán a los expertos en la técnica en vista de las descripciones
del presente documento. Para algunos sistemas productores de
señales, no es necesario ningún agente para la activación tales como
aquellos sistemas que implican un marcador que es un marcador
radiactivo, una enzima, etcétera. Para los sistemas enzimáticos,
puede ser necesaria la adición de un sustrato y/o un cofactor.
En determinadas realizaciones, puede emplearse
una segunda enzima además de la enzima del conjugado enzimático.
Las enzimas de los pares de enzimas están relacionadas porque un
producto de la primera enzima sirve como un sustrato para la
segunda enzima.
El examen para determinar la presencia y la
cantidad de la señal también incluye la detección de la señal, que
generalmente es meramente una etapa en la que se lee la señal. La
señal normalmente se lee usando un instrumento, cuya naturaleza
depende de la naturaleza de la señal. El instrumento puede ser un
espectrofotómetro, fluorómetro, espectrómetro de absorción,
luminómetro, quimioluminómetro, actinómetro, instrumento
fotográfico, y similares. La presencia y la cantidad de señal
detectada se relacionan con la presencia y la cantidad de los
analitos de anfetamina y/o metanfetamina presentes en una muestra
por encima del nivel de punto de corte predeterminado. Las
temperaturas durante las mediciones generalmente oscilan desde
aproximadamente 10º hasta aproximadamente 70ºC, más habitualmente
desde aproximadamente 20º hasta aproximadamente 45ºC, más
habitualmente de aproximadamente 20º a aproximadamente 25ºC. En un
enfoque se forman curvas patrón usando concentraciones conocidas de
los analitos que van a examinarse. Tal como se trató anteriormente,
también pueden usarse calibradores y otros controles.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a kits útiles para realizar de manera conveniente un ensayo para la
determinación de analitos de anfetamina y/o metanfetamina. El kit
comprende en combinación envasada (i) un anticuerpo para
anfetamina, (ii) un anticuerpo para metanfetamina y (iii) un
compuesto de fórmula IV en el que el compuesto comprende una enzima
y en el que R_{1}' y R_{2}' son H.
Para mejorar la versatilidad de la invención
objeto, pueden proporcionarse los reactivos del kit en combinación
envasada, en los mismos recipientes o recipientes separados, en
forma líquida o liofilizada de modo que la razón de los reactivos
proporcione la optimización sustancial del método y el ensayo. Los
reactivos pueden estar cada uno en recipientes separados o pueden
combinarse diversos reactivos en uno o más recipientes dependiendo
de la reactividad cruzada y la estabilidad de los reactivos.
El kit además puede incluir otros reactivos
envasados por separado para llevar a cabo un ensayo tal como
miembros sbp adicionales, reactivos auxiliares tales como un
sustrato enzimático auxiliar, etcétera. Las cantidades relativas de
los diversos reactivos en los kits puede variarse ampliamente para
proporcionar concentraciones de los reactivos que optimicen
sustancialmente las reacciones que es necesario que se produzcan
durante el presente método y además optimizar sustancialmente la
sensibilidad del ensayo. En las circunstancias apropiadas, pueden
proporcionarse uno o más de los reactivos en el kit como un polvo
seco, habitualmente liofilizado, incluyendo los excipientes, que
con su disolución proporcionarán una disolución de reactivos que
tiene las concentraciones apropiadas para realizar un método o un
ensayo según la presente invención. El kit puede incluir además una
descripción por escrito de un método según la presente invención tal
como se describió anteriormente.
La invención se demuestra además mediante los
siguientes ejemplos ilustrativos. Las partes y los porcentajes
citados en el presente documento están en peso a menos que se
especifique lo contrario. Las temperaturas están en grados
centígrados (ºC).
La cromatografía en capa fina (CCF) analítica
fue el método de análisis de análisis habitual y se realizó en
placas reforzadas con vidrio de gel de sílice GF de Analtech
Uniplate (0,25 mm) usando el disolvente especificado. Las manchas
en la CCF se visualizaron con luz ultravioleta (de onda corta y/o
larga) y/o vapores de yodo. Se llevó a cabo cromatografía
ultrarrápida sobre gel de sílice Whatman 60 \ring{A}
(230-400 de malla). Se obtuvieron todas las
sustancias químicas de Sigma Chemical Company (San Luis, MO),
Aldrich Chemical Company (San Luis, MO), Fluka (Milwaukee, WI) y
Lancaster y se usaron tal como se recibieron. Los espectros de
^{1}H-RMN y ^{13}C-RMN se
registraron de manera rutinaria en un espectrómetro Bruker
Ultrashiel^{TM}-400 (400 MHz) (Bruker; Bellerica,
MA01821). Los desplazamientos químicos se notificaron en partes por
millón (ppm, \delta) y relativos a tetrametilsilano o con
disolvente deuterado como referencia interna. Las abreviaturas de
RMN usadas son s (singlete), d (doblete) y m (multiplete). Se
obtuvieron espectros de masas en el Laboratorio de Espectrometría
de Masas, Universidad de California en Berkeley, Berkeley,
California.
Se realizaron espectros de absorción
UV-visible en un espectrofotómetro de red de diodos
HP 8452A. Se realizaron las mediciones de fluorescencia en un
espectrofotómetro Spex fluorolog o un espectrofotómetro Perkin Elmer
650-40. Las siguientes abreviaturas tienen los
significados explicados a continuación:
- 18-corona-6: 1,4,7,10,13,16-hexaoxaciclooctadecano
- EtOH - etanol
- g - gramos
- MeI - yodometano
- ml - mililitro
- mmol - milimolar
- Pd/C - paladio al 10% sobre carbón activado
- DMF - dimetilformamida
- THF - tetrahidrofurano
- RMN - espectroscopía de resonancia magnética nuclear
- MHz - megahercio
- EDAC - clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (Sigma Chemical Company)
- MeOH - metanol
- FAB-EM - espectrometría de masas de bombardeo con átomos rápidos
- FAB-EMAR - espectrometría de masas de alta resolución de bombardeo con átomos rápidos
- EI-EM - espectroscopía de masas de impacto electrónico
- EI-EMAR - espectroscopía de masas de alta resolución de impacto electrónico
- agua DI - agua desionizada
- TNBS - ácido 2,4,6-trinitrobencesulfónico
- NHS - éster de N-hidroxisuccinimida
- tBoc_{2}O - dicarbonato de di-terc-butilo
- TFA - ácido trifluoroacético
Los anticuerpos usados en los experimentos del
presente documento eran anticuerpos monoclonales preparados tal
como se describió en las patentes estadounidenses n.º^{s}
5.328.828 y 5.135.863. En particular, véase, por ejemplo, de la
columna 37, línea 16, a la columna 39, línea 55, de la patente
estadounidense n.º 5.135.863.
