ES2250972T3 - Inmunoensayo para acido micofenolico. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SUMINISTRA ANTICUERPOS UTILES PARA ENSAYOS PARA EL ACIDO MICOFENOLICO (MPA). ESTOS ANTICUERPOS SE UNEN AL MPA Y SON CAPACES DE DISTINGUIR MPA DE SUS ESTERES, TALES COMO E-6(1,3-DIHIDRO-4-HIDROXI-6-METOXI-7-METIL-3-OXO-5-ISOBENZOFURANIL)4-METIL-4-HEXENOATO DE MORFOLINEOTILO, Y/O SUS METABOLITOS, TALES COMO EL GLUCORONIDO DE ACIDO MICOFENOLICO. LA INVENCION TAMBIEN SUMINISTRA CONJUGADOS DE MARCADORES Y MPA O ANALOGOS DE MPA. LOS ANTICUERPOS DE LA INVENCION SON CAPACES DE UNIRSE A ESTOS CONJUGADOS Y TAMBIEN SON CAPACES DE INHIBIR LA ACTIVIDAD DEL MARCADOR CUANDO ESTAN UNIDOS A LOS CONJUGADOS. LA INVENCION TAMBIEN SUMINISTRA METODOS PARA LA DETERMINACION DE MPA EN UNA MUESTRA SOSPECHOSA DE CONTENER MPA QUE UTILIZA LOS ANTICUERPOS Y/O CONJUGADOS DE LA INVENCION. LA INVENCION TAMBIEN SUMINISTRA REACTIVOS DE ENSAYO ASI COMO EQUIPOS EMPAQUETADOS PARA REALIZAR LOS METODOS DE LA INVENCION.

Description

Inmunoensayo para ácido micofenólico.

Campo de la invención

El ácido micofenólico ("MPA") se produce por fermentación de diversas especies de penicillium.

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Tiene un amplio espectro de actividades, modo específico de acción, y es tolerable en grandes dosis con mínimos efectos secundarios, Epinett, y col., Journal of the American Academy of Dermatology 17 (6): 962-71 (1987). Se ha demostrado que el MPA tiene actividades antitumorales, antivíricas, antipsoriásicas, inmunosupresoras y antiinflamatorias, Lee y col., Pharmaceutical Research 7 (2): 161-166 (1990), solo con actividades antibacteriana y antifúngicas, Nelson, y col., Journal of Medicinal Chemistry 33 (2): 833-838 (1990). Inhibe la inosina monofosfato deshidrogenasa, un enzima en la síntesis de novo de los nucleótidos de purina. Debido a que los linfocitos T y B dependen grandemente de esta síntesis de novo, el MPA es capaz de inhibir la proliferación de linfocitos, que es un factor principal de la respuesta inmune.

El morfolinoetil éster de MPA, E-6-(1,3-dihidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo ("MPA-M" se hidroliza rápidamente in vivo a MPA. La administración de MPA en forma de este éster, mejora mucho la biodisponibilidad de MPA.

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El MPA-M tiene numerosas características farmacéuticas favorables diferentes, incluyendo su estabilidad a pH 2-5 y su buena solubilidad a pH bajo, indicando una disolución rápida en el tracto superior GI, Lee, y col., supra.

Cuando se usa en terapia de combinación con ciclosporina A ("CsA"), MPA-M y CsA pueden tener un modo sinérgico de acción. La CsA tiene un efecto selectivo sobre las células T, pero no suprime la actividad de producción de anticuerpos de las células B, mientras que el MPA tiene un tiene un efecto antiproliferativo tanto sobre las células T como las B. La terapia combinada CsA/MPA-M puede aumentar el tiempo de supervivencia y permite usar dosis más bajas de CsA, lo que reduciría los efectos secundarios asociados con la CsA, principalmente la nefrotoxicidad.

Puesto que el MPA es un potente material biológicamente activo, sería útil un inmunoensayo efectivo para monitorizar su biodisponibilidad. De manera adicional, puede ser importante monitorizar los niveles terapéuticos del fármaco, es decir, los niveles óptimos de fármaco necesarios para una inmunosupresión adecuada. Puesto que el MPA-M se hidroliza rápidamente a MPA, un ensayo de MPA permitiría monitorizar las dosificaciones de MPA-M.

Dichos ensayos, sin embargo, están limitados por la dificultad de preparar los anticuerpos que enlazan de manera específica al MPA y no a cualquier MPA-M o metabolitos tales como los metabolitos inactivos del ácido glucurónido micofenólico ("MPA-G"), que pueden estar presentes.

La presente invención se dirige a esta necesidad. La presente invención proporciona anticuerpos que enlazan el MPA y son capaces de modular la actividad de un marcador que se enlaza a otro anticuerpo o a un MPA análogo y, de manera adicional, que son capaces de distinguir entre el MPA y los materiales con reactividad cruzada, tales como ésteres de micofenolato y/o metabolitos de MPA.

Descripción de la técnica relacionada

Jones, y col., J. Chem. Soc. (c) 1725-1737 (1970) describen las numerosas transformaciones que experimenta el ácido micofenólico cuando se incuba con microorganismos seleccionados.

Nelson, y col., Patente de los Estados Unidos Nº 4.753.935, tiene que ver con el MPA-M, sus usos farmacéuticos y la monitorización postdosificación mediante HPLC de la concentración de MPA en el plasma del paciente.

El Documento WO-A-9118012 describe un ácido micofenólico que comprende un conjugado y un péptido de 5 a 50 subunidades. El péptido se enlaza al grupo carboxilo de la cadena secundaria.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la determinación de ácido micofenólico ("MPA") en una muestra sospechosa de contener MPA que comprende las etapas de: (a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo capaz de distinguir entre el MPA y los ésteres de micofenolato; y (b) detectar el enlace del anticuerpo al MPA. Este procedimiento puede ser homogéneo o heterogéneo. De manera alternativa, este procedimiento usa un anticuerpo capaz de distinguir entre MPOA y metabolitos de MPA.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para medir la cantidad de MPA en una muestra sospechosa de contener MPA que comprende las etapas de (a) combinar en un medio acuoso: la muestra, MPA conjugado a un marcador detectable y un anticuerpo capaz de distinguir entre MPA y un compuesto seleccionado entre el grupo constituido por ésteres de micofenolato y metabolitos de ácido micofenólico; y (b) determinar el efecto de la muestra sobre la actividad del marcador.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para un inmunoensayo homogéneo de MPA en una muestra sospechosa de contener este analito que comprende: (a) combinar en un medio líquido: la muestra, un conjugado de un MPA análogo y un enzima, un anticuerpo capaz de distinguir entre MPA y ésteres de micofenolato, y los sustratos para el enzima; (b) determinar la actividad enzimática del enzima en el medio; y (c) comparar la actividad con la actividad enzimática observada con una muestra que contiene una cantidad conocida del analito. De manera alternativa, este procedimiento usa un anticuerpo capaz de distinguir entre MPA y metabolitos de
MPA.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto que comprende un MPA enlazado con un enzima o vehículo inmunogénico, según se define en la reivindicación 1, por sustitución de uno o más átomos de hidrógeno. Esta invención se refiere también al aumento en la respuesta de dicho anticuerpo respecto de este compuesto, que es capaz de distinguir entre el MPA y un compuesto seleccionado entre el grupo constituido por ésteres de micofenolato y metabolitos de MPA. El anticuerpo puede estar enlazado a un marcador detectable.

Otro aspecto más de la invención se refiere a un kit para llevar a cabo un ensayo para la determinación del MPA, que comprende una combinación embalada de: un anticuerpo capaz de distinguir entre el MPA y los ésteres de micofenolato, y un compuesto que comprende el enlace del MPA a un marcador detectable. De manera alternativa este kit usa un anticuerpo capaz de distinguir entre el MPA y los metabolitos del MPA.

Descripción de las formas de realización específicas

Antes de continuar con la descripción de las formas de realización específicas de la invención, se definirán varios términos.

Muestra sospechosa de contener el analito: cualquier muestra que es razonablemente sospechosa de contener el analito, es decir, el MPA, que se puede analizar mediante el procedimiento de la presente invención. La muestra está normalmente en una solución acuosa tal como un fluido corporal en un huésped, por ejemplo, orina, sangre completa, plasma, suero, saliva, semen, cepa madre, esputo, fluido cerebro espinal, lágrimas, moco, o similares, pero de manera preferible en plasma o suero. Se puede pretratar la muestra tal como se describe a continuación y se puede preparar en cualquier medio conveniente que no interfiera con el ensayo. Se prefiere un medio acuoso.

Material interferente con reactividad cruzada: el material diferente del MPA que se puede reconocer mediante anticuerpos que enlazan al MPA que es un material interferente con reactividad cruzada. Estos incluyen compuestos relacionados con el MPA, tales como ésteres de micofenolato y metabolitos del MPA: El término "éster de micofenolato" incluye, pero no se limita a, ésteres de MPA en un grupo de ácido carboxílico de la cadena secundaria ligada a la posición 1' del sistema de anillo isobenzofuranilo del MPA tal como el MPA-M. El término "metabolito de MPA" se refiere a los productos del metabolismo del MPA, de manera preferible los productos que contienen el sistema del anillo de isobenzofuranilo, de manera más preferible los productos que contienen también una porción de la cadena secundaria ligada a la posición 1' tal como MPA-G.

Medida de la cantidad de MPA: procedimientos cuantitativos, semicuantitativos y cualitativos, así como otros procedimientos para determinar el MPA, se consideran todos procedimientos para determinar el MPA. Por ejemplo, se considera que se va a incluir en el alcance de la presente invención un procedimiento que detecte meramente la presencia o ausencia de MPA en una muestra sospechosa de contener MPA. Se contemplan dentro del alcance de la presente invención los términos "detectar" y "determinar", así como otros sinónimos comunes de medir.

Capaz de distinguir entre: la capacidad de un receptor o anticuerpo para enlazar de manera preferente con un primer ligando relativo a un segundo ligando. En la presente invención, el primer ligando es MPA y el segundo ligando es un éster de micofenolato o un metabolito de MPA. Normalmente se enlazarán al menos 5 veces más del primer ligando que del segundo ligando cuando el anticuerpo se combina con una muestra que contiene los ligandos. De manera preferible, al menos 10 veces más y, de manera más preferible, se enlazarán al menos 20 veces más del primer ligando. Aunque el enlace relativo de cada ligando dependerá de las concentraciones relativas en la muestra, normalmente estas condiciones se cumplen cuando la constante de enlace del anticuerpo del primer ligando es al menos igual a la constante de enlace del segundo ligando, y de manera preferible, es al menos de 10 veces, de manera más preferible, al menos de 50 veces la constante de enlace del segundo ligando. La reactividad cruzada de un anticuerpo con un primer ligando se refiere a la relación de la concentración del primer ligando a la del segundo ligando que hace que los dos ligandos se enlacen en cantidades iguales. La cuantificación de un grado "alto" o "bajo" de reactividad cruzada, es decir, la extensión de reactividad cruzada que es aceptable, depende de la concentración más alta esperada de los reactivos cruzados, la sensibilidad requerida para el ensayo y la precisión necesaria. Por ejemplo, si un anticuerpo tiene un 10% de reactividad cruzada con el MPA-G, y el MPA-G está presente en la muestra en una cantidad cinco veces mayor que el nivel más bajo de MPA que se va a detectar, entonces el nivel medido de MPA será un 50% demasiado alto cuando el MPA está en su nivel más bajo. Si solo es aceptable un 5% de error, entonces la reactividad cruzada tendrá que ser menor de un 1%. En la presente invención los anticuerpos dirigidos contra el MPA deberán presentar un grado bajo de reactividad cruzada con materiales tales como MPA-M y MPA-G.

Conjugado: una molécula formada por dos o más moléculas enlazadas entre sí, de manera opcional a través de un grupo de enlace, para formar una estructura única. El enlace se puede producir bien mediante una conexión directa (por ejemplo, un enlace químico) entre las moléculas o mediante el uso de un grupo de enlace. Por ejemplo, en un contexto de la presente invención, un análogo conjugado de MPA con un enzima es un análogo de MPA-enzima conjugado.

