JP2003506336A - タクロリムスに対するモノクローナル抗体およびタクロリムスのためのイムノアッセイ - Google Patents

タクロリムスに対するモノクローナル抗体およびタクロリムスのためのイムノアッセイ

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Abstract

(57)【要約】 免疫抑制薬タクロリムスに対するＩｇＧ1λモノクローナル抗体は改良された性質を有する。とくに、１Ｈ６と命名されるこのモノクローナル抗体は数種のタクロリムス代謝物に対する交叉反応性が低下している。この抗体はサンプルたとえば血清中のタクロリムスの存在またはその濃度を検出または定量するイムノアッセイに適している。本発明はさらに、その分子の非結合部分において誘導体化されたタクロリムスに誘導体を包含する。これは、抗体産生動物の免疫処置およびこのようなモノクローナル抗体の製造に有用であり、さらにこのようなアッセイにおけるタクロリムス類縁体として有用である。本発明はさらに、タクロリムスの検出のためのイムノアッセイ法およびこのようなイムノアッセイの実施に有用な試験キットを包含する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明はタクロリムスに対するモノクローナル抗体、そのようなモノクローナ
ル抗体の製造方法、およびこのようなモノクローナル抗体の製造に有用なタクロ
リムスの誘導体を目的とするものである。
【０００２】
【背景技術】
タクロリムスは Streptomyces tsukubaensis から単離されたマクロライドで
ある。タクロリムスは、化学名［３Ｓ−［３Ｒ*［Ｅ[(１Ｓ*,３Ｓ*,４Ｓ*)],４
Ｓ*,５Ｒ*,８Ｓ*,９Ｅ,１２Ｒ*,１４Ｒ*,１５Ｓ*,１６Ｒ*,１８Ｓ*,１９Ｓ*,２
６ａＲ*]]−５,６,８,１１,１２,１３,１４,１５,１６,１７,１８,１９,２４,２
５,２６,２６ａ−ヘキサデカヒドロ−５,１９−ジヒドロキシ−３−［２−（４
−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル）−１−メチルエテニル］−１４,
１６−ジメトキシ−４,１０,１２,１８−テトラメチル−８−（２−プロペニル
）−１５,１９−エポキシ−３Ｈ−ピリド［２,１−ｃ］[１,４］−オキサアザシ
クロトリコシン−１,７,２０,２１（４Ｈ,２３Ｈ）テトロンを有する。タクロリ
ムスの構造およびナンバリングは以下に図１６に示す。
【０００３】 タクロリムスはＦＲ−９ＯＯ５０６またはＦＫ−５０６としても知られている
。タクロリムスは免疫抑制活性および抗微生物活性を有する。 タクロリムスの免疫抑制活性はとくに重要であり、この薬物の広範囲の重要な
用途を招いてきた。免疫抑制は臨床的に多くの関連で使用されているが、とくに
重要なのは臓器移植における拒絶反応の防止である。免疫抑制薬物はまた、新生
児のＲｈ溶血性疾患の予防および自己免疫障害の処置に投与される。タクロリム
スはＦＫＢＰ（ＦＫ５０６結合タンパク質）として知られた細胞質ゾルタンパク
質に結合することによりＴ−細胞を活性化する。薬物結合タンパク質複合体はカ
ルシノイリンと安定に会合する。これはこのＣａ2+−依存性酵素のセリン−スレ
オニンホスファターゼ活性を阻害する。これは、カルシノイリン依存性のリンフ
ォカインの発現、アポトーシスおよび脱顆粒の活性化を阻害する（G. Wiederrec
htら,“The Mechanism of Action of FK-506 and Cyclosporin A," Ann. N.Y. A
cad. Sci. 696: 9-19, 1993)。
【０００４】 タクロリムスは短時間もしくは連続的な輸液により静脈内にまたは経口的に投
与することができる。薬物の臨床的使用に伴う主要な毒性は腎毒性である。さら
に神経毒性が、頭痛、振戦、不眠、疼痛または他の症状を伴って発症することが
ある。さらに胃腸毒性は下痢または吐気として、また心脈管系毒性は高血圧とし
て発現する。
【０００５】 さらに代謝毒性は、たとえば高カリウム血症、低マグネシウム血症または高血
糖のような症状の発症として現れることがある。加えて、タクロリムスによる長
期間の免疫抑制はすべてのタイプの感染の危険を増大させ、通常の細菌、ウイル
スおよびカビ病原体のみでなく、様々な通常はみられない日和見感染も同様に生
じることがある。
【０００６】 更には、タクロリムスの投与に伴い、リンパ腫および関連悪性腫瘍の危険が増
大する（M.L. Cleary & J. Sklar,“Lymphoproliferative Disorders in Cardia
c Transport Recipients are Multiclonal Lymphomas," Lancet 2: 49-493, 198
4;L.S. Swinnennら,“Increased Incidence of Lymphoproliferative Disorders
After Immunosuppression with a Monoclonal Antibody OKT3 in Cardiac-Tran
splant Recipients," N. Eng. J. Med. 323: 1723-1728, 1990）。これらの悪性
腫瘍の少なくとも一部はエプスタイン−バールウイルスに対する障害された免疫
応答に類似する（B.Z. Katzら,“Latent and Replicating Forms of Epstein-Ba
rr virus DNA and Lymphomas in Lymphoproliferative Disorders," J. Infect.
Dis. 160: 589-598, 1989）。
【０００７】 タクロリムスの効力および毒性スペクトルを明らかにするには、臓器移植を受
けた患者に投与後のこれらの化合物の血中濃度をモニターするための高感度な、
再現性および信頼性のある方法が要求される。このような方法は低濃度のタクロ
リムスを検出できる十分な感度を有することが重要である。またこのような方法
は信頼性および再現性を有し、タクロリムスの代謝物のような化合物からの干渉
を回避できることも重要である。
【０００８】 タクロリムスに対する抗体およびイムノアッセイはについては、たとえば米国
特許５,５３２,１３７（Niwaら、この引用により本明細書に導入される）に記載
されているがなお、タクロリムスに特異的な改良された抗体およびイムノアッセ
イの開発の必要性がある。とくにタクロリムスの高感度な、信頼性および再現性
のあるイムノアッセイの開発に使用することができる、タクロリムスに対する改
良されたモノクローナル抗体の必要性がある。
【０００９】 タクロリムスの信頼性あるイムノアッセイの開発は、タクロリムスで処置され
た個体の血中にはタクロリムスの多数の代謝物が見出されるという事実によって
複雑である。タクロリムスのこれらの代謝物への変換には、デメチル化、ヒドロ
キシル化、および環形成が包含される。タクロリムスに対する抗体は可能な限り
これらの誘導体と交叉反応しないことが重要である。
【００１０】 したがって、タクロリムスのイムノアッセイに有用で、タクロリムス代謝物に
対する最小限の交叉反応性しか示さない、タクロリムスに対する改良されたモノ
クローナル抗体を開発する必要性がある。また、タクロリムスを投与された患者
の血中タクロリムスの検出および定量にこのようなモノクローナル抗体を用いる
改良されたイムノアッセイの必要性がある。
【００１１】
【発明の開示】
本発明者らは、タクロリムスを、その非結合ドメインにおいて誘導体化すると
、高分子量担体たとえば免疫処置のためのタンパク質とカップリングして抗体を
産生できることを発見した。得られた抗体産生細胞は細胞融合によってモノクロ
ーナル抗体の発生に使用できる。それらのモノクローナル抗体はタクロリムス代
謝物との低い交叉反応性を含む望ましい性質を有する。
【００１２】 本発明の一実施態様は、１Ｈ６と命名されるタクロリムスに対するモノクロー
ナル抗体であり、１５−デメチルタクロリムス；３１−デメチルタクロリムス；
１３,３１−ジデメチルタクロリムス；１５,３１−ジデメチルタクロリムスおよ
び１２−ヒドロキシタクロリムスのそれぞれと約８％未満の交叉反応性を有する
。
【００１３】 本発明の他の実施態様は、 (１) １Ｈ６と命名されるＩｇＧ1λモノクローナル抗体と競合アッセイにより
モルベースで測定した場合に、少なくとも約８０％の有効性で１Ｈ６と命名され
るＩｇＧ1λモノクローナル抗体と競合し、 (２) １５−デメチルタクロリムス；３１−デメチルタクロリムス；１３,３１
−ジデメチルタクロリムス；１５,３１−デメチルタクロリムスおよび１２−ヒ
ドロキシタクロリムスそれぞれと約１０％未満の交叉反応性を有するタクロリム
スに対するモノクローナル抗体である。好ましくはタクロリムスに対するモノク
ローナル抗体は、１Ｈ６と命名されるモノクローナル抗体と少なくとも約９０％
の有効性で競合し、１５−デメチルタクロリムス；３１−デメチルタクロリムス
；１３,３１−ジデメチルタクロリムス；１５,３１−ジデメチルタクロリムスお
よび１２−ヒドロキシタクロリムスのそれぞれと約８％未満の交叉反応性を有す
る。 本発明の他の実施態様は抗体は、上述の１Ｈ６と命名されるタクロリムスに対
するＩｇＧ1λモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマである。
【００１４】 本発明の他の実施態様は、 (１) 競合アッセイで測定して、１Ｈ６と命名されるＩｇＧ1λモノクローナル
抗体と比較しモルベースで少なくとも約８０％の有効性で１Ｈ６と命名されるＩ
ｇＧ1λモノクローナル抗体と競合し、 (２) １５−デメチルタクロリムス；３１−デメチルタクロリムス；１３,３１
−ジデメチルタクロリムス；１５,３１−デメチルタクロリムスおよび１２−ヒ
ドロキシタクロリムスそれぞれと約１０％未満の交叉反応性を有する、モノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマである。
【００１５】 本発明のさらに他の実施態様は、 (１) 競合アッセイにより測定して１Ｈ６と命名されるＩｇＧ1λモノクロー
ナル抗体と比較した場合、モルベースで少なくとも約８０％の有効性で１Ｈ６と
命名されるＩｇＧ1λモノクローナル抗体と競合し、 (２) １５−デメチルタクロリムス；３１−デメチルタクロリムス；１３,３
１−ジデメチルタクロリムス；１５,３１−デメチルタクロリムスおよび１２−
ヒドロキシタクロリムスそれぞれと約１０％未満の交叉反応性を有するタクロリ
ムスに対するモノクローナル抗体である。
【００１６】 本発明の他の実施態様は、 (１) 競合アッセイにより測定して１Ｈ６と命名されるＩｇＧ1λモノクロー
ナル抗体と比較した場合、モルベースで少なくとも約８０％の有効性で１Ｈ６と
命名されるＩｇＧ1λモノクローナル抗体と競合し、 (２) １５−デメチルタクロリムス；３１−デメチルタクロリムス；１３,３
１−ジデメチルタクロリムス；１５,３１−デメチルタクロリムスおよび１２−
ヒドロキシタクロリムスそれぞれと約１０％未満の交叉反応性を有し、この場合
、抗体の少なくとも一部の定常領域は、モノクローナル抗体が人化するようにヒ
ト定常領域で置換されているモノクローナル抗体である。
【００１７】 本発明のさらに他の実施態様は、一本鎖組換え抗体(ｓＦｖ）であり、それは (１) 競合アッセイにより測定して１Ｈ６と命名されるＩｇＧ1λモノクロー
ナル抗体と比較した場合、モルベースで少なくとも約８０％の有効性で１Ｈ６と
命名されるＩｇＧ1λモノクローナル抗体と競合し、 (２) １５−デメチルタクロリムス；３１−デメチルタクロリムス；１３,３
１−ジデメチルタクロリムス；１５,３１−デメチルタクロリムスおよび１２−
ヒドロキシタクロリムスそれぞれと約１０％未満の交叉反応性を有する、タクロ
リムスに対する抗体の可変領域を包含する。
【００１８】 本発明のさらに他の実施態様は、高分子量タンパク質に接合したタクロリムス
の非結合ドメインにおける炭素原子でカルボキシメチルオキシム残基により誘導
体化されたタクロリムスで免疫処置された抗体産生哺乳動物からの抗体産生細胞
の、適当な融合パートナーとの融合により製造されるタクロリムスに対するモノ
クローナル抗体である。好ましくは、タクロリムスの非結合ドメインにおける炭
素原子は炭素２２である。好ましくは、高分子量タンパク質はキーホールリンペ