En general, se produjeron los anticuerpos
monoclonales según las técnicas convencionales de Köhler y Milstein,
Nature 265:495-497, 1975. Se encuentran revisiones
de técnicas para anticuerpos monoclonales en Lymphocyte Hybridomas,
ed. Melchers, et al. Springer-Verlag (Nueva
York 1978), Nature 266: 495 (1977), Science 208: 692 (1980), y
Methods of Enzymology 73 (Parte B): 3-46 (1981). Se
inyectaron muestras de una preparación de inmunógeno apropiada en
un animal tal como un ratón y tras un tiempo suficiente, se
sacrificó el animal y se obtuvieron células de bazo.
Alternativamente, pueden sensibilizarse las células de bazo de un
animal no inmunizado frente al inmunógeno in vitro. Pueden
condensarse los cromosomas de células de bazo que codifican para
las secuencias de bases para las inmunoglobulinas deseadas
fusionando las células de bazo, generalmente en presencia de un
detergente no iónico, polietilenglicol, con una línea celular de
mieloma. Se dejan crecer las células resultantes, que incluyen
hibridomas fusionados, en un medio selectivo, tal como medio HAT, y
se cultivan las células inmortalizadas supervivientes en tal medio
usando condiciones de dilución limitantes. Se hacen crecer las
células en un recipiente adecuado, por ejemplo, pocillos de
microtitulación, y se examina el sobrenadante para determinar los
anticuerpos monoclonales que tienen la especificidad deseada.
Existen diversas técnicas para mejorar los
rendimientos de anticuerpos monoclonales, tales como inyección de
las células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un huésped
mamífero, que acepta las células, y recoger el líquido ascítico.
Cuando se recoge una cantidad insuficiente del anticuerpo monoclonal
en el líquido ascítico, se recoge el anticuerpo de la sangre del
huésped. Alternativamente, puede cultivarse la célula que produce
el anticuerpo deseado en un dispositivo de cultivo celular de fibra
hueca o en un dispositivo de matraz de agitación, conociéndose bien
ambos en la técnica. Existen diversas maneras convencionales para el
aislamiento y la purificación de los anticuerpos monoclonales de
otras proteínas y otros contaminantes (véase Köhler y Milstein,
citado anteriormente).
Se preparó el compuesto (11) partiendo del
compuesto (1) tal como se describe a continuación (véase también la
figura 7).
A una disolución de sal de birtartrato de
[-]-m-hidroxifenilpropanolamina (1)
(40 g, 126 mmol) en agua (60 ml) se le añadió lentamente NH_{4}OH
(60 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 0,5
horas. Se extrajo la mezcla con acetato de etilo (6 x 250 ml). Se
lavó la fase orgánica combinada con agua (30 ml) y se secó sobre
MgSO_{4} anhidro. Se filtró el disolvente orgánico y se evaporó el
filtrado mediante evaporación rotativa seguido de alto vacío hasta
sequedad dando el producto de metaraminol (2) deseado (16,8 g,
rendimiento del 79,7%). Se usó este producto para la siguiente
reacción sin purificación adicional.
A una disolución con agitación de metaraminol
(2) (16,8 g, 100,4 mmol) en cloroformo (250 ml) se le añadió
lentamente cloruro de tionilo (60 ml, 800 mmol) bajo argón. Se agitó
la mezcla de reacción durante 0,5 horas y se calentó a 50ºC durante
45 minutos usando un baño de aceite. Se enfrió la mezcla de reacción
hasta temperatura ambiente. Se eliminaron el cloroformo y la mayor
parte del cloruro de tionilo en exceso mediante evaporación
rotativa a alto vacío. Tras la evaporación, se formó un residuo
sólido bruto. Se disolvió el residuo sólido en MeOH (250 ml) y se
calentó con carbón (30 g) a 70ºC mediante un baño de agua durante
0,5 horas. Se filtró la disolución de MeOH caliente a través de una
almohadilla de celita (0,5 cm de espesor) en un embudo de
filtración. Se evaporó el filtrado mediante evaporación rotativa
seguido de alto vacío hasta sequedad dando el producto (3) deseado
(19,0 g, rendimiento del 85,5%). Se usó este producto para la
siguiente reacción sin purificación adicional.
A una disolución con agitación de (3) (19,0 g,
85,54 mmol) en EtOH (100 ml) se le añadió Pd al 10%/C (7,0 g) y se
hidrogenó la disolución en un hidrogenador (parr) bajo 35 psi de
presión de hidrógeno durante 16 horas. Se filtró la disolución de
etanol a través de una almohadilla de celita (0,5 cm de espesor) y
se lavó la almohadilla de celita con EtOH (30 ml). Se evaporaron
los filtrados combinados mediante evaporación rotativa seguido de
alto vacío hasta sequedad dando el producto deseado, clorhidrato de
(2S)-3-(2-aminopropil)fenol
(4) (16,1 g, rendimiento del 100%). ^{1}H-RMN
(CD_{3}OD, 400 MHz) \delta: 7,15 (m, 1H), 6,90 (m, 3H), 3,48 (m,
1H), 2,85 (m, 1H), 2,70 (m, 1H), 1,24 (d, J=6,6 Hz, 3H). Se
usó este producto para la siguiente reacción sin purificación
adicional.
A una disolución con agitación de (4) (5 g,
26,64 mmol) en THF (150 ml) se le añadió lentamente trietilamina
(3,8 ml, 27,2 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura
ambiente durante 10 minutos. Se añadió anhídrido acético (2,6 ml,
27,51 mmol) a la mezcla, seguido de carbonato de potasio (3,68 g,
26,63 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente
durante 3 horas. Se añadió agua (50 ml) y se evaporó la mayor parte
del THF mediante evaporación rotativa. Se extrajo la fase acuosa con
acetato de etilo (4 x 120 ml). Se lavaron las fases orgánicas
combinadas con agua (40 ml) y se secaron sobre MgSO_{4}. Se
evaporó la fase orgánica hasta sequedad mediante evaporación
rotativa y se disolvió el residuo en metanol (40 ml) y NH_{4}OH
(10 ml). Se agitó la disolución a temperatura ambiente durante 0,5
horas y se eliminó la mayor parte del metanol mediante evaporación
rotativa. Se añadió agua (20 ml) y se extrajo la fase acuosa con
acetato de etilo (4 x 50 ml). Se lavaron los extractos combinados
con agua (15 ml) y se secaron sobre MgSO_{4}. Se filtró el
disolvente orgánico y se evaporó hasta sequedad mediante evaporación
rotativa. Se purificó el residuo mediante cromatografía en columna
ultrarrápida (gel de sílice) usando acetato de etilo/hexano (4/1)
como eluyente dando acetamina (5) (3,90 g, rendimiento del 76%).
^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta:7,91 (m,
1H; OH), 7,12 (m, 1H), 6,77 (m, 2H), 6,68 (m, 1H), 5,61 (m,
1H, NH), 4,28 (s, 1H), 2,81 (m, 1H), 2,66 (m, 1H), 1,98 (s,
3H), 1,13 (d, J=6,5 Hz, 3H).