Miembro de un par de enlace específico (miembro "sbp"): una de dos moléculas diferentes que tiene un área sobre la superficie o en una cavidad que enlaza de manera específica con, y por tanto se define como complementaria, con una organización polar y espacial particular de la otra molécula. Los miembros del sbp se pueden denominar como ligando y receptor tales como los miembros de un par inmunológico, por ejemplo, antígeno-anticuerpo. Tal como se usa en el presente documento, el término "ligando" se refiere a cualquier compuesto orgánico para el cual existe un receptor natural o se puede preparar uno, y el término "receptor" se refiere a cualquier compuesto o composición capaz de reconocer una organización polar y espacial particular de una molécula, es decir, un emplazamiento epitópico o determinante. Los miembros sbp complementarios enlazan entre sí, como por ejemplo, un ligando y su receptor complementario. Los miembros sbp pueden ser pares inmunológicos tales como antígeno y anticuerpo, o pares no inmunológicos tales como avidina y biotina. Los miembros sbp pueden ser también moléculas pequeñas o residuos de moléculas pequeñas y sus receptores. Las moléculas pequeñas tienen un peso molecular de entre 100-2000, de manera preferible 150-100, y existe o se puede preparar un receptor para la molécula pequeña. Los ejemplos de moléculas pequeñas incluyen derivados de biotina, ácido lisérgico, fluoresceína o un derivado de fluoresceína, y vitamina B_{12}, siendo los receptores correspondientes avidina o estreptavidina, ácido antilisérgico, antifluoresceína y un factor intrínseco, de manera respectiva. Las moléculas pequeñas están a menudo unidas de forma covalente a los otros miembros sbp para formar un conjugado que tiene al menos una, y frecuentemente 2-20, pequeñas moléculas. El enlace de la molécula pequeña con el miembro sbp se puede llevar a cabo mediante reacciones químicas que dan como resultado la sustitución de un átomo de hidrógeno de la molécula pequeña con un enlace con un miembro sbp, o mediante un grupo de enlace entre la molécula pequeña y el miembro sbp de cualquier tamaño, pero de manera preferible no mayor de lo necesario para permitir el enlace con el conjugado tanto del receptor de la molécula pequeña como del miembro sbp.

Hapteno: un compuesto capaz de enlazar de manera específica con los anticuerpos correspondientes, pero no actúan ellos mismos como inmunógenos (o antígenos) para la preparación de los anticuerpos. Los anticuerpos que reconocen un hapteno se pueden preparar frente a compuestos que comprende el hapteno enlazado a un vehículo inmunogénico (o antigénico). Los haptenos son un subtipo de ligandos.

Análogo de MPA: MPA modificado. La modificación proporciona medios de unir este análogo con otra molécula. El análogo diferirá normalmente del MPA por más que la sustitución de un hidrógeno con un enlace que enlaza el análogo con un núcleo o marca.

Vehículo inmunogénico: un grupo que, cuando se conjuga con un hapteno y se inyecta en un mamífero inducirá una respuesta inmune y desencadenará la producción de anticuerpos que enlazan con el hapteno, en este caso MPA. Los vehículos inmunogénicos se denominan también vehículos antigénicos. Los vehículos inmunogénicos de la presente invención son polisacáridos, ácidos nucleicos y partículas (materiales biológicos y sintéticos), albúminas, proteínas de suero, por ejemplo, globulina, proteínas de lentes oculares y lipoproteínas, albúmina de suero bovino, hemocianina de la lapa californiana ("KLH"), ovoalbúmina de huevo y gamma globulina bovina.

Soporte o superficie: La fase sólida es normalmente un soporte o superficie, que es un material insoluble en agua poroso o no poroso que puede tener una cualquiera de numerosas formas, tales como una tira, cilindro, partícula y perla. Se describen una amplia variedad de soportes adecuados en Ullman, y col., patente de los Estados Unidos Nº 5.185.243, columnas 10-11, Kurn, y col., patente de los Estados Unidos 4.868.104, columna 6, líneas 21-42 y Milburn, y col., Patente de los Estados Unidos Nº 4.959.303, columna 6, líneas 14-31. El enlace de los miembros sbp con un soporte o superficie se puede llevar a cabo mediante técnicas bien conocidas, disponibles de manera común en la bibliografía. Véase, por ejemplo, "Immobilized Enzymes", Ichiro Chivata, Halsted Press, Nueva York (1978) y Cuatrecasas, J. Biol. Chem., 245:3059 (1970).

Sistema productor de señal ("sps"): uno o más componentes siendo al menos un componente un marcador detectable que genera una señal detectable que está relacionada con la cantidad de marcador enlazado y/o no enlazado, es decir, la cantidad de marcador enlazado o no enlazado con el compuesto que está siendo detectado. El marcador es cualquier molécula que produce o que se puede inducir a producir una señal, y de manera preferible un fluorescente, marcador radiológico, enzima, quimioluminiscente o fotosensibilizador. De esta manera, la señal se detecta y/o se mide detectando la actividad del enzima, luminiscencia, absorbancia de luz o radioactividad.

Los marcadores adecuados incluyen, como ilustración y sin limitación, enzimas tales como la fosfatasa alcalina, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa ("G6PDH") y peroxidasa del rábano picante; ribozima, un sustrato para una replicasa tal como replicasa QB; promotores; tintes; fluorescentes tales como fluoresceína, isotiocianato, compuestos de rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina o ftaldehído, y fluorescamina; quimioluminiscentes tales como isoluminol; sensibilizadores; coenzimas; sustratos de enzima; radiomarcas tales como ^{125}I, ^{131}I, ^{14}C, ^{3}H, ^{57}Co y ^{37}Se; partículas tales como látex o carbono; soles metálicos; cristalitos; liposomas; células, etc., que se pueden marcar de manera adicional con un tinte, catalizador u otro grupo detectable. Los enzimas y coenzimas adecuados se describen por Litman, y col., Patente de los Estados Unidos Nº 4.725.149, columnas 19-28, y Boguslaski, y col., Patente de los Estados Unidos Nº 4.318.980, columnas 10-14; los fluorescentes y quimioluminiscentes adecuados se describen por Litman, y col., Patente de los Estados Unidos Nº 4.275.149, en las columnas 30 y 31.

Existen numerosos procedimientos mediante los cuales el marcador puede producir una señal detectable por medios externos, deseable por examen visual, por ejemplo, mediante radiación electromagnética, calor, y reactivos químicos. Se pueden enlazar también el marcador o el resto de miembros sps a un miembro sbp, otras moléculas o a un soporte.

El marcador puede producir de manera directa una señal, y por tanto, no se requieren componentes adicionales para producir una señal. Numerosas moléculas orgánicas, por ejemplo fluorescente, son capaces de absorber el ultravioleta y la luz visible, en la que la energía de transferencia de absorción de la luz de estas moléculas las eleva a un estado de energía excitado. Esta energía absorbida se disipa a continuación mediante la emisión de luz a una segunda longitud de onda. Otras marcas que producen de manera directa una señal incluyen isótopos radioactivos y tintes.

De manera alternativa, el marcador puede necesitar otros componentes para producir la señal, y el sistema productor de la señal Incluiría entonces todos los componentes requeridos para producir una señal medible, que pueden incluir sustratos, coenzimas, mejoradores, enzimas adicionales, sustancias que reaccionan con productos enzímicos, catalizadores, activadores, cofactores, inhibidores, limpiadores, iones metálicos, y sustancias de enlace específicas que requieren para el enlace sustancias que generen una señal. En la Patente de los Estados Unidos Nº 5.185.243, de Ullman, y col., se puede encontrar una descripción detallada de los sistemas de producción de señales.

El marcador se puede unir de manera covalente a numerosos miembros sbp: un anticuerpo que enlaza con el MPA; un receptor para un anticuerpo que enlaza con el MPA; un receptor que es capaz de enlazar con una molécula pequeña conjugada con un anticuerpo que enlaza con el MPA; o un ligando tal como un análogo de MPA. El enlace del marcador con el miembro sbp se puede llevar a cabo mediante reacciones químicas que dan como resultado la sustitución de un átomo de hidrógeno del marcador con un enlace al miembro sbp, o pueden incluir un grupo de enlace entre el marcador y el miembro sbp. Se pueden enlazar también de manera covalente otros miembros sbp con miembros sbp. Por ejemplo, dos miembros sbp tal como un fluorescente o un quencher se pueden cada uno enlazar con un anticuerpo diferente que forma un complejo con el analito MPA. La formación del complejo hace que el fluorescente y el quencher estén muy próximos, permitiendo de esta manera que el quencher interactúe con el fluorescente para producir una señal. Los procedimientos de conjugación son bien conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Rubenstein, y col., Patente de los Estados Unidos Nº 3.817.837. Esta invención contempla también tener un anticuerpo enlazado con un primer miembro sps y un marcador detectable como el segundo miembro sps. Por ejemplo, cuando el marcador detectable está enlazado con un análogo de MPA, se puede medir la extensión del enlace del anticuerpo con el análogo detectando la señal producida por la interacción de los miembros sps.

Materiales auxiliares: se emplearán de manera frecuente diversos materiales auxiliares en un ensayo de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, los tampones estarán normalmente presentes en el medio de ensayo, así como estabilizadores del medio de ensayo y los componentes del ensayo. De manera frecuente, además de estos aditivos, se pueden incluir otras proteínas, como albúminas o tensioactivos, en particular tensioactivos no iónicos, mejoradores del enlace, por ejemplo, polialquilén glicoles, o similares.

Grupo de enlace: una porción de la estructura que conecta 2 o más subestructuras. El grupo de enlace puede ser un enlace o puede tener al menos 1 cadena ininterrumpida de átomos diferentes del hidrógeno (u otros átomos monovalentes) extendiéndose entre las subestructuras. El número de átomos en la cadena será al menos de uno, y se determina por el recuento del número de átomos diferentes de hidrógeno a lo largo de la ruta más corta entre las subestructuras que están siendo conectadas, y es normalmente de 1-30, usualmente 2-10, de manera preferible 3-8 átomos, seleccionados cada uno de manera independiente entre el grupo constituido por carbono, oxígeno, nitrógeno, azufre y fósforo. El número total de átomos en el grupo de enlace se determina mediante recuento del carbono total, y los átomos de oxígeno, nitrógeno, azufre y fósforo, es decir, los átomos diferentes del hidrógeno. Normalmente, el grupo de enlace tiene un total de menos de 30 átomos, de manera preferible de menos de 20 átomos, de manera más preferible de menos de 10 átomos. Como regla general se puede seleccionar de manera arbitraria la longitud de un grupo de enlace particular a proporcionar por conveniencia de la síntesis y la incorporación de cualquier grupo deseado. Los grupos de enlace pueden ser alifáticos o aromáticos aunque los grupos aromáticos estarán normalmente implicados con los grupos diazo. El oxígeno estará normalmente presente como oxo u oxi, enlazado al carbono, azufre, nitrógeno o fósforo; el nitrógeno estará normalmente presente como nitro, nitroso o amino, normalmente enlazado al carbono, oxígeno, azufre o fósforo; el azufre sería análogo al oxígeno; mientras que el fósforo estará enlazado al carbono, azufre, oxígeno o nitrógeno, de manera usual como fosfonato y mono- o diéster
fosfato.

Las funcionalidades comunes en la formación de un enlace covalente entre el grupo de enlace y la molécula que se van a conjugar son alquilamina, amidina, tioamida, ditiol, éter, urea, tiourea, guanidina, azo, tioéter y ésteres de carboxilato, sulfonato, y fosfato, amidas y tioésteres.

Alquilo inferior: un grupo alquilo (radical monovalente ramificado o no ramificado derivado de un hidrocarburo alifático mediante eliminación de un átomo de H) que contiene entre 1-5 átomos de carbono. Los ejemplos ilustrativos incluyen metilo, etilo, propilo, butilo, isopropilo, isobutilo, pentilo e isopentilo.

Formas de realización específicas

Un aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto que comprende ácido micofenólico ("MPA") enlazado a un enzima o a un vehículo inmunogénico según se define en la reivindicación 1 por sustitución de uno o más átomos de hidrógeno, tales como un átomo de hidrógeno del grupo carboxilato. Este compuesto encuentra utilidad como reactivo de ensayo para uso en procedimientos de detectación del MPA cuando, por ejemplo, la proteína es un marcador enzimático. Este compuesto también encuentra utilidad en el aumento de los anticuerpos cuando, por ejemplo, la proteína es un vehículo inmunogénico.

El enzima y el vehículo inmunogénico conjugados de la invención se pueden preparar mediante síntesis única o multi etapa, cuyos numerosos procedimientos estándar son bien conocidos en la técnica. Normalmente, dichos conjugados se preparan mediante una única etapa directa de acoplamiento de un análogo de MPA con un enzima o vehículo inmunogénico, tal como en el Esquema I. De manera alternativa, los conjugados se preparan mediante síntesis multi etapa cuando se prepara en primer lugar un análogo de MPA y a continuación se enlaza a la enzima o vehículo inmunogénico.