ットヘモシアニンである。
【００１９】 本発明のさらに他の実施態様は、タクロリムスに対して約３.７×１０9Ｌ／mo
leの結合親和性を有し、１３−デメチルタクロリムスと交叉反応し、以下のタク
ロリムス代謝物：１５−デメチルタクロリムス；３１−デメチルタクロリムス；
１３,３１−ジデメチルタクロリムス；１５,３１−ジデメチルタクロリムスおよ
び１２−ヒドロキシタクロリムスのすべてと約８％未満の交叉反応性を有するＩ
ｇＧ1λモノクローナル抗体である、タクロリムスに対するモノクローナル抗体
である。
【００２０】 本発明の他の態様は、高分子量タンパク質に接合したタクロリムスの非結合ド
メインにおける炭素原子でカルボキシメチルオキシム残基により誘導体化された
タクロリムスで免疫処置された抗体産生哺乳動物により産生されるポリクローナ
ル抗体を包含する抗体である。好ましくは、タクロリムスの非結合ドメインにお
ける炭素原子は炭素２２である。好ましくは、高分子量タンパク質はキーホール
リンペットヘモシアニンである。
【００２１】 本発明のさらに他の態様は、タクロリムスを検出または定量する方法において (１) タクロリムスの含有が疑われるサンプルを準備し、 (２) そのサンプルを、 (ａ) 本発明の抗体および (ｂ) 場合によってタクロリムス類縁体（抗体またはタクロリムス類縁体の
１つは検出可能なシグナルを産生する標識によって標識されている）と反応させ
、 (３) サンプル中におけるタクロリムスの存在またはタクロリムスの濃度を検
出または定量するために、 （ａ）抗体に結合したタクロリムスと会合しているシグナル； （ｂ）抗体に結合していないタクロリムスと会合しているシグナル；または （ｃ）存在する総シグナル のいずれかを観察または測定する各工程からなる方法である。
【００２２】 この方法では通常、サンプルを酵素標識で標識されたタクロリムス類縁体と反
応させ、サンプル中におけるタクロリムスの存在またはタクロリムスの濃度を検
出または定量するために存在する総シグナルが観察または測定される。
【００２３】 本発明のさらに他の態様は、 (１) 本発明の抗体および (２) 酵素標識で直接または間接的に標識されたタクロリムス類縁体を、別個
の容器にパッケージングしてなる試験キットである。
【００２４】 本発明のさらに他の態様は、タクロリムスの非結合ドメインにおける炭素原子
でカルボキシメチルオキシム残基によって誘導体化されたタクロリムスからなる
タクロリムスの誘導体である。タクロリムスの非結合ドメインにおける炭素原子
は炭素２２であることが好ましい。
【００２５】 本発明のさらに他の態様は、高分子量タンパク質に上述のように接合したタク
ロリムスの誘導体からなる接合体である。好ましくは高分子量タンパク質はキー
ホールリンペットヘモシアニンである。
【００２６】 本発明のさらに他の態様は、タクロリムスをカルボキシメトキシルアミンと反
応させ、カルボキシメチルオキシム残基が炭素原子２２に存在するタクロリムス
のカルボキシメチルオキシム誘導体を生成させることからなるタクロリムスを誘
導体化する方法である。
【００２７】 本発明のさらに他の態様は、高分子量タンパク質とタクロリムスの接合体を製
造する方法において、 (１) タクロリムスをカルボキシメトキシルアミンと反応させ、カルボキシメ
チルオキシム残基が炭素原子２２に存在するタクロリムスのカルボキシメチルオ
キシム誘導体を生成させ、 (２) カルボキシメチルオキシムを活性化して反応性Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステルを生成させ、 (３) Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを高分子量タンパク質と反応さ
せて接合体を産生させる方法である。
【００２８】 本発明のさらに他の態様は、炭素原子２２においてカルボキシメチルオキシム
残基で置換されたタクロリムスがリンカーを介してビオチン残基に連結してなる
タクロリムスの誘導体である。本発明のこの態様の好ましい実施態様においては
、リンカーは構造：ＮＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ2)5−ＮＨ2であり
、リンカーの１つのアミノ基はカルボキシメチルオキシムのカルボキシル基とア
ミド結合を形成し、リンカーの他のアミノ基はビオチンのカルボキシル基とアミ
ド基を形成する。
【００２９】 本発明のさらに他の態様はタクロリムスを誘導体化する方法において、 (１) タクロリムスをカルボキシメトキシルアミンと反応させ、カルボキシメ
チルオキシム誘導体は炭素原子２２に存在するタクロリムスのカルボキシメチル
オキシム誘導体を生成させ、 (２) カルボキシメチルオキシムを活性化して反応性Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステルを生成させ、 (３) Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをビオチンもしくはビオチン誘
導体またはビオチン類縁体のカルボキシル基と反応させる方法である。
【００３０】 本発明のさらに他の態様は、タクロリムスの非結合ドメインにおける炭素原子
でブロモアセチル残基で誘導体化されたタクロリムスからなるタクロリムスの誘
導体である。好ましくは、非結合ドメインにおける炭素原子は炭素原子２２であ
る。これらの誘導体はついで酵素または他のタンパク質と反応させてタンパク質
たとえば酵素に接合した誘導体を含有する接合体を産生させることができる。好
ましい一実施態様おいては、タンパク質はグルコース−６−ホスフェートデヒド
ロゲナーゼのシステイン含有ムテインである。
【００３１】 したがって、本発明の他の態様は、タクロリムスを誘導体化する方法において
、 (１) タクロリムスをカルボキシメトキシルアミンと反応させ、カルボキシメ
チルオキシム誘導体は炭素原子２２に存在するタクロリムスのカルボキシメチル
オキシム誘導体を生成させ、 (２) カルボキシメチルオキシムを活性化して反応性Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステルを生成させ、 (３) Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをブロモアセチルエチレンジア
ミンのトリフルオロ酢酸塩と反応させ、タクロリムスのブロモアセチル誘導体を
産生させる方法である。
【００３２】 図面の説明 本発明の以上のおよび他の特徴、態様および利点は、以下の記述、上記特許請
求の範囲および添付の図面を参考にすればよりよく理解されるものと確信する。 図１はタクロリムスに構造の酷似したマクロライド抗生物質ＦＫ−５２０とカ
ルボキシメトキシルアミンの反応から生成した生成物のマススペクトル図である
。 図２は図１のマススペクトル図の部分であり、拡大した分解能で最も高いピー
クの周辺を中心に示している。 図３はタクロリムスとカルボキシメトキシルアミンの反応から生成した生成物
のマススペクトル図である。 図４は図３のマススペクトル図の部分であり、拡大した分解能で最も高いピー
クの周辺を中心に示している。 図５はタクロリムスとカルボキシメトキシルアミンの反応から生成した生成物
のＣＤＣｌ3中２５０ＭＨｚにおける1Ｈ ＮＭＲスペクトルである。 図６はタクロリムスとカルボキシメトキシルアミンの反応から生成した生成物
のＣＤＣｌ3中２５０ＭＨｚにおける13Ｃ ＮＭＲスペクトルである。 図７は参考として提示するタクロリムスのＣＤＣｌ3中２５０ＭＨｚにおける1 3 ＣＮＭＲスペクトルである。 図８はタクロリムスモノオキシムとＬＣ−ビオチンの反応から生成した生成物
のマススペクトル図である。 図９は図８のマススペクトル図の部分であり、拡大した分解能で最も高いピ
ークの周辺を中心に示している。 図１０はタクロリムスモノオキシムとＬＣ−ビオチンの反応から生成した生成
物のＣＤＣｌ3中２５０ＭＨｚにおける1Ｈ ＮＭＲスペクトルである。 図１１は、位置２２においてカルボキシメチルオキシムにより誘導体化された
タクロリムスをキーホールリンペットヘモシアニンに連結した接合体でマウスを
免疫処置することにより産生させたモノクローナル抗体と、得られた抗体産生細
胞と融合パートナーとの細胞融合を用いるタクロリムスの均一系酵素イムノアッ
セイの検量曲線である。 図１２は、図１１に検量曲線を示したモノクローナル抗体との均一系酵素イム
ノアッセイを用いたタクロリムスのアッセイの結果と、ガスクロマトグラフィー
および縦列マススペクトロスコピーを使用する方法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用い
たタクロリムスのアッセイの結果との間の相関を示すグラフである。 図１３は、タクロリムスを投与された肝障害を有する７０例の患者のパネルに
ついて均一系酵素イムノアッセイおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いたタクロリムス
のアッセイの結果の間の相関を示すグラフである。 図１４は、図１３の７０例の患者のパネルについて均一系酵素イムノアッセイ
および市販品を入手できるイムノアッセイを用いたタクロリムスのアッセイの結
果の間の相関を示すグラフである。 図１５は、図１３および図１４についての Bland-Altman 差分析プロットを示
すグラフである。 図１６は、タクロリムスの構造式の図であり、分子のナンバリングを示す。
【００３３】 本明細書で用いられる以下に定義する語は、とくに他の指示がない限り以下の
意味を有する。定義 「抗体」：本明細書で用いられる「抗体」の語は、適当な特異性の無傷の抗体
分子および抗体フラグメント（Ｆａｂ，Ｆ(ａｂ′)，ＦｖおよびＦ(ａｂ′)2を
含む）の両者、ならびに化学的に修飾された無傷の抗体および抗体フラグメント
たとえばサブユニットのインビトロ会合によってアセンブルされたハイブリド抗
体を包含する。また、ｓＦｖの語で呼ばれ、元は非ヒト定常領域の一部またはす
べてが元はヒト抗体配列から誘導された定常領域で置換された人化抗体の単一鎖
抗体分子も包含される。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両者が他に
特定されない限り包含され、多くの関連でモノクローナル抗体がとくに特定され
る。さらに修飾抗体または抗体の結合能力を遮断もしくは変更させない標識もし
くは他の分子に接合した抗体が包含される。
【００３４】 「核酸配列」：「核酸配列」の語にはとくに他の特定がない限りＤＮＡおよび
ＲＮＡの両者を包含し、とくに他の特定がない限り二本鎖および一本鎖核酸の両
者が包含される。また、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリドのようなハイブリドも包含さ
れる。とくに、ＤＮＡに関する論及には、ＤＮＡにおけるチミンに代えてＲＮＡ
におけるウラシルの置換を除いて均等な塩基配列またはチミンに代えてウラシル
の置換を除いて相補性塩基配列のいずれかを有するＲＮＡを包含する。相補性は
ワトソン−クリック塩基対の法則に従って決定される。さらに、核酸配列の言及
には、とくに他の特定がない限り、ワトソン−クリック塩基対の法則に従うその
相補体が包含される。
【００３５】 本発明者らは、非結合ドメイン内の炭素原子、好ましくは炭素−２２において
誘導体化されたタクロリムスの使用に基づくタクロリムスに対する改良されたモ
ノクローナル抗体を開発した。抗体産生動物のこのイムノゲンによる免疫処置で
産生されたポリクローナル抗体が最初に作成される。得られた抗体産生細胞をつ
いで適当な融合パートナーとの細胞融合に使用してハイブリドーマを産生させる
。ハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体はタクロリムスの検出
のためのイムノアッセイにとくに有用である。
【００３６】 I．タクロリムスの誘導体 したがって、本発明の一態様はタクロリムスの非結合ドメイン内の炭素原子に
おいて誘導体化されたタクロリムスの誘導体である。好ましくは、誘導体は炭素
−２２において誘導体化される。一つのとくに好ましいクラスの誘導体には２２
位置におけるケト基をアミンと反応させて生じたオキシムを包含する。とくに好
ましいアミンはカルボキシメトキシルアミンである。タクロリムスのカルボキシ