A una disolución con agitación de (5) (2,45 g,
12,68 mmol) en DMF (80 ml) se le añadió NaH (0,5 g, al 95%, 19,79
mmol) a 0ºC. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente
durante 45 minutos bajo nitrógeno. Tras cesar el desprendimiento de
hidrógeno, se enfrió la mezcla de reacción hasta 0ºC y se añadió
cloruro de dimetiltiocarbamoílo (2,35 g, 19,0 mmol) a la mezcla. Se
agitó la mezcla de reacción y se calentó a 45ºC durante 2 horas y
se dejó enfriar hasta temperatura ambiente. Se añadieron disolución
saturada de cloruro de sodio (50 ml) y agua (30 ml) a la mezcla. Se
extrajo la fase acuosa con acetato de etilo (3 x 100 ml) y se lavó
la fase orgánica combinada con disolución saturada de NaCl (50 ml) y
se secó sobre MgSO_{4}. Se filtró el disolvente orgánico y se
evaporó hasta sequedad mediante evaporación rotativa. Se purificó el
residuo mediante cromatografía en columna ultrarrápida (gel de
sílice) usando acetato de etilo/hexano (9/1) como eluyente dando
(6) (2,9 g, rendimiento del 81,6%). ^{1}H-RMN
(CDCl_{3}, 400 MHz) \delta: 7,30 (m, 1H), 7,05 (m, 1H), 6,90
(m, 2H), 5,36 (m, 1H, NH), 4,30 (m, 1H), 3,44 (s, 3H), 3,34
(s, 3H), 2,79 (m, 2H), 1,93 (s, 3H), 1,09 (d, J=6,4 Hz,
3H).
Se agitó el compuesto (6) puro (2,14 g, 7,60
mmol) y se calentó bajo argón a 238-243ºC en un baño
de aceite durante 8 horas. Se observó la reacción completa mediante
cromatografía en capa fina (CCF) (gel de sílice, acetato de etilo)
mediante la desaparición de una mancha y una nueva mancha que se
visualizaba en la CCF. Se dejó enfriar la reacción hasta
temperatura ambiente. Se purificó el residuo oleoso mediante
cromatografía en columna ultrarrápida (gel de sílice) usando
acetato de etilo como eluyente dando (7) (1,15 g, rendimiento del
53,7%). ^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta:
7,32-7,28 (m, 3H), 7,18 (m, 1H), 5,67 (m, 1H,
N_{H}), 4,25 (m, 1H), 3,08 (s, 3H), 3,00 (s, 3H), 2,78 (m, 2H),
1,93 (s, 3H), 1,05 (d, J=6,6 Hz, 3H);
^{13}C-RMN (CDCl_{3}, 100 MHz): \delta
170,09, 167,31, 139,09, 137,27, 133,71, 130,76, 129,11, 128,92,
46,02, 42,14, 37,30, 23,62, 20,08.
Se sometió a reflujo una mezcla de (7) (100 mg,
0,356 mmol) y KOH (400 mg, 7,13 mmol) en EtOH (9 ml) y agua (6 ml)
bajo argón durante 4 horas. Se evaporó la mayor parte del etanol y
se añadió agua (14 ml) a la mezcla. Se acidificó la disolución
acuosa con HCl 6 N (pH de aproximadamente 3) y luego se extrajo con
acetato de etilo (4 x 40 ml). Se secaron los extractos combinados
sobre MgSO_{4}, se filtraron, y se evaporaron hasta sequedad
mediante evaporación rotativa. Se purificó el residuo mediante
cromatografía en columna ultrarrápida (gel de sílice) usando
acetato de etilo/hexano (9/1) como eluyente dando (8) (42 mg,
rendimiento del 56,3%). FAB-EM: MH^{+} (210);
^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta:
7,15-7,07 (m, 3H), 6,93 (m, 1H), 5,57 (m, 1H,
NH), 4,20 (m, 1H), 3,42 (s, 1H, SH), 2,75 (m, 1H),
2,58 (m, 1H), 1,91 (s, 3H), 1,07 (d, J=6,6 Hz, 3H).
Se sometió a reflujo el compuesto (8) (206 mg,
0,984 mmol) en HCl 3 N (30 ml) bajo argón durante 48 horas. Se
observó la reacción completa mediante cromatografía en capa fina
(CCF) (gel de sílice, acetato de etilo/hexano = 1/9). Se evaporó la
mezcla de reacción mediante evaporación rotativa en alto vacío hasta
sequedad. Se disolvieron los residuos en agua (5 ml). Se congeló la
disolución acuosa bajo argón y se liofilizó dando (9) (192 mg,
rendimiento del 95%). FAB-EM: MH^{+} (168);
^{1}H-RMN (D_{2}O, 400 MHz) \delta:
7,29-7,08 (m, 3H), 6,95 (m, 1H), 3,40 (m, 1H), 2,76
(m, 2H), 1,06 (d, J=6,6 Hz, 3H); ^{13}C-RMN
(D_{2}O, 100 MHz) \delta: 137,78, 132,10, 130,32, 130,00,
128,12, 127,11, 49,53, 40,30, 18,07.
A una disolución con agitación de (9) (192 mg,
0,942 mmol) en THF (12 ml) y agua (6 ml) se le añadió dicarbonato
de di-terc-butilo (420 mg, 1,92
mmol) a 0ºC. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente
durante 2 horas bajo argón. Se añadió agua (14 ml) a la mezcla y se
evaporó la mayor parte del THF mediante evaporación rotativa. Se
extrajo la fase acuosa con acetato de etilo (3 x 70 ml) y se lavó la
fase orgánica combinada con disolución saturada de NaCl (30 ml) y
se secó sobre MgSO_{4}. Se filtró el disolvente orgánico y se
evaporó hasta sequedad. Se purificó el residuo mediante
cromatografía en columna ultrarrápida (gel de sílice) usando
acetato de etilo/hexano (1/4) como eluyente dando (10) (118 mg,
rendimiento del 47%) y su dímero de disulfuro (10a) (98 mg,
rendimiento del 20%). (10a): FAB-EM: (MH^{+},
533); ^{1}H-RMN(CDCl_{3}, 400 MHz)
\delta: 7,34-7,18 (m, 6H),
7,04-7,02 (m, 2H), 4,34 (m, 2H, NH), 3,80 (m,
2H), 2,75 (m, 2H), 2,62 (m, 2H), 1,40 (s, 18H), 1,03 (d,
J=6,6 Hz, 6H). (10): EI-EM m/z: 267
(M^{+}, 31), 211 (38), 194 (7), 151 (5), 144 (17), 123 (13), 88
(32), 57(100); ^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 400
MHz) \delta: 7,15-7,08 (m, 3H), 6,95 (m, 1H),
4,38 (m, 1H, NH), 3,85 (m, 1H), 3,41 (s, 1H, SH), 2,76
(m, 1H), 2,62 (m, 1H), 1,42 (s, 9H), 1,06 (d, J=6,6 Hz, 3H);
^{13}C-RMN (CDCl_{3}, 100 MHz) \delta: 155,56,
139,84, 131,07, 130,72, 129,43, 127,68, 127,26, 79,62, 47,79,
43,17, 28,83, 20,52.