Un material de partida conveniente para dicha solución es el propio MPA. Normalmente, el MPA se modifica en un grupo funcional existente para permitir el enlace o la unión. Los grupos funcionales preferidos son los hidroxi fenólicos en la posición 4 y el grupo carboxilo en la posición 1', de manera más preferible el grupo carboxilo. Por ejemplo, la modificación del grupo funcional carboxilo en la posición 1' mediante sustitución del átomo de hidrógeno del grupo carboxilato da como resultado un compuesto de fórmula:

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en la que X es un polipéptido, L es un enlace o grupo de enlace, R es H, alquilo inferior, o alquilo-CO bajo, y n es un número comprendido entre 1 hasta el peso molecular de X dividido por 5.000.

El ejemplo de una etapa única de síntesis de conjugado de MPA utilizando un grupo funcional existente es el procedimiento que se muestra en el Esquema I:

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Esquema I

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En una hipótesis, el Esquema I implica hacer reaccionar el MPA con un compuesto tal como carbonato de disuccinilo ("DSC") y un marcador enzimático o un vehículo inmunogénico en un tampón adecuado. Los ejemplos de enzimas incluyen la G6PDH y la fosfatasa alcalina, y los ejemplos de vehículos inmunogénicos incluyen KLH. Este es un procedimiento de ejemplo que pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invención.

De manera alternativa, se puede añadir un grupo funcional a la estructura del MPA mediante oxidación de cualquier enlace C-H para formar, por ejemplo, un hidroxilo, aldehído, cetona, carboxilo, amino, halo o sulfidrilo. De manera más preferible la oxidación dará como resultado un oxígeno que contiene grupos tales como un grupo hidroxilo, aldehído, cetona, o carboxilo, aún de manera más preferible un grupo hidroxilo.

De manera preferible, la oxidación se lleva a cabo en un emplazamiento que es químicamente oxidable con alto rendimiento y da como resultado un análogo que, cuando se conjuga con un enzima, da como resultado un conjugado que tiene alta capacidad de inhibición y alta capacidad de modulación cuando se usa junto con un anticuerpo de la invención, y, cuando se conjuga con un vehículo inmunogénico, da como resultado un inmunógeno útil para la preparación de los anticuerpos de la invención. Un emplazamiento preferido para dicha oxidación son los hidrógenos benzílicos del grupo metilo en la posición 7 del anillo de isobenzofuranilo del ácido micofenólico, que dan como resultado un compuesto de fórmula:

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en la que: X es un polipéptido, L es un enlace o un grupo de enlace, R es H, alquilo inferior, o alquilo-CO bajo, y n es un número entre 1 hasta el peso molecular de X dividido por 5000.

Un ejemplo de una síntesis multi etapa basada en la adición oxidativa de un grupo hidroxilo con un ácido micofenólico es el procedimiento que se muestra en el Esquema II:

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Esquema II

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En una hipótesis, el Esquema II implica la oxidación del MPA usando una modificación del procedimiento de Jones, y col., J. Chem. Soc. (C) 1725-1737 (1979). El MPA se oxida con ferricianuro de potasio alcalino. El compuesto resultante se trata con cloruro de acetilo para dar clorometil MPA que se trata a continuación con un exceso de 1,2-etanoditiol en presencia de carbonato de potasio para dar MPA extendido con ditiol.

En otra hipótesis alternativa se puede añadir un grupo funcional a la estructura del MPA modificando un grupo funcional existente, por oposición a la oxidación de un enlace C-H. Por medio de ejemplo, se rompe el grupo metoxilo en la posición 6 del sistema del anillo de isobenzofuranilo y el OH fenólico resultante se hace reaccionar para formar un éter, éster, carbonato, o similar. De manera preferible el OH fenólico se hace reaccionar para formar un enlace éter, en el que el grupo éter se convierte en un grupo funcional capaz de reaccionar en una reacción de conjugación. Esto da como resultado un compuesto de fórmula:

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en la que: X es un polipéptido, L es un enlace o un grupo de enlace, R es H, alquilo inferior, o alquilo CO bajo, y n es un número entre 1 hasta el peso molecular de X dividido por 5000.

El ejemplo de una síntesis multi etapa basada en la modificación de un grupo funcional existente es el procedimiento que se muestra en el Esquema III:

Esquema III

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En una hipótesis, el Esquema III implica la rotura del grupo metoxilo en la posición 6 del anillo de isobenzofuranilo según el procedimiento descrito por Harrison, Chem. Común. 16 (1969), mediante reacción con LiI en colidina. El MPA difenólico resultante se extiende, por ejemplo, mediante el procedimiento descrito por Jones, y col., Journal of Medicinal Chemistry 14:305 (1971), por reacción con K_{2}CO_{3} e ICH_{2}CH_{2}CH_{2}S (t-bu) en acetona. Tras cromatografía opcional en gel de sílice, el tiol protegido se desprotege mediante reacción, por ejemplo con ácido trifluoroacético. Los conjugados del MPA extendido con ditiol se preparan mediante reacción en tampón fosfato con marcadores enzimáticos modificados con bromoacetilo o vehículos inmunogénicos, tales como bromoacetil-KLH o bromoacetil-G6PDH. Este es un procedimiento de ejemplo que pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invención. Cualesquiera de los procedimientos de conjugación aplicables descritos anteriormente son adecuados en la etapa de conjugación de estos procedimientos de ejemplo.

Frecuentemente, el enzima o vehículo inmunogénico contendrá un grupo amino o hidroxilo al cual se va a enlazar el MPA o análogo de MPA y la etapa de conjugación puede ser cualesquiera de los numerosos procedimientos estándar para sintetizar poli (aminoácidos). Se puede encontrar un resumen de dichas etapas en White, y col., "Principles of Biochemistry" (McGraw-Hill, NY, 1978), páginas 92-95. Véase también Maggio, E. T. "Enzyme-Inmunoassay" (CRC Press, Boca Raton, FL, 1980), Capítulo 4, páginas 81-86.

De manera general, cuando el MPA o análogo de MPA contiene un grupo carboxilato, se protege cualquier grupo amino, hidroxilo, carboxilo, u otros grupos que no se hacen reaccionar. Esto se describe con detalle por Greene, T. W. "Protective Groups in Organic Synthesis" (Wiley-Interscience, NY, 1981) y McOmie, J: F. W., Ed. "Protective Groups IN Organic Chemistry" (Plenum Press, NY, 1973).

Los grupos protectores adecuados incluyen, sin limitación, benciloxicarbonilo, trifenilmetilo, butiloxicarbonilo terciario, ftaloílo, trifluoroacetilo, bencilo, p-toluén sulfonilo, alquilo inferior saturado, éster de bencilo, éster de butil terciario y acetilo.

A continuación se activa el MPA o análogo de MPA protegido de manera opcional. De manera preferible el compuesto se activará mediante reacción con un reactivo de activación tal como un alquilo (de menos de 9 átomos de carbono) cloroformiato, por ejemplo cloroformiato de isobutilo; dialquilcarbodiimida, por ejemplo, diciclohexil carbodiimida; 1-etil-3-(3-dimetilamino propil) carbodiimida ("EDAC"), 1-ciclohexil-3-(2-morfolino-4-etil) carbodiimida metil-p-toluensulfonato, N-hidroxisuccinimida / EDAC y N-hidroxisulfosuccinimida / EDAC, en un solvente orgánico tal como dimetil formamida ("DMF"). La reacción de activación se lleva a cabo de manera normal a 10-100ºC, de manera preferible a 0-30ºC, de manera más preferible a 0-10ºC, de manera preferible bajo atmósfera de nitrógeno, helio, argón, o similares. La reacción de activación se lleva a cabo durante 1 minuto a 10 días, de manera preferible entre 1 hora a 2 días, de manera más preferible durante 6-18 horas.

Tras la reacción de activación, el compuesto activado se añade a una solución del polipéptido en un solvente orgánico u acuoso / orgánico tal como DMF o tampón DMF / borato. La adición puede tener lugar durante un período de tiempo, este requerirá normalmente entre 1 minuto y 12 horas, de manera preferible entre 10 minutos y 8 horas, y de manera más preferible entre 30 minutos y 3 horas. Tras la adición, se deja agitar la mezcla durante entre 1 minuto y 3 días, de manera preferible entre 10 minutos y 1 día, de manera más preferible entre 1-18 horas.

A continuación se puede eliminar cualquier grupo protector no deseado. La etapa de desprotección se seleccionará en función del grupo protector detallado anteriormente. Las referencias citadas anteriormente describen las condiciones y los reactivos para la eliminación de los grupos protectores preferidos.

Otro procedimiento de conjugación implica la reacción de una funcionalidad sin el oxo carbonilo del enzima o vehículo inmunógeno con un compuesto que contiene un \alpha-halo o un pseudohaloalquil carbonilo. El enzima o vehículo inmunogénico resultante que contiene el halo o \alpha-seudohalo se hace reaccionar a continuación con un mercaptano que contiene el MPA o análogo de MPA para formar el conjugado deseado. Este procedimiento se describe de manera general por Rowley, y col., patente de los Estados Unidos Nº 4.220.722. Los compuestos preferidos son compuestos \alpha-bromo tales como ácido \alpha-bromoacético.

Las reacciones de conjugación con polipéptidos de enzima, tales como G6PDH, se pueden afectar por numerosos factores que incluyen, pero no se limitan a, pH, temperatura, tampón, fuerza iónica, sustancias que pueden proteger el emplazamiento activo del enzima, cantidad y tipo de cosolvente, tiempo de reacción, y química de activación. Para cada combinación enzima-MPA, la manipulación apropiada de estas variables puede llevar a conjugados que son mejorados en una o más de las siguientes propiedades: desactivación reducida para una cantidad dada de inhibición; curva estándar más grande; precisión de ensayo mejorada; y estabilidad térmica aumentada. Se puede usar normalmente un intervalo de valores de pH entre 5-9,5 para las reacciones de conjugación. Estas reacciones se llevan a cabo de manera general a 0-40ºC, de manera preferible 4-20ºC. Se pueden usar numerosos tampones y sales, sólos y en combinación para dichas reacciones. Estas incluyen Tris, bicarbonato, fosfato, pirofosfato, EDTA, KCl, NaCl, y muchos otros: El emplazamiento activo se puede proteger mediante sustratos (es decir, G6P), cofactores (NAD^{+}, NADH, NADP^{+}, NADPH) y análogos de cofactores (tio-NAD^{+}, tio-NADH, tio-NADP^{+}, o tio-NADPH), y los compuestos que reaccionan de manera reversible con lisina (es decir, piridoxal) para reducir la desactivación del enzima durante la conjugación. Los cosolventes que pueden mejorar la solubilidad del MPA incluyen, sin limitación, dimetilformamida, carbitol, dimetil sulfóxido, 1-metil-2-pirrolidinona, y 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro 2 (1H)-pirimidinona. Este puede ser útil como un 1-30% del volumen de reacción. Las reacciones pueden variar entre 15 minutos y muchos días, dependiendo de la química de activación. Los compuestos carboxílicos se pueden activar para formar ésteres con N-hidroxisuccinimida o su análogo sulfo-, o para mezclar anhídridos a través de la reacción con el cloroformiato de carbitol o t-butilcloroformiato, o se puede acoplar de manera directa usando carbodiimidas tales como EDAC. Para la reacción con los tioles de la cisteína en el enzima, el MPA o análogo del MPA deberían contener un buen grupo saliente tal como I, Br o tosilo; de manera alternativa, el MPA o análogo del MPA puede contener un tiol, activado con un compuesto tal como 2,2' ditio-dipiridina.

Se puede purificar el conjugado si se desea. Se han descrito con detalle la purificación y caracterización de los conjugados de poli (aminoácido)-hapteno en Maggio, supra, Capítulo 4, páginas 86-88. Por ejemplo, la purificación puede ser mediante diálisis frente a soluciones acuosas / orgánicas y acuosas tales como agua / DMF o agua, o mediante cromatografía de filtración en gel o soportes tales como Sephadex.