メトキシルアミンとの反応はカルボキシメチルオキシムを産生する。
【００３７】 この反応はメタノール中酢酸ナトリウムの存在下にタクロリムスとカルボキシ
メトキシルアミンとの反応を包含し、オキシムを与える。したがって、本発明の
他の態様は、タクロリムスをカルボキシメトキシルアミンと反応させ、タクロリ
ムスのカルボキシメチルオキシム誘導体を産生させることからなるタクロリムス
を誘導体化する方法である。オキシム残基は炭素−２２に存在する。この反応の
更なる詳細は実施例１に示す。
【００３８】 したがって、本発明の他の態様は、位置２２におけるカルボキシメチルオキシ
ム残基で誘導体化されたタクロリムスがオキシム残基を介して高分子量タンパク
質に接合したタクロリムスの誘導体からなる接合体である。典型的には、高分子
量タンパク質はハプテンのための適当な担体であり、必ずしもそれらに限定され
るものではないが、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、オバルブミン、フ
ィブリノーゲンまたはキーホールリンペットヘモシアニンのようなタンパク質で
ある。とくに好ましい担体はキーホールリンペットヘモシアニンである。また、
高分子量タンパク質は酵素、たとえば検出可能なシグナルを産生する酵素、たと
えばグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼまたはアルカリホスァター
ゼとすることもできる。このような接合体は以下に述べるようにとくにタクロリ
ムスのイムノアッセイに有用である。
【００３９】 これらの接合体の製造はさらに詳細に以下の実施例２に掲げる。しかしながら
一般に、タクロリムスの高分子量タンパク質との接合体の製造方法は次の通りで
ある。 (１) 上述のように、タクロリムスのカルボキシメチルオキシムの製造、 (２) カルボキシメチルオキシムを活性化による反応性Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステルの製造、および (３) Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと高分子量タンパク質の反応に
よる接合体の製造。この反応は実施例２において詳細に論じる。Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステルを製造するためのカルボキシメチルオキシムの活性化は
通常、カップリング剤たとえば水溶性カルボジイミドを用いて実施される。好ま
しい水溶性カルボジイミドは３−（３−ジメチルアミノプロピル１−エチル−３
−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）である。他の
水溶性カルボジイミドは本技術分野において周知であり、同様に使用することが
できる。
【００４０】 高分子量タンパク質たとえばキーホールリンペットヘモシアニンとの接合体の
形成に加えて、本発明はまた、炭素２２においてビオチン残基にリンカーを介し
て連結したカルボキシメチルオキシム残基で置換されたタクロリムスの誘導体を
包含する。ビオチンおよびハプテンまたは抗原の間にリンカーの使用は本技術分
野で周知であり、ここに詳細に説明する必要はないと考える。とくに好ましい１
つの誘導体では、リンカーはＮＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ(ＣＨ2)5−ＮＨ2 の構造を有する。リンカーのアミノ基の１つはカルボキシメチルオキシムのカル
ボキシル基とアミド結合を形成し、他のアミノ基はビオチンのカルボキシル基と
アミド結合を形成する。
【００４１】 このスペーサーの長さは１または２以上のＣＨ2（メチレン）基を２またはそ
れ以上のメチレン基を有するスペーサー中の２つの位置で挿入または欠失するこ
とによって変化させることができる。 誘導体は上述のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをビオチンまたはビオ
チン誘導体もしくは類縁体のカルボキシル基と反応させることによって形成する
ことができる。この反応は、上述のように実施することができる。
【００４２】 一般に、このようなビオチン誘導体の形成方法は、 (１) カルボキシメトキシルアミンとタクロリムスを反応させて、タクロリム
スのカルボキシメチルオキシム誘導体（この場合、カルボキシメチルオキシム誘
導体は位置２２に存在する）を製造し、 (２) カルボキシメチルオキシムを活性化して反応性Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステルを製造し、ついで (３) Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをビオチンまたはビオチン誘導
体もしくは類縁体のカルボキシル基と反応させることからなる。
【００４３】 好ましい一変法においては、以下に実施例３において述べるように、オキシム
をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中ＥＤＡＣおよびＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミドと反応させる。活性化された生成物をついでリンカーを含有するビオチン、
たとえばＬＣ−ビオチンと反応させる。
【００４４】 タクロリムスの非結合ドメイン内の炭素原子、好ましくは位置２２において誘
導体化されたタクロリムスの接合体のさらに他の実施態様は、ブロモアセチル誘
導体である。位置２２で誘導体化されたタクロリムスのブロモアセチル誘導体は
実施例４に記載する。このような誘導体の製造は一般に、 (１) カルボキシメトキシルアミンとタクロリムスを反応させて、タクロリム
スのカルボキシメチルオキシム誘導体（この場合、カルボキシメチルオキシム誘
導体は位置２２に存在する）を製造し、 (２) カルボキシメチルオキシムを活性化して反応性Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステルを製造し、ついで (３) Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをトリブロモアセチルエチレン
ジアミンのトリフルオロ酢酸塩と反応させてブロモアセチル誘導体を得ることか
らなる。この方法に用いるカルボキシメチルオキシム誘導体は上述のようにして
製造される。
【００４５】 このようなブロモアセチル誘導体はタクロリムスの酵素接合体を製造するため
に使用することができる。すなわちブロモアセチル残基を酵素のスルフヒドリル
基、たとえばシステイン残基を含有するグルコース−６−ホスフェートデヒドロ
ゲナーゼのムテインと反応させる。ブロモアセチル誘導体は他の酵素またはタン
パク質中の他のシステイン基と反応させて、タクロリムスの他の酵素またはタン
パク質接合体を製造することができる。
【００４６】 II．モノクローナルおよびポリクローナル抗体ならびにハイブリドーマ 本発明の他の態様はモノクローナル抗体およびそれらを産生するハイブリドー
マ、ならびに上述のタクロリムス誘導体で抗体産生動物を免疫処置することによ
って産生されるポリクローナル抗体である。
【００４７】 本発明に対するモノクローナル抗体の好ましい一実施態様は、１Ｈ６と命名さ
れるＩｇＧ1λモノクローナル抗体であるタクロリムスに対するマウスモノクロ
ーナル抗体である。このモノクローナル抗体は１３−デメチルと反応するが、以
下のタクロリムス代謝物：１５−デメチルタクロリムス、３１−デメチルタクロ
リムス、１３,３１−ジデメチルタクロリムス、１５,３１−ジデメチルタクロリ
ムス、および１２−ヒドロキシタクロリムスのすべてに約８％未満の交叉反応性
しか示さない。このモノクローナル抗体のタクロリムスに対する結合親和性は３
.７×１０9Ｌ／moleと推定されている。
【００４８】 本発明による他のモノクローナル抗体は、 (１) 競合アッセイにより測定して１Ｈ６と命名されるＩｇＧ1λモノクロー
ナル抗体と比較した場合、モルベースで少なくとも約８０％の有効性で１Ｈ６と
命名されるＩｇＧ1λモノクローナル抗体と競合し、 (２) １５−デメチルタクロリムス；３１−デメチルタクロリムス；１３,３
１−ジデメチルタクロリムス；１５,３１−デメチルタクロリムスおよび１２−
ヒドロキシタクロリムスそれぞれと約１０％未満の交叉反応性を有するタクロリ
ムスに対するモノクローナル抗体である。
【００４９】 好ましくは、モノクローナル抗体は、１Ｈ６と命名されるモノクローナル抗体
とモルベースで少なくとも約９０％の有効性で競合し、これらのタクロリムスの
代謝物それぞれと約８％未満の交叉反応性を有する。
【００５０】 本発明の他の態様は上述のようにモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マである。これには、１Ｈ６と命名されるタクロリムスに対するＩｇＧ1λモノ
クローナル抗体が包含される。これにはまた、その抗体とモルベースで少なくと
も約８０％の有効性で競合し、上述のようにタクロリムスの代謝物と限られた程
度の交叉反応性を有するモノクローナル抗体を上述のように産生するハイブリド
ーマが包含される。
【００５１】 本発明の他の実施態様は人化モノクローナル抗体である。ある種の適用におい
てはモノクローナル抗体が人化されるように抗体の定常領域の少なくとも一部が
ヒト定常領域により置換された人化モノクローナル抗体であることが好ましい。
典型的にはこのような操作は、ヒト抗体上にマウスの相補性決定領域（ＣＤＲ）
をグラフトすることを包含する。フレームワーク内の個々のアミノ酸の付加的な
変化が抗原結合部位の創製のために必要な場合もある。典型的には、この技術に
は、小レベルの縮重を有する合成オリゴヌクレオチドプライマーのサブセットに
よるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いるマウスハイブリドーマの重鎖およ
び軽鎖の可変領域のＰＣＲ増幅が包含される。必要ならば突然変異の誘発が標準
方法によって行われる。典型的には、可変領域を有する人化Ｖ遺伝子が適当な発
現ベクターにクローン化され、ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ−Ｋ１細胞のような細胞
中で発現される。他の突然変異は必要に応じて行われる。このような人化モノク
ローナル抗体の製造は一般的に本技術分野において周知であり、たとえば C.A.K
. Borrebaeck,“Antibody Engineering" 2nd ed., Oxford University Press, N
ew York, 1995（引用により本明細書に導入される）に記載されている。
【００５２】 したがって、本発明の他の実施態様は一本鎖組換え抗体（ｓＦｖ）であり、 (１) 競合アッセイにより測定して１Ｈ６と命名されるＩｇＧ1λモノクロー
ナル抗体と比較した場合、モルベースで少なくとも約８０％の有効性で１Ｈ６と
命名されるＩｇＧ1λモノクローナル抗体と競合し、 (２) １５−デメチルタクロリムス；３１−デメチルタクロリムス；１３,３
１−ジデメチルタクロリムス；１５,３１−デメチルタクロリムスおよび１２−
ヒドロキシタクロリムスそれぞれと約１０％未満の交叉反応性を有するタクロリ
ムスに対するモノクローナル抗体の可変領域が包含される。
【００５３】 ｓＦｖ一本鎖抗体を製造するための戦略は本技術分野において周知であり、た
とえば C.A.K. Borrebaeck,“Antibody Engineering”前出（引用により本明細
書に導入される）に記載されている。一般的に、ｓＦｖの構築には重鎖および軽
鎖の可変領域の操作を包含し、これらは適当なペプチドリンカーのためのコドン
のオリゴヌクレオチド配列によって遺伝子レベルで連結されなければならない。
リンカーは選ばれたＦｖのＶHおよびＶLドメインを、ドメイン間の接触を混乱さ
せたり、ドメインのフォールディングに干渉したりすることなく連結させなけれ
ばならない。用いられる典型的なリンカーはそれぞれが４つのグリシン残基つい
でセリン残基を有する３つの反復ユニットから構成される１５−残基ペプチドで
ある（J.H. Hustonら,“Protein Engineering of Antibody Binding Sites: Rec
