JPH09510789A

JPH09510789A - ミコフェノール酸のイムノアッセイ

Info

Publication number: JPH09510789A
Application number: JP8504337A
Authority: JP
Inventors: アレクサンダー，スベトラナ; ダバリアン，ダリウシュ
Original assignee: ベーリングヴェルケ・アクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1994-07-07
Filing date: 1995-06-29
Publication date: 1997-10-28
Anticipated expiration: 2017-01-07
Also published as: EP0769149B1; WO1996002004A1; EP0769149A1; ES2250972T3; JP3245172B2; US6225073B1; DE69534598T2; CA2194439A1; DE69534598D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ミコフェノール酸（ＭＰＡ）のアッセイに有用な抗体を提供するものである。これらの抗体は、ＭＰＡを結合し、ＭＰＡをそのエステル、例えば、Ｅ−６−(１,３−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−６−メトキシ−７−メチル−３−オキソ−５−イソベンゾフラニル)−４−メチル−４−ヘキセン酸モルホリノエチル、および／またはその代謝物、例えば、ミコフェノール酸グルクロニドと識別することができる。本発明は、また標識とＭＰＡまたはＭＰＡ類似体のコンジュゲートを提供するものである。本発明の抗体は、これらのコンジュゲートを結合する能力があり、また、コンジュゲートに結合したときに標識の活性を阻害する能力がある。本発明は、また、本発明の抗体および／またはコンジュゲートを用いる、ＭＰＡを含有する疑いのある試料中のＭＰＡの測定法を提供するものである。本発明は、さらに、アッセイ試薬、並びに本発明の方法を実施するのに有用なパッケージ化キットを提供するものである。

Description

【発明の詳細な説明】ミコフェノール酸のイムノアッセイ発明の背景発明の分野ミコフェノール酸（“ＭＰＡ”）は、数種のペニシリウム菌の発酵により生産される。これは、広範な活性スペクトル、特殊な作用モードを有し、大用量でも最低限の副作用で許容可能である（Epinette等、Jornal of the American Academy of De rmatology 17(6)：962-71(1987)）。ＭＰＡは、抗腫瘍活性、抗ウイルス活性、抗乾癬活性、免疫抑制活性、抗炎症活性を有すること（Lee等、Pharmaceutical Research 7(2)：161-166(1990)）、並びに抗菌活性および抗真菌活性を有すること（Nelson等、Journal of Medicinal Chemistry 33(2)：833-838(1990)）が示されている。これは、イノシンモノホスフェートデヒドロゲナーゼ、即ち、プリンヌクレオチドの新規（デゥノボ）合成における酵素を阻害する。ＴおよびＢリンパ球は、この新規合成に大きく依存しているため、ＭＰＡは、免疫応答の主な要因であるリンパ球増殖を阻害することができる。ＭＰＡのモルホリノエチルエステル、即ち、Ｅ−６−(１,３−ジヒドロ−４− ヒドロキシ−６−メトキシ−７−メチル−３−オキソ−５−イソベンゾフラニル )−４−メチル−４−ヘキセン酸モルホリノエチル(“ＭＰＡ−Ｍ”)は、生体内で迅速にＭＰＡへと加水分解される。ＭＰＡをこのエステル形態で投与すると、ＭＰＡのバイオアベイラビリティーが大きく向上する。ＭＰＡ−Ｍは、その他多くの好ましい医薬特性を持っており、それにはｐＨ２− ５での安定性、低ｐＨでの良好な溶解性があり、上部胃腸管において迅速な溶解を示す（Lee等、上記）。シクロスポリンＡ(“ＣsＡ”)との組合わせ療法を採用する場合、ＭＰＡ−ＭとＣsＡの作用モードは、相乗的であることがある。ＣsＡは、Ｔ細胞に対する選択的効果を有するが、Ｂ細胞抗体産生活性を抑制しないのに対し、ＭＰＡはＴ細胞とＢ細胞の双方に対して抗増殖効果を有する。ＣsＡ／ＭＰＡ−Ｍ組合わせ療法は、生存時間を増長し、ＣsＡ使用を可より低用量にすることができ、これによってＣsＡに関連する副作用、主に腎毒性を低減する。ＭＰＡは、強力な生物学的活性物質であるので、効果的なイムノアッセイがあればそのバイオアベイラビリティーを監視する際に役立つであろう。加えて、治療剤レベル、即ち、好適な免疫抑制のために必要な最適薬剤レベルを監視することも重要であり得る。ＭＰＡ−Ｍは、ＭＰＡへと迅速に加水分解されるため、ＭＰＡについてのアッセイは、ＭＰＡ−Ｍ用量を監視することも可能とする。しかしながら、このようなアッセイは、ＭＰＡには特異的に結合するが、存在し得るＭＰＡ−Ｍまたは不活性代謝ミコフェノール酸グルクロニド(“ＭＰＡ− Ｇ”)のような代謝物には結合しない、抗体の調製が困難であることから制約がある。本発明は、この難点に対応するものである。本発明は、ＭＰＡに結合し、かつその他の抗体またはＭＰＡ類似体に結合する標識の活性を調節でき、さらに、ＭＰＡと、ミコフェノール酸エステルおよび／またはＭＰＡ代謝物などの交差反応性物質、とを識別する能力のある抗体を提供する。関連技術の記載 Jones等、J.Chem.Soc.(C)1725-1737(1970)は、選択微生物とインキュベートした場合に、ミコフェノール酸が受ける非常に多くのトランスフォーメーションについて開示している。 Nelson等、米国特許第４,７５３,９３５号は、ＭＰＡ−Ｍ、その医薬用途、および投与後の受容者のＭＰＡ血漿濃度のＨＰＬＣによる監視に関するものである。発明の概要本発明は、(ａ) 試料を、ＭＰＡとミコフェノール酸エステルとを識別する能力のある抗体と接触させ、そして(ｂ) 抗体のＭＰＡへの結合を検出する、各工程を含んでなる、ＭＰＡを含有する疑いのある試料中のミコフェノール酸（“ＭＰＡ”）を測定する方法に関する。この方法は、均一系または不均一系であることができる。別法では、この方法は、ＭＰＡとＭＰＡ代謝物とを識別する能力のある抗体を使用する。本発明の他の態様は、(ａ) 水性媒質中で、試料、検出可能な標識にコンジュゲートさせたＭＰＡ、および、ＭＰＡと、ミコフェノール酸エステルおよびミコフェノール酸代謝物からなる群から選択される化合物とを、識別する能力のある抗体とを合わせ、そして(ｂ) 標識の活性に対する試料の影響を測定する、各工程を含んでなる、ＭＰＡを含有する疑いのある試料中のＭＰＡ量を測定する方法に関する。本発明の他の態様は、(ａ) 液体媒質中で、試料、ＭＰＡ類似体と酵素とのコンジュゲート、ＭＰＡとミコフェノール酸エステルとを識別する能力のある抗体、その酵素の基質を合わせ、(ｂ) 媒質中の酵素の酵素活性を測定し、そして(ｃ ) その活性を、既知量の分析物を含有する試料の場合に観察された酵素活性と比較することを含んでなる、この分析物を含有する疑いのある試料中のＭＰＡの均一系イムノアッセイ法に関する。別法では、この方法は、ＭＰＡとＭＰＡ代謝物とを識別する能力のある抗体を使用する。本発明のその他の態様は、１またはそれ以上の水素原子の置換によりタンパク質に結合したＭＰＡを含む化合物に関する。本発明はまた、この化合物に応答して生じる抗体にも関し、この抗体は、ＭＰＡと、ミコフェノール酸エステルおよびＭＰＡ代謝物からなる群から選択される化合物とを、識別する能力のあるものである。この抗体は、検出可能な標識に結合していてもよい。本発明のさらに別の態様は、ＭＰＡの測定用アッセイを実施するためのキットに関し、これはパッケージした組合せ物中に、ＭＰＡとミコフェノール酸エステルとを識別する能力のある抗体と、検出可能な標識に結合したＭＰＡを含む化合物とを含んでなる。別の形態では、このキットは、ＭＰＡとＭＰＡ代謝物とを識別する能力のある抗体を使用する。実施態様の説明本発明の実施態様の説明に進む前に、多くの用語を定義する。分析物を含有する疑いのある試料：理論的に、分析物、即ち、ＭＰＡを含有する疑いのある任意の試料が、本発明の方法により分析され得る。この試料は、典型的には、宿主由来の体液、例えば、尿、全血、血漿、血清、唾液、精液、糞、たん、脳脊髄液、涙、粘液、または同等物などの水性溶液である。この試料は、下記に述べるように、前処理することもでき、アッセイを妨害しない適当な媒質中で調製することもできる。水性媒質が好ましい。干渉交差反応性物質：ＭＰＡに結合する抗体によって認識され得るＭＰＡ以外の物質は、干渉交差反応性物質である。これらには、ＭＰＡに関連する化合物群、例えば、ミコフェノール酸エステルおよびＭＰＡ代謝物がある。用語“ミコフェノール酸エステル”は、ＭＰＡイソベンゾフラニル環系の１位に結合した側鎖のカルボン酸基でのＭＰＡのエステルであり、例えば、ＭＰＡ−Ｍを含むが、これに限定されない。用語“ＭＰＡ代謝物”は、ＭＰＡの代謝生成物、好ましくはイソベンゾフラニル環系を含有する生成物、より好ましくは、ＭＰＡ−Ｇのように１位に結合した側鎖部をも含有する生成物を表す。ＭＰＡ量の測定：ＭＰＡ測定のための定量、半定量、および定性法、ならびにその他のあらゆる方法が、ＭＰＡ量を測定する方法であると考えられる。例えば、ＭＰＡを含有する疑いのある試料中のＭＰＡの存在または不存在を検出するだけの方法も、本発明の範囲内に含まれると考えられる。用語“検出する”および “測定する”、並びに測定を表す他の普通の類義語が、本発明の範囲内に包含される。とを識別する能力のある：受容体または抗体が、第２リガンドに相対して第１リガンドに優先的に結合する能力。本発明では、第１リガンドはＭＰＡであり、第２リガンドはミコフェノール酸エステルまたはＭＰＡ代謝物である。通常、抗体を各リガンド含有試料と合わせた場合、第２リガンドの少なくとも５倍以上の第１リガンドが結合するであろう。好ましくは、少なくとも１０倍以上、より好ましくは少なくとも２０倍以上の第１リガンドが結合するであろう。各リガンドの相対結合は、試料中の相対濃度によって変わり、通常、第１リガンドに対する抗体の結合定数が第２リガンドに対する結合定数に少なくとも等しい場合、好ましくは第２リガンドに対する結合定数の少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも５０倍である場合、これらの条件は満足される。第１リガンドに対する抗体の交差反応性は、２つのリガンドを当量で結合させる、第２リガンドの濃度に対する第１リガンドの濃度比に関係する。“高度”または“低度”交差反応性の定量化、即ち、許容できる交差反応性の程度は、交差反応物の予想最大濃度、アッセイに求められる感度、および必要とされる精度によって変わる。例えば、抗体がＭＰＡ−Ｇと１０％交差反応性であり、ＭＰＡ−Ｇが検出しようとするＭＰＡの最低レベルより５倍多い量で試料中に存在するならば、その場合、ＭＰＡがその最低レベルにあると、測定されたＭＰＡのレベルは５０％高く出すぎることとなる。許容できる誤差が５％だけであるならば、その場合、交差反応性は１％以下でなければならない。本発明において、ＭＰＡに対する抗体は、ＭＰＡ−ＭおよびＭＰＡ−Ｇのような物質と低い交差反応性を示すものでなければならない。コンジュゲート：互いに、場合によっては連結基を介して結合して単一の構造を形成している２つまたはそれ以上の分子からなる分子。