Un aspecto de la presente invención se refiere a anticuerpos preparados en respuesta a un inmunógeno que comprende ácido micofenólico ("MPA") o un análogo conjugado de MPA, de manera opcional a través de un grupo de enlace, con un vehículo inmunogénico. Además, la presente invención incluye compuestos que son conjugados de tales anticuerpos y un marcador detectable.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoclonales o policlonales, y se pueden preparar mediante técnicas que son bien conocidas en la técnica tales como la inmunización de un huésped y la recogida de suero a partir del cual se puede separar las inmunoglobulinas por técnicas conocidas (policlonales), preparando líneas celulares continuas de híbridos y recogiendo la proteína segregada (monoclonal), o mediante clonación y expresión de secuencias de nucleótidos o versiones mutagénicas de las mismas que codifican al menos las secuencias de aminoácidos requeridas para el enlace específico de anticuerpos naturales. Los anticuerpos pueden incluir una inmunoglobulina completa, o un fragmento de la misma, en la que las inmunoglobulinas incluyen las diversas clases e isotipos, tales como IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 e IgM. Los fragmentos de los mismos pueden incluir Fab, Fv, F(ab')2 y Fab.

Se pueden obtener anticuerpos monoclonales mediante el procedimiento que describen Milstein y Kohler en Nature 256:495-7 (1975). Se inyecta un inmunógeno a un huésped, normalmente un ratón, seguido por la eliminación de las células del bazo del animal. El huésped también puede ser células de bazo insensibilizadas, que se sensibilizan con el inmunógeno in vitro. Las células resultantes se fusionan con células de mieloma. El resultado es una célula híbrida, denominada como "hibridoma" que se puede cultivar in vitro. La población de hibridomas se tamiza y manipula de tal manera que se aíslan clones individuales, cada uno de los cuales segrega un anticuerpo único para el antígeno.

Un anticuerpo es una inmunoglobulina que enlaza de manera específica con, y se define por tanto como un complementario de, una organización polar y espacial particular de otra molécula. Los anticuerpos de la presente invención son capaces de reconocer y enlazarse de manera específica con el MPA, y son por tanto útiles en ensayos para detectar le presencia de MPA en una muestra sospechosa de contener MPA. De manera más importante, estos anticuerpos son capaces de distinguir entre el MPA y compuestos estrechamente relacionados que pueden también estar presentes en la muestra que está siendo ensayada, tales como aquellos seleccionados entre el grupo constituido por ésteres de micofenolato y metabolitos del MPA. En una forma de realización de la invención, los anticuerpos son capaces de distinguir entre el MPA y los ésteres de micofenolato, tales como MPA-M. En otra forma de realización de la invención, los anticuerpos son capaces de distinguir entre el MPA y los metabolitos del MPA, tales como MPA-G.

Los anticuerpos de esta invención se producen de manera preferible para un inmunógeno seleccionado entre el grupo constituido por:

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y

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en la que X es un vehículo inmunogénico, L es un enlace o un grupo de enlace, R se selecciona entre el grupo constituido por H, alquilo inferior, y alquilo CO bajo, y n es un número entre 1 hasta el peso molecular de X dividido por 5000.

Tal como se ha señalado anteriormente, estos anticuerpos son útiles en ensayos de MPA. De acuerdo con esto, otro aspecto de la presente invención se refiere a los procedimientos para determinar MPA en una muestra sospechosa de contener MPA que comprende las etapas de: (a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo capaz de distinguir entre MPA y los ésteres de micofenolato; y (b) detectar el enlace del anticuerpo con el MPA. Otra forma de realización de la invención usa un anticuerpo capaz de distinguir entre el MPA y el metabolito del MPA.

Este procedimiento puede comprender de manera adicional poner en contacto la muestra con un análogo marcado del MPA en la etapa (a). El procedimiento puede ser homogéneo o heterogéneo. Un ejemplo de un formato homogéneo es aquel en que el marcador es un enzima cuya actividad se modifica cuando el anticuerpo enlaza con el análogo. Un ejemplo de un formato heterogéneo es aquel en que el anticuerpo se enlaza con un soporte o es capaz de enlazarse con un soporte. Tal como se usa en el presente documento, el término "capaz de enlazarse con un soporte" significa por ejemplo que un reactivo, tal como un anticuerpo anti MPA se enlaza con un primer miembro sbp o con una molécula pequeña y con un segundo miembro sbp complementario o receptor de la molécula pequeña, este se enlaza a la vez con un soporte. De manera alternativa, un receptor para el anticuerpo anti MPA, tal como un anticuerpo de anti-ratón, se enlaza con un soporte y es usado para capturar el anticuerpo anti MPA. Por tanto, el anticuerpo anti MPA no se enlaza realmente con un soporte, pero resultará enlazado cuando se añada un miembro sbp o receptor complementario.

Se puede detectar el enlace del anticuerpo con el MPA de numerosas formas que son bien conocidas en la técnica. El enlace del anticuerpo y el MPA forma un complejo inmune que se puede detectar directa o indirectamente. Los complejos inmunes se detectan de manera directa, por ejemplo, cuando los anticuerpos empleados se conjugan con un marcador. El complejo inmune se detecta de manera indirecta examinando el efecto de formación del complejo inmune en un medio de ensayo sobre un sistema de producción de señales o empleando un receptor marcado que enlaza de manera específica con un anticuerpo de la invención.

El ensayo de la invención tiene aplicación para todos los inmunoensayos para el MPA. El ensayo se puede llevar a cabo sin separación (homogéneo) o con separación (heterogéneo) de cualquiera de los componentes o productos de ensayo. Los inmunoensayos homogéneos se ejemplifican mediante técnicas de inmunoensayo multiplicado por enzimas (EMIT®) descritas por Rubenstein, y col, Patente de los Estados Unidos Nº 3.817.837, columna 3 línea 6 en columna 6, línea 64; los procedimientos de inmunofluorescencia tales como aquellos descritos por Ullman, y col., Patente de los Estados Unidos Nº 3.996.345, columna 17, línea 59 en columna 23, línea 25; técnicas de tunelamiento de enzimas tales como aquellas descritas por Maggio, y col, Patente de los Estados Unidos Nº 4.233.402, columna 6, línea 25 en columna 9, línea 63; y otros inmunoensayos de enzimas tales como el ensayo inmunosorbente ligado al enzima ("ELISA") se describen en Maggio, E. T. supra. Los ejemplos de ensayos heterogéneos son los radioinmunoensayos, descritos en Yalow, y col., J. Clin. Invest. 39: 1157

La muestra, de manera preferible en un medio adecuado, se puede examinar directamente o se puede pretratar antes que la muestra se añada al medio de ensayo. El pretratamiento puede volver el MPA más fácilmente disponible para uno o más de los reactivos de ensayo al reducir la interferencia en el ensayo eliminando materiales no deseados. La muestra se puede pretratar para separar o lisar células; precipitar, hidrolizar o desnaturalizar proteínas; hidrolizar lípidos; solubilizar el analito; o similares. Dicho pretratamiento puede incluir, sin limitación: la centrifugación; el tratamiento de la muestra con un solvente orgánico, por ejemplo, un alcohol, de manera preferible un alcohol que tenga menos de 7 átomos de carbono tal como metanol; y el tratamiento con detergentes.

El ensayo se llevará a cabo de manera normal en un medio tamponado acuoso a un pH moderado, que generalmente proporciona una sensibilidad óptima al ensayo.

El medio acuoso puede ser solamente agua o puede incluir entre un 0-40 porcentaje en volumen de un cosolvente. El pH del medio estará comprendido de manera normal en el intervalo de 4-11, de manera más usual en el intervalo de 5-10, y de manera preferible en el intervalo de 6,5-9,5. El pH será de manera usual un compromiso entre el enlace óptimo de los miembros de enlace de cualquier par de enlace específico y el pH óptimo para diferentes reactivos del ensayo tales como los miembros del sistema que produce la señal.

Se pueden usar diversos tampones para conseguir el pH deseado y mantener el pH durante la determinación. Los tampones ilustrativos incluyen borato, fosfato, carbonato, tris y barbital. No es crítico para esta invención el tampón concreto empleado, pero en un ensayo individual se pueden preferir uno u otro tampón.

Se emplean normalmente temperaturas moderadas para llevar a cabo el ensayo y de manera usual temperaturas constantes durante el período de medida, de manera particular para las determinaciones de la velocidad. Las temperaturas de incubación oscilarán de manera normal entre 5-45ºC, de manera más usual entre 15-40ºC. Las temperaturas durante las medidas oscilaran generalmente entre 10-50ºC, de manera más usual entre 15-40ºC.

La concentración de MPA que se puede ensayar variará de manera general entre 10^{-5} y 10^{-13} M, de manera más usual entre 10^{-6} y 10^{-8} M. Consideraciones tales como si el ensayo es cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo (en relación con la cantidad de MPA presente en la muestra), la técnica de detección concreta y la concentración del MPA determinarán de manera normal las concentraciones de los diversos reactivos.

Las concentraciones de los diversos reactivos en el medio de ensayo se determinarán de manera general mediante el intervalo de concentración del MPA de interés. Sin embargo, la concentración final de cada uno de los reactivos se determinará normalmente de manera empírica para optimizar la sensibilidad del ensayo en todo el intervalo. Esto es, una variación de la concentración del MPA que sea significativa debería proporcionar una diferencia de señala medible de manera precisa.

Aunque se puede variar ampliamente el orden de adición, existirán ciertas preferencias dependiendo de la naturaleza del ensayo. El orden más simple de adición es añadir todos los materiales de manera simultánea y determinar el efecto que el medio de ensayo tiene sobre la señal en un ensayo homogéneo. De manera alternativa, los reactivos se pueden combinar de manera secuencial. De manera opcional, se puede implicar una etapa de incubación subsiguiente con cada adición, oscilando generalmente entre 30 segundos y 6 horas, de manera más usual entre 1 minuto y 1 hora.

Los siguientes ejemplos describen de manera adicional las formas de realización específicas de la invención, y se pretende que describan y no limiten el alcance de la invención.

En un ensayo homogéneo, después que se han combinado los reactivos, la señal se determina y se relaciona con la cantidad de MPA en la muestra ensayada. Por ejemplo, en el EMIT, se combina una muestra sospechosa de contener MPA en un medio acuoso bien de manera simultánea o de manera secuencial con un enzima MPA conjugado y un anticuerpo capaz de reconocer el MPA y el conjugado. De manera general, se añade un sustrato para el enzima que da como resultado la formación de un producto cromógeno o fluorógeno tras la reacción catalizada del enzima. Los enzimas preferidos son glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y fosfatasa alcalina. El MPA de la muestra y el conjugado MPA-enzima competen por los emplazamientos de enlace del anticuerpo. Se determina a continuación la actividad del enzima en el medio, de manera usual por medios espectrofotométricos, y se compara con la actividad del enzima determinada cuando se ensartan los calibradores o las muestras de referencia en las que está presente una cantidad conocida de MPA. Normalmente, los calibradores se ensayan de manera similar al ensayo de la muestra sospechosa de contener MPA. Los calibradores contendrán normalmente diferentes, pero conocidas, concentraciones del analito de MPA que se va a determinar. De manera preferible, los intervalos de concentración presentes en los calibradores medirán el intervalo de concentraciones de MPA sospechosas en las muestras desconocidas.

Los ensayos heterogéneos implican de manera usual una o más etapas de separación y pueden ser competitivos o no competitivos. Se describen una variedad de formatos de ensayo competitivos y no competitivos en Davalian, y col., Patente de los Estados Unidos Nº 5.089.390, columna 14, línea 25 en columna 15, línea 9. En un ensayo competitivo típico un anticuerpo de la invención se enlaza con un soporte, a continuación se pone en contacto con un medio que contiene la muestra y el conjugado de MPA para un marcador detectable tal como un enzima. El MPA de la muestra compete con el conjugado para enlazar con el anticuerpo. Después de separar el soporte y el medio se determina la actividad del marcador del soporte o del medio mediante técnicas convencionales y se relaciona con la cantidad de MPA en la muestra.

Un ensayo no competitivo típico es un ensayo sándwich descrito por David, y col., Patente de los Estados unidos Nº 4.486.530, columna 8, línea 6 en columna 15, línea 63. En este procedimiento se forma un complejo sándwich inmune que comprende el MPA, un primer anticuerpo (monoclonal o policlonal) que enlaza con el MPA y un segundo anticuerpo que enlaza con el MPA. De manera subsiguiente se detecta el complejo sándwich inmune y se relaciona con la cantidad de MPA en la muestra. El complejo sándwich inmune se detecta en virtud de la presencia en el complejo de un marcador en la que bien o el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo contienen marcas o sustituyentes capaces de combinar con marcas, tales como por ejemplo, enlazando el anticuerpo con biotina y proporcionando un enlace de avidina a el marcador.