overyof Specific Activity in an Anti-Digoxin Single-Chain Fv Analog Prod
uced in Escherichia coli," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85: 5879-588
3）。通常このような一本鎖抗体は細菌の封入体中で産生される。活性は通常、
封入体から発現されたポリヌクレオチドの再フォールディングを要し、これを実
施するための条件は一般的に周知である。 したがって、このような一本鎖抗体またはｓＦｖもまた本発明の範囲内に包含
される。
【００５４】 本発明の他の実施態様は、高分子量タンパク質に接合したタクロリムスの非結
合ドメインにおいてカルボキシメチルオキシム残基で誘導体化されたタクロリム
スで免疫処置された抗体産生哺乳動物からの抗体産生細胞の、適当な融合パート
ナーとの融合によって製造されたタクロリムスに対するモノクローナル抗体であ
る。好ましくは、タクロリムスの非結合ドメインにおける炭素原子は炭素２２で
ある。上に指摘したように免疫処置に使用される高分子量タンパク質はキーホー
ルリンペットヘモシアニンである。
【００５５】 モノクローナル抗体の製造は本技術分野において周知であり、ここでさらに詳
細に説明す必要はないものと考える。たとえば、モノクローナル抗体の製造は、
J.W. Goding,“Monoclonal Antibodies: Principles and Practice" 2nd ed., A
cademic Press, London, 1986（引用により本明細書に導入される）に記載され
ている。
【００５６】 一般に、その操作における第一工程は標準技術、たとえば、抗体産生動物たと
えばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジまたはウシの抗原での免疫処置によるポリク
ローナル抗体の製造である。抗原は通常、高分子量担体たとえば上述の高分子量
タンパク質である。免疫処置はアジュバントたとえば完全フロイントアジュバン
トもしくは他のアジュバントたとえばモノホスホリルリピドＡおよび合成トレハ
ロースジコリノミコレートアジュバントを用いまたは用いないで実施することが
できる。一般的にはアジュバントを用いて免疫処置するのが好ましい。次の工程
は抗体産生動物からの脾臓細胞の単離および抗体産生動物の脾臓細胞と適当な融
合パートナー、典型的には骨髄腫細胞のたとえばプロピレングリコールの使用ま
たは他の技術による融合である。典型的には、用いられる骨髄腫細胞はヒポキサ
チン−チミジン（ＨＴ）メジウム中では正常に増殖するが、融合細胞の選択に用
いるヒポキサチン−アミノプチリン−チミジン（ＨＡＴ）メジウム中では増殖で
きない。次の工程は、融合細胞の典型的にはＨＡＴメジウムによる選択である。
次の工程はイムノアッセイたとえば固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）または他
のスクリーニングに適当なイムノアッセイを用いる適当な抗体産生のためのクロ
ーン化ハイブリドの選択である。この場合も、これらの工程は本技術分野におい
て周知であり、さらに説明する必要はないものと考える。
【００５７】 本発明の他の実施態様は、上述のような高分子量タンパク質に接合するタクロ
リムスの非結合ドメインにおける炭素原子においてカルボキシメチル残基で誘導
体化されたタクロリムスによる抗体産生哺乳類動物の免疫処置で産生されたタク
ロリムスに対するポリクロナール抗体とすることができる抗体である。タクロリ
ムスの非結合ドメインにおける炭素原子は好ましくは炭素２２である。
【００５８】 本発明の他の態様は、検出可能な標識に直接または間接的に接合した上述の本
発明の抗体からなる接合体である。抗体は、標識と抗体の間に共有結合リンクが
存在するように、検出可能な標識に直接接合させることができる。このような方
法は本技術分野において周知であり、このような技術はたとえば G.T. Hermanso
n,“Bioconjugate Techniques", Academic Press, San Diego, 1996（引用によ
り本明細書に導入される）に記載されている。一般的にこのような技術は抗体お
よび標識上の反応性の基を典型的にはリンカーまたはスペーサーを介して連結さ
せる。リンカーまたはスペーサーの長さは抗体の活性および特異性が保存される
ように調整することが可能であり、標識によって抗体の活性に干渉することなく
検出可能なシグナルが産生されることを保証する。
【００５９】 このような標識は本技術分野において周知であり、詳細に説明する必要はない
ものと考える。このような標識には、それらに限定されるものではないが、酵素
標識、放射性標識、蛍光標識、化学ルミネセンス標識、バイオルミネセンス標識
または粒子標識が包含される。
【００６０】 酵素標識は本技術分野において周知である。典型的には用いられる酵素は肉眼
で検出できるシグナルたとえば着色生成物または不溶性生成物を産生できる酵素
である。使用できる酵素にはとくに、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラク
トシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、
カタラーゼ、ライソザイム、マレエートデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼおよびリボヌクレアーゼＡがある。イムノアッセイ
に使用できる他の酵素は本技術分野において周知である。
【００６１】 使用できる粒子標識には、とくにラテックス標識およびコロイド状金属標識た
とえばコロイド状金、銀、錫および他の金属がある。 多くの様々な放射性、蛍光、化学ルミネセンスおよびバイオルミネセンス標識
が本技術分野で周知である。これらの標識についてここにさらに説明する必要は
ないものと考えられる。
【００６２】 抗体と標識の間の直接的な共有結合の別法として、結合はたとえばビオチン−
アビジン結合のような間接的なものとすることもできる。アビジンまたはその細
菌性類縁体、ストレプトアビジンへのビオチンの結合は本技術分野ではよく理解
されている。この結合は高い特異性およびきわめて高い親和性を有する。典型的
には、抗体はビオチン残基に接合され、標識はアビジンまたはストレプトアビジ
ンに結合させる。他のアレンジメントも使用できる。アビジン−ビオチン結合に
ついては、たとえば、 G.T. Hermanson, 前出, pp. 570-592 に記載されている
。
【００６３】 III．イムノアッセイ 本発明の他の態様は、上述の抗体を使用するタクロリムスに対するイムノアッ
セイである。一般的に、このようなイムノアッセイはタクロリムスの検出または
測定方法である。本明細書において用いられる「検出」の語はサンプル中におけ
るタクロリムスの存在または不存在を検出する定性的アッセイを意味し、一方、
「測定」の語はサンプル中におけるタクロリムスの濃度を決定する定量的または
半定量的アッセイを意味する。
【００６４】 一般に、このようなイムノアッセイ法は以下の工程： (１) タクロリムスの含有が疑われるサンプルを準備し、 (２) サンプルを (ａ) タクロリムスに対する上述の抗体、および (ｂ) 場合によって、タクロリムス類縁体と反応させ（この場合、抗体また
はタクロリムス類縁体の１つは検出可能なシグナルで標識される）、 (３) サンプル中のタクロリムスの存在または濃度を検出または定量するため
に以下の１つ： (ａ) 抗体に結合したタクロリムスに伴うシグナル、 (ｂ) 抗体に結合していないタクロリムスに伴うシグナル、または (ｃ) 存在する総シグナル を観察または測定する各工程からなる。
【００６５】 このようなアッセイは均一または不均一アッセイのいずれかとして記載される
。不均一アッセイにおいては、抗原に結合した抗体は抗原に結合していない抗体
から分離される。この分離は本技術分野において周知の多くの工程、たとえば溶
解度、他の抗体との反応性または他の性質の差によって行われる。このようなア
ッセイは本技術分野においてはよく知られていて、ここにさらに詳細に説明する
必要はないものと考える。抗体に結合したタクロリムスに伴うシグナルまたは抗
体に結合していないタクロリムスに伴うシグナルのいずれを検出または定量する
かにより、不均一アッセイが実施される。これに対し、均一アッセイでは、存在
する総シグナルが検出または定量される。均一アッセイにおいては、抗原−抗体
複合体の存在がシグナルを修飾し、したがって、抗体に結合した抗原を抗体に結
合していない抗原から分離することなく、シグナルレベルの変化が測定される。
【００６６】 多くの不均一イムノアッセイフォーマットが本技術分野においては周知である
が、本発明の関連では一般的に、均一イムノアッセイ系の使用が好ましい。本発
明の抗体を使用するタクロリムスのイムノアッセイのために好ましい均一イムノ
アッセイ系の例には、ＥＭＩＴとして知られ、D.D. Schottelius,“Homogeneous
Immunoassay System (EMIT) for Quantitation of Antiepileptic Drugs in Bi
ological Fluids", in Antiepileptic Drugs: Quantitative Analysis and Inte
rpretation, C.E. Pippengerら, Raven Press, New York, 1978, Ch. 10, pp. 9
8-101（引用により本明細書に導入される）に記載され、Rubensteinら、米国特
許３,８１７,８３７（引用により本明細書に導入される）にさらに記載されてい
る均一アッセイ系がある。
【００６７】 一般的にこのアッセイでは、酵素たとえばグルコース−６−デヒドロゲナーゼ
が酵素の活性が有意に変化しないような様式でアッセイされるアナライト（この
場合、タクロリムス）に接合される。しかしながら、このアナライト−酵素接合
体がアナライトに対する抗体に結合する場合には、酵素の活性部位が遮断され、
したがってその基質が排除されるようにコンフィギュレーションが変化する。こ
れは酵素活性の低下を生じる。複合体が結合しない場合には、活性部位は基質と
の相互作用に利用される。未知サンプル中に遊離のアナライトが存在すると、そ
の場合、遊離のアナライトは抗体に結合する。これはアナライト−酵素接合体の
結合は妨害し、サンプル中のアナライトの濃度に比例して抗体誘発酵素不活性化
は低下する。したがって、このような均一アッセイにおいては、サンプル中のア
ナライト濃度が大きいほど、酵素標識によって産生されるシグナルは増大する。
これが上述の均一アッセイである。
【００６８】 IV．試験キット 本発明の他の態様はとくに上述のＥＭＩＴ均一イムノアッセイに使用するため
の試験キットに関する。このような試験キットは、 (１) 上述のような抗体および (２) 酵素標識により直接もしくは間接的に標識されたタクロリムス類縁体 を別個の容器中にパッケージして構成される試験キットである。
【００６９】 タクロリムス類縁体は直接的または間接的に標識され、一般的にはタクロリム
ス類縁体はビオチン化タクロリムス分子とストレプトアビジン化酵素によって間
接的に標識される。しかしながら、タクロリムスは炭素２２において上述のよう
なＥＭＩＴアッセイにおける使用に適当な酵素とカップリングさせることができ
る。 試験キットにはまた、別個にパッケージされた容器に、他の成分たとえば基質
、緩衝剤、安定剤、補酵素、およびイムノアッセイの実施に必要な他の成分を包
含させることができる。
【００７０】
【実施例】
本発明を次に以下の実施例によって例示する。実施例は例示的な目的のみで提
供されるものであり、本発明の限定を意図するものではない。
【００７１】実施例１ タクロリムスの炭素−２２−置換誘導体の製造 タクロリムスの炭素２２における誘導体化の可能性を検討するため、この分子
のモデルとして酷似した分子、ＦＫ−５２０の誘導体化を実施した。ＦＫ−５２
０は炭素２１におけるアリル基の代わりにエチル基を有するほかはタクロリムス
と同じ構造である。
【００７２】 これらの実験では、試薬および溶媒は市販の等級で、それらを供給されたまま
使用し、さらに精製することはしなかった。小規模でのＦＫ−５２０との反応は
以下のように実施した。０.３２mLのメタノール中ＦＫ−５２０（０.９mg，１.