結合は、分子間の直接結合（例えば、化学結合）または連結基の使用のいずれかにより作ることができる。例えば、本発明の一態様では、酵素にコンジュゲートしたＭＰＡ類似体が、ＭＰＡ類似体−酵素コンジュゲートである。特異的結合対の構成員(“ｓｂｐ”構成員)：他方の分子の特定の空間的構成および極性構造と特異的に結合し、それ故、他方の分子の特定の空間的構成および極性構造と相補的なものとして定義される領域、を表面上にまたは腔内に有する、２つの異なる分子のうちの１つ。ｓｂｐ構成員は、免疫学的ペア、例えば抗原 −抗体の構成員のようなリガンドおよび受容体として表すことができる。本明細書で使用した“リガンド”という用語は、受容体が天然に存在するかまたは調製できるあらゆる化合物を表しており、“受容体”という用語は、分子の特定の空間的および極性の構成、即ち、エピトープ性部位または決定因子部位を認識する能力のあるあらゆる化合物または組成物を表す。相補的ｓｂｐ構成員は、例えばリガンドとその相補的受容体のように、もう一方と結合するものである。ｓｂｐ構成員は、抗原および抗体のような免疫学的ペア、またはアビジンとビオチンのような非免疫学的ペアであることができる。ｓｂｐ構成員は、また、低分子または低分子残基およびそれらの受容体であることもある。低分子は、分子量１００から２０００、好ましくは１５０ないし１０００を有し、その低分子に対する受容体が存在するか、または調製できるかのいずれかである。低分子の例には、ビオチン、リセルグ酸、フルオレセイン、またはフルオレセイン誘導体、およびビタミンＢ₁₂があり、それぞれアビジンまたはストレプトアビジン、抗リセルグ酸、抗フルオレセイン、および内因子である対応する受容体を持つ。低分子は、その他のｓｂｐ構成員に共有結合して、少なくとも１つの、多くの場合２−２０の低分子を有するコンジュゲートを形成することが多い。ｓｂｐ構成員に対する低分子の結合は、化学反応の結果として低分子の水素原子をｓｂｐ構成員への結合で置換することにより、または低分子と、あらゆるサイズの、ただし、好ましくは、低分子とｓｂｐ構成員の両方の受容体のコンジュゲートに結合させるのに必要なサイズ以上ではない、ｓｂｐ構成員との間の連結基により達成され得る。ハプテン：対応する抗体に特異的に結合する能力のある化合物であるが、それ自身は、抗体産生の免疫原（または抗原）として働かない。ハプテンを認識する抗体は、免疫原性（または抗原性）キャリアーに連結するハプテンからなる化合物群に対して製造され得る。ハプテンは、リガンドのサブセットである。ＭＰＡ類似体：修飾ＭＰＡ。修飾により、この類似体とその他の分子を結合する手段を提供する。類似体は、通常、水素が類似体をハブまたは標識に連結させている結合で置換されていること以外の点でもＭＰＡと異なる。免疫原性キャリアー：ハプテンにコンジュゲートした場合、および哺乳動物に注入した場合に、免疫応答を引き起こし、ハプテン、この場合ＭＰＡ、に結合する抗体の産生を誘導する化合物群。免疫原性キャリアーは、抗原性キャリアーを表すこともある。典型的な免疫原性キャリアーには、ポリ(アミノ酸)、ポリサッカライド類、核酸類、および粒子（生体物質および合成物質）があるが、これらに限定されない。このようなキャリアーの広範な種類は、出典明示により本明細書の一部としている、Davalian等、米国特許第５,０８９,３９０号、４欄５７行から５欄５行に開示されている。他の適切な免疫原性キャリアーには、アルブミン類、血清タンパク質類、例えば、グロブリン類、接眼レンズタンパク質、およびリポタンパク質がある。実例となるタンパク質には、ウシの血清アルブミン、鍵穴カサガイのヘモシアニン(“ＫＬＨ”)、卵の卵白アルブミン、およびウシのガンマグロブリンがある。支持体または表面：固相は典型的には支持体または表面であり、例えば、ストリップ、ロッド、粒子、およびビーズなどの多くの形状のいずれかであることができる多孔性または非多孔性水不溶性物質である。適切な支持体の広範な種類が、出典明示により本明細書の一部としている、Ullman等、米国特許第5,185,243 号、10−11欄、Kurn等、米国特許第4,868,104号、6欄、21−42行、およびMilbur n等、米国特許第4,959,303号、6欄、14−31行に開示されている。ｓｂｐ構成員の支持体または表面への結合は、普通に文献から入手できるよく知られた技術により達成することができる。例えば、“Immobilized Enzymes”、千畑一郎、Hal sted Press,New York(1978)およびCuatrecasas，J.Biol.Chem.245:3059(1970)参照。シグナル生成系(“ｓｐｓ”)：結合および／または非結合標識の量、即ち、検出すべき化合物に結合した標識または結合しなかった標識の量に相関する検出可能なシグナルを産生する１またはそれ以上の成分で、少なくとも１つは検出可能な標識である成分。標識は、シグナルを生成するか、またはシグナルの生成を誘導できる、あらゆる分子であり、好ましくは、蛍光剤、放射性標識、酵素、化学発光剤、または光増感剤である。そうして、酵素活性、化学発光、光吸収、または放射能を検出することによりシグナルを検出および／または測定する。適切な標識には、例示であって限定ではないが、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(“Ｇ６ＰＤＨ”)、および西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素；リボザイム；ＱＢレプリカーゼなどのレプリカーゼの基質；プロモーター類；染料類；フルオレセイン、イソチオシアネート、ロダミン化合物類、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド、およびフルオレサミンなどの蛍光剤；イソルミノールなどの化学発光剤；増感剤；補酵素；酵素基質：¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、¹⁴Ｃ、³Ｈ、⁵⁷Ｃo および⁷⁵Ｓeなどの放射性標識；ラテックスまたは炭素粒子などの粒子；金属ゾル；クリスタライト；リポソーム；細胞等があり、これらを更に染料、触媒または他の検出可能な基で標識してもよい。適切な酵素および補酵素は、Litman等、米国特許第4,275,149号、19−28欄、およびBoguslaski等、米国特許第4,318,980 号、10−14欄に開示されており；適切な蛍光剤および化学発光剤は、Litman等、米国特許第4,275,149号、30および31欄に開示されており、これらは出典明示により本明細書の一部としている。外的手段、望ましくは目視試験、例えば電磁放射、加熱、および化学試薬により標識が検出可能なシグナルを生成できる方法は多数ある。標識または他のｓｐｓ構成員もまたｓｂｐ構成員、他の分子、または支持体に結合できる。標識は、直接、シグナルを生成できるので、シグナル生成のための更なる成分を必要としない。多くの有機分子、例えば、蛍光剤は、紫外線および可視光を吸収でき、その光吸収がエネルギーをこれらの分子に転移させ、それらを励起エネルギー状態へと高める。その後、吸収されたこのエネルギーは、第２波長での光放出により放散する。シグナルを直接生成する他の標識には、放射性アイソトープや色素がある。これとは別に、標識がシグナルを生成するために他の成分を必要とする場合もあり、その場合、シグナル生成系は、測定可能なシグナルを生成するのに必要な全ての成分を含み、その成分には、基質、補酵素、増強剤、更なる酵素、酵素生成物と反応する物質、触媒、アクチベーター、補助因子、阻害因子、スカベンジャー、金属イオン、シグナル生成物質の結合に必要な特異的結合物質を含むことができる。適切なシグナル生成系についての詳細な記載は、Ullman等、米国特許第5,185,243号、11−13欄に見ることができ、これは出典明示により本明細書に一部としている。標識は、多数のｓｂｐ構成員：ＭＰＡに結合する抗体；ＭＰＡに結合する抗体の受容体；ＭＰＡに結合する抗体とコンジュゲートした低分子に結合することができる受容体；またはＭＰＡ類似体などのリガンドに共有結合できる。標識のｓｂｐ構成員への結合は、化学反応の結果、標識の水素原子をｓｂｐ構成員への結合で置換することにより達成することができ、また標識とｓｂｐ構成員との間に連結基を含んでいてもよい。他のｓｐｓ構成員もｓｂｐ構成員と共有結合できる。例えば、蛍光剤や消光剤などの２つのｓｐｓ構成員は、それぞれ、ＭＰＡ分析物と複合体を形成する異なる抗体に結合できる。複合体の形成により、蛍光剤と消光剤は極めて接近した状態になり、そうして消光剤が蛍光剤と相互作用してシグナルを生成可能にする。コンジュゲーション法は、当該分野ではよく知られている。例えば、出典明示により本明細書の一部としている、Rubenstein等、米国特許第３,８１７,８３７号参照。本発明はまた、第１ｓｐｓ構成員に結合した抗体および第２ｓｐｓ構成員として検出可能な抗体を有することを意図する。例えば、検出可能な標識がＭＰＡ類似体に結合するとき、抗体の類似体への結合度は、ｓｐｓ構成員の相互作用により生成したシグナルを検出することにより、測定できる。補助物質：本発明の方法では、様々な補助物質を採用することが多い。例えば、緩衝液は、通常、アッセイ媒質やアッセイ成分の安定剤と同じく、アッセイ媒質中に存在する。これらの添加物に加えて、アルブミンなどのタンパク質類、または界面活性剤類、特に非イオン性界面活性剤、結合増強剤、例えば、ポリアルキレングリコール類、または同等物を含む場合がしばしばある。連結基：２またはそれ以上の副構造（部分構造）をつないでおり、構造の一部をなすもの。連結基は、結合であってもよく、また各副構造の間に伸びている水素以外の原子（または他の一価原子）の連続鎖を少なくとも１つ有することもできる。鎖中の原子の数は、少なくとも１つであり、つながっている各副構造間の最も短い経路で水素以外の原子の数を数えることによって決まるが、典型的には１−３０個、普通は２−１０個、好ましくは３−８個の、炭素、酸素、窒素、硫黄、およびリンからなる群から独立してそれぞれ選択される原子である。連結基の総原子数は、炭素、酸素、窒素、硫黄、およびリン原子、即ち、水素以外の原子全部を数えることによって決まる。典型的には、連結基は、全部で３０原子以下、好ましくは２０原子以下、より好ましくは１０原子以下を有する。一般規則として、特定の連結基の長さは、所望の基の合成や組み込みを都合良く行えるように自由裁量で選択できる。連結基は、脂肪族または芳香族であることができ、ジアゾ基を有するとしても、芳香族基は、普通含まれるであろう。酸素は、通常、オキソまたはオキシとして存在し、炭素、硫黄、窒素、またはリンに結合しているものであり；窒素は、通常、ニトロ、ニトロソ、またはアミノとして存在し、通常は炭素、酸素、硫黄、またはリンに結合しているものであり；硫黄は、酸素に類似しているが；リンは、通常ホスホネートおよびホスフェートモノまたはジエステルとして、炭素、硫黄、酸素、または窒素に結合しているものである。連結基と分子との間の共有結合を形成してコンジュゲートさせる際の普通の官能性は、アルキルアミン、アミジン、チオアミド、ジチオール、エーテル、尿素、チオ尿素、グアニジン、アゾ、チオエーテル、およびカルボキシレート、スルホネート、およびホスフェートエステル類、アミド類およびチオエステル類である。低級アルキル：１−５個の炭素原子を含有するアルキル基（脂肪族炭化水素からＨ原子１つがはずれることにより生じる分枝状または非分枝状一価基）。