Otro procedimiento útil para llevar a cabo la presente invención se describe por Weng y col., patente de los Estados Unidos Nº 4.879.214, columna 9, línea 11, en columna 12, línea 39. El procedimiento implica proporcionar en combinación una solución de ensayo que contiene la muestra, un primer miembro sbp y una porción de contacto de una tira de ensayo de material embebible capaz de ser atravesada por la solución de ensayo por medio de la acción capilar. El primer miembro sbp puede ser capaz de unirse el analito. La tira contiene un segundo miembro sbp y enlazar de manera no difusiva el primer miembro sbp en pequeños emplazamientos sobre la tira separados de la porción de contacto de la tira. La tira puede contener de manera adicional un tercer miembro sbp entre los pequeños emplazamientos y la porción de contacto. Se produce una señal detectable en relación con la presencia del analito en la solución de ensayo.

Otro procedimiento que es útil para llevar a cabo el ensayo de esta invención se describe por Ullman y col., patente de los Estados Unidos Nº 4.857.453, columna 11, línea 21 en columna 14, línea 42, y columna 18, línea 21 en columna 21, línea 55.

Se emplearán de manera frecuente diversos materiales auxiliares en un ensayo de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, los tampones estarán presentes de manera normal en el medio de ensayo, así como los estabilizadores para el medio de ensayo y los componentes del ensayo. Frecuentemente, en adición a estos aditivos, se pueden incluir proteínas adicionales tales como albúminas, por ejemplo, polialquilén glicoles, o similares.

Un procedimiento preferido de la invención para determinar el MPA en una muestra sospechosa de contener MPA comprende las etapas de: (a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo que enlaza con el MPA; y (b) detectar el enlace del anticuerpo con el MPA. El anticuerpo se produce con uno de los siguientes inmunógenos:

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y

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en las que X es un vehículo inmunógeno, L es un enlace o un grupo de enlace, R se selecciona entre el grupo constituido por H, alquilo inferior, y alquilo inferior- CO, y n es un número comprendido entre 1 hasta el peso molecular de X dividido por 5.000. El anticuerpo se puede enlazar con un soporte o es capaz de enlazarse con un soporte. En este procedimiento, la etapa (a) puede comprender de manera adicional poner en contacto la muestra con uno de los siguientes compuestos;

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aquí, X' es un marcador detectable, L es un enlace o un grupo de enlace, R se selecciona entre el grupo constituido por H, alquilo inferior y alquilo CO-bajo, y n es un número comprendido entre 1 hasta el peso molecular de X' dividido por 5.000.

Otro procedimiento preferido de la invención para medir la cantidad de MPA en una muestra sospechosa de contener MPA comprende las etapas de: (a) combinar en un medio acuoso: la muestra, el conjugado de MPA con un marcador detectable, y un anticuerpo capaz de distinguir entre el MPA y un compuesto seleccionado entre el grupo constituido por ésteres de micofenolato y metabolitos del MPA; y (b) determinar el efecto de la muestra sobre la actividad del marcador. El marcador detectable es de manera preferible un enzima y la etapa determinante implica medir la actividad del enzima. El procedimiento puede incluir también sustratos para el enzima en la etapa de combinación.

Otro procedimiento preferido es un inmunoensayo homogéneo para el MPA en una muestra sospechosa de contener MPA que comprende: (a) combinar en un medio líquido: la muestra, un conjugado de un análogo del MPA y un enzima, un anticuerpo capaz de distinguir entre el MPA y los ésteres de micofenolato, y los sustratos para el enzima; (b) determinar la actividad enzimática del enzima en el medio; y (c) comparar la actividad con la actividad enzimática observada con una muestra que contiene una cantidad conocida de MPA.

La presente invención se refiere también a composiciones que comprenden complejos formados a partir de un anticuerpo de la invención y MPA. Dichos complejos son útiles como calibradores en los procedimientos de la invención en los que el procedimiento se calibra determinando la cantidad de MPA en una solución de calibración que tiene una concentración conocida de MPA. De esta manera, la presente invención se refiere también a un procedimiento para preparar dicha composición que comprende la etapa de combinar en un medio líquido: MPA y un anticuerpo de la invención. Dichos compuestos se pueden embalar en el kit de aspectos de la invención para uso en dichos calibradores.

Otro aspecto de la presente invención se refieres a kits útiles para llevar a cabo de manera conveniente los procedimientos de ensayo de la invención para la determinación del MPA. Para aumentar la versatilidad de la invención sujeto, los reactivos útiles en los procedimientos de la invención se pueden proporcionar en una combinación embalada, en el mismo o contenedores separados, en forma líquida o liofilizada de tal manera que la relación de reactivos proporciona una optimización sustancial del procedimiento y el ensayo. Los reactivos pueden cada uno estar en contenedores separados o se pueden combinar diversos reactivos en uno o más contenedores dependiendo de la reactividad cruzada y la estabilidad de los reactivos.

El kit contiene un anticuerpo de la invención aumentado en respuesta a un análogo del conjugado de MPA, de manera opcional a través de un grupo de enlace, en un vehículo inmunógeno. Los inmunógenos adecuados incluyen:

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en la que X es un vehículo inmunógeno, L es un enlace o un grupo de enlace, R se selecciona entre el grupo constituido por H, alquilo inferior, y alquilo CO-bajo y n es un número comprendido entre 1 hasta el peso molecular de X dividido por 5.000. De manera preferible, el anticuerpo puede distinguir entre el MPA y los ésteres de micofenolato y/o los metabolitos de MPA. Dichos anticuerpos se puede marcar no marcar.

El kit puede comprender también como reactivo MPA o un análogo conjugado del MPA, de manera opcional a través de un grupo de enlace, con un marcador. Los conjugados adecuados incluyen:

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en los que X' es un marcador detectable, L es un enlace o un grupo de enlace, R se selecciona entre el grupo constituido por H, alquilo inferior y alquilo CO bajo y n es un número comprendido entre 1 hasta el peso molecular de X' dividido por 5.000.

Otro reactivo útil para llevar a cabo los aspectos del ensayo de la invención es un complejo formado entre un anticuerpo de la invención y un conjugado del MPA marcado de la invención. Dicho kit puede comprender de manera adicional otros reactivos embalados para llevar a cabo los aspectos del ensayo de la invención que incluyen, por medio de ejemplo y sin limitación, miembros de un sistema que produce señales, soportes, reactivos auxiliares, y así sucesivamente. En una forma de realización preferida, el kit comprende en una combinación embalada: (a) un anticuerpo capaz de distinguir entre MPA y ésteres de micofenolato, y (b) un compuesto que comprende MPA enlazado con un marcador detectable.

De manera preferible, el pH del reactivo conjugado del MPA marcado se optimiza para el balance, entre cualquier otra consideración, la actividad y estabilidad del conjugado. En una de sus formas de realización preferidas, esta presente invención se refiere a reactivos conjugados de MPA-G6PDH o MPA-fosfatasa alcalina en los que el pH es 6-10, de manera preferible 7-9, de manera más preferible 7,5-8,5.

De manera preferible, el pH del reactivo del anticuerpo se optimiza para maximizar la estabilidad y precisión de los componentes del reactivo de ensayo. En una de sus formas de realización preferidas, la presente invención se refiere a reactivos de un anticuerpo de MPA en los que el pH es 4-7, de manera preferible 5-6, de manera más preferible 5,25-5,85.

Se pueden añadir aditivos de tensioactivo, entre los que incluyen agentes de volumen tales como BLG o PEG; desespumantes y tensioactivos tales como Tween-20®, Plurafax A-38®, Triton X-100®, RSA, albúmina de suero bovino, Mod-u-cyte, sol-u-pro, o similares; y otros materiales usados de manera habitual en la técnica para el anticuerpo y los reactivos conjugados con marca. Se pueden añadir aditivos de tensioactivo con el fin de mantener los compuestos hidrófobos o de baja solubilidad en solución, estabilizar los componentes de los reactivos de ensayo, u optimizar la actividad de los reactivos de ensayo. Se pueden añadir agentes antimicrobianos a los reactivos de ensayo con el fin de extender la vida en almacenamiento de los reactivos.

La invención se demuestras de manera adicional mediante los siguientes ejemplos ilustrativos.

Ejemplos

En el presente documento las partes y porcentajes están en peso a no ser que se indique otra cosa. Las temperaturas están en grados centígrados (ºC). Las separaciones mediante cromatografía en columna se llevaron a cabo sobre gel de sílice (Merck, malla de 230-400). Todas las reacciones se llevaron a cabo bajo atmósfera de argón seco. Todos los reactivos usados están comercialmente disponibles.

Abreviaturas

ALP

Fosfatasa alcalina

BSA

Albúmina de suero bovino

DMEM

Medio Eagle modificado de Dulbecco

DMF

N,N-dimetilformamida

ELISA

Ensayo inmunosorbente con enzima enlazado

EMIT

Técnica de inmunoensayo enzimático multiplicado

FA

Coadyuvante de Freund

G6PDH

Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa

KLH

Hemocianina de la lapa californiana

MPA

Ácido micofenólico

MPA-M

E-6-(1,3-dihidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4 hexenoato de morfolinoetilo

MPA-G

Ácido glucurónido micofenólico

NHS

N-hidroxisuccinamida

OD

Densidad óptica

PBS

Fosfato salino tamponado

SAT

Título de anticuerpos en suero

Ejemplo 1 Oxidación del MPA a hidroximetil-MPA

Se calentó una solución agitada de MPA (5 g, 34,5 mmol) y NaOH (7g) en agua (100 mL) a 70-80ºC durante 1 hora bajo atmósfera de argón. A continuación se enfrió la mezcla a 0ºC y se añadió una solución de ferricianuro de potasio (4 g, 21,3 mmol) en agua (100 mL) durante un período de 30 min. Tras 4 horas se añadió más ferricianuro de potasio (2 g, 10,6 mmol) en agua (50 mL). La reacción se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente. A continuación, la mezcla se acidificó con HCl (3N) hasta pH 2,0 y a continuación se extrajo la mezcla con acetato de etilo (2 x 150 mL). A continuación se lavó el extracto orgánico con agua:salmuera (1:1, 100 mL) y se secó (MgSO_{4}). El solvente se eliminó bajo presión reducida para dar el producto crudo, que se purificó mediante cromatografía en columna (acetato de etilo:hexano:ácido acético, 60:40:1) para dar el producto de hidroximetil-MPA puro en forma de un sólido blanco (2,0 g, 40%).

Ejemplo 2 Preparación de clorometil-MPA a partir de hidroximetil-MPA

Se agitó una suspensión de hidroximetil-MPA (400 mg, 1,2 mmol) en cloruro de acetilo (10 mL) a temperatura ambiente durante 3 horas hasta que se convirtió en una solución transparente. Se eliminó el exceso de cloruro de acetilo bajo presión reducida, y se disolvió el residuo en acetato de etilo (40 mL) y se lavó con agua (3 x 50 mL) o hasta que el lavado acuoso fue neutro. A continuación se secó la fase orgánica (MgSO_{4}) y se evaporó con sequedad para dar clorometil-MPA (300 mg, 63%) en forma de un líquido espeso que se usó en la siguiente etapa sin más purificación.

Ejemplo 3 Preparación de MPA extendido con ditiol

Se añadió a una solución agitada de clorometil-MPA (200 mg, 0,5 mmol) en acetona (5 mL) 1,2-etanoditiol (0,25 mL, 3 mmol) y carbonato de potasio (200 mg, polvo fino). La reacción se agitó durante 3 horas y a continuación se filtró. La torta del filtro se lavó con acetona (10 mL) y a continuación se evaporó el filtrado hasta sequedad. Se añadió acetato de etilo y la mezcla se lavó con agua (3 x 100 mL) y se secó (MgSO_{4}). Se eliminó el solvente bajo presión reducida, y el residuo se sometió a cromatografía en columna de gel de sílice (acetato de etilo:hexano:ácido acético, 60:40:0,1) para dar MPA-7-(2-tiometil-etanotiol) ("MPA extendido con ditiol") como un aceite espeso (150 mg, 72%):

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Ejemplo 4 Conjugación del MPA extendido con ditiol con bromoacetil-KLH

Se añadió DMF (2 ml) a una solución de bromoacetil-KLH (26 mg, 1,3 mg/mL, 5 x 10^{-5} mmol, número de grupos acetilo \approx 1100 en tampón fosfato (pH = 8,5, 100 mM). Se añadió una solución de MPA extendido con ditiol (20 mg, 4,8 x 10^{-2} mmol) en DMF (1 mL) bajo atmósfera de argón.