１μmol）の溶液に酢酸ナトリウム（１.５mg，１８.３μmol，１６equiv.）およ
びカルボキシメトキシルアミン塩酸塩（３.０mg，１３.７μmol，１２equiv.）
を加えた。反応混合物をアルゴン下に室温で３時間撹拌した。ついで溶媒をアル
ゴン気流で洗浄しながら蒸発させた。Analtechからのプレート（１０×２０cm刻
線付，２５０μ）上、残留物を５：６：１.１：０.５％（ＣＨ2Ｃｌ2／ＥｔＯＡ
ｃ／ＭｅＯＨ／ＨＯＡｃ）で薄層クロマトグラフィーに付すと、ＦＫ−５２０モ
ノオキシムのゲノムの２つの異性体が高速原子衝突質量スペクトル分析による分
析に十分な量得られた。Ｃ45Ｈ72Ｎ2Ｏ14のＬＳＩＭＳは８６３.３の［Ｍ−Ｈ]- を与えることが期待される。質量スペクトルの関連部分を図１および図２に示す
。図２は図１に示すスペクトルの部分であり、その中心ピークの周辺で拡大した
ものである。
【００７３】 ついで、タクロリムスのモノオキシムを製造するために同様の操作を用いた。
タクロリムスはタクロリムス一水和物１.０２ｇおよび約６倍過剰のドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有するカプセル中固体混合物として提供した。３０
カプセルからの固体混合物を合して各回１２mLの酢酸エチルで４回抽出した。有
機抽出液を合して真空下に濃縮して４９mgの粗製タクロリムスを得て、これをそ
のまま以下の反応に使用した。
【００７４】 ３.５mLのメタノール中粗製タクロリムス４９mg（理論的には３６.５μmol）
に酢酸ナトリウム（１６.７mg，２０４μmol，５equiv.）およびカルボキシメト
キシルアミン塩酸塩（４０mg，１８３μmol，５equiv.）を加えた。反応混合物
をアルゴン下に室温で１２時間撹拌した。溶媒および揮発性物質を減圧下に除去
して、粗製の固体残留物を得た。Analtechからの予めコーティングしたシリカゲ
ルプレート（２０×２０cm，１０００μ）上３０：７０：１１：０.６（ＣＨ2Ｃ
ｌ2／ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ／ＨＯＡｃ）で粗精製物を薄層クロマトグラフィー
に付すと、タクロリムスモノオキシムのゲノムの２つの異性体が白色固体として
得られた。Ｃ46Ｈ72Ｎ2Ｏ14のＬＳＩＭＳは［Ｍ＋Ｎａ]+として８９９.４および
［Ｎ＋Ｋ]+として９１５.４を与えることが期待された。結果は図３および４に
示す。図４は図３のデータを高い分解能でスペクトルの関連部分を中心に示した
ものである。
【００７５】 カルボキシメトキシルアミン塩酸塩のタクロリムスとの反応生成物のＣＤＣｌ 3 中２５０ＭＨｚにおける1Ｈ ＮＭＲを図５に示す。カルボキシメトキシルアミ
ン塩酸塩のタクロリムスとの反応生成物のＣＤＣｌ3中２５０ＭＨｚにおける13
Ｃ ＮＭＲを図６に示す。図７におけるＣＤＣｌ3中５００ＭＨｚの13Ｃ ＮＭＲ
は対照としてのタクロリムスのＮＭＲである。ＮＭＲスペクトルはすべてBruker
の装置で記録した。
【００７６】実施例２ タクロリムス−キーホールリンペットヘモシアニンの製造 １.０５mLの無水ジメチルホルヌアミド中タクロリムスモノオキシム（３２.３
mg，３６.８μmol）に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）（１１mg，５７.４μmol, １.５equiv.）およびＮ
−ヒドロキシスクシンアミド（７.３mg, ６３.４μmol, １.７equiv.）を加えた
。反応混合物をアルゴン下に室温で１時間撹拌した。ついで混合物をシリンジを
介して、５.０mLのリン酸塩緩衝食塩溶液（０.１Ｍ，ｐＨ８.０）および０.２５
mLのジメチルホルムアミド中キーホールリンペットヘモシアニン（７４mg, ５４
％純度）の溶液に添加した。室温で２時間撹拌したのち、得られた懸濁液をＰＢ
Ｃ（１０mM，ｐＨ７.０）に対して透析した（１×４Ｌ，４℃，２時間）。
【００７７】 得られた混合物をついで３回ＣＨ2Ｃｌ2で抽出して未反応タクロリムスモノオ
キシムの痕跡量を除去した。混合物の定量分析はビシンコニン（ＢＣＡ）タンパ
ク質アッセイ溶液を用いて行い、８mLのＰＢＳ中イムノーゲン５０mg（１０mM，
ｐＨ７.０）を示した。
【００７８】 ＴＮＢＳ法（A.F.S.A．Habeeb, Anal．Biochem. 1966, 14: 328）を用いるハ
プテン数の定量では１３００のハプテン数を与えた。イムノーゲンはドライアイ
ス−アセトンを用いて直ちに凍結し、保存には−２０℃に保持した。
【００７９】実施例３ タクロリムス−ビオチン接合体の製造 ０.３mLの無水ジメチルホルムアミド中、タクロリムスモノオキシム（１２mg
，１３.７μmol）にＥＤＡＣ（４mg, ２３.４μmol, １.７equiv.）およびＮ−
ヒドロキシスクシンアミド（２.７mg, ２３.４μmol, １.７equiv.）を加えた。
反応混合物をアルゴン下に室温で１時間撹拌した。これにトリエチルアミン（１
０μＬ, ７５μmol）および１.０mLのＤＭＦ中ＬＣ−ビオチンの溶液（１０mg，
２５μmol, ２equiv.）を加えた。撹拌をさらに３時間続け、混合物を高真空下
に濃縮し、無色の残留物を得た。粗生成物をWhatmanからのＣ−１８プレート（
ＰＫＬＣ１８Ｆ，２０×２０cm，１０００μ）逆相プレパラティブ薄層クロマト
グラフィー（ＰＴＬＣ）（１３：７ ＣＨ3ＯＨ／Ｈ2Ｏ）に付すと８mgの生成物
が無色の固体として得られた。Ｃ64Ｈ103Ｎ7Ｏ16ＳのＬＳＩＭＳからの期待され
る結果は［Ｍ＋Ｈ]+ １２５８.５であった。マススペクトルの結果は図８および
９に示す。図９は興味ある領域の周辺を中心に高分解能で図８のスペクトルの部
分を示すものである。ＣＤＣｌ3中３５０ＭＨｚにおける1Ｈ ＮＭＲを実施し、
結果を図１０に示す。 この実施例はタクロリムスの位置２２における誘導体化の例である。
【００８０】実施例４ タクロリムスのブロモアセチル誘導体の製造 位置２２において誘導体化したタクロリムスの他の誘導体はブロモアセチル誘
導体である。ブロモアセチル誘導体は酵素または他のタンパク質のスルフヒドリ
ル基と反応することができ、タクロリムス−酵素接合体を生成する。
【００８１】 タクロリムスのブロモアセチル誘導体を形成させるためには、まずテトラヒド
ロフラン（ＴＨＦ）６mL中スクシンイミジルブロモアセテート（７４０mg, ３.
１４mmol）の溶液に４℃、アルゴン下にシリンジを介して純粋なモノ−Ｎ−ＢＯ
Ｃ−エチレンジアミンを滴下して加えた。添加完了後、反応混合物を室温まで加
温し、３時間撹拌した。ついで反応溶液を真空中で濃縮し、残留物を酢酸エチル
に溶解した。酢酸エチル層を水で１回、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液で２回、食塩水
で１回洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥し、蒸発乾固すると、粗製の固体４４０mgが
白色固体として得られた。クロマトトロンを用いシリカゲル上で精製すると（１
：１９ ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2）、純粋なブロモアセチルエチレンジアミン−モ
ノ−ｔ−ＢＯＣ ３８６mgが白色固体として得られた。
【００８２】 ２mLのＣＨ2Ｃｌ2中ブロモアセチルエチレンジアミン−モノ−ｔ−ＢＯＣ（５
０mg，０.１７８mmol）の溶液に室温でシリンジを介して純粋なトリフルオロ酢
酸（ＴＦＡ，０.２９mL, ３.７６mmol）を滴下して加えた。反応混合物を３時間
撹拌し、ついで真空下に濃縮した。痕跡量のＴＦＡをトルエンとの共沸によって
除去し、得られた黄色油状の生成物、ブロモアセチルエチレンジアミンのＴＦＡ
塩をそのまま次の反応に使用した。
【００８３】 ２mLのＴＨＦ中タクロリムスのカルボキシメチルオキシム誘導体（位置２２で
誘導体化）（１００mg, ０.１４mmol）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（
ＮＨＳ）（１９mg, ０.１６５mmol）の溶液にアルゴン下シリンジを介して純粋
なジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（２３μＬ, ０.１４７mmol）を加
えた。反応混合物を室温で３時間撹拌し、ついでシリンジを介してＴＨＦ ３mL
中ブロモアセチルエチレンジアミンのＴＦＡ塩（０.１７８mmol）の溶液に移し
た。ついでこの反応溶液に純粋なジイソプロピルエチレンアミン（ＤＩＥＡ）（
４０μＬ, ０.２３mmol）を加えた。撹拌を２.５時間続け、反応混合物を真空中
で濃縮して粗製の油状物を得た。プレパラティブ薄層クロマトグラフィー（ＴＬ
Ｃ）（７：３：１ ＥｔＯＡｃ／ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ）で精製するとブロモア
セチルタクロリムス４４mg（３７％）が無色の固体として得られた。
【００８４】実施例５ タクロリムスに対するモノクローナル抗体の製造 タクロリムスに対するモノクローナル抗体の製造は以下のように実施した。イ
ムノーゲンは実施例２のタクロリムスのキーホールリンペットヘモシアニンとの
接合体とした。イムノーゲンはＢａｌｂ／ｃマウスの免疫処置に使用した。最初
の免疫処置は、モノホスホリル脂質Ａおよび合成トレハロースジコリノミコレー
トアジュバント（ＲＩＢＩ ＭＰＬ＋ＴＤＭ Emulsion, ＲＩＢＩ ImmunoChem Re
search Inc.）とともに容量２００μL中２５μgの腹腔内投与とした。５週後、
モノホスホリル脂質Ａおよび合成トレハロースジコリノミコレートアジュバント
２００μL中イムノーゲン２５μgによりブースター免疫処置を腹腔内に行った。
ついでさらに８週後に２００μLのハンクの平衡塩溶液中イムノーゲン２５μgの
注入ブースター投与を静脈内および腹腔内に実施した。 ３日後に、Ｐ３×６３−ＡＧ８.６５３と命名された非分泌マウス骨髄腫を用
いる標準方法によって融合を行った。クローニングは標準方法で実施した。
【００８５】 クローンは以下のプロトコールに従い以下の逆ＥＬＩＳＡイムノアッセイによ
りスクリーニングした。プレートは各ウエルあたり１００μLのリン酸緩衝食塩
溶液中ポリクロナールヤギ抗−マウスＩｇＧ（ＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭ）（Zyme
d）５μg／mLでコーティングした。プレートコーティングは室温で２時間もしく
はそれ以上または４℃で一夜実施した。プレートはフィルムに包んで約４℃で数
日間保存することができた。プレートをついで振盪乾燥し、ブロック緩衝希釈液
（ＰＢＳ中０.５％ウシ血清アルブミン，０.０５％Tween２０）をウエルあたり
３００μL使用してブロックした。プレートのブロックは、プレートを振盪しな
がら室温で１５分間またはそれ以上インキュベートして行った。プレートをつい
で振盪乾燥した。スクリーニングするモノクローナル抗体をついで各ウエルに次
のように添加した。ウエルあたり５０μLのブロック緩衝希釈液を、相当するウ
エルから融合増殖プレートに移した細胞培養上清、ウエルあたり５０μLととも
に添加した。プレートを振盪しながら、室温で約１時間インキュベートした。プ
レートをＳ２０スタッカー付きTiterteck Plusプレート洗浄器を使用して洗浄し
た。洗浄緩衝液は０.０５％Tween ２０を含むＰＢＳとした。ブロック緩衝希釈
液に１：４０００に希釈しグルコース−６−ホスフェートヒドロキシラーゼに共
有結合的にカップリングされたタクロリムスの酵素接合体をウエルあたり１００
μL添加した。プレートを振盪しながら室温で約１時間インキュベーションを行
った。ついでプレートを洗浄し、ウエルあたり１００μLの容量で色素形成溶液
を添加した。色素形成溶液は０.５９３mMのｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバ
イオレット、０.０２ＭのＮＡＤ、０.０３３Ｍのグルコース−６−ホスフェート
、０.０５５Ｍ Tris、０.０２Ｍナトリウムアジドおよびジアフォラーゼ（リポ
イルデヒドロゲナーゼ）（Sigma, St. Louis, MO）を含有した。ＢＳＡは５％ｗ
／vol ＢＳＡ溶液の１％（vol／vol）存在した。ＢＳＡは還元されたｐ−ヨード
ニトロテトラゾリウムバイオレットの迅速な沈殿の防止を助けるために使用され
た。
【００８６】 スクリーニングから適当なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選
択した。これは１Ｈ６と命名され、ＩｇＧ1λ抗体である。この抗体はタクロリ
ムスに対して約３.７×１０9Ｌ／moleの結合親和性を有し、１３−デメチルタク
