DE60031858T2

DE60031858T2 - Monoklonale antikörper gegen tacrolimus und immunotestverfahren für tacrolimus

Info

Publication number: DE60031858T2
Application number: DE60031858T
Authority: DE
Inventors: C. Kenneth Monte Sereno KASPER; Henry Palo Alto JEONG; Dariush San Jose DAVALIAN; Hshiou-Ting Milpitas LIU; L. Paul South San Francisco MILLER; L. Denise San Jose WILLIAMS
Original assignee: Dade Behring Inc
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 1999-08-03
Filing date: 2000-08-02
Publication date: 2007-06-21
Anticipated expiration: 2020-08-03
Also published as: WO2001009190A3; JP2003506336A; US20090087865A1; US20060216770A1; AU6618100A; WO2001009190A2; EP1206493B1; JP4753514B2; EP1206493A2; ES2275534T3; US7078495B1; DE60031858D1; US8030458B2

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf monoklonale Antikörper gegen Tacrolimus, Verfahren zur Herstellung solcher monoklonalen Antikörper sowie Tacrolimusderivate, die sich zur Herstellung solcher monoklonalen Antikörper eignen.
STAND DER TECHNIK
Bei Tacrolimus handelt es sich um ein aus Streptomyces tsukubaensis isoliertes Makrolid. Tacrolimus besitzt den chemischen Namen [3S-[3R*[E(1S*,3S*,4S*)],4S*,5R*,8S*,9E,12R*,14R*,155*,16R*,185*,195*,26aR*]]-5,6,8,11,12,13,14,15,16,17,18,19,24,25,26,26a-Hexadecahydro-5,19-dihydroxy-3-[2-(4-hydroxy-3-methoxycylohexyl)-1-methylethenyl]-14,16-dimethoxy-4,10,12,18-tetramethyl-8-(2-propenyl)-15,19-epoxy-3H-pyrido[2,1-c][1,4]-oxaazacyclotricosin-1,7,20,21(4H,23H)-tetron. Die Struktur von Tacrolimus ist unter Angabe der Bezifferung in 16 unten dargestellt.
Tacrolimus ist auch unter dem Namen FR-900506 oder FK-506 bekannt. Tacrolimus besitzt immunsuppressive sowie antimikrobielle Aktivität.
Die immunsuppressive Aktivität von Tacrolimus ist besonders wichtig und führte zur zunehmend weit verbreiteten Verwendung dieses Arzneistoffs. Die Immunsuppression wird klinisch in einer Reihe von Zusammenhängen eingesetzt, wobei die Verhinderung einer Abstoßung bei der Organtransplantation am wichtigsten ist. Immunsuppressiva werden ebenso zur Vorbeugung der durch Rh-Faktor verursachten hämolytischen Krankheit beim Neugeborenen sowie bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten verabreicht. Tacrolimus hemmt die T-Zellaktivierung durch Bindung an ein unter dem Namen FKBP (FK506-bindendes Protein) bekanntes cytosolisches Protein. Der Komplex aus Arzneistoff und Bindungsprotein lagert sich stabil mit Calcineurin zusammen. Dadurch wird die Serin-Threonin-Phosphataseaktivität dieses Ca²⁺-abhängigen Enzyms gehemmt. Dies hemmt die Calcineurin-abhängige Aktivität der Lymphokinexpression, Apoptose und Degranulierung (G. Wiederrecht et al. "The Mechanism of Action of FK-506 and Cyclosporin A "Ann. NY. Acad. Sci. 696: 9–19 (1993)).
Tacrolimus läßt sich intravenös über kurzzeitige oder kontinuierliche Infusion oder oral verabreichen. Wie andere Immunsuppressiva weist Tacrolimus ein Toxizitätsspektrum auf. Die mit der klinischen Verwendung dieses Arzneistoffs assoziierte Haupttoxizität ist die Nephrotoxizität. Darüber hinaus kann sich eine Neurotoxizität entwickeln, die mit Kopfschmerzen, Tremor, Schlaflosigkeit, Schmerzen oder anderen Symptomen verbunden ist. Zusätzlich kann sich eine durch Diarrhoe oder Übelkeit manifestierte gastrointestinale Toxizität ebenso wie eine durch Bluthochdruck manifestierte kardiovaskuläre Toxizität entwickeln.
Zudem kann sich eine Stoffwechseltoxizität entwickeln, wie sie durch die Entwicklung solcher Symptome wie etwa Hyperkalämie, Hypomagnesämie oder Hyperglykämie manifestiert wird. Darüber hinaus kann die Langzeitimmunsuppression mit Tacrolimus zu einem erhöhten Risiko aller Arten von Infektionen, und zwar nicht nur mit den üblichen bakteriellen, viralen und pilzlichen Krankheitserregern, sondern auch verschiedener ungewöhnlicher opportunistischer Infektionen, führen.