A una disolución con agitación de dímero (10a)
(138 mg, 0,259 mmol) en THF (8 ml) y disolución tampón de NaOAc/AcOH
(5 ml, pH= 5,0) se le añadió clorhidrato de
tris-(2-carboxietil)fosfina (76 mg, 0,265
mmol). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente
durante 0,5 horas bajo argón. Se evaporó la mayor parte del THF
mediante evaporación rotativa y se extrajo la fase acuosa con
acetato de etilo (3 x 30 ml). Se lavó la fase orgánica combinada
con disolución saturada de NaCl (20 ml) y se secó sobre MgSO_{4}.
Se filtró el disolvente orgánico y se evaporó hasta sequedad. Se
purificó el residuo mediante cromatografía en columna ultrarrápida
(gel de sílice) usando acetato de etilo/hexano (1/4) como eluyente
dando (10) (130 mg, rendimiento del 94%).
A una disolución con agitación de
1,3-dibromoacetona (144 mg, 0,667 mmol) en acetona
(5 ml) a 0ºC bajo argón se le añadió el compuesto (10) (20 mg,
0,0748 mmol) y diisopropiletilamina (14 \mul, 0,08 mmol). Se agitó
la mezcla de reacción a 0ºC durante 45 minutos bajo argón. Se
evaporó la acetona hasta sequedad mediante evaporación rotativa. Se
purificó el residuo mediante cromatografía en columna ultrarrápida
(gel de sílice) usando acetato de etilo/hexano (1/4) como eluyente
dando (11) (20 mg, rendimiento del 66,5%). EI-EM
m/z: 403(M^{+}, 52), 401 (M^{+}, 50), 347 (74), 345
(72), 330 (44), 328 (40), 260 (14), 258 (16), 144 (100), 88 (31), 57
(100); ^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta:
7,21-7,00 (m, 4H), 4,45 (m, 1H, NH), 4,07 (s,
2H), 3,87 (sa, 3H), 2,80 (m, 1H), 2,65 (m, 1H), 1,41 (s, 9H), 1,05
(d, J=6,4 Hz, 3H); ^{13}C-RMN (CDCl_{3}, 100
MHz) \delta: 197,05, 155,53, 140,06, 133,82, 131,69, 129,67,
129,26, 128,53, 79,62, 47,68, 43,09, 41,52, 32,47, 28,83,
20,47.
Se preparó el compuesto (2) partiendo del
compuesto (4) tal como se describe a continuación (véase también la
figura 8).
A una disolución con agitación de (4) (271 mg,
1,44 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (30 ml) se le añadió KHCO_{3} (144
mg, 1,44 mmol) seguido de la adición lenta de trietilamina (0,8 ml,
5,73 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente
durante 20 minutos. Se añadió anhídrido trifluoroacético (0,6 ml,
4,24 mmol) a la mezcla. Se agitó la mezcla de reacción a
temperatura ambiente durante 4 horas. Se añadió agua (15 ml) y se
separó la fase orgánica. Se extrajo la fase acuosa con
CH_{2}Cl_{2} (4 x 30 ml). Se lavó la fase orgánica combinada
con disolución de NaHCO_{3} al 10% (30 ml) y se secó sobre
MgSO_{4}. Se filtró la fase orgánica y se evaporó hasta sequedad
mediante evaporación rotativa. Se purificó el residuo mediante
cromatografía en columna ultrarrápida (gel de sílice) usando
acetato de etilo/hexano (2/3) como eluyente dando (13) (274 mg,
rendimiento del 77%). FAB-EM: MH^{+} (248, 100%);
^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta:
7,17-7,14 (m, 1H), 6,74-6,64 (m,
3H), 6,34 (m, 1H, NH), 5,91 (m, 1H, OH), 4,25 (m, 1H),
2,80-2,73 (m, 2H), 1,20 (d, J=5,9 Hz, 3H).
Se repitió esta reacción usando 10,9 g de (4) y se obtuvo 8,6 g de
(13). El ^{1}H-RMN de (13) en ambos lotes es
idéntico.
A una disolución con agitación de (13) (1,65 g,
6,67 mmol) en DMF (30 ml) bajo argón se le añadió NaH (332 mg, al
95%, 13,14 mmol) a 0ºC. Se agitó la mezcla de reacción a 0ºC durante
10 minutos y a temperatura ambiente durante 45 minutos. Tras cesar
del desprendimiento de hidrógeno, se enfrió la mezcla de reacción
hasta 0ºC y se añadió cloruro de dimetiltiocarbamoílo (1,23 g, 9,95
mmol). Se agitó la mezcla de reacción y se calentó a 40ºC durante 2
horas y se dejó que se enfriase hasta temperatura ambiente. Se
añadió disolución saturada de cloruro de sodio (15 ml) y agua (35
ml) a la mezcla. Se extrajo la fase acuosa con acetato de etilo (4
x 80 ml) y se lavó la fase orgánica combinada con disolución
saturada de NaCl (50 ml) y se secó sobre MgSO_{4}. Se filtró y se
evaporó el disolvente orgánico hasta sequedad mediante evaporación
rotativa. Se purificó el residuo mediante cromatografía en columna
ultrarrápida (gel de sílice) usando acetato de etilo/hexano (3/7)
como eluyente dando (14) (1,12 g, rendimiento del 68%).
^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta: 7,25 (m,
1H), 7,00 (m, 2H), 6,90 (m, 1H), 6,81 (m, 1H, NH), 4,20 (m,
1H), 3,36 (s, 3H), 3,24 (s, 3H), 2,85 (m, 1H), 2,72 (m, 1H), 1,15
(d, J=6,7 Hz, 3H); ^{13}C-RMN (CDCl_{3}, 100
MHz) \delta: 187,93, 157,06, 154,51, 138,89, 129,60, 127,17,
124,19, 121,48, 47,91, 43,54, 41,79, 39,07, 19,56.
FAB-EMAR Calcd. para
C_{14}H_{18}F_{3}N_{2}O_{2}S: 335,1042; Hallado:
335,1041.
Se agitó el compuesto (14) puro (1,0 g, 2,99
mmol) y se calentó bajo argón a 238-243ºC en un baño
de aceite durante 9 horas. Se observó la reacción completa mediante
cromatografía en capa fina (CCF) (gel de sílice, acetato de
etilo/hexano = 3/7) mediante la desaparición de (14) y una nueva
mancha que se visualizaba en la CCF que es más polar que (14). Se
permitió que se enfriase la reacción hasta temperatura ambiente. Se
purificó el residuo oleoso mediante cromatografía en columna
ultrarrápida (gel de sílice) usando acetato de etilo/hexano = 3/7
como eluyente dando (15) (0,702 g, rendimiento del 70%).
^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta:
7,35-7,27 (m, 3H), 7,13 (m, 1H), 6,75 (m, 1H,
NH), 4,22 (m, 1H), 3,07 (s, 3H), 2,98 (s, 3H),
2,80-2,72 (m, 2H), 1,11 (d, J=6,7 Hz, 3H);
^{13}C-RMN (CDCl_{3}, 100 MHz) \delta: 167,35,
156,8, 138,11, 137,16, 134,40, 130,67, 129,41, 128,92, 47,49,
41,56, 37,33, 19,57; FAB-EMAR Calcd. para
C_{14}H_{18}F_{3}N_{2}O_{2}S: 335,1042; Hallado:
335,1041.