ロリムスと交差反応し、以下のタクロリムス代謝物：１５−デメチルタクロリム
ス；３１−デメチルタクロリムス；１３,３１−ジデメチルタクロリムス；１５,
３１−ジデメチルタクロリムスおよび１２−ヒドロキシタクロリムスのすべてと
約８％未満の交差反応性を有する。
【００８７】実施例６ 実施例４のモノクローナル抗体および他の抗体についてタクロリムスとの交叉反 応性の比較 実施例５の抗体、クローニングから得られ１４Ｈ０４と命名された他の抗体お
よびその他の抗体をタクロリムスの代謝物（１３−デメチルタクロリムス、１５
−デメチルタクロリムス；３１−デメチルタクロリムス；１３,３１−ジデメチ
ルタクロリムス；１５,３１−デメチルタクロリムスおよび１２−ヒドロキシタ
クロリムス）の交叉反応性について試験した。これらの代謝物は１２−ヒドロキ
シタクロリムスを除いてすべて１０ng／mLのタクロリムスを含む溶血血液中様々
なレベルで試験し、１２−ヒドロキシタクロリムスはタクロリムスを含まないサ
ンプル中１０ng／mLで試験した。この試験にはメタノール性抽出液を用いた。こ
の試験のために発生させた標準曲線はこれらのアッセイの標準対照、ＭＯＲＥ免
疫抑制薬対照（More Diagnostic，Los Osos, California）１〜４レベルを用い
て確認した。
【００８８】 すべての抗体が１３−デメチルタクロリムスに対して様々な程度の交叉反応性
を示した。交叉反応性は以下の式：（交叉反応値ng／mL）−溶媒対照値（ng／mL
）×１００）／代謝物を抑制する標的（ng／mL）＝％交叉反応性によって計算さ
れた。
【００８９】 結果は表１に示す。１３−デメチルタクロリムスを例外として、実施例５の１
Ｈ６抗体試験した他のアナライトと８％未満の交叉反応性を示した。
【表１】
【００９０】実施例７ タクロリムスに対するモノクローナル抗体を用いる均一イムノアッセイ ＥＭＩＴ法に基づくタクロリムスに対するイムノアッセイは以下のプロトコー
ルに従って実施された。サンプルまたは検量標準の一定容量（２００μL）を微
小遠沈管にピペットで採取した。同じ試験管に３００mM ＣｕＳＯ4 ５０μLを２
００μLのメタノールとともにピペットで加えた。混合物に栓をし、５分間２０
８００×ｇで遠心分離した。上清は、Roche Cobas Miraアナライザーのサンプル
キャップにそのアナライザーのパラメーターに従って傾瀉した。以下の試薬をア
ナライザーのラックに配置した。試薬ＡはＮａＣｌ、Ｎａ2ＥＤＴＡ、抗−タク
ロリムスモノクローナル抗体（１Ｈ６）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド（ＮＡＤ）、グルコース−６−ホスフェート、界面活性剤（Pluronic 25R2）
、ナトリウムアジド、およびｎ−メチルイソチアゾロン、ｐＨ５.５を含有した
。試薬ＢはTris、ｐＨ８.２を、Ｎａ2ＥＤＴＡ、界面活性剤（Pluronic 25R2）
、ナトリウムアジド、およびｎ−メチルイソチアゾロンを含有した。試薬Ｃはタ
クロリムス−グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ接合体で、Ｎａ2
ＨＰＯ4、Ｎａ2ＥＤＴＡ、ウシ血清アルブミン、界面活性剤（Pluronic 25R2）
およびナトリウムアジド中にｐＨ７.０中に含有した。サンプルおよび試薬ラッ
クをアナライザーに負荷し、試行はプレセットしたパラメーターに従って開始し
た。酵素率は試行時にミリ−ｏｄ／分に換算してプリントアウトした。検量線は
１Ｈ６および１４Ｈ０４と命名された他のモノクローナル抗体について図１１に
示す。
【００９１】実施例８ 本発明のモノクローナル抗体を使用するタクロリムスのアッセイとＬＣ−ＭＳ／ ＭＳ法によるＥＭＩＴアッセイの間の相関 タクロリムスを投与された７０例の患者からの一連のサンプルを本発明の１Ｈ
６モノクローナル抗体を用いるＥＭＩＴ均一イムノアッセイでアッセイし、ＬＣ
−ＭＳ／ＭＳ法と比較した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法は液体クロマトグラフィー、つ
いで縦列マススペクトルを用いるタクロリムスのアッセイ法である（P.J．Taylo
rら,“Sensitive, Specific Quantitative Analysis of Tacrolimus（FK506) in
Bloodby Liquid Chromatography-Electrospray Tandem Mass Spectrometry," C
lin．Chem. 1996, 42: 279-285）。結果は図１２に示す。結果は相関係数０.９
２９のきわめて高い相関を示す。
【００９２】実施例９ 肝機能不全を有する患者からのサンプルについてＥＭＩＴ均一イムノアッセイお よびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法用いた結果の比較 モノクローナル抗体１Ｈ６は１３−デメチルタクロリムス以外のタクロリムス
の代謝物に対する交叉反応性を実質的に最小にしたが、１３−デメチルタクロリ
ムスとの一部の交叉反応性は残っている。１３−デメチルタクロリムスがイムノ
アッセイにおけるこの抗体の使用を妨害するか否かを決定するために、重篤な肝
機能不全を有し移植を待っていたが、タクロリムスを投与されていた７０例の患
者からのサンプルのパネルについて、１Ｈ６モノクローナル抗体を用いるＥＭＩ
Ｔイムノアッセイ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法、およびタクロリムスの他のAbott製の
市販イムノアッセイＩＭｘイムノアッセイでアッセイした。このようなサンプル
は通常臓器移植を受け、正常な肝機能を有する患者からのサンプルよりもタクロ
リムス代謝物のレベルが高い。タクロリムスレベルはこれらの３つのアッセイを
用いてサンプルのパネルについて測定した。
【００９３】 ＥＭＩＴアッセイとＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイの間の比較は図１３、またＥＭ
ＩＴアッセイとＩＭｘアッセイ（Abott）の間の比較は図１４に示す。結果の解
釈にはデミングの回帰分析を用い、結果は表２に示す。１Ｈ６モノクローナル抗
体を用いるＥＭＩＴイムノアッセイは結果の傾斜に基づいて（表２参照）Abott
のＩＭｘアッセイよりＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイとよく一致した。傾斜はＥＭＩ
Ｔについて１.１１、ＩＭｘについて１.４５であった。７０例のサンプルの平均
濃度はＬＣ−ＭＳ／ＭＳで６.７９ng／mL、１Ｈ６モノクローナル抗体を用いた
ＥＭＩＴで６.９６ng／mL、Abott ＩＭｘで７.９３ng／mLであった。上記範囲よ
り高い試験結果を示した２つのサンプルはのＩＭｘによるもののみであった。７
０例の結果のBlant-Altman分析を１Ｈ６モノクローナル抗体を使用したＥＭＩＴ
およびAbott ＩＭｘ対ＬＣ−ＭＳ／ＭＳについて図１５に示す。これらのプロッ
トは一般に対ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの結果の注目すべき変動性がサンプルにつき約１
０ng／mLであることを例示する。イムノアッセイによるＬＣ−ＭＳ／ＭＳの差の
パターンは、１Ｈ６モノクローナル抗体を使用したＥＭＩＴおよびAbott ＩＭｘ
アッセイについて類似していた。
【００９４】
【表２】
【００９５】 高レベルのタクロリムス代謝物を含有するこれらの患者でも、ＥＭＩＴ均一イ
ムノアッセイにおいてモノクローナル抗体１Ｈ６を用いるアッセイは他の方法に
対して高度の相関を示した。したがって、肝機能不全はこの抗体を使用するこの
アッセイにはひどいインパクトを与えず、この結果から、イムノアッセイによる
患者の臨床的管理が、タクロリムスに対するモノクローナル抗体１Ｈ６を用いる
ＥＭＩＴアッセイまたは以前から利用されているAbott ＩＭｘイムノアッセイを
使用して同様に達成できると解釈される。これは１Ｈ６モノクローナル抗体の臨
床的な価値を示すものである。
【００９６】本発明の利点 本発明はタクロリムス代謝物との交差反応性を最小にするタクロリムスに対す
るモノクローナル抗体を提供する。本発明のモノクローナル抗体は、タクロリム
スの他のイムノアッセイ法および非イムノアッセイ法とよく相関するタクロリム
スの改良されたイムノアッセイに使用することができる。モノクローナル抗体を
用いるイムノアッセイは、肝機能が障害されて彼らの血清中に高レベルのタクロ
リムス代謝物を含有すると考えられる患者を含めて、タクロリムスの投与を受け
ている患者の臨床的モニタリングに適当である。
【００９７】 以上、本発明をそのある種の好ましいバージョンを参照しながらかなり詳細に
説明してきたが、他のバージョンも可能である。したがって、上述の特許請求の
範囲の精神および範囲は、本明細書における好ましいバージョンの記載によって
制限されるものではないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 タクロリムスに構造の酷似したマクロライド抗生物質ＦＫ−５２０とカルボキ
シメトキシルアミンの反応から生成した生成物のマススペクトル図である。
【図２】 図１のマススペクトル図の部分であり、拡大した分解能で最も高いピークの周
辺を中心に示している。
【図３】 タクロリムスとカルボキシメトキシルアミンの反応から生成した生成物のマス
スペクトル図である。
【図４】 図３のマススペクトル図の部分であり、拡大した分解能で最も高いピークの周
辺を中心に示している。
【図５】 タクロリムスとカルボキシメトキシルアミンの反応から生成した生成物のＣＤ
Ｃｌ3中２５０ＭＨｚにおける1Ｈ ＮＭＲスペクトルである。
【図６】 タクロリムスとカルボキシメトキシルアミンの反応から生成した生成物のＣＤ
Ｃｌ3中２５０ＭＨｚにおける13Ｃ ＮＭＲスペクトルである。
【図７】 参考として提示するタクロリムスのＣＤＣｌ3中２５０ＭＨｚにおける13ＣＮ
ＭＲスペクトルである。
【図８】 タクロリムスモノオキシムとＬＣ−ビオチンの反応から生成した生成物のマス
スペクトル図である。
【図９】 図８のマススペクトル図の部分であり、拡大した分解能で最も高いピークの周
辺を中心に示している。
【図１０】 タクロリムスモノオキシムとＬＣ−ビオチンの反応から生成した生成物のＣＤ
Ｃｌ3中２５０ＭＨｚにおける1Ｈ ＮＭＲスペクトルである。
【図１１】 位置２２においてカルボキシメチルオキシムにより誘導体化されたタクロリム
スをキーホールリンペットヘモシアニンに連結した接合体でマウスを免疫処置す
ることにより産生させたモノクローナル抗体と、得られた抗体産生細胞と融合パ
ートナーとの細胞融合を用いるタクロリムスの均一系酵素イムノアッセイの検量
曲線である。
【図１２】 図１１に検量曲線を示したモノクローナル抗体との均一系酵素イムノアッセイ
を用いたタクロリムスのアッセイの結果と、ガスクロマトグラフィーおよび縦列
マススペクトロスコピーを使用する方法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いたタクロリ
ムスのアッセイの結果との間の相関を示すグラフである。
【図１３】 タクロリムスを投与された肝障害を有する７０例の患者のパネルについて均一
系酵素イムノアッセイおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いたタクロリムスのアッセイ
の結果の間の相関を示すグラフである。
【図１４】 図１３の７０例の患者のパネルについて均一系酵素イムノアッセイおよび市販
品を入手できるイムノアッセイを用いたタクロリムスのアッセイの結果の間の相
関を示すグラフである。
【図１５】 図１３および図１４についての Bland-Altman 差分析プロットを示すグラフで
ある。
【図１６】 タクロリムスの構造式の図であり、分子のナンバリングを示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年１０月１８日（２００１．１０．１８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ダリウシュ・ダヴァーリアン アメリカ合衆国カリフォルニア州95124． サンノゼ．ロムフォードドライブ5363 (72)発明者 シウ−ティン・リウ アメリカ合衆国カリフォルニア州95035． ミルピータス．ポートーラドライブ1552 (72)発明者 ポール・エル・ミラー アメリカ合衆国カリフォルニア州94080． サウスサンフランシスコ．アルハムブラロ ード499 (72)発明者 デニース・エル・ウィリアムズ アメリカ合衆国カリフォルニア州95123． サンノゼ．チェスブロアベニュー5511 Ｆターム(参考） 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4B065 AA92X AB05 AC14 BA08 CA25 CA46 4C072 AA03 BB03 CC01 CC12 DD07 EE09 FF15 GG01 GG07 HH01 UU01 4H045 AA11 AA30 BA10 CA40 DA76 EA50 FA74