20

A continuación se agitó la mezcla de reacción durante 24 horas bajo atmósfera de argón a temperatura ambiente. La solución resultante se pasó a continuación a través de una columna Sephadex G-50 (se usó como eluyente tampón fosfato, pH 8,0, 100 mM) para dar la solución del inmunógeno MPA extendido con ditiol-bromoacetil-KLH (40 mL, 0,5 mg/mL). Se determinó que el número de haptenos era de 500, de acuerdo con el procedimiento descrito por Habeeb, Analytical Biochemistry 14:328-336 (1966).

Ejemplo 5 Conjugación del MPA con KLH

A una solución agitada de MPA (32 mg, 0,1 mmol) en acetonitrilo (1 mL) y piridina (160 mg) se añadió carbonato de disuccinilo en forma de un sólido, en porciones (\cong 10 mg por porción) y se siguió la reacción mediante TLC (gel de sílice, acetato de etilo:hexano:ácido acético, 50:50:1) hasta que no quedó material de partida (\cong 4 horas). La mezcla del éster MPA-NHS resultante se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. A una solución agitada de KLH (40 mg, 8 x 10^{-6} mmol) en agua desionizada (5 mL) y acetonitrilo (0,5 mL) se añadió una solución de NaOH (1N) hasta que el pH fue 9,0. A la solución resultante a 4ºC se añadió una solución del éster MPA-NSH (270 \muL, \cong 0,03 mmol). La mezcla se agitó durante la noche a 4ºC y a continuación se purificó dializándola frente a una mezcla de agua y DMF (80:20) y a continuación agua y DMF (90:10) y finalmente agua. La solución resultante se secó por congelación para dar el inmunógeno MPA-KLH puro (50 mg), con KLH enlazado en la posición 1' del sistema del anillo de MPA isobenzofuranilo. Se determinó que el número de haptenos era 1200.

Ejemplo 6 Conjugación de MPA con G6PDH

Usando el procedimiento del Ejemplo 5, se prepararon una serie de 4 enzimas-conjugados que se diferenciaban en cuán fuertemente estaba desactivado el enzima, es decir, cuánto más desactivado esté el enzima mayor es el número de haptenos que están enlazados con el enzima. El conjugado de MPA-G6PDH A se desactivó en un 23%, B en un 38%, C en un 52% y D en un 71%.

Ejemplo 7 Conjugación de MPA extendido con ditiol a G6PDH

Usando el procedimiento del Ejemplo 4, se preparó una serie de enzimas-conjugados usando el hapteno MPA extendido con ditiol. El conjugado MPA-G6PDH extendido con ditiol A se desactivó en un 35%, B en un 48%, C en un 52% y D en un 77%.

Ejemplo 8 Producción de anticuerpos Procedimientos A. Inmunizaciones

Los ratones se inmunizaron con el inmunógeno del Ejemplo 4 y/o 5 en uno de los siguientes adyuvantes: FA Completo e Incompleto, alum, Sistema Coaduyuvante de RIBI, constituido por dimicolato de trehalosa y monofosforil lípido A. Se administraron los inmunógenos a 20 y 122 \mug por inyección intraperitoneal, mensualmente, 2 a 4 veces. Tres días antes de la fusión, los ratones recibieron un estímulo salino intraperitoneal que contenía 200 a 500 \mug/mL de inmunógeno.

B. Cultivo del tejido

Se usó super DMEM para todos los cultivos de tejido. Este consistió en DMEM suplementado con: suero bovino fetal al 10%, NCTC-135 al 10% (Gibco # 440-1100EC), glutamina 4 mM, ácido oxaloacético 1 mM, piruvato de sodio 1 mM, l-cisteína 0,148nM, 10 \mug/mL de insulina, y bicarbonato de sodio 3,5 mM.

Se preparó medio acondicionado haciendo crecer células P388D_{1} (EATCC #TIB 63) en Super DMEM y dividiendo en 1:4 cada cuatro o cinco días. Se centrífugo el medio agotado a 15.000 rpm durante 15 minutos. A continuación se filtró el medio agotado para eliminar todas las células y residuos remanentes. Se añadió glutamina (100 x stock = 58,5 g/l) al medio agotado antes del uso, o se refrigeró a -20ºC para uso futuro. Se preparó medio condicionado Super DMEM suplementando Super DMEM con medio agotado P388D_{1} al 10%, y a continuación se usó como soporte de crecimiento de hibridomas tras la fusión y durante la clonación.

La línea celular de mieloma de ratón P3/X63-Ag 8653 (Ag8653) se mantuvo en cultivo dividiendo de 1:2 a 1:4 diariamente, o mediante dilución en serie en una placa de 6 pocillos durante el fin de semana. Todas las células se mantuvieron a 37ºC en CO_{2} al 7%.

1. Fusión

Se retiró asépticamente el bazo de un ratón inmunizado, se colocó en DMEM a 10 ml, se picó y a continuación se aplastó entre dos placas. Se consiguió una suspensión de esplenocitos de células individuales haciendo pasar la suspensión de células a través de un paño tamiz de monofilamento. Los esplenocitos procedentes de dos bazos, aproximadamente 2 x 10^{8} células se combinaron con 40 x 10^{6} células de Ag8653, se centrifugaron a 800 rpm durante 5 minutos, y se lavaron de una a dos veces con DMEM. Se llevaron a cabo las fusiones añadiendo 4,0 ml de PEG (50% de solución en Hepes 75 mM), que se añadió a lo largo de 3 minutos con agitación suave, y a continuación se añadieron 30 ó 40 ml de Super DMEM para inactivar el PEG. Se centrifugó la suspensión de células a 800 rpm durante 5 minutos. Se vertió el sobrenadante y las células se resuspendieron en 250 ml de Super DMEM-HAT (Stock de HAT = 50X Sigma #H0262; en medio: hipoxantina 100 \muM, aminopterina 0,4 \muM, y timidina 16 \muM) y se plaqueó a 200 \muL / pocillo en doce placas de cultivo de 96 pocillos.

Se alimentaron las células retirando 100 \muL / pocillo de medio agotado y añadiendo a continuación 200 \muL / pocillo de medio condicionado Super DMEM-HAT 4 o 5 días después de la fusión.

Las fusiones se seleccionaron en aproximadamente 7 a 10 días después de la fusión. Las células se clonaron finalmente por dilución en serie tal como se describe a continuación.

2. Clonación por dilución en serie

Los pocillos que dieron positivo en ELISA se ensayaron a continuación en el formato EMIT. Los hibridomas que produjeron anticuerpos ELISA y EMIT positivos se clonaron a continuación varias veces por dilución en serie para asegurar colonias de células únicas.

Los hibridomas procedentes de un pocillo de una placa de 96 pocillos se transfirieron a un pocillo de una placa de 24 pocillos que contenía 1,5 ml/pocillo de medio Super DMEM condicionado. La células se mezclaron por pipeteo, y se añadieron 100 \mul/pocillo a la fila A de la placa de 96 pocillos que contenía 200 \mul/pocillo de medio Super DMEM condicionado. Cien 100 \mul/pocillo se transfirieron a la fila B usando un pipeteador Flow Multichannel, se mezclo por pipeteo, y se transfirieron de nuevo 100 \mul/pocillo a la fila siguiente. Cada "clon" se diluyó en serie 7 veces, de uno a 4 clones por placa. Las células se reclinaron por dilución limitante de 3 a 4 veces o hasta estabilidad.

3. Congelación y descongelación de líneas celulares

Las líneas celulares clonadas y estabilizadas preparadas usando los inmunogenes de los Ejemplo 4 y 5 que fueron positivos para ELISA, y las líneas celulares que inhibieron el enzima-conjugado y se modularon con fármaco libre según el protocolo EMIT procedentes de fusiones consecutivas se congelaron y almacenaron a -100ºC. El pocillo elegido (clon) procedente de la placa de 96 pocillos se hizo crecer por trasiego diario de las células y expansión posterior de una placa de 24 pocillos con 1,5 ml/pocillo de medio Super DMEM a una placa de 6 pocillos con 8 ml/pocillo de medio Super DMEM, y finalmente, en un matraz T-75 con 50 ml de medio Super DMEM.

Las células procedentes del matraz T-75 (aproximadamente 15 x 10^{6} células/matraz) se centrifugaron a 800 rpm durante 5 minutos y se resuspendieron en 3 ml de medio de congelación, dimetil sulfóxido al 10% y suero fetal bovino al 10% en Super DMEM. Se pipetearon alícuotas de un ml en viales, y se almacenaron a -100ºC.

Las células se descongelaron calentando los viales en un baño a 37ºC. La suspensión de células se centrifugó con 5 ml de Super DMEM a 800 rpm durante 5 minutos. Se decantó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 8 ml de Super DMEM y se pipetearon en una placa de 6 pocillos para expansión de las células.

C. Selección

Todas las selecciones ELISA se realizaron a temperatura ambiente.

1. Reactivos ELISA

PBS, pH 7,2: fosfato de sodio 0,01 M, NaCl 0,15 m, y azida de sodio al 0.002%.

Tampón de lavado ELISA: Tween 20 al 0,5% en PBS.

Conteo en placa: conejo anti-ratón IgG+A+M(H+L), reconstituido con 2 ml de agua según las directrices de los fabricantes, y se diluyó a 1:100 en PBS.

Bloqueo en placa: BSA al 1% en PBS.

Diluyente: BSA al 0,5% en PBS; bloqueo en placa diluido 1:2 en PBS.

Conjugado MPA extendido con ditiol MPA-G6PDH ELISA, de acuerdo con el Ejemplo 7: diluido a 1:5000 en BSA al 0,5% en PBS.

Substrato: Trizma Base 0,053 M (Sigma), NAD 0,02 M, glucosa-6-fosfato 0,033 M, azida de sodio 0,025M, violeta de p-yodonitro tetrazilio (Sigma) 1 \mug/ml de BSA, diforasa 0,6 unidades/ml (Sigma #2381), pH ajustado a 6,2 con HCl.

2. Protocolo ELISA inverso

Este protocolo se usó para selecciones de placas primarias y clonadas. Las placas se recubrieron con conejo anti-ratón, 50 \mul/pocillo, y se incubaron. Los pocillos se vaciaron, y se bloquearon a continuación con 300 \mul/pocillo, se incubaron y se vaciaron de nuevo. Se añadieron anticuerpos (medio agotado, 50 \mul/pocillo), se incubaron, y se lavaron a continuación. Se añadió sustrato (100 \mul/pocillo) y se incubaron. Se consideró ELISA positivo un OD mayor que 0,5.

3. Protocolo ELISA inverso competitivo

Se usó este ensayo para determinar la capacidad del anticuerpo para enlazarse con el MPA libre de forma preferente en presencia del conjugado MPA-enzima. Se ensayó un panel de anticuerpos frente a concentraciones decrecientes de MPA libre en soluciones de conjugado MPA-enzima. Este protocolo de ensayo fue el mismo que para el ELISA inverso, excepto en que se añadieron 50 \mul/pocillo de de MPA G6PDH extendido con ditiol.

En su lugar, el MPA, diluido con la solución de MPA G6PDH extendido con ditiol, se añadió a 50 \mul/pocillo, con las siguientes concentraciones de \mug de MPA por ml de solución de conjugado: 100 \mug/ml, 1 \mug/ml, 10 ng/ml, 100 pg/ml, y 1 pg/ml. Esto se incubó y lavó como se describe anteriormente. El porcentaje de competencia se calculó como sigue:

% de competencia = \frac{OD \ w/E \ - \ C \ solo \ - \ OD \ w/fármaco}{OD \ w/E \ - \ C \ solo}

siendo el término "E-C" el conjugado MPA-G6PDH extendido con ditiol.

4. Reactivos ELISA hacia delante

La placa se recubrió con el conjugado MPA G6PDH extendido con ditiol del ejemplo 7, se diluyó a 1: 100 en PBS. Se añadieron cabra antí-ratón (IgG + IgM-ALP, diluido 1:500 en PBS) y los anticuerpos específicos de la subclase marca-ALP, diluído 1:100 en PBS.

5. Protocolo ELISA hacia delante

Se usó este protocolo para determinar los títulos de suero anticuerpo ("SAT") de ratones para monitorizar el efecto relativo de diferentes inmunizaciones, dosis y tipo de inmunógeno, y coadyuvante. También se determinaron las subclases de anticuerpos usando una variación de este protocolo.

Las placas se recubrieron con el conjugado MPA G6PDH extendido con ditiol del ejemplo 7 (50 \mul/pocillo), se incubaron y se vaciaron los pocillos. Las placas de bloquearon (300 \mul/pocillo), se incubaron y se vació el contenido.