A una disolución con agitación de (15) (678 mg,
2,01 mmol) en THF (60 ml) bajo argón se le añadió KH (231 mg, 5,75
mmol, liberado del aceite mineral protector lavando con hexano tres
veces seguido de centrifugación). Se agitó la mezcla de reacción
durante 10 minutos y se le añadió
18-corona-6 (230 mg) y MeI (2,0 ml,
32 mmol) a la mezcla. Se dejó la mezcla de reacción con agitación a
temperatura ambiente durante 2 horas y se sometió a reflujo durante
16 horas. Se eliminó la mayor parte del THF mediante evaporación
rotativa y se añadió acetato de etilo (60 ml) a la mezcla seguido
de la adición con cuidado de HCl acuoso al 10% (10 ml) y agua (20
ml). Se separó la fase orgánica y se extrajo la fase acuosa con
acetato de etilo (3 x 50 ml) y se lavó la fase orgánica combinada
con agua (30 ml) y se secó sobre MgSO_{4}. Se filtró el disolvente
orgánico y se evaporó hasta sequedad mediante evaporación rotativa.
Se purificó el residuo mediante cromatografía en columna
ultrarrápida (gel de sílice) usando acetato de etilo/hexano (3/7)
como eluyente dando (16) (490 mg, rendimiento del 72%).
^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta:
7,36-7,19 (m, 4H), 4,75, 4,20 (m, 1H), 3,08 (s, 3H),
2,98 (s, 3H), 2,90, 2,93 (s, 3H), 2,87-2,75 (m,
2H), 1,22 (m, 3H); ^{13}C-RMN (CDCl_{3}, 100
MHz) \delta: 167,20, 157,12, 138,60, 138,20, 136,65, 134,65,
134,41, 130,12, 129,63, 124,19, 54,58, 53,12, 41,17, 39,54, 37,33,
29,81, 28,46, 18,30, 16,98; FAB-EMAR Calcd. para
C_{15}H_{20}F_{3}N_{2}O_{2}S: 349,1198; Hallado:
349,1194.
Se sometió a reflujo una mezcla de (16) (457 mg,
1,31 mmol) y KOH (1,1 g, 19,6 mmol) en EtOH (24 ml) y agua (16 ml)
bajo argón durante 6 horas. Se dejo enfriar la mezcla de reacción
hasta temperatura ambiente. Se acidificó la disolución acuosa con
HCl 1 N (pH de aproximadamente 3). Se evaporó la mayor parte del
etanol mediante evaporación rotativa. Se congeló la fase acuosa en
hielo seco y se liofilizó dando la sal de clorhidrato de (17).
^{1}H-RMN (D_{2}O, 400 MHz) \delta:
7,40-7,00 (m, 4H), 3,40 (m, 1H), 2,93 (m, 1H), 2,72
(m, 1H), 2,62 (s, 3H), 1,17 (d, J=6,5 Hz, 3H).
A una disolución con agitación de (17) en THF
(18 ml) y agua (6 ml) se le añadió dicarbonato de
di-terc-butilo (571 mg, 2,62 mmol)
y K_{2}CO_{3} (387 mg, 2,80 mmol) a 0ºC. Se agitó la mezcla de
reacción a temperatura ambiente durante 2 horas bajo argón. Se
añadió agua (15 ml) a la mezcla y se evaporó la mayor parte del THF
mediante evaporación rotativa. Se extrajo la fase acuosa con acetato
de etilo (3 x 70 ml) y se lavó la fase orgánica combinada con
disolución saturada de NaCl (35 ml) y se secó sobre MgSO_{4}. Se
filtró el disolvente orgánico y se evaporó hasta sequedad. Se
purificó el residuo mediante cromatografía en columna ultrarrápida
(gel de sílice) usando acetato de etilo/hexano (15/85) como eluyente
dando (18) (295 mg, 84,2%) y su dímero de disulfuro (18a) (40 mg,
11,4%). (18): FAB-EM:(MH^{+}, 282);
^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta:
7,20-6,80 (m, 4H), 4,46-4,32 (m,
1H), 3,39 (s, 1H, SH), 2,73-2,50 (m, 5H),
1,37-1,30 (m, 9H) 1,12 (m, 3H);
^{13}C-RMN (CDCl_{3}, 100 MHz) \delta: 155,87,
147,14, 140,45, 133,03, 130,93, 130,30, 129,37 127,67, 126,83,
85,59, 79,61, 52,81, 51,44, 40,77, 28,75, 28,59, 27,82, 18,89,
17,96.
A una disolución con agitación de (11) (87 mg,
0,216 mmol) en acetona (15 ml) se le añadió una disolución de (18)
(61 mg, 0,217 mmol) en acetona (1 ml) y diisopropiletilamina (45 uL,
0,258 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente
durante 45 minutos. Se observó la reacción completa mediante la
desaparición del compuesto (11) en la CCF. Se evaporó la acetona
hasta sequedad. Se purificó el residuo mediante cromatografía en
columna ultrarrápida (gel de sílice) usando acetato de etilo/hexano
(2/3) como eluyente dando el compuesto (19) (110 mg, 84%).
EI-EM m/z: 602 (M^{+}, 18), 502 (62), 158 (56),
102 (100); ^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 400 MHz)
\delta: 7,25-7,00 (m, 8H),
4,42-4,26 (m, 2H), 3,82(m, 4H),
2,78-2,55 (m, 8H), 1,41-1,24 (m,
18H), 1,11-1,02 (m, 6H); FAB-EMAR
Calculado (Calcd.) para C_{32}H_{46}N_{2}O_{5}S_{2}Li
(MLi^{+}): 609,3011; Hallado: 609,3008.
A una disolución con agitación de (19) (80 mg,
0,1327 mmol) (obtenido tal como se describió anteriormente) en MeOH
(15 ml) se le añadió acetato de amonio (194 mg, 2,51 mmol). Se agitó
la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 2 horas. Se
añadió cianoborohidruro de sodio (43 mg, 0,65 mmol) a la mezcla. Se
agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 16
horas. Se observó la reacción completa mediante la desaparición del
compuesto (19) en la CCF y una mancha más polar que se visualizaba
(gel de sílice, acetato de etilo/hexano = 2/3). Se añadió ácido
acético (0,14 ml) a la reacción. Se evaporó el MeOH hasta sequedad
mediante evaporación rotativa. Se purificó el residuo mediante
cromatografía en columna ultrarrápida (gel de sílice) usando
MeOH/CH_{2}Cl_{2} (1/9) como eluyente dando (20) (69 mg,
rendimiento del 86%). EI-EM m/z: 604 (M^{+}, 51),
323 (76), 309 (45), 102 (100); ^{1}H-RMN
(CDCl_{3}, 400 MHz) \delta: 7,25-6,96 (m, 8H),
4,45-4,43 (m, 4H), 3,19(m, 5H), 2,67 (m,
8H), 1,42-1,20 (m, 18H), 1,13-1,05
(m, 6H); EI-EMAR Calcd. para
C_{32}H_{49}N_{3}O_{4}S_{2}(M^{+}): 603,3164;
Hallado: 603,3177.