Claims (82)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 タクロリムスに対して約３.７×１０9Ｌ／moleの結合親和性
    を有し、１３−デメチルタクロリムスと交叉反応し、以下のタクロリムス代謝物
    ：１５−デメチルタクロリムス；３１−デメチルタクロリムス；１３,３１−ジ
    デメチルタクロリムス；１５,３１−ジデメチルタクロリムスおよび１２−ヒド
    ロキシタクロリムスのすべてとそれぞれ約８％未満の交叉反応性を有するＩｇＧ 1 λモノクローナル抗体である、タクロリムスに対する１Ｈ６と命名されるモノ
    クローナル抗体。
  2. 【請求項２】 (ａ) 競合アッセイで測定して、１Ｈ６と命名されるＩｇＧ 1 λモノクローナル抗体と比較しモルベースで少なくとも約８０％の有効性で
    １Ｈ６と命名されるＩｇＧ1λモノクローナル抗体と競合し、 (ｂ) １５−デメチルタクロリムス；３１−デメチルタクロリムス；１３,３
    １−ジデメチルタクロリムス；１５,３１−ジデメチルタクロリムスおよび１２
    −ヒドロキシタクロリムスそれぞれと約１０％未満の交叉反応性を有する、タク
    ロリムスに対するモノクローナル抗体。
  3. 【請求項３】 抗体は１Ｈ６と命名されるモノクローナル抗体とモルベース
    で少なくとも約９０％の有効性で競合し、１５−デメチルタクロリムス；３１−
    デメチルタクロリムス；１３,３１−ジデメチルタクロリムス；１５,３１−ジデ
    メチルタクロリムス、および１２−ヒドロキシタクロリムスそれぞれと約８％未
    満の交叉反応性を有する請求項２記載のモノクローナル抗体。
  4. 【請求項４】 タクロリムスに対して約３.７×１０9Ｌ／moleの結合親和性
    を有し、１３−デメチルタクロリムスと交叉反応し、以下のタクロリムス代謝物
    ：１５−デメチルタクロリムス；３１−デメチルタクロリムス；１３,３１−ジ
    デメチルタクロリムス；１５,３１−ジデメチルタクロリムスおよび１２−ヒド
    ロキシタクロリムスのすべてに対して約８％未満の交叉反応性を有するＩｇＧ1
    λモノクローナル抗体である、タクロリムスに対する１Ｈ６と命名されるＩｇＧ 1 λモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
  5. 【請求項５】 請求項２記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
    マ。
  6. 【請求項６】 抗体の定常領域の少なくとも一部はヒト定常領域で置換され
    、モノクローナル抗体が人化されている請求項２記載のモノクローナル抗体。
  7. 【請求項７】 抗体は１Ｈ６と命名されるＩｇＧ1λモノクローナル抗体と
    比較しモルベースで少なくとも約９０％の有効性で競合し、抗体は１５−デメチ
    ルタクロリムス；３１−デメチルタクロリムス；１３,３１−ジデメチルタクロ
    リムス；１５,３１−ジデメチルタクロリムスおよび１２−ヒドロキシタクロリ
    ムスそれぞれと約８％未満の交叉反応性を有する請求項６記載のモノクローナル
    抗体。
  8. 【請求項８】 (ａ) 競合アッセイにより測定して１Ｈ６と命名されるＩｇ
    Ｇ1λモノクローナル抗体と比較した場合、モルベースで少なくとも約８０％の
    有効性で１Ｈ６と命名されるＩｇＧ1λモノクローナル抗体と競合し、そして (ｂ) １５−デメチルタクロリムス；３１−デメチルタクロリムス；１３,３
    １−ジデメチルタクロリムス；１５,３１−ジデメチルタクロリムスおよび１２
    −ヒドロキシタクロリムスそれぞれと約１０％未満の交叉反応性を有する、タク
    ロリムスに対する抗体の可変領域をその中に包含する、一本鎖組換え抗体(ｓＦ
    ｖ)。
  9. 【請求項９】 抗体は１Ｈ６と命名されるモノクローナル抗体とモルベース
    で少なくとも約９０％の有効性で競合し、１５−デメチルタクロリムス；３１−
    デメチルタクロリムス；１３,３１−ジデメチルタクロリムス；１５,３１−ジデ
    メチルタクロリムス、および１２−ヒドロキシタクロリムスそれぞれと約８％未
    満の交叉反応性を有する請求項８記載のモノクローナル抗体。
  10. 【請求項１０】 タクロリムスの非結合ドメインの炭素原子においてカルボ
    キシメチルオキシム部分で高分子量タンパク質に接合して誘導体化されたタクロ
    リムスにより免疫処置された抗体産生哺乳動物からの抗体産生細胞の、適当な融
    合パートナーとの融合によって製造されるタクロリムスに対するモノクローナル
    抗体。
  11. 【請求項１１】 炭素２２におけるカルボキシメチルオキシム残基で高分子
    量タンパク質に接合して誘導体化されたタクロリムスにより免疫処置された抗体
    産生哺乳動物からの抗体産生細胞の、適当な融合パートナーとの融合によって製
    造されるタクロリムスに対するモノクローナル抗体。
  12. 【請求項１２】 高分子量タンパク質はキーホールリンペットヘモシアニン
    である請求項１１記載のモノクローナル抗体。
  13. 【請求項１３】 タクロリムスの非結合ドメインの炭素原子において、カル
    ボキシメチルオキシム部分で高分子量タンパク質に接合して誘導体化されたタク
    ロリムスの免疫処置によって抗体産生哺乳動物から製造されるタクロリムスに対
    する抗体。
  14. 【請求項１４】 炭素２２におけるオキシム残基で高分子量タンパク質に接
    合して誘導体化されたタクロリムスによる抗体産生哺乳動物の免疫処置にによっ
    て製造されるタクロリムスに対する抗体。
  15. 【請求項１５】 高分子量タンパク質はキーホールリンペットヘモシアニン
    である請求項１４記載の抗体。
  16. 【請求項１６】 検出可能な標識に直接もしくは間接的に接合された請求項
    １記載の抗体からなる接合体。
  17. 【請求項１７】 検出可能な標識は酵素標識、放射性標識、蛍光標識、化学
    ルミネセンス標識、バイオルミネセンス標識および粒子標識からなる群より選択
    される請求項１６記載の接合体。
  18. 【請求項１８】 標識は酵素標識である請求項１７記載の接合体。
  19. 【請求項１９】 検出可能な標識に直接もしくは間接的に接合された請求項
    ２記載の抗体からなる接合体。
  20. 【請求項２０】 検出可能な標識は酵素標識、放射性標識、蛍光標識、化学
    ルミネセンス標識、バイオルミネセンス標識および粒子標識からなる群より選択
    される請求項１９記載の接合体。
  21. 【請求項２１】 標識は酵素標識である請求項２０記載の接合体。
  22. 【請求項２２】 検出可能な標識に直接もしくは間接的に接合された請求項
    ６記載の抗体からなる接合体。
  23. 【請求項２３】 検出可能な標識は酵素標識、放射性標識、蛍光標識、化学
    ルミネセンス標識、バイオルミネセンス標識および粒子標識からなる群より選択
    される請求項２２記載の接合体。
  24. 【請求項２４】 標識は酵素標識である請求項２３記載の接合体。
  25. 【請求項２５】 検出可能な標識に直接もしくは間接的に接合された請求項
    ８記載の抗体からなる接合体。
  26. 【請求項２６】 検出可能な標識は酵素標識、放射性標識、蛍光標識、化学
    ルミネセンス標識、バイオルミネセンス標識および粒子標識からなる群より選択
    される請求項２５記載の接合体。
  27. 【請求項２７】 標識は酵素標識である請求項２６記載の接合体。
  28. 【請求項２８】 検出可能な標識に直接もしくは間接的に接合された請求項
    １０記載の抗体からなる接合体。
  29. 【請求項２９】 検出可能な標識は酵素標識、放射性標識、蛍光標識、化学
    ルミネセンス標識、バイオルミネセンス標識および粒子標識からなる群より選択
    される請求項２８記載の接合体。
  30. 【請求項３０】 標識は酵素標識である請求項２９記載の接合体。
  31. 【請求項３１】 検出可能な標識に直接もしくは間接的に接合された請求項
    １１記載の抗体からなる接合体。
  32. 【請求項３２】 検出可能な標識は酵素標識、放射性標識、蛍光標識、化学
    ルミネセンス標識、バイオルミネセンス標識および粒子標識からなる群より選択
    される請求項３１記載の接合体。
  33. 【請求項３３】 標識は酵素標識である請求項３２記載の接合体。
  34. 【請求項３４】 検出可能な標識に直接もしくは間接的に接合された請求項
    １３記載の抗体からなる接合体。
  35. 【請求項３５】 検出可能な標識は酵素標識、放射性標識、蛍光標識、化学
    ルミネセンス標識、バイオルミネセンス標識および粒子標識からなる群より選択
    される請求項３４記載の接合体。
  36. 【請求項３６】 標識は酵素標識である請求項３５記載の接合体。
  37. 【請求項３７】 検出可能な標識に直接もしくは間接的に接合された請求項
    １４記載の抗体からなる接合体。
  38. 【請求項３８】 検出可能な標識は酵素標識、放射性標識、蛍光標識、化学
    ルミネセンス標識、バイオルミネセンス標識および粒子標識からなる群より選択
    される請求項３７記載の接合体。
  39. 【請求項３９】 標識は酵素標識である請求項３８記載の接合体。
  40. 【請求項４０】 (ａ) タクロリムスの含有が疑われるサンプルを準備し、 (ｂ) そのサンプルを、 (ｉ) 請求項１記載の抗体および (ii) 場合によってタクロリムス類縁体（抗体またはタクロリムス類縁体の
    １つは検出可能なシグナルを産生する標識によって標識されている）と反応させ
    、そして (ｃ) サンプル中におけるタクロリムスの存在またはタクロリムスの濃度を検
    出または定量するために、 (ｉ) 抗体に結合したタクロリムスと会合しているシグナル； (ii) 抗体に結合していないタクロリムスと会合しているシグナル；または (iii) 存在する総シグナル のいずれかを観察または測定する各工程からなる、タクロリムスを検出または定
    量する方法。
  41. 【請求項４１】 サンプルを酵素標識で標識されたタクロリムス類縁体と反
    応させ、サンプル中におけるタクロリムスの存在またはタクロリムスの濃度を検
    出または定量するために存在する総シグナルを観察または測定する請求項４０記
    載の方法。
  42. 【請求項４２】 (ａ) タクロリムスの含有が疑われるサンプルを準備し、 (ｂ) そのサンプルを、 (ｉ) 請求項２記載の抗体および (ii) 場合によってタクロリムス類縁体（抗体またはタクロリムス類縁体の
    １つは検出可能なシグナルを産生する標識によって標識されている）と反応させ
    、そして (ｃ) サンプル中におけるタクロリムスの存在またはタクロリムスの濃度を検
    出または定量するために、 (ｉ) 抗体に結合したタクロリムスと会合しているシグナル； (ii) 抗体に結合していないタクロリムスと会合しているシグナル；または (iii) 存在する総シグナル のいずれかを観察または測定する各工程からなる、タクロリムスを検出または定
    量する方法。
  43. 【請求項４３】 サンプルを酵素標識で標識されたタクロリムス類縁体と反
    応させ、サンプル中におけるタクロリムスの存在またはタクロリムスの濃度を検
    出または定量するために存在する総シグナルを観察または測定する請求項４２記
    載の方法。
  44. 【請求項４４】 (ａ) タクロリムスの含有が疑われるサンプルを準備し、 (ｂ) そのサンプルを、 (ｉ) 請求項６記載の抗体および (ii) 場合によってタクロリムス類縁体（抗体またはタクロリムス類縁体の
    １つは検出可能なシグナルを産生する標識によって標識されている）と反応させ
    、そして (ｃ) サンプル中におけるタクロリムスの存在またはタクロリムスの濃度を検
    出または定量するために、 (ｉ) 抗体に結合したタクロリムスと会合しているシグナル； (ii) 抗体に結合していないタクロリムスと会合しているシグナル；または (iii) 存在する総シグナル のいずれかを観察または測定する各工程からなる、タクロリムスを検出または定
    量する方法。