実例には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、イソブチル、ペンチル、およびイソペンチルがある。実施態様本発明の一態様は、カルボキシレート基の水素原子のような１またはそれ以上の水素原子の置き換えにより、ポリペプチド、好ましくはタンパク質、に結合したミコフェノール酸(“ＭＰＡ”)を含む化合物に関する。この化合物は、例えば、タンパク質が酵素標識である場合、ＭＰＡ検出法に使用するためのアッセイ試薬としての有用性が見いだされている。この化合物はまた、例えば、タンパク質が免疫原性キャリアーである場合、抗体産生における有用性が見いだされている。本発明の酵素および免疫原性キャリアーコンジュゲートは、当該技術分野ではよく知られている多数の標準的な方法のうちの一段階または多段階合成により製造できる。典型的には、このようなコンジュゲートは、反応式Ｉのように、ＭＰＡ類似体と酵素または免疫原性キャリアーとの一段階直接結合で製造する。別法としては、反応式IIのように、まずＭＰＡ類似体を製造してから、酵素または免疫原性キャリアーに連結させる多段階合成により製造する。かかる手法の場合の常用出発物質は、ＭＰＡ自身である。典型的には、ＭＰＡを連結または結合させる官能基が存在する位置で修飾する。好ましい官能基は、４位のフェノール性ヒドロキシ、および１'位のカルボキシル基、より好ましくはカルボキシル基である。例えば、１'カルボキシル官能基をカルボキシル基の水素原子の置き換えにより修飾して、式：式中、Ｘはポリペプチドであり、Ｌは結合または連結基であり、ＲはＨ、低級アルキル、またはＣＯ−低級アルキルであり、ｎは１から、Ｘの分子量を５０００で割った値までの数である、の化合物を得る。存在する官能基を利用するＭＰＡコンジュゲートの一段階合成の例は、反応式Ｉ：に示した方法である。１つの方法では、反応式Ｉは、ＭＰＡを炭酸ジスクシニル (“ＤＳＣ”)のような化合物および酵素標識または免疫原性キャリアーと適切な緩衝液中で反応させることを含む。酵素の例には、Ｇ６ＰＤＨおよびアルカリホスファターゼがあり、免疫原性キャリアーの例には、ＫＬＨがある。これは、例示を目的とした方法であり、本発明の範囲を限定するものではない。別法として、任意のＣ−Ｈ結合を酸化して、例えばヒドロキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、アミノ、ハロ、またはスルフヒドリルを形成することにより、官能基をＭＰＡ構造に加えることができる。より好ましくは、この酸化により、ヒドロキシ、アルデヒド、ケトン、またはカルボキシ基などの酸素含有基、より一層好ましくはヒドロキシ基を生じる。好ましくは、高収率で化学的に酸化可能な部位で酸化を行い、酵素とコンジュゲートした場合に、本発明の抗体と共に使用したとき高い阻害能および調節能を有するコンジュゲートを生じる類似体、また、免疫原性キャリアーとコンジュゲートした場合に、本発明の抗体を製造するのに有用な免疫原を生じる類似体を得る。このような酸化に好ましい部位は、ミコフェノール酸のイソベンゾフラニル環の７位にあるメチル基のベンジル水素であり、式：式中、Ｘはポリペプチドであり、Ｌは結合または連結基であり、ＲはＨ、低級アルキル、またはＣＯ−低級アルキルであり、ｎは１から、Ｘの分子量を５０００で割った値までの数である、の化合物を得る。ミコフェノール酸へのヒドロキシ基の酸化的添加に基づく多段階合成の例は、反応式II：に示した方法である。一つの手法では、反応式IIは、Jones等、J.Chem.Soc.(C)1 725-1737(1970)の方法の改良法を用いるＭＰＡの酸化を含む。ＭＰＡは、アルカリ性フェリシアン化カリウムで酸化する。得られる化合物を塩化アセチルで処理して、クロロメチルＭＰＡを得、次いで、これを炭酸カリウムの存在下、過剰の１,２−エタンジチオールで処理して、ジチオール伸長化ＭＰＡを得る。また別の手法では、Ｃ−Ｈ結合の酸化とは異なり、存在する官能基を修飾することによって、官能基をＭＰＡ構造に加えることができる。一例として、イソベンゾフラニル環系の６位のメトキシ基を切断し、得られたフェノール性ＯＨを反応させて、エーテル、エステル、カルボネート、または同等物を形成させる。好ましくは、フェノール性ＯＨを反応させて、エーテル連結を形成させるが、この場合、エーテル基は、コンジュゲーション反応において反応する能力がある官能基となる。これにより、式：式中、Ｘはポリペプチドであり、Ｌは結合または連結基であり、ＲはＨ、低級アルキル、またはＣＯ−低級アルキルであり、ｎは１から、Ｘの分子量を５０００で割った値までの数である、の化合物を得る。存在する官能基の修飾に基づく多段階合成の例は、反応式III：に示した方法である。一つの手法では、反応式IIIは、コリジン中でＬiＩと反応させる、Harrison、Chem.Commun.16(1969)に記載の方法による、イソベンゾフラニル環の６位にあるメトキシ基の切断を含む。得られる二フェノール性ＭＰＡを、例えば、アセトン中でＫ₂ＣＯ₃およびＩＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂Ｓ(t-bu)と反応させる、Jones等、Jornal of Medicinal Chemistry 14：305(1971)に記載の方法により、伸長させる。所望によりシリカゲルクロマトグラフィーにかけた後、保護したチオールを、例えばトリフルオロ酢酸との反応により脱保護する。ジチオール伸長したＭＰＡのコンジュゲートは、ホスフェート緩衝液中でブロモメチル修飾標識酵素または免疫原性キャリアー、例えば、ブロモアセチル−ＫＬＨまたはブロモアセチル−Ｇ６ＰＤＨと反応させることにより製造する。これは、例示を目的とした模範的な方法であり、本発明の範囲を限定するものではない。上記した適用可能なコンジュゲーション法のいずれも、この模範的な方法のコンジュゲーション工程に適している。しばしば、ポリペプチドは、ＭＰＡまたはＭＰＡ類似体が連結する、アミノまたはヒドロキシ基を含有するものであり、コンジュゲーション工程は、ポリ（アミノ酸）を合成する多くの標準的な方法のいずれかであり得る。このような工程の概要は、出典明示により本明細書の一部とするWhite等、“Principles of Bio chemistry”(McGraw-Hill,NY,1978)、92-95頁に見られる。また、出典明示により本明細書の一部とするMggio,E.T.“Enzyme-Immunoassay”(CRC Press，Boca R aton，FL，1980)、4章、81-86頁、参照。一般的に、ＭＰＡまたはＭＰＡ類似体がカルボキシレート基を含有する場合、反応しないアミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、または他の基は、保護する。このことは、Greene,T.W.“Protective Groups in Organic Synthesis”(Wiley- Interscience,NY,1981)およびMcOmie,J.F.W.編“Protective Groups In Organic Chemistry”(Plenum Press，NY，1973)に詳細に記載されており、その等価な部分を出典明示により本明細書の一部としている。適切な保護基には、これらに限定されないが、ベンジルオキシカルボニル、トリフェニルメチル、第３級ブチルオキシカルボニル、フタロイル、トリフルオロアセチル、ベンジル、ｐ−トルエンスルホニル、飽和低級アルキル、ベンジルエステル、第３級ブチルエステル、およびアセチルがある。その後、所望により保護したＭＰＡまたはＭＰＡ類似体を活性化する。好ましくは、ジメチルホルムアミド(“ＤＭＦ”)などの有機溶媒中での活性化試薬、例えば、クロロギ酸アルキル（炭素原子９以下）、例えば、クロロギ酸イソブチル；ジアルキルカルボジイミド、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド；１− エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(“ＥＤＡＣ”)、１ −シクロヘキシル−３−(２−モルホリノ−４−エチル)カルボジイミド、ｐ−トルエンスルホン酸メチル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド／ＥＤＡＣ、およびＮ −ヒドロキシスルホスクシンイミド／ＥＤＡＣとの反応により、化合物を活性化する。活性化反応は、典型的には、１０−１００℃、好ましくは０−３０℃、より好ましくは０−１０℃で、好ましくは窒素、ヘリウム、アルゴン、または同等物の雰囲気下で行う。活性化反応は、１分ないし１０日間、好ましくは１時間から２日、より好ましくは６−１８時間行う。活性化反応後、活性化した化合物を、ポリペプチドのＤＭＦまたはＤＭＦ／ボレート緩衝液などの有機または水性／有機溶媒の溶液に加える。添加は、一定時間かけて行うことができ、また、一段階で実施することもできる。添加を一定時間かけて行うならば、典型的には、１分から１２時間、好ましくは１０分から８時間、より好ましくは３０分から３時間を要する。添加後、混合物を１分から３日間、好ましくは１０分から１日、より好ましくは１−１８時間撹拌させる。その後、望ましくない保護基は除去できる。脱保護工程は、上記詳述した保護基に基づいて選択する。上記引用した文献には、好ましい保護基の除去のための条件や試薬類が記載されている。その他のコンジュゲーション法は、酵素または免疫原性キャリアーの非−オキソカルボニル官能性とα−ハロまたはα−プソイドハロアルキルカルボニル含有化合物との反応を含む。その後、得られたハロまたはα−プソイドハロ含有酵素または免疫原性キャリアーをメルカプタン含有ＭＰＡまたはＭＰＡ類似体と反応させて、所望のコンジュゲートを形成させる。この方法は、全体的にRowley等、米国特許第4,220,722号に開示されており、出典明示により本明細書の一部としている。好ましい化合物は、α−ブロモ酢酸などのα−ブロモ化合物である。Ｇ６ＰＤＨなどの酵素ポリペプチドとのコンジュゲーション反応は、これらに限定されないが、ｐＨ、温度、緩衝液、イオン強度、酵素活性部位を保護し得る物質、共溶媒の量および種類、反応時間、および活性化化学を含む、多くの要因に影響され得る。それぞれの酵素−ＭＰＡ組み合わせの場合、これらの変化する要因を適切に操作することにより、下記の特性：所定の阻害量の非活性化の低減；より大きい標準曲線；アッセイ精度の向上；および熱安定性の増大、の１つまたはそれ以上について改良されたコンジュゲートを導くことができる。コンジュゲーション反応の場合、５から９.５の範囲のｐＨ値が、通常は使用できる。これらの反応は、一般的に、０−４０℃、好ましくは４−２０℃で行う。多くの緩衝液および塩類を単独および組み合わせの両方で、このような反応に使用することができる。これらには、トリス、ビカーボネート、ホスフェート、ピロホスフェート、ＥＤＴＡ、ＫＣl、ＮaＣl、およびその他多くのものがある。活性部位は、基質（即ち、Ｇ６Ｐ）、補因子（ＮＡＤ⁺、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ⁺、ＮＡＤＰＨ）および補因子類似体（チオ−ＮＡＤ⁺、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰ⁺、またはチオ−ＮＡＤＰＨ）、およびリジンと可逆的に反応してコンジュゲーション中の酵素の非活性化を低減する化合物（即ち、ピリドキサール）により、保護することができる。