A una disolución con agitación de (20) (22 mg,
0,0364 mmol) (obtenido tal como se describió anteriormente) en THF
(4 ml) se le añadió diisopropiletilamina (50 \mul, 0,286 mmol) y
N-hidroxisuccinimida de ácido bromoacético (30 mg,
0,127 mmol) a 0ºC bajo argón. Se agitó la mezcla de reacción a
temperatura ambiente durante 1,5 horas. Se añadió agua (5 ml) y se
eliminó la mayor parte del THF mediante evaporación rotativa. Se
extrajo la fase acuosa con CH_{2}Cl_{2} (3 x 30 ml). Se lavó la
fase orgánica combinada con agua (15 ml) y se secó sobre
MgSO_{4}. Se filtró la fase orgánica combinada y se evaporó hasta
sequedad mediante evaporación rotativa. Se purificó el residuo
mediante cromatografía en columna ultrarrápida (gel de sílice)
usando acetato de etilo/hexano (2/3) como eluyente dando (21) (19
mg, rendimiento del 72%) FAB-EM: (MLi^{+},
Br^{79}): 730; (MLi^{+}, Br^{81}) 732; Hallado: 730
(Br^{79}), 732 (Br^{81}); ^{1}H-RMN
(CDCl_{3}, 400 MHz) \delta: 7,22-7,00 (m, 8H),
4,65-4,20 (m, 3H), 3,90 (m, 1H), 3,68 (d, J = 5,1
Hz, 2H), 3,34-3,30 (m, 2H),
3,19-3,15 (m, 2H), 2,85-2,61 (m,
8H), 1,41-1,26 (m, 18H), 1,12-1,05
(m, 6H); FAB-EMAR Calcd. para
C_{34}H_{50}BrN_{3}O_{5}S_{2}Li (MLi^{+}, Br^{79}):
730,2535; (MLi^{+}, Br^{81}): 732,2515; Hallado: 730,2540
(Br^{79}), 732,2543 (Br^{81}).
A una disolución de (21) (18 mg, 0,0248 mmol)
(obtenido tal como se describió anteriormente) en CH_{2}Cl_{2}
(2 ml) se le añadió ácido trifluoroacético (0,4 ml, 5,23 mmol). Se
agitó la reacción a temperatura ambiente durante 40 minutos. Se
eliminaron el exceso de ácido trifluoroacético y de CH_{2}Cl_{2}
disolvente mediante evaporación rotativa y se puso a alto vacío.
Esto dio el producto deseado (22) (18 mg, rendimiento del 96%).
FAB-EM: (MH^{+}, Br^{79}): 524; (MH^{+},
Br^{81}) 526; Hallado: 524 (Br^{79}), 526 (Br^{81});
FAB-EMAR Calcd. para
C_{24}H_{35}BrN_{3}OS_{2} (MH^{+}, Br^{79}): 524,1404,
(MH^{+}, Br^{81}): 526,1384; Hallado: 524,1400 (Br^{79}),
526,1394 (Br^{81}).
A una disolución con agitación de (20) (23 mg,
0,38 mmol) en THF (4 ml) se le añadió diisopropiletilamina (50
\mul, 0,286 mmol) y N-hidroxisuccinimida de
bromoacetilglicina (36 mg, 0,123 mmol) a 0ºC bajo argón. Se agitó
la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 3 horas. Se
añadió agua (5 ml) y se eliminó la mayor parte del THF mediante
evaporación rotativa. Se extrajo la fase acuosa con CH_{2}Cl_{2}
(3 x 30 ml). Se lavó la fase orgánica combinada con agua (15 ml) y
se secó sobre MgSO_{4}. Se filtró la fase orgánica combinada y se
concentró hasta sequedad mediante evaporación rotativa. Se purificó
el residuo mediante cromatografía en columna ultrarrápida (gel de
sílice) usando acetato de etilo/hexano (3/2) como eluyente dando
(23) (6 mg, 20,2% de rendimiento). FAB-EM:
(MLi^{+}, Br^{79}): 787; (MLi^{+}, Br^{81}) 789; Hallado:
787 (Br79), 789 (Br^{81}); FAB-EMAR Calcd. para
C_{36}H_{53}BrN_{4}O_{6}S_{2}Li (MLi^{+}, Br^{79}):
787,2749, (MLi^{+}, Br^{81}): 789,2729; Hallado: 787,2776
(Br^{79}), 789,2774 (Br^{81}).
A una disolución de (23) (4 mg, 0,00512 mmol)
(obtenido tal como se describió anteriormente) en CH_{2}Cl_{2}
(2 ml) se le añadió ácido trifluoroacético (0,3 ml, 3,92 mmol). Se
agitó la reacción a temperatura ambiente durante 60 minutos. Se
eliminaron el exceso de ácido trifluoroacético y de CH_{2}Cl_{2}
disolvente mediante evaporación rotativa y además se secó a alto
vacío. Esto dio el producto deseado 24 (4 mg, rendimiento del 96%).
FAB-EM: (MH^{+}, Br^{79}): 581; (MH^{+},
Br^{81}) 583; Hallado: 581 (Br^{79}), 583 (Br^{81});
FAB-EMAR Calcd. para
C_{26}H_{38}BrN_{4}O_{2}S_{2} (MH^{+}, Br^{79}):
581,1819, (MH^{+}, Br^{81}): 583,1599; Hallado: 581,1612
(Br^{79}), 583,1582 (Br^{81}).
Los haptenos bivalentes (22) y (24), preparados
tal como se describió anteriormente, se dejaron reaccionar con una
enzima glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa (G6PDH) mutante para formar el conjugado de
enzima/hapteno bivalente. En esta enzima mutante, se ha reemplazado
un aminoácido en la secuencia de aminoácidos primaria por una
cisteína. Se obtuvo la enzima mutante mediante el procedimiento
descrito en las patentes estadounidenses n.º^{s} 6.090.567 y
6.033.890, cuyas descripciones relevantes se incorporaron
anteriormente al presente documento como referencia. Entonces se
utilizó la técnica de conjugación descrita en las patentes
estadounidenses n.º^{s} 6.090.567 y 6.033.890 para acoplar el
hapteno bivalente a la enzima a través de un conector de tioéter.
Se describe la preparación en la patente estadounidense n.º
6.090.567 en particular en la columna 28, línea 44, a la columna
43, línea 29, cuya descripción se incorpora al presente documento
como referencia.