  45. 【請求項４５】 サンプルを酵素標識で標識されたタクロリムス類縁体と反
    応させ、サンプル中におけるタクロリムスの存在またはタクロリムスの濃度を検
    出または定量するために存在する総シグナルを観察または測定する請求項４４記
    載の方法。
  46. 【請求項４６】 (ａ) タクロリムスの含有が疑われるサンプルを準備し、 (ｂ) そのサンプルを、 (ｉ) 請求項８記載の抗体および (ii) 場合によってタクロリムス類縁体（抗体またはタクロリムス類縁体の
    １つは検出可能なシグナルを産生する標識によって標識されている）と反応させ
    、そして (ｃ) サンプル中におけるタクロリムスの存在またはタクロリムスの濃度を検
    出または定量するために、 (ｉ) 抗体に結合したタクロリムスと会合しているシグナル； (ii) 抗体に結合していないタクロリムスと会合しているシグナル；または (iii) 存在する総シグナル のいずれかを観察または測定する各工程からなる、タクロリムスを検出または定
    量する方法。
  47. 【請求項４７】 サンプルを酵素標識で標識されたタクロリムス類縁体と反
    応させ、サンプル中におけるタクロリムスの存在またはタクロリムスの濃度を検
    出または定量するために存在する総シグナルを観察または測定する請求項４６記
    載の方法。
  48. 【請求項４８】 (ａ) タクロリムスの含有が疑われるサンプルを準備し、 (ｂ) そのサンプルを、 (ｉ) 請求項１０記載の抗体および (ii) 場合によってタクロリムス類縁体（抗体またはタクロリムス類縁体の
    １つは検出可能なシグナルを産生する標識によって標識されている）と反応させ
    、そして (ｃ) サンプル中におけるタクロリムスの存在またはタクロリムスの濃度を検
    出または定量するために、 (ｉ) 抗体に結合したタクロリムスと会合しているシグナル； (ii) 抗体に結合していないタクロリムスと会合しているシグナル；または (iii) 存在する総シグナル のいずれかを観察または測定する各工程からなる、タクロリムスを検出または定
    量する方法。
  49. 【請求項４９】 サンプルを酵素標識で標識されたタクロリムス類縁体と反
    応させ、サンプル中におけるタクロリムスの存在またはタクロリムスの濃度を検
    出または定量するために存在する総シグナルを観察または測定する請求項４８記
    載の方法。
  50. 【請求項５０】 (ａ) タクロリムスの含有が疑われるサンプルを準備し、 (ｂ) そのサンプルを、 (ｉ) 請求項１１記載の抗体および (ii) 場合によってタクロリムス類縁体（抗体またはタクロリムス類縁体の
    １つは検出可能なシグナルを産生する標識によって標識されている）と反応させ
    、そして (ｃ) サンプル中におけるタクロリムスの存在またはタクロリムスの濃度を検
    出または定量するために、 (ｉ) 抗体に結合したタクロリムスと会合しているシグナル； (ii) 抗体に結合していないタクロリムスと会合しているシグナル；または (iii) 存在する総シグナル のいずれかを観察または測定する各工程からなる、タクロリムスを検出または定
    量する方法。
  51. 【請求項５１】 サンプルを酵素標識で標識されたタクロリムス類縁体と反
    応させ、サンプル中におけるタクロリムスの存在またはタクロリムスの濃度を検
    出または定量するために存在する総シグナルを観察または測定する請求項５０記
    載の方法。
  52. 【請求項５２】 (ａ) タクロリムスの含有が疑われるサンプルを準備し、 (ｂ) そのサンプルを、 (ｉ) 請求項１３記載の抗体および (ii) 場合によってタクロリムス類縁体（抗体またはタクロリムス類縁体の
    １つは検出可能なシグナルを産生する標識によって標識されている）と反応させ
    、そして (ｃ) サンプル中におけるタクロリムスの存在またはタクロリムスの濃度を検
    出または定量するために、 (ｉ) 抗体に結合したタクロリムスと会合しているシグナル； (ii) 抗体に結合していないタクロリムスと会合しているシグナル；または (iii) 存在する総シグナル のいずれかを観察または測定する各工程からなる、タクロリムスを検出または定
    量する方法。
  53. 【請求項５３】 サンプルを酵素標識で標識されたタクロリムス類縁体と反
    応させ、サンプル中におけるタクロリムスの存在またはタクロリムスの濃度を検
    出または定量するために存在する総シグナルを観察または測定する請求項５２記
    載の方法。
  54. 【請求項５４】 (ａ) タクロリムスの含有が疑われるサンプルを準備し、 (ｂ) そのサンプルを、 (ｉ) 請求項１４記載の抗体および (ii) 場合によってタクロリムス類縁体（抗体またはタクロリムス類縁体の
    １つは検出可能なシグナルを産生する標識によって標識されている）と反応させ
    、そして (ｃ) サンプル中におけるタクロリムスの存在またはタクロリムスの濃度を検
    出または定量するために、 (ｉ) 抗体に結合したタクロリムスと会合しているシグナル； (ii) 抗体に結合していないタクロリムスと会合しているシグナル；または (iii) 存在する総シグナル のいずれかを観察または測定する各工程からなる、タクロリムスを検出または定
    量する方法。
  55. 【請求項５５】 サンプルを酵素標識で標識されたタクロリムス類縁体と反
    応させ、サンプル中におけるタクロリムスの存在またはタクロリムスの濃度を検
    出または定量するために存在する総シグナルを観察または測定する請求項５４記
    載の方法。
  56. 【請求項５６】 別個の容器中にパッケージされた試験キットにおいて、 (ａ) 請求項１記載の抗体および (ｂ) 酵素標識により直接もしくは間接的に標識されたタクロリムス類縁体を
    含有する試験キット。
  57. 【請求項５７】 別個の容器中にパッケージされた試験キットにおいて、 (ａ) 請求項２記載の抗体および (ｂ) 酵素標識により直接もしくは間接的に標識されたタクロリムス類縁体を
    含有する試験キット。
  58. 【請求項５８】 別個の容器中にパッケージされた試験キットにおいて、 (ａ) 請求項６記載の抗体および (ｂ) 酵素標識により直接もしくは間接的に標識されたタクロリムス類縁体を
    含有する試験キット。
  59. 【請求項５９】 別個の容器中にパッケージされた試験キットにおいて、 (ａ) 請求項８記載の抗体および (ｂ) 酵素標識により直接もしくは間接的に標識されたタクロリムス類縁体を
    含有する試験キット。
  60. 【請求項６０】 別個の容器中にパッケージされた試験キットにおいて、 （ａ）請求項１０記載の抗体および （ｂ）酵素標識により直接もしくは間接的に標識されたタクロリムス類縁体を
    含有する試験キット。
  61. 【請求項６１】 別個の容器中にパッケージされた試験キットにおいて、 (ａ) 請求項１１記載の抗体および (ｂ) 酵素標識により直接もしくは間接的に標識されたタクロリムス類縁体を
    含有する試験キット。
  62. 【請求項６２】 別個の容器中にパッケージされた試験キットにおいて、 (ａ) 請求項１３記載の抗体および (ｂ) 酵素標識により直接もしくは間接的に標識されたタクロリムス類縁体を
    含有する試験キット。
  63. 【請求項６３】 別個の容器中にパッケージされた試験キットにおいて、 (ａ) 請求項１４記載の抗体および (ｂ) 酵素標識により直接もしくは間接的に標識されたタクロリムス類縁体を
    含有する試験キット。
  64. 【請求項６４】 タクロリムスの非結合ドメインの炭素原子においてカルボ
    キシメチルオキシム部分によって誘導体化されたタクロリムスからなるタクロリ
    ムスの誘導体。
  65. 【請求項６５】 炭素原子２２でカルボキシメチルオキシム部分によって誘
    導体化されたタクロリムスからなるタクロリムスの誘導体。
  66. 【請求項６６】 高分子量タンパク質に接合した請求項６４記載の誘導体か
    らなる接合体。
  67. 【請求項６７】 高分子量タンパク質はキーホールリンペットヘモシアニン
    である請求項６６記載の接合体。
  68. 【請求項６８】 高分子量タンパク質に接合した請求項６５記載の誘導体か
    らなる接合体。
  69. 【請求項６９】 高分子量タンパク質はキーホールリンペットヘモシアニン
    である請求項６８記載の接合体。
  70. 【請求項７０】 タクロリムスをカルボキシメトキシルアミンと反応させ、
    カルボキシメチルオキシム部分が炭素原子２２に存在するタクロリムスのカルボ
    キシメチルオキシム誘導体を生成させることからなるタクロリムスを誘導体化す
    る方法。
  71. 【請求項７１】 (ａ) タクロリムスをカルボキシメトキシルアミンと反応
    させ、カルボキシメチルオキシム部分が炭素原子２２に存在するタクロリムスの
    カルボキシメチルオキシム誘導体を生成させ、 (ｂ) カルボキシメチルオキシムを活性化して反応性Ｎ−ヒドロキシスクシン
    イミドエステルを生成させ、 (ｃ) Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを高分子量タンパク質と反応さ
    せて接合体を産生させること からなる高分子量タンパク質とタクロリムスの接合体を製造する方法。
  72. 【請求項７２】 高分子量タンパク質はキーホールリンペットヘモシアニン
    である請求項７１記載の接合体。
  73. 【請求項７３】 炭素原子２２においてカルボキシメチルオキシム部分で置
    換されたタクロリムスがリンカーを介してビオチン部分に連結してなるタクロリ
    ムスの誘導体。
  74. 【請求項７４】 リンカーは構造：ＮＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−(Ｃ
    Ｈ2)5−ＮＨ2であり、リンカーの１つのアミノ基はカルボキシメチルオキシムの
    カルボキシル基とアミド結合を形成し、リンカーの他のアミノ基はビオチンのカ
    ルボキシル基とアミド結合を形成する請求項７３記載の誘導体。
  75. 【請求項７５】 (ａ) タクロリムスをカルボキシメトキシルアミンと反応
    させ、カルボキシメチルオキシム誘導体は炭素原子２２に存在するタクロリムス
    のカルボキシメチルオキシム誘導体を生成させ、 (ｂ) カルボキシメチルオキシムを活性化して反応性Ｎ−ヒドロキシスクシン
    イミドエステルを生成させ、 (ｃ) Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをビオチンもしくはビオチン誘
    導体またはビオチン類縁体のカルボキシル基と反応させてタクロリムスの誘導体
    を産生させること からなるタクロリムスを誘導体化する方法。
  76. 【請求項７６】 タクロリムスの非結合ドメインの炭素原子においてブロモ
    アセチル部分で誘導体化されたタクロリムスからなるタクロリムスの誘導体。
  77. 【請求項７７】 位置２２においてブロモアセチル部分で誘導体化されたタ
    クロリムスからなるタクロリムスの誘導体。
  78. 【請求項７８】 タンパク質に接合した請求項７６記載の誘導体からなる接
    合体。
  79. 【請求項７９】 タンパク質はグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナ
    ーゼのシステイン含有ムテインである請求項７８記載の接合体。
  80. 【請求項８０】 タンパク質に接合した請求項７７記載の誘導体からなる接
    合体。
  81. 【請求項８１】 タンパク質はグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナ
    ーゼのシステイン含有ムテインである請求項８０記載の接合体。
  82. 【請求項８２】 (ａ) タクロリムスをカルボキシメトキシルアミンと反応
    させ、カルボキシメチルオキシム誘導体は炭素原子２２に存在するタクロリムス
    のカルボキシメチルオキシム誘導体を生成させ、 (ｂ) カルボキシメチルオキシムを活性化して反応性Ｎ−ヒドロキシスクシン
    イミドエステルを生成させ、 (ｃ) Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをブロモアセチルエチレンジア
    ミンのトリフルオロ酢酸塩と反応させてタクロリムスのブロモアセチル誘導体を
    産生させること からなるタクロリムスを誘導体化する方法。
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