ＭＰＡ溶解性を高め得る共溶媒には、ジメチルホルムアミド、カルビトール、ジメチルスルホキシド、１−メチル−２−ピロリジノン、および１,３−ジメチル−３,４,５,６−テトラヒドロ２(１Ｈ)−ピリミジノンがあるが、これらに限定されない。これらは、反応容量の１−３０％として有用であり得る。反応は、その活性化化学によって１５分から数日までで変わることがある。カルボキシル化合物を活性化して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはそのスルホ類似体とのエステルを形成させるか、またはクロロギ酸カルビトールｔ− ブチルクロロギ酸カルビトールとの反応により混合無水物にすることができ、また、ＥＤＡＣのようなカルボジイミドを用いて直接結合させることもできる。酵素によるシステインチオールとの反応の場合、ＭＰＡまたはＭＰＡ類似体は、Ｉ、Ｂr、トシルのような良好な脱離基を含有すべきであり、あるいは、ＭＰＡまたはＭＰＡ類似体は、２,２'−ジチオ−ジピリジンなどの化合物で活性化したチオールを含有することができる。所望ならば、コンジュゲートを精製することができる。ポリ(アミノ酸)−ハプテンコンジュゲートの精製および特性化は、出典明示により本明細書の一部としているMggio、上記、第４章、86−88頁に詳細に開示されている。例えば、精製は、水／ＤＭＦまたは水などの水性／有機および水性溶液に対する透析によって、または、セファデックスなどの支持体でのゲル濾過クロマトグラフィーによってできる。本発明の一態様は、所望により連結基により免疫原性キャリアーとコンジュゲートしたミコフェノール酸（“ＭＰＡ”）またはＭＰＡ類似体を含む免疫原に応答して製造される抗体に関する。更に、本発明は、このような抗体と検出可能な標識とのコンジュゲートである化合物類を含む。本発明の抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであることができ、当分野ではよく知られた技術、例えば、宿主の免疫感作、および既知技術により分離できる免疫グロブリンからの血清の採集（ポリクローナル）により、継代ハイブリッド細胞系列の製造および分泌タンパク質の採集（モノクローナル）により、または、少なくとも天然抗体の特異的結合のために必要なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列またはその突然変異物のクローニングおよび発現により製造できる。抗体は、完全な免疫グロブリン、またはそのフラグメントを含み、これらの免疫グロブリンは、様々な種類およびアイソタイプ、例えば、ＩgＡ、ＩgＤ、ＩgＥ、ＩgＧ１、ＩgＧ２a、ＩgＧ２b、およびＩgＧ３、およびＩgＭを含む。それらのフラグメントは、Ｆab、Ｆv、Ｆ(ab')2、およびＦabを含むこともできる。モノクローナル抗体は、MilsteinおよびKohlerのNature 256:495-7(1975)に記載の方法により得ることができる。宿主、通常はマウスに免疫原を注射し、その後、動物の脾臓から細胞を取り出す。宿主は非感作脾臓細胞であることもでき、これをインビトロで免疫原に感作させる。得られた細胞を骨髄腫細胞と融合させる。その結果“ハイブリドーマ”と呼ばれるハイブリッド細胞が得られ、これはインビトロで培養できる。ハイブリドーマの集団をスクリーンし、それぞれが抗原に対して単一の抗体を分泌する個々のクローンを単離するために処理する。抗体は、他の分子の特定の空間的および極性の構成と特異的に結合し、それによって、他の分子の特定の空間的および極性の構成と相補的なものとして定義される免疫グロブリンである。本発明の抗体は、ＭＰＡを特異的に認識し、かつＭＰＡに特異的に結合する能力があり、それ故に、ＭＰＡを含有する疑いのある試料中のＭＰＡの存在を検出するアッセイに有用である。更に重要なことには、これらの抗体は、アッセイする試料中に存在し得るＭＰＡと、これに近密に関連する化合物類、例えば、ミコフェノール酸エステルやＭＰＡ代謝物からなる群から選択されるものとを識別する能力がある。本発明のある実施態様では、抗体は、ＭＰＡとＭＰＡ−Ｍなどのミコフェノール酸エステルとを識別する能力がある。本発明のその他の実施態様では、抗体は、ＭＰＡとＭＰＡ−ＧなどのＭＰＡ代謝物とを識別できる。本発明の抗体は、好ましくは：および式中、Ｘは免疫原性キャリアーであり、Ｌは結合または連結基であり、ＲはＨ、低級アルキル、およびＣＯ−低級アルキルからなる群から選択され、ｎは１から、Ｘの分子量を５０００で割った値までの数である、から選択される免疫原に対して生じる。上記のように、これらの抗体は、ＭＰＡのアッセイに有用である。従って、本発明のその他の態様は、(ａ) 試料を、ＭＰＡとミコフェノール酸エステルとを識別する能力のある抗体と接触させ、そして(ｂ) 抗体のＭＰＡへの結合を測定する、各工程を含んでなる、ＭＰＡを含有する疑いのある試料中のＭＰＡを測定する方法に関する。本発明のその他の実施態様は、ＭＰＡとＭＰＡ代謝物とを識別する能力のある抗体を使用する。この方法は更に、工程（ａ）において試料とＭＰＡの標識化類似体とを接触させることを含むこともできる。この方法は、均一系または不均一系であることができる。均一系形式の例は、標識が、抗体が類似体に結合するとその活性が修飾される酵素である場合である。不均一系形式の例は、抗体が支持体に結合されるか、または支持体に結合する能力がある場合である。本明細書で使用した、用語 “支持体に結合する能力がある”は、例えば、抗−ＭＰＡ抗体などの試薬を第１ｓｂｐ構成員または低分子に結合させ、次に、相補的な第２ｓｂｐ構成員または低分子の受容体を支持体に結合させることを意味する。あるいは、抗−ＭＰＡ抗体の受容体、例えば抗−マウス抗体を支持体に結合させ、抗−ＭＰＡ抗体を捕獲するのに使用する。故に、抗−ＭＰＡ抗体は、実際には支持体に結合していないが、相補的なｓｂｐ構成員または受容体を加えると、結合することになるのである。抗体のＭＰＡへの結合は、当分野ではよく知られた多くの方法で検出できる。抗体とＭＰＡとが結合すると、直接的または間接的に検出できる免疫複合体を形成する。この免疫複合体は、例えば、使用した抗体が標識にコンジュゲートしている場合、直接的に検出される。この免疫複合体は、シグナル生成系におけるアッセイ媒質中の免疫複合体形成の影響を調べることにより、または本発明の抗体に特異的に結合する標識化受容体を採用することにより、間接的に検出される。本発明のアッセイは、ＭＰＡに対するあらゆるイムノアッセイに応用できる。このアッセイは、アッセイ成分または生成物の分離を伴わない（均一系）か、また分離を伴う（不均一系）かのいずれかで実施できる。均一系イムノアッセイは、Rubenstein等、米国特許第３,８１７,８３７号、３欄６行から６欄６４行に開示されている、enzyme multiplied immunoassay techniques(“ＥＭＩＴ”)；Ul lman等、米国特許第３,９９６,３４５号、１７欄５９行から２３欄２５行に開示されているような免疫蛍光法；Magio等、米国特許第４,２３３,４０２号、６欄２５行から９欄６３行に開示されているような酵素チャンネリング技術；および、Mggio,E.T.上記に記載されているenzyme linked immunosorbant assay (“ＥＬＩＳＡ”)などのその他の酵素イムノアッセイにより例示されている。不均一系アッセイの実例は、Yalow等、J.Clin.Invest.39:1157(1960)に開示されているラジオイムノアッセイがある。上記開示は、全て、出典明示により本明細書の一部としている。試料は、好ましくは適切な媒質中で、直接的に試験することができ、また試料をアッセイ媒質に加える前に前処理することもできる。前処理は、ＭＰＡを１またはそれ以上のアッセイ試薬に対して一層容易に利用できるようにするものであるか、または、望ましくない物質を除去することによってアッセイにおける干渉を低減することによりＭＰＡを一層容易に検出できるようにするものである。細胞を分離または溶解する；タンパク質を沈澱、加水分解、または変性させる；脂質を加水分解する：分析物を可溶性にする；その他のために、試料を前処理することができる。このような前処理には、限定ではないが、遠心分離；有機溶媒、例えば、アルコール、好ましくはメタノールなどの７個以下の炭素を有するアルコール、での試料の処理；洗剤での処理がある。アッセイは、通常、水性緩衝化媒質中、穏やかなｐＨ、一般的に最適アッセイ感度を提供するｐＨで実施されるであろう。水性媒質は、単なる水であってもよく、また０−４０容量パーセントの共溶媒を含んでいてもよい。媒質のｐＨは、通常、４−１１の範囲、より普通には５− １０の範囲、好ましくは６.５−９.５の範囲である。ｐＨは、普通、特異的結合対の結合構成員の最適結合とシグナル生成系の構成員などのアッセイの他の試薬の最適ｐＨとの間の中間である。様々な緩衝液を用いて、所望のｐＨを達成し、測定中、そのｐＨを維持することができる。例示的な緩衝液には、ボレート、ホスフェート、カルボネート、トリス、およびバルビタールがある。採用した特定の緩衝液が本発明にとって重大なのではないが、個々のアッセイにおいて１またはもう１つの緩衝液が好ましいことがある。アッセイを実施するためには、通常、穏やかな温度を採用し、普通は、測定期間中、特に速度測定の場合、一定温度を採用する。インキュベーション温度は、５−４５℃、より普通には１５−４０℃の範囲である。測定中の温度は、一般的に１０−５０℃、より普通には１５−４０℃の範囲である。アッセイされ得るＭＰＡの濃度は、一般的に１０^-5から１０^-13Ｍ、より普通には１０^-6から１０^-8Ｍで変わるであろう。アッセイが定性的、半定量的、または定量的（試料中に存在するＭＰＡ量に相関する）であるかどうかなどの検討、特定の検出技術およびＭＰＡの濃度が、通常、様々な試薬の濃度を決定するであろう。アッセイ媒質中の様々な試薬の濃度は、一般的に、対象となるＭＰＡの濃度範囲によって決まる。しかしながら、それぞれの試薬の最終濃度は、アッセイの感度がその範囲で最適であるように経験に基づいて決められるものである。即ち、ＭＰＡ濃度の変化は重要であり、精確に測定可能なシグナル差異を提供すべきである。添加順序は、広範囲に変わり得るが、アッセイの性質に基づく一定の優先順位がある。最も簡単な添加順序は、全ての材料を同時に加え、均一系アッセイにおけるように、アッセイ媒質がシグナルに対して有する影響を測定するものである。別法として、試薬を連続的に合わせてもよい。所望により、インキュベーション段階を、それぞれの添加後、一般的には３０秒から６時間、より普通には１分から１時間の範囲で含めてもよい。下記の実施例は、更に、本発明の特定の実施態様を説明するものであり、本発明の範囲を説明することを意図しているのであって、本発明の範囲を限定するものではない。均一系アッセイでは、試薬全てを合わせた後、シグナルを測定し、試験した試料中のＭＰＡ量に相関させる。例えば、ＥＭＩＴでは、ＭＰＡを含有する疑いのある試料を水性媒質中、同時にかまたは連続的かのいずれかで、ＭＰＡ−酵素コンジュゲート、およびＭＰＡとそのコンジョゲートを識別する能力のある抗体と合わせる。一般的に、酵素の基質を加えると、酵素触媒化反応に際して発色または発光生成物の形成を生じる。好ましい酵素は、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびアルカリホスファターゼである。試料中のＭＰＡとＭＰＡ−酵素コンジュゲートは、抗体の結合部位に対して競合する。次いで、媒質中の酵素活性を、通常は、分光測定手段により測定し、既知量のＭＰＡが存在するカリブレーターまたは基準試料を試験した場合に測定しておいた酵素活性と比較する。典型的には、カリブレーターは、ＭＰＡを含有する疑いのある試料の試験と同様の方法で試験する。カリブレーターは、典型的には、測定されるＭＰＡ分析物の様々な濃度を含有するが、その濃度は既知である。好ましくは、カリブレーター中に存在する濃度範囲は、未知試料に存在する疑いのあるＭＰＡ濃度の範囲に及ぶ。不均一系アッセイは、普通、１またはそれ以上の分離工程を伴い、競合型または非競合型であり得る。様々な競合型および非競合型アッセイ形式が、出典明示により本明細書の一部としている、Davalian等、米国特許第５,０８９,３９０号、１４欄２５行から１５欄１９行に開示されている。典型的な競合型アッセイの場合、本発明の抗体を支持体に結合させ、次いで、試料および酵素などの検出可能な標識にコンジュゲートさせたＭＰＡを含有する媒質と接触させる。試料中のＭＰＡは、抗体への結合についてコンジュゲートと競合する。支持体および媒質を分離後、支持体または媒質の標識活性を常用技術により測定し、試料中のＭＰＡ量に相関させる。典型的には非競合型アッセイは、出典明示により本明細書の一部としている、 David等、米国特許第４,４８６,５３０号、８欄６行ないし１５欄６３行に開示のサンドウィッチアッセイである。この方法では、ＭＰＡ、ＭＰＡに結合する第１抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）、およびＭＰＡに結合する第２抗体を含んでなる免疫サンドウィッチ複合体が形成される。続いて、免疫サンドウィッチ複合体を検出し、試料中のＭＰＡ量に相関させる。免疫サンドウィッチ複合体は、複合体中の標識の存在により検出されるが、そのとき、第１抗体および第２抗体のいずれかまたは両方が、標識または、例えば、抗体をビオチンに連結させたり、アビジンを標識に与えるような標識と結合する能力のある置換基を含有している。本発明を実施するのに有用なその他の方法は、出典明示により本明細書の一部としている、Weng等、米国特許第４,８７９,２１４号、９欄１１行ないし１２欄３９行に開示されている。この方法は、試料を含有する試験溶液、第１ｓｂｐ構成員、および毛管作用により試験溶液を上昇移動させることができる吸収性材料からなるテストストリップの接触部分を組み合わせて与える必要がある。第１ｓｂｐ構成員は、分析物に結合する能力があるものであってもよい。ストリップは、ストリップの接触部分から離れたストリップ上の小部位で第１ｓｂｐ構成員を濃縮および非拡散結合させるための第２ｓｂｐ構成員を含む。このストリップは、更に、小部位と接触部分との間に第３ｓｂｐ構成員を含むこともできる。検出可能なシグナルは、試験溶液中の分析物の存在に相関して生成する。本発明のアッセイを実施するのに有用なその他の方法は、出典明示により本明細書の一部としている、Ullman等、米国特許第４,８５７,４５３号、１１欄２１行ないし１４欄４２行および１８欄２１行ないし２１欄５５行に開示されている。本発明によるアッセイでは様々な補助物質がたびたび採用される。例えば、緩衝液は、通常、アッセイ媒質およびアッセイ成分の安定化剤と同じく、アッセイ媒質中に存在する。多くは、これらの添加物に加えて、更に、アルブミンなどのタンパク質、または界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤、結合増強剤、例えばポリアルキレングリコール、または同等物を含むこともできる。ＭＰＡを含有する疑いのある試料中のＭＰＡを測定するための本発明の好ましい方法は、(ａ) 試料をＭＰＡに結合する抗体と接触させ、そして(ｂ) ＭＰＡへの抗体の結合を検出する、各工程を含んでなる。抗体は、下記の免疫原の１つに対して生じる：および式中、Ｘは免疫原性キャリアーであり、Ｌは結合または連結基であり、ＲはＨ、低級アルキル、およびＣＯ−低級アルキルからなる群から選択され、ｎは１から、Ｘの分子量を５０００で割った値までの数である。抗体は、支持体に結合するもの、または支持体に結合する能力があるものであることができる。この方法では、工程（ａ）は、更に、試料を下記化合物の１つと接触させることを含んでいてもよい；およびここで、Ｘ'は検出可能な標識であり、Ｌは結合または連結基であり、ＲはＨ、低級アルキル、およびＣＯ−低級アルキルからなる群から選択され、ｎは１から、Ｘ'の分子量を５０００で割った値までの数である。ＭＰＡを含有する疑いのある試料中のＭＰＡの量を測定するための本発明の別の好ましい方法は、(ａ) 水性媒質中で、試料、検出可能な標識にコンジュゲートさせたＭＰＡ、およびＭＰＡと、ミコフェノール酸エステルおよびＭＰＡ代謝物からなる群から選択される化合物とを識別する能力のある抗体とを合わせ、そして(ｂ) 標識の活性に対する試料の影響を測定する、各工程を含んでなる。検出可能な標識は、好ましくは酵素であり、測定工程は、酵素活性の測定を含む。この方法はまた、合わせる工程において酵素の基質を含んでいてもよい。その他の好ましい方法は、ＭＰＡを含有する疑いのある試料中のＭＰＡに対する均一系イムノアッセイであり、(ａ) 液体媒質中で、試料、ＭＰＡ類似体と酵素とのコンジュゲート、ＭＰＡとミコフェノール酸エステルとを識別する能力のある抗体、その酵素の基質を合わせ、(ｂ) 媒質中の酵素の酵素活性を測定し、そして(ｃ) その活性を、既知量のＭＰＡを含有する試料の場合に観察された酵素活性と比較することを含んでなる。本発明は、本発明の抗体およびＭＰＡから形成される複合体を含んでなる物質の組成物にも関連する。このような複合体は、既知濃度のＭＰＡを有する検定溶液（calibration solution）中のＭＰＡ量を測定することにより検定（calibrat e）する本発明の方法におけるカリブレーターとして有用である。そのため、本発明は、液体媒質中でＭＰＡおよび本発明の抗体を合わせる工程を含んでなる、かかる組成物の製法にも関する。このような複合体を、かかる検定（calibratio n）に使用するための本発明のキット態様中にパッケージすることもできる。本発明の別の態様は、本発明のＭＰＡの測定用アッセイ法を簡便に実施するのに有用なキットに関する。主題発明の融通性を高めるために、本発明の方法に有用な試薬を、パッケージした組合せ物中、同じかまたは別の容器に液体または凍結乾燥形態で提供することができ、そうして、試薬の比率がその方法およびアッセイにおいて実質的に最適であるようにする。試薬は、それぞれ別の容器に入れてもよく、また、様々な試薬を、試薬の交差反応性および安定性にあわせて１またはそれ以上の容器内に入れてもよい。キットは、所望により連結基を介して、免疫原性キャリアーにコンジュゲートさせたＭＰＡの類似体に応答して生じる本発明の抗体を含有する。適切な免疫原には：および式中、Ｘは免疫原性キャリアーであり、Ｌは結合または連結基であり、ＲはＨ、低級アルキル、およびＣＯ−低級アルキルからなる群から選択され、ｎは１から、Ｘの分子量を５０００で割った値までの数である、がある。好ましくは、抗体は、ＭＰＡとミコフェノール酸エステルおよび／またはＭＰＡ代謝物とを識別することができる。このような抗体は標識してもよいし、標識しなくてもよい。このキットは、試薬としてＭＰＡ、または所望により連結基を介して標識にコンジュゲートさせたＭＰＡ類似体を含んでなる。適切なコンジュゲートには：およびＸ'は検出可能な標識であり、Ｌは結合または連結基であり、ＲはＨ、低級アルキル、およびＣＯ−低級アルキルからなる群から選択され、ｎは１から、Ｘ'の分子量を５０００で割った値までの数である、がある。本発明のアッセイ態様を行うのに有用なその他の試薬は、本発明の抗体から形成される複合体および本発明の標識化ＭＰＡコンジュゲートである。このようなキットは、更に、例示であって限定ではないが、シグナル生成系の構成員、支持体、補助試薬、およびその他を含む、本発明のアッセイ態様を実施するための他の試薬をパッケージして含むこともできる。好ましい実施態様では、キットは、パッケージした組合せ物中に、(ａ) ＭＰＡとミコフェノール酸エステルとを識別する能力のある抗体、および(ｂ) 検出可能な標識に結合したＭＰＡを含む化合物を含んでなる。好ましくは、標識化ＭＰＡコンジュゲート試薬のｐＨを、他の配慮すべきことの中で、コンジュゲートの活性および安定性との釣り合いを保つように、最適化する。その好ましい実施態様の一つにおいて、本発明は、ｐＨが６−１０、好ましくは７−９、より好ましくは７.５−８.５であるＭＰＡ−Ｇ６ＰＤＨまたはＭＰＡ−アリカリホスファターゼコンジュゲート試薬に関する。好ましくは、抗体試薬のｐＨを、アッセイ試薬成分の安定性および精度を最大限にするように、最適化する。その好ましい実施態様の一つにおいて、本発明は、ｐＨが４−７、好ましくは５−６、より好ましくは２.２５−５.８５である、ＭＰＡ抗体試薬に関する。ＢＬＧまたはＰＥＧなどの増量剤を含む表面活性添加物、およびトゥイーン− ２０、プルラファックスＡ３８、トリトンＸ−１００、プルロニック２５Ｒ２、ＲＳＡ、ウシ血清アルブミン、モデュサイト（Mod-u-cyte）、ソルプロ（sol-u- pro）または同種物などの界面活性剤、およびその他、当分野で通常使用される物質を抗体および標識コンジュゲート試薬の両方に加えることができる。表面活性添加物は、溶液中の化合物の疎水性または低溶解性を維持し、アッセイ試薬成分を安定化し、またはアッセイ試薬活性を最適化するために、加えることができる。抗菌剤をアッセイ試薬に加えて、試薬類の貯蔵寿命を延長させることもできる。本発明を更に下記例示の実施例により示す。実施例本明細書中の部およびパーセンテージは特記しない限り重量によるものである。温度はセ氏温度（℃）である。カラムクロマトグラフィー分離は、シリカゲル（Merck、２３０−４００メッシュ）で行った。反応は全て、乾燥アルゴン雰囲気下で行った。使用した試薬は、全て市販のものである。略語ＡＬＰアルカリホスファターゼＢＳＡウシ血清アルブミンＤＭＥＭダルベッコ修飾イーグル培地ＤＭＦＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミドＥＬＩＳＡ Enzyme Linked Immunosorbent Assay ＥＭＩＴ Enzyme Multiplied Immunoassay Technique ＦＡフロイントアジュバントＧ６ＰＤＨグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼＫＬＨ鍵穴カサガイヘモシアニンＭＰＡミコフェノール酸ＭＰＡ−ＭＥ−６−(１,３−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−６−メトキシ−７−メチル−３−オキソ−５−イソベンゾフラニル) −４−メチル−４−ヘキセン酸モルホリノエチルＭＰＡ−Ｇミコフェノール酸グルクロニドＮＨＳＮ−ヒドロキシスクシンアミドＯＤ光学密度ＰＢＳホスフェート緩衝化塩水ＳＡＴ血清抗体力価実施例１ＭＰＡのヒドロキシメチル−ＭＰＡへの酸化水（１００ml）中ＭＰＡ（５g、３４.５ミリモル）とＮaＯＨ（７g）の撹拌溶液をアルゴン雰囲気下で１時間７０−９０℃まで暖めた。次いで、混合物を０℃ まで冷却し、水（１００ml）中フェリシアン化カリウム（４g、２１.