Etapa de adición de anticuerpo - Se añadió anticuerpo (50 \mul/pocillo), se incubó, a continuación se lavaron las placas. Para SAT: cada muestra de suero se diluyó a 1:100 en diluyente BSA/PBS en un tubo de ensayo, a continuación se transfirieron 300 \mul a un pocillo de la columna 1 de la placa de micro valoración prebloqueada que contenía 0,15 ml de diluyente BSA/PBS en todos los pocillos entres las columnas 2 a 12. Cada muestra de suero se diluyó a continuación en serie 1:2 a lo largo de la placa. Se trasfirieron 50 \mul/pocillo desde la placa de dilución a la placa de ensayo. Para la determinación de la subclase, se añadieron 50 \mul/pocillo de cada anticuerpo (medio agotado) a lo largo de la placa, un anticuerpo por fila.

Se añadió el conjugado MPA G6PDH extendido con ditiol (50 \mul/pocillo), se incubó, se levó a continuación. Para la determinación de la subclase: se añadieron anticuerpos específicos con marca ALP de subclase (50 \mul/pocillo), con una subclase diferente de anticuerpo en cada columna.

Se añadió sustrato (100 \mul/pocillo), se incubó, a continuación se leyó a 405 nm. Para SAT, dilución del suero para el que se ve una reducción del 70% de OD desde el valor de OD más alto de la curva de dilución. Para la determinación de subclase: para cada anticuerpo, hay tres pozos positivos: el pozo de control (anti-ratón), cadena pesada (una subclase de IgG, IgM o IgA), y una cadena ligera.

6. Selección EMIT

Los productos de las fusiones que usaron los inmunogenes de los Ejemplos 4 y 5 se seleccionaron mediante ELISA inverso. Todos los hibridomas positivos se clonaron antes de realizar cualquier ensayo EMIT. Las siguientes fusiones se seleccionaron mediante ELISA, en primer lugar, y se volvieron a seleccionar los pocillos positivos mediante EMIT.

Los ensayos EMIT se llevaron a cabo usando diluyente Reactivo A (substrato), Reactivo B (enzima-conjugado) a R_{max} = 250 \DeltaA/min, calibradores MPA en tampón de ensayo, MPA-G en tampón de ensayo, y MPA-M en DMF. Se usaron dos protocolos, uno que tenía un periodo de incubación corto y uno que tenia un periodo de incubación largo. La única diferencia entre el protocolo corto y largo fue que el tiempo de retardo (incubación del sustrato + anticuerpo + enzima-conjugado) se incrementó en el protocolo largo de 25 a 175 segundos antes de leer la reacción. El tampón de ensayo, y los diluyentes Reactivo A y Reactivo B usados fueron formulaciones líquidas habituales de EMIT
2000.

Las selecciones primarias se llevaron a cabo usando un programa de 3 reactivos. Los anticuerpos MPA en medio agotado se colocaron en las tazas de ensayo. El rack de reactivos contenía el Diluyente Reactivo A en la posición A, el reactivo B en la posición 1 y el tampón de ensayo, calibrador MPA, MPA-G o soluciones MPA-M en posición 2. Se realizaron al menos dos ensayos para cada anticuerpo: los anticuerpos del primer medio agotado se ensayaron para la inhibición del enzima-conjugado, el %I, y a continuación para la modulación con MPA libre o para reactividad cruzada con MPA-G o MPA-M.

D. Producción de anticuerpos In vitro

Todos los anticuerpos ELISA positivos producidos usando los inmunogenes de los Ejemplos 4 ó 5 y los anticuerpos procedentes de las fusiones posteriores que inhibieron y modularon bien en el EMIT se expandieron mediante cultivo. Se hicieron crecer en un matraz T-75 (50 ml de medio agotado), dos matraces T225 (1 l de medio agotado), y un poquito en cuatro matraces (1 l de medio agotado). Las células y los residuos se separaron mediante centrifugación y filtración. Se añadió azida de sodio al 0,2% antes de la purificación.

E. Purificación del anticuerpo

Los medios agotados de los anticuerpos de mayor interés, expandidos a 500 ml o 1 l, se purificaron mediante cromatografía en columna de Proteína G, a temperatura ambiente.

1. Reactivos para la purificación de la Proteína G

Tampón de lavado / enlace, PBS pH 7,0: fosfato de sodio 0,01 M, cloruro de sodio 0,15 M, y azida de sodio al 0,002%.

Tampón de elución: ácido acético 0,5 M ajustado a pH 3,0 con hidróxido de amonio.

Solución neutralizante: base tris 1 M.

Tampón de limpieza: ácido acético (57,2 ml de ácido acético glacial / 1 l).

2. Protocolo de purificación de la Proteína G

Se rellenó una columna con 10 ml de Proteína G-Sefarosa, y se lavó con tampón de lavado / enlace. Se cargó anticuerpo (medio agotado, 0,5 a 1l) en la columna. La columna se lavó con tampón de lavado / enlace hasta que el OD volvió a la línea base. Se eluyó el anticuerpo con el tampón delusión. Se recogieron cincuenta fracciones en gota (aproximadamente 2,5 ml) en tubos de ensayo que ya contenían 1,5 ml de solución neutralizante. El pico de anticuerpo se mezcló y dializó durante toda la noche frente a 4 l de PBS, pH 7,4. La columna se lavó con tampón de limpieza y se reequilibró con el tampón de lavado / enlace, a continuación se almacenó a 4ºC. Se comprobó la pureza del anticuerpo mediante electroforesis Paragon respecto de la presencia de una banda única. La concentración de anticuerpo se determinó en primer lugar obteniendo la OD del anticuerpo a 280 nm, y a continuación calculando la concentración usando el coeficiente de extinción del IgG: A_{280} (1 mg/ml) = 1,35; o IgM: A_{280} (1 mg/ml) = 1,2.

Resultados A. Títulos de suero de anticuerpo y selección ELISA

Para despertar una respuesta inmune, se inmunizó en primer lugar un grupo de ratones con el inmunógeno del Ejemplo 5. Se usó inmunógeno en diferentes dosis y en diferentes adyuvantes: 100 \mug en FA, 20 \mug en FA y 20 \mug en Alum. Después de 3 inmunizaciones, se ensayaron los sueros de los ratones respecto el título de anticuerpo con el conjugado de MPA G6PDH extendido con ditiol fabricado en el Ejemplo 7. Los títulos de anticuerpo en suero de los ratones que recibieron 100 \mug en FA fueron ligeramente superiores al resto, 1:100.000 a 1:200.000, mientras que los títulos de anticuerpo en suero de los ratones que recibieron 20 \mug en Alum fueron los más bajos, 1:50.000.

Posteriormente, se inmunizó un nuevo grupo se ratones con el inmunógeno MPA-bromoacetilo-KLH extendido con ditiol del Ejemplo 4. Algunos ratones recibieron 22 \mug de inmunógeno en Alum y otros recibieron 50 \mug en FA. Después de 3 inmunizaciones, los títulos de anticuerpos en suero de ambos grupos fueron semejantes, 1:8.000.

Los sueros procedentes del grupo de ratones que recibieron el inmunógeno del Ejemplo 4 produjeron una señal mucho más fuerte en el ELISA, de 2 a 2,5 unidades OD, y curvas de valoración con mayor pendiente, mientras que los sueros procedentes del grupo de ratones que recibieron el inmunógeno del Ejemplo 5 produjeron una señal mucho débil, de 0,5 a 1,2 unidades OD, y curvas de valoración planas. Estas diferencias se deben probablemente al enzima-conjugado usado. Los enlaces MPA en ambos reactivos, el segundo inmunógeno y el enzima-conjugado usado en el ELISA fueron idénticos. El enlace entre los anticuerpos producidos usando el inmunógeno del Ejemplo 4 y el enzima-conjugado del Ejemplo 7 es más fuerte que con los anticuerpos producidos frente al inmunógeno KLH no emparejado enlazado a carbonilo del Ejemplo 5.

Los productos de las fusiones usando los inmunógenos de los Ejemplos 4 ó 5 se llevaron a cabo antes de iniciar cualquier labor de desarrollo del ensayo. Las fusiones se seleccionaron usando únicamente una selección tipo ELISA inverso. Todos los hibridomas ELISA positivos se clonaron y estabilizaron. Se usaron más adelante en el desarrollo del ensayo.

Una vez los hibridomas producidos usando los inmunógenos de los Ejemplos 4 ó 5 se estabilizaron, se ensayaron los anticuerpos del medio agotado en un ensayo ELISA inverso competitivo para determinar las afinidades relativas de estos anticuerpos. En estos ensayos, los anticuerpos inmovilizados se incubaron con cantidades variables de MPA libre en presencia de un nivel óptimo de enzima-conjugado. El enlace preferente de los anticuerpos con el MPA libre respecto del enzima-conjugado se calcula en forma de % de competencia en cada nivel de MPA libre. Se considera que aquellos anticuerpos que se enlazan con el MPA libre (es decir, compiten con el enzima-conjugado) a las menores concentraciones de MPA libre tienen una afinidad más elevada que aquellos anticuerpos que compiten únicamente con niveles más elevados de fármaco libre. Las Tablas 1A y 1B resumen los datos del ELISA competitivo de los anticuerpos.

TABLA 1A Resumen de los datos de los anticuerpos (inmunógenos del Ejemplo 5) ensayados mediante el ELISA inverso competitivo para diferentes concentraciones de MPA

	MPA,	MPA	MPA
	10 ng/ml en E-C	100 ng/ml en E-C	1 pg/ml en E-C
Clon	OD		OD		OD
	promedio	% comp.	promedio	% comp.	promedio	% comp.
1B8	0,542	43	1,021		1,097
1F9	0,356	61	0,795	12	0,991
3B4	0,496	63	1,147	14	1,319
5G4	0,646	57	1,373	9	1,540
6F1	0,269	80	1,033	24	1,328
7E9	0,299	77	1,043	19	1,297
8A3	0,955	33	1,362	5	1,511
8H1	0,411	67	0,930	26	1,271
1B7	0,493	57	1,067	7	1,094	5
3A3	0,133	69	0,363	15	0,403	6
3D8	0,294	65	0,824		0,844
4G5	0,347	69	0,988	13	1,056	7

TABLA 1A (continuación)

	MPA,	MPA	MPA
	10 ng/ml en E-C	100 ng/ml en E-C	1 pg/ml en E-C
Clon	OD		OD		OD
	promedio	% comp.	promedio	% comp.	promedio	% comp.
5A8	0,295	72	0,897	16	0,978	8
5G9	0,446	64	1,126	10	1,221
5G11	0,104	88	0,720	15	1,016
7B6	0,491	59	1,215		1,282
11A1	0,447	69	1,498		1,651
11H1	0,380	68	1,168		1,269
11H11	0,372	69	1,215		1,299

TABLA 1B Resumen de los datos de los anticuerpos (inmunógenos del Ejemplo 4) ensayados mediante el ELISA inverso competitivo para diferentes concentraciones de MPA

	MPA,	MPA
	1,0 \mug/ml en E-C	10 ng/ml en E-C
Clon	OD		OD
	promedio	% comp.	promedio	% comp.
1A7	0,159	87	0,974	20
1B5	1,067	6	1,142
1F2	1,170	16	1,333
1H3	0,428	68	0,626	53
2E3	0,090	84	0,344	38
2H12	0,248	83	1,277	14
4B9	0,279	58	0,579	13
4C7	0,554	40	0,882	5
5C7	0,054	85	0,134	62
5G1	0,329	57	0,696	9
6A8	0,949	5	1,014
6B10	0,481	49	0,906
6B3	1,097	17	1,225	7
6E2	0,629	52	1,249
7C3	0,088	93	0,720	46
7G4	0,185	87	1,003	28
7H12	0,597	26	0,792
8B7	1,392		1,516
8C7	0,733	48	1,313	7
9A12	1,307	14	1,471
11A8	1,069	18	1,227	6
11G10	0,459	47	0,773	11
12D5	0,083	84	0,350	33
2G4	0,390	56	0,767	14

B. Selección EMIT temprana

Se ensayaron también los anticuerpos en una COBAS MIRA, en primer lugar mediante un protocolo de tiempo de incubación corto. Usando el enzima-conjugado ELISA, no optimizado para EMIT, se ensayaron 19 medios agotados de anticuerpo para la inhibición del enzima-conjugado. Se añadieron 95 \mul de medio agotado de anticuerpo aun ensayo de 325 \mul. Un anticuerpo inhibió el enzima-conjugado en un 11%. Estos anticuerpos se volvieron a ensayar mediante un protocolo de tiempo de incubación largo, y 4 anticuerpos inhibieron ligeramente el enzima-conjugado en un 10 a 14%. Cuando se ensayaron frente a fármaco libre, 2 de los 4 anticuerpos modularon la mayor parte de la señal con 100 \mug/ml de MPA. Todos los ensayos EMIT a partir de este punto utilizaron el protocolo largo.