Zudem besteht ein mit der Verabreichung von Tacrolimus assoziiertes erhöhtes Risiko von Lymptomen und verwandten bösartigen Erkrankungen (M. L. Cleary & J. Sklar, "Lymphoproliferative Disorders in Cardiac Transplant Recipients are Multiclonal Lymphomas, "Lancet 2: 49–493 (1984); L. J. Swinnen et al., "Increased Incidence of Lymphoproliferative Disorder After Immunosuppression with a Monoclonal Antibody OKT3 in Cardiac-Transplant Recipients, "N. Engl. J. Med. 323: 1723–1728 (1990)). Dabei stehen wenigstens einige dieser bösartigen Erkrankungen im Zusammenhang mit beeinträchtigten Immunreaktionen gegen das Epstein-Barr-Virus (B. Z. Katz et al., "Latent and Replicating Forms of Epstein-Barr virus DNA and Lymphomas in Lymphoproliferative Diseases, "J. Infect. Dis., 160: 589–598 (1989)).
Die Stärke und das Spektrum der Toxizitäten von Tacrolimus erfordern empfindliche, reproduzierbare und zuverlässige Verfahren zur Überwachung der Blutkonzentration dieser Verbindungen nach Verabreichung an einen Patienten, wenn dieser sich einer Organtransplantation unterzieht. Dabei ist wichtig, daß derartige Verfahren empfindlich genug sind, um geringe Konzentrationen an Tacrolimus nachzuweisen. Von Wichtigkeit ist ebenso, daß solche Verfahren zuverlässig und reproduzierbar sind und daß dabei eine Störung durch Verbindungen, wie beispielsweise Tacrolimusmetabolite, vermieden wird.
Sowohl in der EP-A 293 892 und in Clinical Biochemistry, Bd. 31, 1998, S. 613–617 werden jeweils monoklonale und polyklonale Antikörper gegen Tacrolimus offenbart. Allerdings werden in diesen Literaturstellen keine monoklonalen Antikörper gegen Tacrolimus offenbart, die eine beschränkte Kreuzreaktivität gegen alle der folgenden Tacrolimusmetabolite aufweisen: 15-Demethyltacrolimus; 31-Demethyltacrolimus; 13,31-Didemethyltacrolimus; 15,31-Didemethyltacrolimus und 12-Hydroxytacrolimus.
Zwar existieren Antikörper gegen und Immuntests für Tacrolimus, wobei diese beispielsweise im US-Patent Nr. 5,532,137 an Niwa et al. beschrieben sind, doch besteht nach wie vor ein Bedarf an der Entwicklung verbesserter Antikörper und Immuntests, die spezifisch für Tacrolimus sind. Insbesondere besteht ein Bedarf an verbesserten monoklonalen Antikörpern gegen Tacrolimus, die sich bei der Entwicklung eines empfindlichen, zuverlässigen und reproduzierbaren Immuntests für Tacrolimus verwenden lassen.
Die Entwicklung eines Immuntests für Tacrolimus wird dadurch kompliziert, daß Tacrolimus eine Reihe von Metaboliten aufweist, die im Blut eines mit Tacrolimus behandelten Individuums angetroffen werden. An der Umwandlung von Tacrolimus zu diesen Metaboliten sind Demethylierung, Hydroxylierung und Ringbildung beteiligt. Dabei ist wichtig, daß Antikörper gegen Tacrolimus eine möglichst geringe Kreuzreaktivität mit diesen Derivaten aufweisen.
Es besteht daher ein Bedarf an der Entwicklung verbesserter monoklonaler Antikörper gegen Tacrolimus, die sich für Immuntests für Tacrolimus eignen und einen minimalen Grad an Kreuzreaktivität gegenüber Tacrolimusmetaboliten besitzen. Ebenso besteht ein Bedarf an verbesserten Immuntests, bei denen der derartige monoklonale Antikörper zum Nachweis und zur Bestimmung von Tacrolimus im Blut von Patienten, denen Tacrolimus verabreicht wurde, verwendet werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es stellte sich heraus, daß Tacrolimus sich, wenn es in der nichtbindenden Domäne derivatisiert ist, an einen hochmolekularen Träger, wie z. B. ein Protein, zur Immunisierung zur Produktion von Antikörpern koppeln läßt. Die erhaltenen antikörperproduzierenden Zellen können dann zur Erzeugung monoklonaler Antikörper über Zellfusion verwendet werden. Diese monoklonalen Antikörper weisen wünschenswerte Eigenschaften, einschließlich reduzierter Kreuzreaktivität und Tacrolimusmetaboliten, auf.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in einem monoklonalen Antikörper gegen Tacrolimus, bei dem es sich um einen monoklonalen Antikörper mit der Bezeichnung 1H6 handelt, der jeweils weniger als etwa 8% Kreuzreaktivität gegenüber 15-Demethyltacrolimus; 31-Demethyltacrolimus; 13,31-Didemethyltacrolimus; 15,31-Didemethyltacrolimus und 12-Hydroxytacrolimus aufweist.
Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich um einen monoklonalen Antikörper gegen Tacrolimus, der:

(1) mit dem monoklonalen IgG₁λ-Antikörper mit der Bezeichnung 1H6 mit in bezug auf Molarität mindestens 80% Effektivität im Vergleich zum monoklonalen IgG₁λ-Antikörper mit der Bezeichnung 1H6, wie mit Kompetitionstests gemessen, konkurriert und
(2) jeweils weniger als etwa 10% Kreuzreaktivität mit 15-Demethyltacrolimus, 31-Demethyltacrolimus, 13,31-Didemethyltacrolimus, 15,31-Didemethyltacrolimus und 12-Hydroxytacrolimus aufweist. Vorzugsweise konkurriert der monoklonale Antikörper gegen Tacrolimus mit in bezug auf Molarität mindestens etwa 90% Effektivität wie der monoklonale Antikörper mit der Bezeichnung 1H6 und weist jeweils weniger als etwa 8% Kreuzreaktivität mit 15-Demethyltacrolimus, 31-Demethyltacrolimus, 13,31-Didemethyltacrolimus, 15,31-Didemethyltacrolimus und 12-Hydroxytacrolimus auf.

Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich um eine Hybridomzelle, die den monoklonalen IgG₁λ-Antikörper gegen Tacrolimus mit der Bezeichnung 1H6, wie oben beschrieben, produziert.
Bei noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich um eine Hybridomzelle, die den monoklonalen Antikörper produziert, der:

(1) mit dem monoklonalen IgG₁λ-Antikörper mit der Bezeichnung 1H6 mit in bezug auf Molarität mindestens 80% Effektivität im Vergleich zum monoklonalen IgG₁λ-Antikörper mit der Bezeichnung 1H6, wie mit Kompetitionstests gemessen, konkurriert und
(2) jeweils weniger als etwa 10% Kreuzreaktivität mit 15-Demethyltacrolimus, 31-Demethyltacrolimus, 13,31-Didemethyltacrolimus, 15,31-Didemethyltacrolimus und 12-Hydroxytacrolimus aufweist.

Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich um einen monoklonalen Antikörper, der:

1) mit dem monoklonalen IgG₁λ-Antikörper mit der Bezeichnung 1H6 mit in bezug auf Molarität mindestens 80% Effektivität im Vergleich zum monoklonalen IgG₁λ-Antikörper mit der Bezeichnung 1H6, wie mit Kompetitionstests gemessen, konkurriert und
(2) jeweils weniger als etwa 10% Kreuzreaktivität mit 15-Demethyltacrolimus, 31-Demethyltacrolimus, 13,31-Didemethyltacrolimus, 15,31-Didemethyltacrolimus und 12-Hydroxytacrolimus aufweist, wobei wenigstens einige der konstanten Bereiche des Antikörpers durch menschliche konstante Bereiche ersetzt sind, so daß der monoklonale Antikörper humanisiert ist.

Bei noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich um einen rekombinanten Einketten-Antikörper (sFv) mit den darin enthaltenen variablen Bereichen eines Antikörpers gegen Tacrolimus, der:

Bei noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich um einen monoklonalen Antikörper gegen Tacrolimus, der durch Fusion von antikörperproduzierenden Zellen aus einem mit mit einer Carboxymethyloxim-Gruppierung an einem Kohlenstoffatom in der nichtbindenden Tacrolimusdomäne, die an ein Protein mit hohem Molekulargewicht konjugiert ist, derivatisiertem Tacrolimus immunisierten, antikörperproduzierenden Säuger mit einem geeigneten Fusionspartner produziert wird. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Kohlenstoffatom in der nichtbindenden Tacrolimusdomäne um Kohlenstoff 22. Bei dem Protein mit hohem Molekulargewicht handelt es sich vorzugsweise um Keyhole limpet-Hämocyanin.
Noch eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein monoklonaler Antikörper gegen Tacrolimus, bei dem es sich um einen monoklonalen IgG₁λ-Antikörper handelt, der eine Bindungsaffinität für Tacrolimus von etwa 3,7 × 10⁹ Liter/Mol aufweist, mit 13-Demethyltacrolimus kreuzreagiert und jeweils weniger als etwa 8% Kreuzreaktivität gegenüber den folgenden Tacrolimusmetaboliten aufweist: 15-Demethyltacrolimus; 31-Demethyltacrolimus; 13,31-Didemethyltacrolimus; 15,31-Didemethyltacrolimus und 12-Hydroxytacrolimus.
Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung handelt es sich um Antikörper, einschließlich polyklonaler Antikörper, die durch Immunisierung eines antikörperproduzierenden Säugers mit mit einer Carboxymethyloxim-Gruppierung an einem Kohlenstoffatom in der nichtbindenden Tacrolimusdomäne, die an ein Protein mit hohem Molekulargewicht konjugiert ist, derivatisiertem Tacrolimus produziert werden. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Kohlenstoffatom in der nichtbindenden Tacrolimusdomäne um Kohlenstoff 22. Bei dem Protein mit hohem Molekulargewicht handelt es sich vorzugsweise um Keyhole limpet-Hämocyanin.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Konjugat, umfassend einen direkt oder indirekt an eine nachweisbare Markierung konjugierten Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung. Dabei kann die nachweisbare Markierung aus der aus einer Enzymmarkierung, einer radioaktiven Markierung, einer Fluoreszenzmarkierung, einer Chemilumineszenzmarkierung, einer Biolumineszenzmarkierung und einer partikulären Markierung bestehenden Gruppe ausgewählt sein. Bei vielen Anwendungen handelt es sich bei der Markierung vorzugsweise um eine Enzymmarkierung.
Bei noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung von Tacrolimus, bei dem man in den folgenden Schritten:

(1) eine Probe bereitstellt, von der vermutet wird, daß sie Tacrolimus enthält,
(2) die Probe mit
(a) einem Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung und
(b) gegebenenfalls einem Tacrolimusanalogon reagieren läßt, wobei entweder der Antikörper oder das Tacrolimusanalogon mit einer ein nachweisbares Signal produzierenden Markierung markiert ist, und
(3) entweder
(a) das mit an Antikörper gebundenem Tacrolimus assoziierte Signal,
(b) das mit nicht an Antikörper gebundenem Tacrolimus assoziierte Signal oder
(c) das vorhandene Gesamtsignal

Typischerweise läßt man bei diesem Verfahren die Probe mit einem mit einer Enzymmarkierung markierten Tacrolimusanalogon reagieren und beobachtet oder mißt das vorhandene Gesamtsignal zum Nachweis oder zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Konzentration von Tacrolimus in der Probe.
Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung handelt es sich um einen Testkit, umfassend in in getrennten Behältern abgepackter Form:

(1) den Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung sowie
(2) ein direkt oder indirekt mit einer Enzymmarkierung markiertes Tacrolimusanalogon.

Bei noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein Tacrolimusderivat, umfassend Tacrolimus, das mit einer Carboxymethyloxim-Gruppierung an einem Kohlenstoffatom in der nichtbindenden Tacrolimusdomäne derivatisiert ist. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Kohlenstoffatom in der nichtbindenden Tacrolimusdomäne um Kohlenstoff 22.
Bei noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein Konjugat, umfassend ein wie oben beschriebenes Tacrolimusderivat, das an ein Protein mit hohem Molekulargewicht konjugiert ist. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Protein mit hohem Molekulargewicht um Keyhole limpet-Hämocyanin.
Bei noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein Verfahren zur Derivatisierung von Tacrolimus, bei dem man Tacrolimus mit Carboxymethoxylamin unter Erhalt eines Carboxymethyloximderivats von Tacrolimus reagieren läßt, wobei die Carboxymethyloxim-Gruppierung an Kohlenstoffatom 22 lokalisiert ist.
Bei noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein Verfahren zur Herstellung ein Konjugats von Tacrolimus mit einem Protein mit hohem Molekulargewicht, wobei man in dem Verfahren:

(1) Tacrolimus mit Carboxymethoxylamin unter Erhalt eines Carboxymethyloximderivats von Tacrolimus reagieren läßt, wobei die Carboxymethyloxim-Gruppierung an Kohlenstoffatom 22 lokalisiert ist.
(2) das Carboxymethyloxim unter Erhalt eines reaktiven N-Hydroxysuccinimidesters aktiviert und
(3) den N-Hydroxysuccinimidester mit dem Protein mit hohem Molekulargewicht unter Erhalt des Konjugats reagieren läßt.

Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein Tacrolimusderivat, umfassend Tacrolimus, das mit einer Carboxymethyloxim-Gruppierung am Kohlenstoffatom 22, das über einen Linker mit einer Biotingruppierung verknüpft ist, substituiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung weist der Linker die Struktur NH₂-CH₂-CH₂-NH-CO-(CH₂)₅-NH₂ auf, wobei eine Amingruppe des Linkers eine Amidbindung mit der Carboxylgruppe des Carboxymethyloxims und die andere Amingruppe des Linkers eine Amidbindung mit der Carboxylgruppe des Biotins ausbildet.
Bei noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein Verfahren zur Derivatisierung von Tacrolimus, bei dem man:

(1) Tacrolimus mit Carboxymethoxylamin unter Erhalt eines Carboxymethyloximderivats von Tacrolimus reagieren läßt, wobei die Carboxymethyloxim-Gruppierung an Kohlenstoffatom 22 lokalisiert ist.
(2) das Carboxymethyloxim unter Erhalt eines reaktiven N-Hydroxysuccinimidesters aktiviert und
(3) den N-Hydroxysuccinimidester mit der Carboxylgruppe von Biotin oder einem Biotinderivat oder -analogon umsetzt.