３mmol）の溶液を３０分かけて加えた。４時間後、更に水（５０ml）中フェリシアン化カリウム（２g、１０.６mmol）を加えた。次いで、反応を室温で一晩撹拌した。その後、混合物をＨＣl（３Ｎ）でｐＨ２.０まで酸性化し、次いで、混合物を酢酸エチル（２×１５０ml）で抽出した。それから、有機抽出物を水：塩水（１：１、１００ml）で洗浄し、乾燥（ＭgＳＯ₄）させた。溶媒を減圧下で除去して粗生成物を得、これをカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン：酢酸、６０：４０：１）で精製して、純粋なヒドロキシメチル−ＭＰＡ生成物を白色固体として得た（２.０ｇ、４０％）。実施例２ヒドロキシメチル−ＭＰＡからのクロロメチル−ＭＰＡの製造塩化アセチル（１０ml）中ヒドロキシメチル−ＭＰＡ（４００mg、１.２mmol ）の懸濁液を、それが透明溶液になるまで室温で３時間撹拌した。過剰の塩化アセチルを減圧下で除去し、残渣を酢酸エチル（４０ml）に溶解し、水（３×５０ ml）で、または水洗液が中性になるまで洗浄した。次いで、有機相を乾燥（Ｍg ＳＯ₄）し、蒸発乾固させて、クロロメチル−ＭＰＡ（３００mg、６３％）を濃厚液体として得、これを更に精製せずに次の工程に使用した。実施例３ジチオール伸長化ＭＰＡの製造アセトン（５ml）中クロロメチル−ＭＰＡ（２００mg、０.５mmol）の撹拌溶液に、１,２−エタンジチオール（０.２５ml、３mmol）および炭酸カリウム（２００mg、微細粉末）を加えた。反応物を３時間撹拌し、次いで、濾過した。フィルターケーキをアセトン（１０ml）で洗浄し、次いで、濾液を蒸発乾固させた。酢酸エチル（５０ml）を加え、混合物を水（３×１００ml）で洗浄し、乾燥（Ｍ gＳＯ₄）させた。溶媒を減圧下で除去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン：酢酸、６０：４０：０.１）にかけ、ＭＰＡ− ７−(２−チオメチル−エタンチオール)(“ジチオール伸長化ＭＰＡ”)を濃厚油状物（１５０mg、７２％）として得た。実施例４ジチオール伸長化ＭＰＡのブロモアセチル−ＫＬＨへのコンジュゲーションホスフェート緩衝液（ｐＨ≒８.５、１００ｍＭ）中、ブロモアセチル−ＫＬＨ（２６mg、１.３mg／ml、５×１０^-5mmol、アセチル基の数≒１１００）の撹拌溶液に、ＤＭＦ（２ml）を加えた。ＤＭＦ（１ml）中、ジチオール伸長化ＭＰＡ（２０mg、４.８×１０^-2mmol）の溶液をアルゴン雰囲気下で加えた。次いで、反応混合物をアルゴン雰囲気下室温で２４時間撹拌した。その後、得られた溶液をセファデックスＧ−５０カラム（ホスフェート緩衝液、ｐＨ＝８.０、１００ｍＭを溶離液として用いた）に通し、ジチオール伸長化ＭＰＡ−ブロモアセチル−ＫＬＨ免疫原の溶液（４０ml、０.５mg／ml）を得た。Habeeb，Analy tical Biochemistry，14：328-336(1966)に記載の方法により、ハプテン数が５００であることを測定した。実施例５ＭＰＡのＫＬＨへのコンジュゲーションアセトニトリル（１ml）およびピリジン（１６０mg）中、ＭＰＡ（３２mg、０ .１mmol）の撹拌溶液に、固体の炭酸ジスクシニルを少しずつ（≒１０mgずつ）加え、反応をＴＬＣ（シリカゲル、酢酸エチル：ヘキサン：酢酸、５０：５０：１）で出発物質が残存しなくなるまで（≒４時間）追跡した。得られたＭＰＡ− ＮＨＳエステル混合物を更に精製せずに、次の工程に使用した。脱イオン水（５ ml）およびアセトニトリル（０.５ml）中、ＫＬＨ（４０mg、８×１０^-6mmol）の撹拌溶液に、ｐＨが９.０になるまでＮaＯＨ溶液（１Ｎ）を加えた。得られた溶液に、４℃でＭＰＡ−ＮＨＳエステル（２７０μl、≒０.０３mmol）の溶液を加えた。混合物を４℃で一晩撹拌し、次いで、水およびＤＭＦ（８０：２０）、次いで水およびＤＭＦ（９０：１０）の混合液、最終的には水に対して透析することにより、精製した。得られた溶液を凍結乾燥して、ＭＰＡイソベンゾフラニル環系の１'位にＫＬＨが結合した純粋なＭＰＡ−ＫＬＨ免疫原（５０mg）を得た。ハプテン数は１２００であることを測定した。実施例６ＭＰＡのＧ６ＰＤＨのコンジュゲーション実施例５の方法を用いて、酵素をどの程度重度に非活性化したかが異なる、即ち、より一層非活性化した酵素による、一連の４つの酵素−コンジュゲートを製造し、より多数のハプテンを酵素に対して標識した。ＭＰＡ−Ｇ６ＰＤＨ−コンジュゲートＡは、２３％非活性化されており、Ｂは３８％、Ｃは５２％、さらにＤは７１％非活性化されていた。実施例７ジチオール伸長化ＭＰＡのＧ６ＰＤＨへのコンジュゲーション実施例４の方法を用いて、ジチオール伸長化ＭＰＡハプテンを用いて、一連の酵素−コンジュゲートを製造した。ジチオール伸長化ＭＰＡ−Ｇ６ＰＤＨコンジュゲートＡは、３５％非活性化されており、Ｂは４８％、Ｃは５２％、さらにＤは７７％非活性化されていた。実施例８抗体の産生方法Ａ．免疫感作マウスを下記アジュバント：完全および不完全ＦＡ、アルム(Alum)、およびトレハロースジミコール酸およびモノリン脂質ＡからなるＲＩＢＩアジュバント系の１つにおいて実施例４および／または５の免疫原で免疫感作した。免疫原を腹膜内注射当たり２０ないし１２２μgで月に２ないし４回投与した。融合３日前、マウスは２００ないし５００μg／mlの免疫原を含有する塩水腹膜内ブーストを受けた。Ｂ．組織培養スーパーＤＭＥＭを全ての組織培養に用いた。これは、ＤＭＥＭに１０％ウシ胎児血清、１０％ＮＣＴＣ−１３５(Gibco #440-1100EC)、４mgグルタミン、１ｍＭオキサロ酢酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０.１４８ｎＭ１−システイン、１０μg／mlインシュリン、および３５.５ｍＭ重炭酸ナトリウムを補足したものである。ならし培地は、Ｐ３８８Ｄ₁細胞（ATCC #TIB 63）をスーパーＤＭＥＭ中で生育させ、４ないし５日毎に１：４に分けることにより調製した。スペント培地を１５００rpmで１５分間遠心分離した。その後、スペント培地を濾過して、残りの細胞および異物を除去した。後の使用に備えて、使用前、または−２０℃で凍結する前にグルタミン（１００×ストック＝５８.５ｇ／Ｌ）をスペント培地に加えた。ならしスーパーＤＭＥＭは、スーパーＤＭＥＭに１０％Ｐ３８８Ｄ₁スペント培地を補足し、次いで、それを用いて融合後およびクローニング中のハイブリドーマ増殖を持続させることにより調製した。マウス骨髄腫細胞系列Ｐ３／Ｘ６３−Ａg ８.６５３（Ａg８.６５３）は、毎日１：２ないし１：４に分けるか、または週末に６−ウェルプレート中で連続希釈することにより、培養を維持した。全ての細胞を７％ＣＯ₂中３７℃で維持した。１．融合脾臓を免疫感作させたマウスから無菌的に取り出し、１０mlＤＭＥＭ中に置き、次いで、スライド２つで挟んですり漬した。脾臓細胞の単一細胞懸濁液は、細胞懸濁液を単フィラメントスクリーンクロスに通すことにより得た。脾臓由来の脾臓細胞、約２×１０⁸細胞を４０×１０⁶Ａg８.６５３細胞と合わせ、８００rp mで５分間遠心分離し、ＤＭＥＭで１ないし２回洗浄した。ＰＥＧ（７５ｍＭヘペス中５０％溶液）４.０mlを穏やかに撹拌しながら３分かけて加えることにより融合が起こり、次いで、スーパーＤＭＥＭ３０ないし４０mlを加えて、ＰＥＧを不活性化させた。細胞懸濁液を８００rpmで５分間遠心分離した。上清を流し出し、細胞をスーパーＤＭＥＭ−ＨＡＴ（ストックＨＡＴ＝５０Ｘシグマ#H0262 ；培地中：１００μＭヒポキサンチン、０.４μＭアミノプテリン、および１６μ Ｍチミジン）２４０mlで再懸濁し、１２個の９６−ウェルプレート中に２００μ l／ウェルで置いた。スペント培地１００μl／ウェルを除去し、続いて、ならしスーパーＤＭＥＭ −ＨＡＴ２００μl／ウェルを融合後４ないし５日で加えることにより、細胞を育てた。融合物を、融合後約７ないし１０日スクリーンした。最終的に細胞を下記のように連続希釈によりクローン化した。２．連続希釈によるクローニングＥＬＩＳＡで陽性であったウェルを次いでＥＭＩＴ形式で試験した。その場合、ＥＬＩＳＡおよびＥＭＩＴ陽性抗体を産生するハイブリドーマを連続希釈により数回クローン化して、単一細胞コロニーを確保した。ハイブリドーマを９６−ウェルプレートの１つのウェルからならしスーパーＤＭＥＭ１.５ml／ウェルを含有する２４−ウェルプレートへ移した。細胞をピペット操作により混合し、１００μl／ウェルを、ならしスーパーＤＭＥＭ２００ μl／ウェルを含有する９６−ウェルプレートのＡ列に加えた。１００μl／ウェルをフロウ・マルチチャンネルピペッター（Flow Multichannel pipettor）を用いてＢ列に移し、ピペット操作により混合し、再度、１００μl／ウェルを次の列へと移した。それぞれの“クローン”を７回連続的に希釈し、１プレート当たり１ないし４クローンにした。希釈を３ないし４回に、または安定するまでに限定することにより、細胞を再クローン化した。３．細胞系列の凍結および解凍実施例４および５の免疫原を用いて製造したＥＬＩＳＡ陽性であるクローン化および安定化細胞系列、および酵素−コンジュゲートを阻害し、かつＥＭＩＴプロトコール中でその後の融合物由来の遊離薬剤で調節した細胞系列を凍結し、− １００℃で貯蔵した。９６−ウェルプレートから選択したウェル（クローン）を、細胞を毎日継代し、続いて、スーパーＤＭＥＭ１.５ml／ウェルを用いて２４ −ウェルプレートから、次いで、スーパーＤＭＥＭ８ml／ウェルを用いて６−ウェルプレートへ、最終的にスーパーＤＭＥＭ５０mlを用いてＴ−７５フラスコへと広げることにより、生育させた。Ｔ−７５フラスコ（約１５×１０⁶細胞／フラスコ）由来の細胞を８００rpmで５分間遠心分離し、スーパーＤＭＥＭ中凍結用培地３ml、１０％ジメチルスルホキシドおよび更に１０％ウシ胎児血清に再懸濁した。１mlずつをピペットでバイアルに移し、−１００℃で貯蔵した。バイアルを３７℃水浴で暖めることにより細胞を解凍した。細胞懸濁液をスーパーＤＭＥＭ５mlを用いて８００rpmで５分間遠心分離した。上清をデカントし、細胞をスーパーＤＭＥＭ８mlに再懸濁し、細胞を増やすために６−ウェルプレートへピペットで移した。Ｃ．スクリーニングＥＬＩＳＡスクリーンは全て室温で行った。１．ＥＬＩＳＡ試薬ＰＢＳ、ｐＨ７.２：０.０１Ｍリン酸ナトリウム、０.１５ＭＮaＣl、および０.００２％アジ化ナトリウム。ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液：ＰＢＳ中０.５％トゥイーン２０。プレートコート：製造元指導書に従い水２mlで再構成し、ＰＢＳ中１：１００に希釈したウサギ抗マウスＩgＧ＋Ａ＋Ｍ(Ｈ＋Ｌ)。プレートブロック：ＰＢＳ中１％ＢＳＡ。希釈液：ＰＢＳ中０.５％ＢＳＡ；ＰＢＳ中プレートブロックを１：２に希釈したもの。実施例７のＥＬＩＳＡジチオール伸長化ＭＰＡ−Ｇ６ＰＤＨコンジュゲート：０.５％ＢＳＡ／ＰＢＳ中１：５００に希釈したもの。基質：０.０５３Ｍトリズマ・ベース（Sigma）、０.０２ＭＮＡＤ、０.０３３Ｍグルコース−６−ホスフェート、０.０２５％アジ化ナトリウム、０.６ｍＭｐ−ヨードニトロテトラジリウム・バイオレット（Sigma）、１μg／mlＢＳＡ、０.６単位／mlジアホラーゼ（Sigma #2381）、ＨＣlでｐＨ６.２に調整。２．逆ＥＬＩＳＡプロトコールこのプロトコールは、主たるクローニングプレートスクリーンのために使用した。