C. Evaluación de la factibilidad del ensayo

Treinta y dos de los medios agotados de anticuerpo anteriores se ensayaron en un ensayo EMIT comercial simulado. Se eligieron cinco anticuerpos por el tamaño de su curva patrón y buen perfil de reactividad cruzada. El CV de un anticuerpo fue particularmente elevado cuando se ensayó con precisión elevada.

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TABLA 2B Resumen de los datos EMIT de los anticuerpos con curvas patrón EMIT grandes. Se usó el enzima conjugado del Ejemplo 6

\vskip1.000000\baselineskip

100

TABLA 2 (continuación)

102

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Se seleccionó el anticuerpo 3D8, fabricado frente al inmunógeno enlazado con carboxilo del Ejemplo 5 como anticuerpo preferido. Aunque presentaba reactividad cruzada con MPA-M (18% con matriz DMF vs. 144% con matriz plasma), produjo una curva patrón grande, 112 unidades, y tuvo un CV excelente, 1,9 a 5,8%.

Ejemplo 10 Biotinilación de anticuerpos MPA

El anticuerpo purificado se dializó frente a bicarbonato de sodio 200 mM, cloruro de sodio 150 mM pH 8,8 durante toda la noche a 4ºC con tres cambios de tampón. Se fabricó unas solución de 10 mg/l de biotina-NHS éster en DMf seco.

El biotina-NHS se añadió a alícuotas de anticuerpo para dar relaciones molares de biotina-NHS/anticuerpo entre 2 y 80. La mezcla se vortizó durante 2 minutos, a continuación se dejó sedimentar a temperatura ambiente durante 1 hora. El biotina-NHS no ligado se separó del anticuerpo marcado usando una columna Sephadex G25-80 con bicarbonato de sodio 200 mM, cloruro de sodio 150 mM pH 8,8 como la fase móvil.

Estos anticuerpos biotinilados serían útiles en un inmunoensayo heterogéneo en el que se ligue avidina a un soporte.

Claims (34)

1. Un compuesto que comprende ácido micofenólico enlazado con un enzima o un vehículo inmunógeno seleccionado entre el grupo constituido por albúminas, proteínas de suero, proteínas de lentes oculares, lipoproteínas, polisacáricos, ácidos nucleicos y partículas, por sustitución de uno o más átomos de hidrógeno.

2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que dicho átomo de hidrógeno es un átomo de hidrógeno del grupo carboxilato.

3. El compuesto de la reivindicación 1 en el que dicho ácido micofenólico se enlaza con un enzima seleccionado entre el grupo constituido por glucosa-6-fosfatasa deshidrogenasa y una fosfatasa alcalina.

4. El compuesto de la reivindicación 1, en el que dicho ácido micofenólico se enlaza con un vehículo inmunógeno seleccionado entre el grupo constituido por albúmina de suero, hemocianina de la lapa californiana, ovoalbúmina de huevo y gamma-globulina bovina.

5. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 de fórmula

21

en el que

X es un enzima o un vehículo inmunógeno seleccionado entre el grupo constituido por albúminas, proteínas de suero, proteínas de lentes oculares, lipoproteínas, polisacáridos, ácidos nucleicos y partículas,

L es un enlace o un grupo de enlace,

R es H, alquilo inferior, que contiene entre 1-5 átomos de carbono, o alquilo inferior -CO que contiene entre 1-5 átomos de carbono, y

n es un número comprendido entre 1 hasta el peso molecular de X dividido por 5000.

6. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 de fórmula:

22

o un compuesto de fórmula:

23

en el que en cada una de estas fórmulas:

X es un polipéptido,

L es un enlace o un grupo de enlace,

R es H, alquilo inferior, que contiene entre 1-5 átomos de carbono, o alquilo inferior-CO, que contiene entre 1-5 átomos de carbono, y

n es un número comprendido entre 1 hasta el peso molecular de X dividido por 5000.

7. Un aumento en la respuesta de un anticuerpo a un compuesto que comprende ácido micofenólico enlazado con un vehículo inmunógeno por sustitución de uno o más átomos de hidrógeno, en el que dicho anticuerpo es capaz de distinguir entre el ácido micofenólico y un compuesto seleccionado entre el grupo constituido por ésteres de micofenolato y metabolitos del ácido micofenólico.

8. El anticuerpo de la reivindicación 7 en el que dicho éster es E-6-(1,3-dihidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo.

9. El anticuerpo de la reivindicación 7 en el que dicho metabolito es ácido glucurónido micofenólico.

10. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7 que es un anticuerpo monoclonal que enlaza el ácido micofenólico y es capaz de distinguir entre el ácido micofenólico y al menos un compuesto seleccionado entre el grupo constituido por E-6-(1,3-dihidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo, y ácido glucurónido micofenólico.

11. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7 que se aumenta a un inmunógeno seleccionado entre el grupo constituido por:

24

y

25

en las que:

X es un vehículo inmunógeno

L es un enlace o un grupo de enlace

R se selecciona entre el grupo constituido por H, alquilo inferior, que contiene entre 1-5 átomos de carbono, y alquilo CO-bajo que contiene entre 1-5 átomos de carbono, y n es un número comprendido entre 1 hasta el peso molecular de X dividido por 5000.

12. Un compuesto que comprende un conjugado de un marcador detectable, y un anticuerpo de acuerdo con la Reivindicación 7 con la respuesta aumentada respecto de un compuesto que comprende ácido micofenólico enlazado con un vehículo inmunógeno, por sustitución de uno o más átomos de hidrógeno en el que dicho anticuerpo es capaz de distinguir entre el ácido micofenólico y un compuesto seleccionado entre el grupo constituido por ésteres de micofenolato y metabolitos del ácido micofenólico.

13. Un procedimiento para la determinación de ácido micofenólico en una muestra sospechosa de contener ácido micofenólico que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo capaz de distinguir entre el ácido micofenólico y loe ésteres de micofenolato, de manera preferible un anticuerpo monoclonal, o con un anticuerpo capaz de distinguir entre el ácido micofenólico y un metabolito de ácido micofenólico, de manera preferible un anticuerpo monoclonal; y

(b) detectar el enlace de dicho anticuerpo con el ácido micofenólico.

14. El procedimiento de la reivindicación 13 en el que dicho éster es E-6-(1,3-dihidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo.

15. El procedimiento de la reivindicación 13 en el que la etapa (a) comprende de manera adicional poner en contacto dicha muestra con un análogo marcado de ácido micofenólico.

16. El procedimiento de la reivindicación 13 en el que dicho anticuerpo está enlazado con un soporte, o es capaz de enlazarse con un soporte.

17. El procedimiento de la reivindicación 13 en el que dicho metabolito es ácido glucurónido micofenólico.

18. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13 para la determinación de ácido micofenólico en una muestra sospechosa de contener ácido micofenólico que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo capaz de distinguir entre el ácido micofenólico y los ésteres de micofenolato o metabolitos de ácido micofenólico: y

(b) detectar el enlace de dicho anticuerpo con el ácido micofenólico; en el que dicho anticuerpo se aumenta con un inmunógeno seleccionado entre el grupo constituido por:

26

y

27

\vskip1.000000\baselineskip

en las que:

X es un vehículo inmunógeno,

L es un enlace o un grupo de enlace,

R se selecciona entre el grupo constituido por H, alquilo inferior que contiene entre 1-5 átomos de carbono y alquilo inferior-CO que contiene entre 1-5 átomos de carbono, y

n es un número comprendido entre 1 hasta el peso molecular de X dividido por 5.000.

19. El procedimiento de la reivindicación 18 en el que la etapa (a) comprende de manera adicional poner en contacto dicha muestra con un compuesto seleccionado entre el grupo constituido por:

\vskip1.000000\baselineskip

28

y

29

\newpage

en los que:

X' es un marcador detectable.

L es un enlace o un grupo de enlace,

R se selecciona entre el grupo constituido por H, alquilo inferior que contiene entre 1-5 átomos de carbono, y alquilo inferior-CO, que contiene entre 1-5 átomos de carbono, y

n es un número comprendido entre 1 hasta el peso molecular de X' dividido por 5.000.

20. El procedimiento de la reivindicación 18 en el que dicho anticuerpo se enlaza con un soporte o es capaz de enlazarse con un soporte.

21. El procedimiento de la reivindicación 13 para medir la cantidad de ácido micofenólico en una muestra sospechosa de contener ácido micofenólico que comprende las etapas de:

(a) combinar en un medio acuoso:

(i)

dicha muestra

(ii)

el conjugado de ácido micofenólico con un marcador detectable y

(iii)

un anticuerpo capaz de distinguir entre

el ácido micofenólico y un compuesto seleccionado entre el grupo constituido por ésteres de micofenolato y metabolitos del MPA; y

(b) determinar el efecto de dicha muestra sobre la actividad de dicha marca.

22. El procedimiento de la reivindicación 21 en el que dicho compuesto se selecciona entre el grupo constituido por E-6-(1,3-dihidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo y ácido glucurónido micofenólico.

23. El procedimiento de la reivindicación 21 en el que dicho marcador detectable es un enzima y dicho determinante comprende medir la actividad de dicho enzima.

24. El procedimiento de la reivindicación 23 que comprende de manera adicional combinar en dicha etapa de combinación los sustratos para dicho enzima.

25. El procedimiento de la reivindicación 23 en el que dicho enzima se selecciona entre el grupo constituido por glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y fosfatasa alcalina.

26. El procedimiento de la reivindicación 21 en el que dicho anticuerpo se enlaza con un soporte o es capaz de enlazarse con un soporte.

27. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13 para un inmunoensayo homogéneo para el ácido micofenólico en una muestra sospechosa de contener dicho analito que comprende:

(a) combinar en un medio líquido

(i)

dicha muestra,

(ii)

un conjugado de un análogo de ácido micofenólico y un enzima,

(iii)

un anticuerpo capaz de distinguir entre el ácido micofenólico y el éster de micofenolato, y

(iv)

los sustratos para dicho enzima;

(b) determinar la actividad enzimática de dicho enzima en dicho medio; y

(c) comparar dicha actividad con la actividad enzimática observada con una muestra que contiene una cantidad conocida de dicho analito.

28. El procedimiento de la reivindicación 27 en el que dicho éster de micofenolato es E-6-(1,3-dihidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo.

29. El procedimiento de la reivindicación 27 en el que dicho enzima es glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.

30. El procedimiento de la reivindicación 27 en el que dicho anticuerpo se enlaza con un soporte o es capaz de enlazarse con un soporte.

31. Un kit para llevar a cabo un ensayo para la determinación del ácido micofenólico, comprendiendo dicho kit en una combinación embalada:

(a) un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7 capaz de distinguir entre el ácido micofenólico y un compuesto seleccionado entre el grupo constituido por ésteres de micofenolato y metabolitos del ácido micofenólico, y

(b) un compuesto que comprende ácido micofenólico enlazado con un marcador detectable.

32. Un kit de la reivindicación 31 en el que dicho éster es E-6-(1,3-dihidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo.

33. Un kit de la reivindicación 31 en el que dicho metabolito es ácido glucurónido micofenólico.

34. Un kit de la reivindicación 31 para llevar a cabo un ensayo para la determinación de ácido micofenólico, comprendiendo dicho kit en una combinación embalada

(a)

un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7 aumentado con un inmunógeno seleccionado entre el grupo constituido por

\vskip1.000000\baselineskip

30

31

\vskip1.000000\baselineskip

en los que

X es un vehículo inmunógeno,

L es un enlace o un grupo de enlace,

R se selecciona entre el grupo constituido por H, alquilo inferior que contiene entre 1.5 átomos de carbono, y alquilo inferior-CO que contiene entre 1-5 átomos de carbono, y

n es un número comprendido entre 1 hasta el peso molecular de X dividido por 5000; y

(b)

un compuesto seleccionado entre el grupo constituido por

32

y

33

en los que:

X' es un marcador detectable,

L es un enlace o un grupo de enlace,

R se selecciona entre el grupo constituido por H, alquilo inferior que contiene entre 1-5 átomos de carbono, y alquilo inferior-CO que contiene entre 1-5 átomos de carbono, y

n es un número comprendido entre 1 hasta el peso molecular de X' dividido por 5.000.