Para que un conjugado tenga utilidad en ensayos
de EMIT, el anticuerpo debe inhibir el conjugado. Por tanto, se
incubaron los conjugados preparados con los haptenos bivalentes (22)
y (24) (tal como se describió anteriormente) en presencia de
anticuerpos contra anfetamina y metanfetamina y se sometieron a
prueba para determinar su actividad. Las condiciones y la duración
de la incubación fueron las siguientes:
Se mezcló una dilución apropiada del conjugado
preparado con el hapteno bivalente (22) ó (24) con anticuerpo o
bien contra anfetamina o bien contra metanfetamina, agua desionizada
y sustratos de glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa, a un pH y fuerza iónica apropiados, en un volumen
final de 318 \mul. Tras una incubación de 100 segundos a 37ºC, se
midió la actividad enzimática (\DeltaA/min a 340 nm). Los
experimentos control con agua desionizada en lugar de anticuerpos
establecieron la actividad inicial sin inhibición, la cual se
comparó con la actividad en presencia de anticuerpos contra
establecer el grado de inhibición del conjugado dependiente de
anticuerpo. Los resultados mostrados en la figura 1 demuestran que
cuando se dejó interactuar el conjugado enzimático preparado con el
hapteno bivalente (24) con anticuerpo o bien contra anfetamina o
bien contra metanfetamina, hubo una inhibición dependiente de la
concentración de anticuerpo del conjugado. También se observó la
inhibición dependiente de la concentración del anticuerpo del
conjugado enzimático preparado con el hapteno bivalente (22) (no
resultados no mostrados). Se seleccionó el conjugado enzimático
preparado con el hapteno bivalente (24) para pruebas
adicionales.
Con el fin de someter a prueba la presentación
del hapteno bivalente (24) en el conjugado enzimático con respecto
al anticuerpo, se realizaron experimentos de competencia entre el
conjugado enzimático y o bien anfetamina o bien metanfetamina y el
anticuerpo correspondiente. Las condiciones y la duración de la
incubación fueron las siguientes:
Se prepararon disoluciones de calibrador de
metanfetamina diluyendo una disolución madre de metanfetamina (2000
ng/ml en orina) con orina negativa para metanfetamina, hasta
concentraciones finales de 1000 ng/ml, 600 ng/ml, 400 ng/ml, 200
ng/ml y 100 ng/ml. Se prepararon disoluciones de calibrador de
anfetamina diluyendo una disolución madre de anfetamina (2000 ng/ml
en orina) con orina negativa para anfetamina, hasta concentraciones
finales de 1000 ng/ml, 600 ng/ml, 400 ng/ml, 200 ng/ml y 100 ng/ml.
Con el fin de generar la curva patrón para anfetamina con
anticuerpo contra anfetamina, se incubó un volumen apropiado de cada
calibrador de anfetamina con una dilución apropiada de anticuerpo
contra anfetamina durante 300 seg a 37ºC. Entonces se añadió el
conjugado preparado con el hapteno bivalente (24) y tras una
incubación adicional de 100 seg, se determinó la actividad
enzimática (\DeltaA/min a 340 nm). Se normalizaron las actividades
enzimáticas restando la actividad enzimática observada cuando se
usó el calibrador negativo (0 ng/ml) como la muestra, de la
actividad enzimática observada cuando se usó cada disolución de
calibrador como la muestra. Entonces se representaron gráficamente
los resultados como actividad enzimática en unidades normalizadas
frente a la concentración del calibrador de anfetamina usado. Se
generó la curva patrón para los calibradores de metanfetamina con
anticuerpo contra metanfetamina de manera análoga a la de
anfetamina.
La figura 2 muestra la curva patrón para
anfetamina con anticuerpo contra anfetamina. La figura 3 muestra la
curva patrón para metanfetamina y anticuerpo contra metanfetamina.
Puede observarse claramente una respuesta dependiente de la
concentración de fármaco cuando se sometió a prueba el conjugado
enzimático del hapteno bivalente (24) con o bien la anfetamina y el
anticuerpo correspondiente o bien la metanfetamina y el anticuerpo
correspondiente.
Se empleó el conjugado enzimático del hapteno
bivalente (24) conjuntamente con una mezcla de anticuerpos contra
anfetamina y metanfetamina para detectar la presencia de o bien
anfetamina o bien metanfetamina en una muestra. Las condiciones y
la duración de incubación fueron las siguientes:
Se prepararon disoluciones de calibrador de
metanfetamina diluyendo una disolución madre de metanfetamina (2000
ng/ml en orina) con orina negativa para metanfetamina, hasta
concentraciones finales de 1000 ng/ml, 600 ng/ml, 400 ng/ml, 200
ng/ml y 100 ng/ml. Se prepararon disoluciones de calibrador de
anfetamina diluyendo una disolución madre de anfetamina (2000 ng/ml
en orina) con orina negativa para anfetamina, hasta concentraciones
finales de 1000 ng/ml, 600 ng/ml, 400 ng/ml, 200 ng/ml y 100 ng/ml.
Se preparó un reactivo de anticuerpo que consistía en anticuerpo
contra metanfetamina más anticuerpo contra anfetamina mezclados en
una razón apropiada. Con el fin de generar la curva patrón para
anfetamina con la anfetamina más el reactivo de anticuerpo contra
metanfetamina, se incubó un volumen apropiado de cada calibrador de
anfetamina con una dilución apropiada del reactivo de anticuerpo
durante 300 seg a 37ºC. Después se añadió el conjugado preparado con
el hapteno bivalente (24) y tras una incubación adicional de 100
seg, se determinó la actividad enzimática (\DeltaA/min. a 340
nm). Se normalizaron las actividades enzimáticas restando la
actividad enzimática observada cuando se usó el calibrador negativo
(0 ng/ml) como la muestra, de la actividad enzimática observada
cuando se usó cada disolución de calibrador como la muestra.
Entonces se sometieron a prueba los calibradores de metanfetamina
con la anfetamina más el reactivo de anticuerpo contra metanfetamina
de manera análoga. Después se representaron gráficamente los
resultados como la actividad enzimática en unidades normalizadas
frente a la concentración de calibrador de anfetamina o
metanfetamina usado. La figura 4 muestra que una combinación del
conjugado enzimático y ambos anticuerpos contra anfetamina y
metanfetamina detectaron la presencia de o bien anfetamina o bien
metanfetamina en una muestra.
La discusión anterior incluye determinadas
teorías en cuanto a mecanismos implicados en la presente invención.
Estas teorías no deben interpretarse que limitan la presente
invención en modo alguno, ya que se ha demostrado que la presente
invención logra los resultados descritos.
Claims (18)
1. Compuesto de fórmula:
en la
que:
R_{1} es hidrógeno o un grupo protector,
R_{2} es hidrógeno, alquilo inferior o un
grupo protector,
L_{1} es un grupo conector,
Y_{1} es un enlace, un grupo funcional o un
grupo conector y se une a L_{1} en un punto equidistante entre el
punto de unión a cada uno de los grupos fenilo,
Z_{1} es un poli(aminoácido), un
marcador distinto de poli(aminoácido) o un grupo funcional;
y
t' es 1 cuando Z_{1} es un grupo funcional o
un marcador distinto de poli(aminoácido) o, cuando Z_{1}
es un poli(aminoácido), t' es un número entero entre 1 y el
peso molecular de un poli(aminoácido) dividido entre
aproximadamente 500;
y sales del mismo.
2. Compuesto según la reivindicación 1, en el
que Z_{1} es una enzima.