プレートをウサギ抗−マウス５０μl／ウェルでコートし、インキュベートした。ウェルを空にしてから、３００μl／ウェルでブロックし、再度インキュベートして空にした。抗体（スペント培地、５０μl／ウェル）を加え、インキュベートし、次いで、洗浄した。実施例７由来のジチオール伸長化ＭＰＡ−Ｇ６ＰＤＨコンジュゲート（５０μl／ウェル）を加え、インキュベートしてから、洗浄した。基質（１００μl／ウェル）を加えてインキュベートした。約０.５以上のＯＤをＥＬＩＳＡ陽性と見なした。３．競合型逆ＥＬＩＳＡプロトコールこのアッセイは、抗体がＭＰＡ−酵素コンジュゲートの存在下、優先的に遊離のＭＰＡに結合する能力を測定するために用いた。抗体の一団をＭＰＡ−酵素コンジュゲート溶液中の遊離ＭＰＡ濃度の低減について試験した。アッセイプロトコールは、ジチオール伸長化ＭＰＡ−Ｇ６ＰＤＨコンジュゲート５０μl／ウェルを加える以外は逆ＥＬＩＳＡの場合と同じであった。変わりに、ジチオール伸長化ＭＰＡ−Ｇ６ＰＤＨコンジュゲート中で希釈したＭＰＡを、以下：１００μ g／ml、１μg／ml、１０ng／ml、１００pg／mlおよび１pg／mlのコンジュゲート溶液ml当たりＭＰＡμgの濃度で５０μl／ウェル加えた。その後、これを上記の通りインキュベートおよび洗浄した。競合パーセントは、下式：ここで、“Ｅ−Ｃ”は、ジチオール伸長化ＭＰＡ−Ｇ６ＰＤＨコンジュゲートである、のようにして計算した。４．前進（Forward）ＥＬＩＳＡ試薬プレートをＰＢＳ中１：１００に希釈した実施例７のジチオール伸長化ＭＰＡ −Ｇ６ＰＤＨコンジュゲートでコートした。ＰＢＳ中１：１００に希釈したヤギ抗−マウス（ＰＢＳ中１：５００に希釈したＩgＧ＋ＩgＭ−ＡＬＰ）およびサブクラス特異的ＡＬＰ標識化抗体を加えた。５．前進ＥＬＩＳＡプロトコールこのプロトコールは、様々な免疫感作、投与量、および免疫原の種類、およびアジュバントの相対的な影響を監視するマウスの血清抗体力価（“ＳＡＴ”）を測定するために用いた。サブクラスの抗体もこのプロトコールの変形を用いて測定した。プレートを実施例７のジチオール伸長化ＭＰＡ−Ｇ６ＰＤＨコンジュゲート（５０μl／ウェル）でコートし、インキュベートして、ウェルを空にした。プレートをブロック（３００μl／ウェル）し、インキュベートして、内容物を空にした。抗体添加工程 − 抗体（５０μl／ウェル）を加え、インキュベートしてから、プレートを洗浄した。ＳＡＴの場合：各血清試料を試験管中ＢＳＡ／ＰＢＳ希釈液で１：１００に希釈し、それから、３００μlを、２欄から１２欄の全てのウェル中にＢＳＡ／ＰＢＳ希釈液０.１５mlを含有する予めブロックしたマイクロタイタープレートの１欄の１つのウェルに移した。それから各血清試料をプレートの全域で１：２に連続希釈した。５０μl／ウェルを希釈プレートからアッセイプレートに移した。サブクラス測定の場合：各抗体の５０μl／ウェル（スペント培地）を１列あたり１抗体でプレート全域に加えた。ジチオール伸長化ＭＰＡ−Ｇ６ＰＤＨコンジュゲート（５０μl／ウェル）を加え、インキュベートしてから洗浄した。ＳＡＴの場合：ヤギ抗−マウス−ＡＬＰ（５０μl／ウェル）を加え、インキュベートしてから洗浄した。サブクラス測定の場合：サブクラス特異的ＡＬＰ−標識化抗体（５０μl／ウェル）を全ての欄に異なるサブクラス抗体を用いて加えた。基質（１００μl／ウェル）を加え、インキュベートしてから、４０５nmで読み取った。ＳＡＴの場合：希釈曲線において最大ＯＤから７０％減じたＯＤでの血清の希釈。サブクラス測定の場合：各抗体について、３つの陽性ウェル：対照ウェル（抗−マウス）、Ｈ鎖（ＩgＧサブクラス１本、ＩgＭまたはＩgＡ）、およびＬ鎖１本、があった。６．ＥＭＩＴスクリーニング実施例４および５の免疫原を用いる融合物由来の生成物を、逆ＥＬＩＳＡによりスクリーンした。全ての陽性ハイブリドーマをＥＭＩＴ試験が起こる前にクローン化させた。その後の融合物をまずＥＬＩＳＡによりスクリーンし、その後陽性ウェルをＥＭＩＴで再度スクリーンした。ＥＭＩＴアッセイを、試薬Ａ希釈液（基質）、Ｒ_max＝２５０ΔＡ／分での試薬Ｂ（酵素−コンジュゲート）、アッセイ緩衝液中のＭＰＡカリブレーター、アッセイ緩衝液中のＭＰＡ−Ｇ、およびＤＭＦ中のＭＰＡ−Ｍを用いて実施した。２つのプトロコールを用いたが、１つはインキュベーション時間が短く、もうひとつはインキュベーション時間が長いものであった。短および長プトロコール間の唯一の相異は、長プロトコールにおいて反応が示される前に遅延時間（基質＋抗体＋酵素−コンジュゲートのインキュベーション）が２５ないし１７５秒増大することであった。使用したアッセイ緩衝液、試薬Ａ、および試薬Ｂ希釈液は、典型的な液体ＥＭＩＴ２０００形式であった。第１スクリーンを３−試薬プログラムを用いて実施した。ＭＰＡスペント培地抗体を同じカップに入れた。試薬台には、Ａ位置に試薬Ａ希釈液、１位置に試薬Ｂ、および２位置にアッセイ緩衝液、ＭＰＡカリブレーター、ＭＰＡ−Ｇ、またはＭＰＡ−Ｍ溶液があった。少なくとも２回の試験を各抗体について実施した：まず、スペント培地抗体を酵素−コンジュゲートの阻害、Ｉ％、それから遊離ＭＰＡでの調節、またはＭＰＡ−ＧまたはＭＰＡ−Ｍに対する交差反応性について試験した。Ｄ．インビトロ抗体の産生実施例４または５の免疫原を用いて産生されたＥＬＩＳＡ陽性抗体およびその後の融合物に由来する、ＥＭＩＴにおいてウェルを阻害および調節した抗体の全てを培養拡張した。ハイブリドーマをＴ７５フラスコ１つ（スペント培地５０ml ）、Ｔ２２５フラスコ２つ（スペント培地５００ml）、および最終的にＴ２２５フラスコ４つ（スペント培地１Ｌ）に対して過増殖させた。細胞および異物を遠心分離および濾過により分離した。精製の前にアジ化ナトリウムを０.２％加えた。Ｅ．抗体の精製５００mlまたは１Ｌに拡張させた、より重要なスペント培地抗体をプロテインＧカラムクロマトグラフィーにより、室温で精製した。１．プロテインＧ精製用の試薬洗浄／結合緩衝液、ＰＢＳｐＨ７.０：０.０１Ｍリン酸ナトリウム、０.１５Ｍ塩化ナトリウム、およびアジ化ナトリウム０.００２％。溶離緩衝液：水酸化アンモニウムでｐＨ３.０に調整した０.５Ｍ酢酸。中和溶液：１Ｍトリス塩基。クリーニング緩衝液：１Ｍ酢酸（氷酢酸５７.２ml／１Ｌ）。２．プロテインＧ精製プロトコールカラムにプロテインＧ−セファロース１０mlを充填し、洗浄／結合緩衝液で洗浄した。抗体（スペント培地、０.５ないし１Ｌ）をカラムに載せた。カラムを、ＯＤがベースラインに戻るまで洗浄／結合緩衝液で洗浄した。抗体を溶離緩衝液で溶出した。５０滴（約２.５ml）画分を、予め中和溶液１.１５mlを入れた試験管に集めた。抗体ピークを集め、ＰＢＳ、ｐＨ７.４の４Ｌに対して一晩透析した。カラムをクリーニング緩衝液で洗浄し、洗浄／結合緩衝液で再平衡化してから、４℃で貯蔵した。抗体純度は、単一バンドの存在についてパラゴン電気泳動によりチェックした。抗体濃度は、まず抗体溶液の２８０nmでのＯＤを得、次いでＩgＧの吸光係数：Ａ₂₈₀(１mg／ml)＝１.３５、またはＩgＭ：Ａ₂₈₀(１mg／ ml)＝１.２の吸光係数を用いて濃度を計算することにより測定した。結果Ａ．血清抗体力価およびＥＬＩＳＡスクリーニング免疫応答を開始するために、まず、１グループのマウスを実施例５の免疫原で免疫感作させた。異なる投与量かつ異なるアジュバント中で免疫原を用いた：ＦＡ中１００μg、ＦＡ中２０μg、およびＡlum中２０μg。３回免疫感作後、マウス血清を、実施例７で製造したジチオール伸長化ＭＰＡ−Ｇ６ＰＤＨコンジュゲートを用いて抗体力価について試験した。ＦＡ中１００μgを受けたマウスの血清抗体力価は、他よりも僅かに高く、１：１００,０００ないし１：２００,０００であったが、Ａlum中２０μgを受けたマウスの血清抗体力価は、最低で１：５０ ,０００であった。後ほど、新しいグループのマウスを実施例４のジチオール伸長化ＭＰＡ−ブロモアセチル−ＫＬＨ免疫原で免疫感作させた。マウスはＡlum中免疫原２２μgを受けたもの、およびＦＡ中５０μgを受けたものがあった。３回免疫感作後、両方のグループの血清抗体力価は同等であり、１：８０００であった。実施例４の免疫原を受けたマウスのグループ由来の血清は、ＥＬＩＳＡにおいて２ないし２.５ＯＤ単位のより強いシグナル、およびより急勾配の滴定曲線を生じたが、実施例５の免疫原を受けたマウスのグループ由来の血清は、０.５ないし１.２ＯＤ単位の弱いシグナル、および平坦な滴定曲線を生じた。これらの相異は、恐らく使用した酵素−コンジュゲートに起因する。両方の試薬におけるＭＰＡ連結様式、第２免疫原、ＥＬＩＳＡにおいて使用した酵素−コンジュゲートは同一であった。実施例４の免疫原を用いて産生した抗体と実施例７の酵素− コンジュゲートとの結合は、実施例５の不適合カルボキシル結合ＫＬＨ免疫原に対して生成した抗体の場合よりも強い。実施例４または５の免疫原を用いる融合生成物を、アッセイ展開作業を開始する前に調製した。融合物は、逆ＥＬＩＳＡスクリーンのみでスクリーンした。ＥＬＩＳＡ陽性ハイブリドーマ全てをクローン化および安定化した。これらは、後にアッセイ展開のために使用した。実施例４または５の免疫原を用いて産生されたハイブリドーマが一旦安定化したら、スペント培地抗体を競合型逆ＥＬＩＳＡにおいて試験して、これらの抗体の相対的親和性を測定した。このアッセイでは、固定化抗体を様々な量の遊離ＭＰＡと共に、最適レベルの酵素−コンジュゲートの存在下でインキュベートした。遊離ＭＰＡへの抗体の優先結合対酵素−コンジュゲートへの抗体の優先結合を、遊離ＭＰＡのレベル毎に、競合％として計算する。遊離ＭＰＡがより低濃度でも遊離ＭＰＡに結合する（即ち、酵素−コンジュゲートと競合する）抗体は、遊離薬剤がより高レベルである場合のみ競合する抗体よりも高親和性であるとみなされる。表１Ａおよび１Ｂは、抗体の競合型ＥＬＩＳＡデータをまとめたものである。Ｂ．初期ＥＭＩＴスクリーニング抗体を、まず短インキュベーション時間プロトコールでCOBAS MIRAに対しても試験した。ＥＭＩＴに対しては最適化されていないＥＬＩＳＡ酵素−コンジュゲートを用いて、スクリーニング培地抗体９５μlを３２５μl試験に加えた。ある抗体は、酵素−コンジュゲートを１１％阻害した。これらの抗体を長インキュベーション時間プロトコールで再試験すると、４抗体が酵素−コンジュゲートを僅かに１０ないし１４％阻害した。遊離薬剤を用いて試験した場合、４抗体の内の２つがＭＰＡ１００μg／mlでのシグナルのほとんどを変調した。この点を考慮して、全てのＥＭＩＴ試験は、長プロトコールを利用した。Ｃ．アッセイ成否評価３２の上記スペント培地抗体を市販の模擬ＥＭＩＴアッセイで試験した。５抗体を標準曲線サイズおよび良好な交差反応性プロフィールについて選択した。ある抗体のＣＶは、実行精度内について試験した場合、特に高かった。実施例５のカルボキシル連結免疫原に対して作られた抗体３Ｄ８が好ましい抗体として選択された。これは、ＭＰＡ−Ｍと交差反応した（ＤＭＦマトリックスの場合１８％vs.血漿マトリックスの場合１４４％）が、大きい標準曲線、１１２単位を産し、優れたＣＶ、１.９ないし５.８％を有した。実施例１０ＭＰＡ抗体のビオチニル化精製した抗体を２００ｍＭ重炭酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８.８に対して４℃で一晩、緩衝液を３回変えて、透析した。ビオチン−ＮＨＳエステルの１０mg／ml溶液を乾燥ＤＭＦ中で製造した。ビオチン−ＮＨＳを抗体の一部に加えて、ビオチン−ＮＨＳ／抗体モル比、２から８０を得た。混合物を渦状に２分間撹拌し、次いで、室温で１時間静置させた。非結合ビオチンＮＨＳを、セファデックスＧ２５−８０カラムで、液相として２００ｍＭ重炭酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８.８を用いて標識化抗体から分離した。これらのビオチニル化抗体は、アビジンを支持体に結合させた場合の不均一系イムノアッセイにおいて有用である。本発明は、その特定の実施態様を参照して記載してきたが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変化を為すことができ、かつ均等物で置換できることが、当業者には理解されるであろうし、また明らかであろう。加えて、本発明の目的、精神、および範囲に対する特定の状況、材料、材料組成、方法、処理工程または各工程に適合させて、多くの修飾を為すことができる。このような修飾は全て、添付の請求の範囲内にあることが意図されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/08 9282−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ｃ