Bei noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein Tacrolimusderivat, umfassend Tacrolimus, das mit einer Bromacetyl-Gruppierung an einem Kohlenstoffatom in der nichtbindenden Tacrolimusdomäne derivatisiert ist. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Kohlenstoffatom in der nichtbindenden Domäne um das Kohlenstoffatom 22. Anschließend kann man diese Derivate mit einem Enzym oder einem anderen Protein unter Erhalt eines das an ein Protein, wie z. B. ein Enzym, konjugierte Derivat enthaltenden Konjugats reagieren lassen. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Protein um ein cysteinhaltiges Mutein von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase.
Dementsprechend handelt es sich bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung um ein Verfahren zur Derivatisierung von Tacrolimus, bei dem man:

(1) Tacrolimus mit Carboxymethoxylamin unter Erhalt eines Carboxymethyloximderivats von Tacrolimus reagieren läßt, wobei die Carboxymethyloxim-Gruppierung an Kohlenstoffatom 22 lokalisiert ist.
(2) das Carboxymethyloxim unter Erhalt eines reaktiven N-Hydroxysuccinimidesters aktiviert und
(3) den N-Hydroxysuccinimidester mit dem Trifluoressigsäuresalz von Bromoacetylethylendiamin unter Erhalt eines Bromoacetylderivats von Tacrolimus umsetzt.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Zum besseren Verständnis dieser und weiterer Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung wird auf die folgende Beschreibung, die anhängigen Ansprüche sowie beigefügten Zeichnungen verwiesen, wobei es sich bei:
1 um ein Massenspektrogramm des aus der Umsetzung von Carboxymethoxylamin mit dem Makrolidantibiotikum FK-520, das in seiner Struktur mit Tacrolimus eng verwandt ist, erhaltenen Produkts handelt;
2 um einen in stärkerer Auflösung mit Zentrum um den Hauptspitzenwert dargestellten Teil des Massenspektrogramms aus 1 handelt;
3 um ein Massenspektrogramm des aus der Umsetzung von Carboxymethoxylamin mit Tacrolimus erhaltenen Produkts handelt;
4 um einen in stärkerer Auflösung mit Zentrum um den Hauptspitzenwert dargestellten Teil des Massenspektrogramms aus 3 handelt;
5 um ein ¹H-NMR-Spektrum bei 250 MHz in CDCl₃ des aus der Umsetzung von Carboxymethoxylamin mit Tacrolimus erhaltenen Produkts handelt;
6 um ein ¹³C-NMR-Spektrum bei 250 MHz in CDCl₃ des aus der Umsetzung von Carboxymethoxylamin mit Tacrolimus erhaltenen Produkts handelt;
7 um ein als Referenz dargestelltes ¹³C-NMR-Spektrum von Tacrolimus bei 500 MHz in CDCl₃ handelt;
8 um ein Massenspektrogramm des aus der Umsetzung von LC-Biotin mit Tacrolimusmonooxim erhaltenen Produkts handelt;
9 um einen in stärkerer Auflösung mit Zentrum um den Hauptspitzenwert dargestellten Teil des Massenspektrogramms aus 8 handelt;
10 um ein ¹H-NMR-Spektrum bei 250 MHz in CDCl₃ des aus der Umsetzung von LC-Biotin mit Tacrolimusmonooxim erhaltenen Produkts handelt;
11 um eine Eichkurve eines homogenen Enzym-Immuntests von Tacrolimus unter Verwendung eines durch Immunisierung von Mäusen mit einem Konjugat von an Position 22 mit einem mit Keyhole limpet-Hämocyanin verknüpften Carboxymethyloxim derivatisierten Tacrolimus sowie Zellfusion der erhaltenen antikörperproduzierenden Zellen mit einem Fusionspartner produzierten monoklonalen Antikörpers handelt;
12 um eine grafische Auftragung handelt, die die Korrelation zwischen den Ergebnissen für den Tacrolimustest unter Verwendung eines homogenen Enzym-Immuntests mit dem monoklonalen Antikörper, dessen Eichkurve in 11 dargestellt ist, sowie den Ergebnissen für den Tacrolimustest unter Verwendung eines Verfahrens unter Einsatz von Gaschromatographie und Tandem-Massenspekroskopie (LC/MS/MS) zeigt;
13 um eine grafische Auftragung handelt, die die Korrelation zwischen den Ergebnissen für den Tacrolimustest unter Verwendung des homogenen Enzym-Immuntests und von LC/MS/MS an einer Gruppe von 70 Patienten mit geschädigter Leber, denen Tacrolimus verabreicht worden war, zeigt;