3. Compuesto de fórmula:
en la
que:
R_{1} y R_{2} son independientemente H o un
grupo protector,
X y X' son independientemente O, S o un
enlace;
D y D' son independientemente alquileno o
alquileno sustituido;
V y V' son independientemente O, S o un
enlace;
W es CH;
Y es NR_{3} en el que R_{3} es H o alquilo
inferior, O, S o un enlace;
T es alquileno, -(C=O)alquileno,
alquileno etéreo, acetamida o un enlace;
Y' es NR_{3} en el que R_{3} es H o alquilo
inferior, O, S o un enlace;
T' es alquileno, -(C=O)alquileno,
alquileno etéreo, acetamida o un enlace; y
Z' es un poli(aminoácido), un resto de
marcador distinto de poli(aminoácido), H, Br, Cl, F, I,
NH_{2}, acetamida o haloacetamida;
t'' es 1 cuando Z' es un grupo funcional o un
marcador distinto de poli(aminoácido) o, cuando Z' es un
poli(aminoácido), t'' es un número entero entre 1 y el peso
molecular de un poli(aminoácido) dividido entre
aproximadamente 500;
con la condición de que X y X' tienen
aproximadamente la misma longitud, D y D' tienen aproximadamente la
misma longitud y V y V' tienen aproximadamente la misma longitud; y
sales del mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Compuesto de fórmula:
en la
que:
R_{1}' y R_{2}' son independientemente H o
un grupo protector,
X_{1}' y X_{1}'' son S u O;
Z'' es una enzima; H, Br, Cl, F, I, NH_{2},
acetamida o haloacetamida;
t''' es 1 cuando Z'' es distinto de enzima y,
cuando Z'' es un marcador de enzima, t''' es un número entero entre
1 y el peso molecular de dicha enzima dividido entre aproximadamente
500; y
n, m, p, q son cada uno independientemente de 1
a 5 y r y s son cada uno independientemente de 0 a 5;
y sales del mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Compuesto de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
Z'' es una enzima; y
T''' es un número entero entre 1 y el peso
molecular de dicha enzima dividido entre aproximadamente 500.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Compuesto según la reivindicación 5, en el
que dicha enzima es
glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa.
7. Sistema de reactivos que comprende un
compuesto según la reivindicación 5, un anticuerpo para anfetamina y
un anticuerpo para metanfetamina.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Método para determinar anfetamina y/o
metanfetamina en una muestra que se sospecha que contiene anfetamina
y/o metanfetamina, comprendiendo dicho método:
(a) proporcionar en combinación en un medio:
- (i)
- dicha muestra y
- (ii)
- un sistema de reactivos según la reivindicación 7; y
(b) examinar dicho medio para determinar la
presencia de un complejo que comprende dicho compuesto y dicho
anticuerpo para anfetamina y/o un complejo de dicho compuesto y
dicho anticuerpo para metanfetamina, indicando la presencia de los
mismos la presencia de dicha anfetamina y/o metanfetamina en dicha
muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Método según la reivindicación 8, en el que
dicho examen comprende medir la señal de dicha enzima,
relacionándose la cantidad de la misma con la presencia de dicha
anfetamina y/o metanfetamina en dicha muestra.
10. Método según la reivindicación 9, siendo
dicho método un método homogéneo y examinándose dicho medio para
determinar la cantidad de dicha señal.
11. Método según la reivindicación 9, siendo
dicho método un método heterogéneo y dicho complejo, si está
presente, se separa de dicho medio y se examina dicho medio o dicho
complejo para determinar la cantidad de dicha señal.
12. Método para determinar anfetamina y/o
metanfetamina en una muestra que se sospecha que contiene anfetamina
y/o metanfetamina, comprendiendo dicho método:
(a) proporcionar en combinación en un medio:
- (i)
- dicha muestra,
- (ii)
- un anticuerpo para anfetamina,
- (iii)
- un anticuerpo para metanfetamina,
- (iv)
- un compuesto de fórmula:
- \quad
- en la que:
- \quad
- R_{1} y R_{2} son H,
- \quad
- X y X' son independientemente O, S o un enlace;
- \quad
- D y D' son independientemente alquileno o alquileno sustituido;
- \quad
- V y V' son independientemente O, S o un enlace;
- \quad
- W es CH;
- \quad
- Y es O, S, un enlace o NR_{3} en el que R_{3} es H o alquilo inferior;
- \quad
- T es alquileno, -(C=O)alquileno, alquileno etéreo, acetamida o un enlace;
- \quad
- Y' es O, S, un enlace o NR_{3} en el que R_{3} es H o alquilo inferior;
- \quad
- T' es alquileno, -(C=O)alquileno, alquileno etéreo, acetamida o un enlace; y
- \quad
- Z' es una enzima;
- \quad
- t'' es un número entero entre 1 y el peso molecular de dicha enzima dividido entre aproximadamente 500;
- \quad
- con la condición de que X y X' tienen aproximadamente la misma longitud, D y D' tienen aproximadamente la misma longitud y V y V' tienen aproximadamente la misma longitud;
- \quad
- o un compuesto de fórmula
- \quad
- en la que:
- \quad
- R_{1}' y R_{2}' son H,
- \quad
- X_{1}' y X_{1}'' son S u O;
- \quad
- Z'' es una enzima;
- \quad
- t''' es un número entero entre 1 y el peso molecular de dicha enzima dividido entre aproximadamente 500; y
- \quad
- n, m, p, q, r y s son cada uno independientemente de 1 a 5; y
(b) examinar dicho medio para determinar la
presencia de un complejo que comprende dicho compuesto y dicho
anticuerpo para anfetamina y/o un complejo de dicho compuesto y
dicho anticuerpo para metanfetamina, indicando
la presencia de los mismos la presencia de dicha anfetamina y/o
metanfetamina en dicha muestra.
13. Método según la reivindicación 12, en el que
dicho examen comprende medir la señal de dicha enzima,
relacionándose la cantidad de la misma con la presencia de dicha
anfetamina y/o metanfetamina en dicha muestra.
14. Método según la reivindicación 13, siendo
dicho método un método homogéneo y dicho medio se examina para
determinar la cantidad de dicha señal.
15. Método según la reivindicación 13, siendo
dicho método un método heterogéneo y dicho complejo, si está
presente, se separa de dicho medio y se examina dicho medio o dicho
complejo para determinar la cantidad de dicha señal.
16. Método según la reivindicación 12, en el que
dicha enzima es glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa.
17. Kit que comprende en combinación
envasada:
- (i)
- un anticuerpo para anfetamina,
- (ii)
- un anticuerpo para metanfetamina,
- (iii)
- un compuesto de fórmula:
- \quad
- en la que:
- \quad
- R_{1}' y R_{2}' son H,
- \quad
- X_{1}' y X_{1}'' son S u O;
- \quad
- Z'' es una enzima;
- \quad
- t''' es un número entero entre 1 y el peso molecular de dicha enzima dividido entre aproximadamente 500; y
- \quad
- n, m, p, q, r y s son cada uno independientemente de 1 a 5.
18. Kit según la reivindicación 17, en el que
dicha enzima es glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa.
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