Claims

【特許請求の範囲】１．ミコフェノール酸を含有する疑いのある試料中のミコフェノール酸の測定法であって、（ａ）該試料を、ミコフェノール酸とミコフェノール酸エステルとを識別する能力のある抗体、好ましくはモノクローナル抗体と接触させ；そして、（ｂ）該抗体のミコフェノール酸への結合を検出する、各段階を含んでなる、方法。２．該エステルがＥ−６−(１,３−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−６−メトキシ −７−メチル−３−オキソ−５−イソベンゾフラニル)−４−メチル−４−ヘキセン酸モルホリノエチルである、請求の範囲第１項記載の方法。３．段階（ａ）が、更に、該試料をミコフェノール酸の標識化類似体と接触させることを含んでなる、請求の範囲第１項記載の方法。４．該抗体が、支持体に結合しているか、または支持体に結合させられている能力がある、請求の範囲第１項記載の方法。５．ミコフェノール酸を含有する疑いのある試料中のミコフェノール酸の測定法であって、（ａ）該試料を、ミコフェノール酸とミコフェノール酸の代謝物とを識別する能力のある抗体、好ましくはモノクローナル抗体と接触させ；そして、（ｂ）該抗体のミコフェノール酸への結合を検出する、各段階を含んでなる、方法。６．該代謝物がミコフェノール酸グルクロニドである、請求の範囲第５項記載の方法。７．段階（ａ）が、更に、該試料をミコフェノール酸の標識化類似体と接触させることを含んでなる、請求の範囲第５項記載の方法。８．該抗体が、支持体に結合しているか、または支持体に結合させられている能力がある、請求の範囲第５項記載の方法。９．ミコフェノール酸を含有する疑いのある試料中のミコフェノール酸の測定法であって、（ａ）該試料を、ミコフェノール酸に結合している抗体と接触させ；そして、（ｂ）該抗体のミコフェノール酸への結合を検出する、各段階を含んでなり、該抗体が、および式中：Ｘは免疫原性キャリアーであり、Ｌは結合または連結基であり、ＲはＨ、低級アルキル、およびＣＯ−低級アルキルからなる群から選択され、ｎは１から、Ｘの分子量を５０００で割った値までの数である、からなる群から選択される免疫原に対して生じるものである、方法。 10．段階（ａ）が更に、該試料を、および式中：Ｘ'は検出可能な標識であり、Ｌは結合または連結基であり、ＲはＨ、低級アルキル、およびＣＯ−低級アルキルからなる群から選択され、ｎは１から、Ｘ'の分子量を５０００で割った値までの数である、からなる群から選択される化合物と接触させることを含んでなる、請求の範囲第９項記載の方法。 11．該抗体が、支持体に結合しているか、または支持体に結合させられている能力がある、請求の範囲第９項記載の方法。 12．ミコフェノール酸を含有する疑いのある試料中のミコフェノール酸の量を測定する方法であって、（ａ）水性媒質中で：（ｉ）該試料、（ii）検出可能な標識にコンジュゲートしたミコフェノール酸、および、（iii）ミコフェノール酸とミコフェノール酸エステルおよびＭＰＡ代謝物からなる群から選択される化合物とを識別する能力のある抗体、を合わせ、そして、（ｂ）該標識の活性に対する該試料の影響を測定する、各段階を含んでなる方法。 13．該化合物が、Ｅ−６−(１,３−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−６−メトキシ −７−メチル−３−オキソ−５−イソベンゾフラニル)−４−メチル−４−ヘキセン酸モルホリノエチルおよびミコフェノール酸グルクロニドからなる群から選択される、請求の範囲第１２項記載の方法。 14．該検出可能な標識が酵素であり、該測定が該酵素の活性を測定することを含む、請求の範囲第１２項記載の方法。 15．該合わせる段階において、更に該酵素の基質を合わせることを含んでなる、請求の範囲第１４項記載の方法。 16．該酵素がグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびアルカリホスファターゼからなる群から選択される、請求の範囲第１４項記載の方法。 17．該抗体が、支持体に結合しているか、または支持体に結合させられている能力がある、請求の範囲第１２項記載の方法。 18．ミコフェノール酸を含有する疑いのある試料中の該分析物の均一系イムノアッセイ法であって、（ａ）液体媒質中で、（ｉ）該試料、（ii）ミコフェノール酸類似体と酵素とのコンジュゲート、（iii）ミコフェノール酸とミコフェノール酸エステルとを識別する能力のある抗体、および（iv）該酵素の基質、を合わせ、（ｂ）該媒質中の該酵素の酵素活性を測定し、さらに、（ｃ）該活性を既知量の該分析物を含有する試料の場合に観察された酵素活性と比較する、ことを含んでなる、方法。 19．該ミコフェノール酸エステルがＥ−６−(１,３−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−６−メトキシ−７−メチル−３−オキソ−５−イソベンゾフラニル)−４− メチル−４−ヘキセン酸モルホリノエチルである、請求の範囲第１８項記載の方法。 20．該酵素がグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼである、請求の範囲第１８項記載の方法。 21．該抗体が、支持体に結合しているか、または支持体に結合させられている能力がある、請求の範囲第１８項記載の方法。 22．１またはそれ以上の水素原子の置き換えによりタンパク質に結合したミコフェノール酸を含んでなる化合物。 23．該水素原子がカルボキシレート基の水素原子である、請求の範囲第２２項記載の化合物。 24．該タンパク質がグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびアルカリホスファターゼからなる群から選択される酵素である、請求の範囲第２２項記載の化合物。 25．該タンパク質が免疫原性キャリアーである、請求の範囲第２２項記載の化合物。 26．式：式中：Ｘはポリペプチドであり、Ｌは結合または連結基であり、ＲはＨ、低級アルキル、またはＣＯ−低級アルキルであり、さらに、ｎは１から、Ｘの分子量を５０００で割った値までの数である、で示される化合物。 27．式：式中：Ｘはポリペプチドであり、Ｌは結合または連結基であり、ＲはＨ、低級アルキル、またはＣＯ−低級アルキルであり、さらに、ｎは１から、Ｘの分子量を５０００で割った値までの数である、で示される化合物。 28．式：式中：Ｘはポリペプチドであり、Ｌは結合または連結基であり、ＲはＨ、低級アルキル、またはＣＯ−低級アルキルであり、さらに、ｎは１から、Ｘの分子量を５０００で割った値までの数である、で示される化合物。 29．１ないしそれ以上の水素原子の置き換えにより免疫原性キャリアーに結合したミコフェノール酸からなる化合物に応答して生じた抗体であって、ミコフェノール酸と、ミコフェノール酸エステルおよびミコフェノール酸代謝物からなる群から選択される化合物とを識別する能力のある、抗体。 30．該エステルがＥ−６−(１,３−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−６−メトキシ −７−メチル−３−オキソ−５−イソベンゾフラニル)−４−メチル−４−ヘキセン酸モルホリノエチルである、請求の範囲第２９項記載の抗体。 31．該代謝物がミコフェノール酸グルクロニドである、請求の範囲第２９項記載の抗体。 32．ミコフェノール酸を結合し、かつミコフェノール酸と、Ｅ−６−(１,３− ジヒドロ−４−ヒドロキシ−６−メトキシ−７−メチル−３−オキソ−５−イソベンゾフラニル)−４−メチル−４−ヘキセン酸モルホリノエチルおよびミコフェノール酸グルクロニドからなる群から選択される少なくとも１つの化合物とを識別する能力がある、モノクローナル抗体。 33．下記からなる群：および式中：Ｘは免疫原性キャリアーであり、Ｌは結合または連結基であり、ＲはＨ、低級アルキル、またはＣＯ−低級アルキルからなる群から選択され、さらに、ｎは１から、Ｘの分子量を５０００で割った値までの数である、から選択される免疫原に対して生じる抗体。 34．検出可能な標識と、１またはそれ以上の水素原子の置き換えにより免疫原性キャリアーに結合したミコフェノール酸を含む化合物に応答して生じる抗体とのコンジュゲートを含んでなる化合物であって、該抗体がミコフェノール酸と、ミコフェノール酸エステルおよびミコフェノール酸代謝物からなる群から選択される化合物とを識別する能力のあるものである、化合物。 35．ミコフェノール酸測定のためのアッセイを実施するためのキットであって、パッケージした組合わせ物中に、（ａ）ミコフェノール酸とミコフェノール酸エステルとを識別する能力のある抗体、と（ｂ）検出可能な標識に結合したミコフェノール酸を含む化合物、とを含んでなる、キット。 36．該エステルが、Ｅ−６−(１,３−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−６−メトキシ−７−メチル−３−オキソ−５−イソベンゾフラニル)−４−メチル−４−ヘキセン酸モルホリノエチルである、請求の範囲第３５項記載のキット。 37．ミコフェノール酸測定のためのアッセイを実施するためのキットであって、パッケージした組合わせ物中に、（ａ）ミコフェノール酸とミコフェノール酸代謝物とを識別する能力のある抗体、と（ｂ）検出可能な標識に結合したミコフェノール酸を含む化合物、とを含んでなる、キット。 38．該代謝物がミコフェノール酸グルクロニドである、請求の範囲第３７項記載のキット。 39．ミコフェノール酸測定のためのアッセイを実施するためのキットであって、パッケージした組合わせ物中に、（ａ）下記の群：および式中：Ｘは免疫原性キャリアーであり、Ｌは結合または連結基であり、ＲはＨ、低級アルキル、またはＣＯ−低級アルキルからなる群から選択され、さらに、ｎは１から、Ｘの分子量を５０００で割った値までの数である、から選択される免疫原に対して生じる抗体、（ｂ）下記の群：および式中：Ｘは検出可能な標識であり、Ｌは結合または連結基であり、ＲはＨ、低級アルキル、またはＣＯ−低級アルキルからなる群から選択され、さらに、ｎは１から、Ｘ'の分子量を５０００で割った値までの数である、から選択される化合物、を含んでなる、キット。