14 um eine grafische Auftragung handelt, die die Korrelation zwischen den Ergebnissen für den Tacrolimustest unter Verwendung des homogenen Enzym-Immuntests sowie eines im Handel erhältlichen Tacrolimus-Immuntests bei der Gruppe von 70 Patienten aus 13 zeigt;
15 um eine grafische Auftragung handelt, in der ein Bland-Altman-Differenzanalyse-Plot für die Ergebnisse aus 13–14 dargestellt ist; und
16 um eine Zeichnung der Strukturformel für Tacrolimus handelt, in der die Bezifferung des Moleküls dargestellt ist.
BESCHREIBUNG
Definitionen
Soweit nicht anders angegeben, besitzen die nachfolgend definierten Begriffe, wie sie hier verwendet werden, die folgenden Bedeutungen:
"Antikörper": Der Begriff "Antikörper", wie er hier verwendet wird, umfaßt sowohl vollständige Antikörpermoleküle der entsprechenden Spezifität und Antikörperfragmente (einschließlich Fab, F(ab'), Fv und F(ab')₂) als auch chemisch modifizierte vollständige Antikörpermoleküle bzw. Antikörperfragmente, einschließlich durch Zusammenlagerung von Untereinheiten in vitro konstruierten Hybrid-Antikörpern. Ebenso umfaßt sind Einketten-Antikörpermoleküle, die allgemein mit dem Begriff sFv bezeichnet werden, sowie humanisierte Antikörper, bei denen einige oder alle der ursprünglich nichtmenschlichen konstanten Bereiche durch ursprünglich aus menschlichen Antikörpersequenzen stammende konstante Bereiche ersetzt sind. Soweit nicht anders angegeben, sind sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper umfaßt; in einer Reihe von Zusammenhängen sind monoklonale Antikörper spezifisch aufgeführt. Zusätzlich umfaßt sind modifizierte Antikörper oder mit Markierungen oder anderen Molekülen, die die Bindungskapazität des Antikörpers weder blockieren noch verändern, konjugierte Antikörper.
"Nukleinsäuresequenz": Der Begriff "Nukleinsäuresequenz" umfaßt, soweit nicht anders angegeben, sowohl DNA als auch RNA und umfaßt sowohl doppelsträngige als auch einzelsträngige Nukleinsäuren, falls nicht anders angegeben. Ebenso umfaßt sind Hybride, wie z. B. DNA-RNA-Hybride. Dabei umfaßt die Bezugnahme auf DNA insbesondere RNA, die entweder die äquivalente Basensequenz mit Ausnahme der Substitution von Uracil in RNA gegen Thymin in DNA aufweist oder eine komplementäre Basensequenz mit Ausnahme der Substitution von Uracil gegen Thymin aufweist, wobei die Komplementarität gemäß den Watson-Crick-Basenpaarregeln bestimmt wird. Darüber hinaus umfaßt eine Bezugnahme auf eine Nukleinsäuresequenz deren Komplement gemäß den Watson-Crick-Basenpaarregeln, soweit nicht anders angegeben.
Auf der Grundlage der Verwendung von an einem Kohlenstoffatom in der nichtbindenden Domäne, vorzugsweise Kohlenstoff 22, derivatisierten Tacrolimus wurde von uns ein verbesserter monoklonaler Antikörper gegen Tacrolimus entwickelt. Dabei werden zunächst durch Immunisierung antikörperproduzierender Tiere mit diesem Immunogen produzierte polyklonale Antikörper hergestellt. Die erhaltenen antikörperproduzierenden Zellen werden dann für die Zellfusion mit einem geeigneten Fusionspartner unter Erhalt von Hybridomzellen verwendet. Die erhaltenen, von den Hybridomzellen produzierten monoklonalen Antikörper eignen sich insbesondere in Immuntests zum Nachweis von Tacrolimus.
I. TACROLIMUSDERIVATE
Dementsprechend betrifft ein Aspekt Tacrolimusderivate, die an einem Kohlenstoffatom in der nichtbindenden Tacrolimusdomäne derivatisiert sind. Dabei ist das Derivat vorzugsweise an der Kohlenstoff-22-Position derivatisiert. Bei einer besonders bevorzugten Klasse von Derivaten wird die Ketogruppe an Position 22 mit einem Amin unter Erhalt eines Oxims umgesetzt. Dabei ist als Amin Carboxymethoxylamin besonders bevorzugt. Bei der Umsetzung von Tacrolimus mit Carboxymethoxylamin erhält man ein Carboxymethyloxim.
Bei dieser Reaktion setzt man Tacrolimus mit Carboxymethoxylamin in Methanol in Gegenwart von Natriumacetat unter Erhalt des Oxims um. Dementsprechend handelt es sich bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung um ein verfahren zur Derivatisierung von Tacrolimus, bei dem man Tacrolimus mit Carboxymethoxylamin unter Erhalt eines Carboxymethyloximderivats von Tacrolimus reagieren läßt, wobei die Oximgruppierung an Kohlenstoff 22 lokalisiert ist. Weitere Einzelheiten zu dieser Reaktion sind in Beispiel 1 angegeben.
Dementsprechend betrifft ein weiterer Aspekt ein das Tacrolimusderivat umfassendes Konjugat, das mit einer Carboxymethyloxim-Gruppierung an Position 22 derivatisiertes Tacrolimus umfaßt, das über die Oximgruppierung an ein Protein mit hohem Molekulargewicht konjugiert ist. Dabei handelt es sich bei dem Protein mit hohem Molekulargewicht typischerweise um ein Protein, das einen geeigneten Träger für Haptene darstellt, wobei es sich, ohne jedoch unbedingt darauf beschränkt zu sein, um Proteine wie z. B. Rinderserumalbumin, Thyroglobulin, Ovalbumin, Fibrinogen oder Keyhole limpet-Hämocyanin handeln kann. Als Träger ist dabei Keyhole limpet-Hämocyanin besonders bevorzugt. Als Alternative kann es sich bei dem Protein mit hohem Molekulargewicht um ein Enzym handeln, wie beispielsweise ein Enzym zur Produktion eines nachweisbaren Signals, wie z. B. Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase oder alkalische Phosphatase. Solche Konjugate eignen sich insbesondere in Immuntests für Tacrolimus, wie unten erörtert.
Die Herstellung dieser Konjugate ist unten in Beispiel 2 ausführlicher angegeben. Im allgemeinen handelt es sich jedoch bei einem Verfahren zur Herstellung des Konjugats von Tacrolimus mit dem Protein mit hohem Molekulargewicht um folgendes: (1) Herstellung des Carboxymethyloxims von Tacrolimus, wie oben beschrieben; (2) Aktivierung des Carboxymethyloxims unter Erhalt eines reaktiven N-Hydroxysuccinimidesters und (3) Umsetzen des N-Hydroxysuccinimidesters mit dem Protein mit hohem Molekulargewicht unter Erhalt des Konjugats. Diese Umsetzung wird ausführlich in Beispiel 2 erörtert. Die Aktivierung des Carboxymethyloxims unter Erhalt eines reaktiven N-Hydroxysuccinimidesters wird typischerweise unter Verwendung eines Kupplungsmittels, wie beispielsweise eines wasserlöslichen Carbodiimids, ausgeführt. Ein bevorzugtes wasserlösliches Carbodiimid ist dabei -3-(3-Dimethylaminopropyl-1-ethyl-3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydrochlorid (EDAC). Andere wasserlösliche Carbodiimide sind im Fachgebiet bekannt und können ebenso verwendet werden.
Zusätzlich zur Bildung von Konjugaten mit Proteinen mit hohem Molekulargewicht, wie z. B. Keyhole limpet-Hämocyanin, umfaßt die vorliegende Erfindung auch Tacrolimusderivate, die mit einer über einen Linker mit einer Biotingruppierung verknüpften Carboxymethyloxim-Gruppierung an Kohlenstoff 22 substituiert sind. Dabei kann der Linker eine aus einer Reihe von Formen annehmen und unterschiedliche Längen aufweisen. Die Verwendung von Linkern zwischen Biotin und einem Hapten oder Antigen ist im Fachgebiet allgemein bekannt und braucht hier nicht weiter ausführlich beschrieben zu werden. In einem besonders bevorzugten Derivat weist der Linker die Struktur NH₂-CH₂-CH₂-NH-CO-(CH₂)₅-NH₂ auf. Dabei bildet eine der Amingruppen des Linkers eine Amidbindung mit der Carboxylgruppe des Carboxymethyloxims und die andere Amingruppe eine Amidbindung mit der Carboxylgruppe des Biotins aus.
Die Länge dieses Abstandhalters ("Spacer") läßt sich durch Einfügen oder Deletieren einer oder mehrerer CH₂ (Methylen)-Gruppen an den zwei Stellen im Abstandhalter, die zwei oder mehr Methylengruppen aufweisen, verändern.
Die Derivate können durch Umsetzen eines N-Hydroxysuccinimidesters, wie oben beschrieben, mit der Carboxylgruppe von Biotin oder eines Biotinderivats oder -analogons gebildet werden. Diese Umsetzung kann wie oben beschrieben durchgeführt werden.
Im allgemeinen umfaßt das Verfahren zur Bildung derartiger Biotinderivate:

(1) das Umsetzen von Tacrolimus mit Carboxymethoxylamin unter Erhalt eines Carboxymethyloximderivats von Tacrolimus, wobei das Carboxymethyloximderivat an Position 22 lokalisiert ist;
(2) das Aktivieren des Carboxymethyloxims unter Erhalt eines reaktiven N-Hydroxysuccinimidesters und
(3) das Umsetzen des N-Hydroxysuccinimidesters mit der Carboxylgruppe von Biotin oder eines Biotinderivats oder -analogons.

In einer bevorzugten Alternative, wie unten in Beispiel 3 erörtert, wird das Oxim mit EDAC und N-Hydroxysuccinimid in Dimethylformamid (DMF) umgesetzt. Anschließend wird das aktivierte Produkt mit dem den Linker enthaltenden Biotin, wie z. B. LC-Biotin, umgesetzt.
Bei noch einer weiteren Ausführungsform von Konjugaten von an einem Kohlenstoffatom in der nichtbindenden Tacrolimusdomäne, vorzugsweise Position 22, derivatisierten Tacrolimus handelt es sich um ein Bromacetylderivat. Die Herstellung von an Position 22 derivatisierten Bromacetylderivaten an Tacrolimus ist in Beispiel 4 beschrieben. Dabei umfaßt die Herstellung derartiger Derivate im allgemeinen:

(1) das Umsetzen von Tacrolimus mit Carboxymethoxylamin unter Erhalt eines Carboxymethyloximderivats von Tacrolimus, wobei das Carboxymethyloximderivat an Position 22 lokalisiert ist;
(2) das Aktivieren des Carboxymethyloxims unter Erhalt eines reaktiven N-Hydroxysuccinimidesters und
(3) das Umsetzen des N-Hydroxysuccinimidesters mit dem Trifluoressigsäuresalz von Bromacetylethylendiamin unter Erhalt eines Bromacetylderivats.

Das in diesem Verfahren verwendete Carboxymethyloximderivat wird wie oben beschrieben hergestellt.
Derartige Bromacetylderivate lassen sich zur Herstellung von Enzymkonjugaten von Tacrolimus verwenden, indem die Bromacetyl-Gruppiering mit einer Sulfhydrylgruppe eines Enzyms, wie beispielsweise einem Mutein von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, das einen Cysteinrest enthält, umgesetzt wird. Das Bromacetylderivat ist in der Lage, mit anderen Cysteingruppen in anderen Enzymen oder Proteinen unter Erhalt weiterer Enzym- oder Proteinkonjugate von Tacrolimus zu reagieren.
II. MONOKLONALE UND POLYKLONALE ANTIKÖRPER UND HYBRIDOMZELLEN
Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung handelt es sich um monoklonale Antikörper und diese produzierende Hybridomzellen ebenso wie um durch Immunisierung antikörperproduzierender Tiere mit Tacrolimusderivaten, wie oben beschrieben, produzierte polyklonale Antikörper.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform eines monoklonalen Antikörpers gegen die vorliegende Erfindung handelt es sich um einen monoklonalen Maus-Antikörper gegen Tacrolimus, bei dem es sich um einen monoklonalen IgG₁λ-Antikörpers mit der Bezeichnung 1H6 handelt. Dieser monoklonale Antikörper reagiert mit 13-Demethyltacrolimus, falls weist jedoch weniger als etwa 8% Kreuzreaktivität gegenüber den folgenden Tacrolimusmetaboliten auf: 15-Demethyltacrolimus; 31-Demethyltacrolimus; 13,31-Didemethyltacrolimus; 15,31-Didemethyltacrolimus und 12-Hydroxytacrolimus. Dieser monoklonale Antikörper weist eine geschätzte Bindungsaffinität zu Tacrolimus von 3,7 × 10⁹ Liter/mol auf.
Bei einem weiteren monoklonalen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung handelt es sich um einen monoklonalen Antikörper gegen Tacrolimus, der:

(1) mit dem monoklonalen IgG₁λ-Antikörper mit der Bezeichnung 1H6 mit in bezug auf Molarität mindestens 80% Effektivität im Vergleich zum monoklonalen IgG₁λ-Antikörper mit der Bezeichnung 1H6, wie mit Kompetitionstests gemessen, konkurriert und
(2) jeweils weniger als etwa 10% Kreuzreaktivität mit den folgenden Tacrolimusmetaboliten aufweist: 15-Demethyltacrolimus, 31-Demethyltacrolimus, 13,31-Didemethyltacrolimus, 15,31-Didemethyltacrolimus und 12-Hydroxytacrolimus.

Vorzugsweise konkurriert der monoklonale Antikörper mit in bezug auf Molarität mindestens etwa 90% Effektivität des monoklonalen Antikörpers mit der Bezeichnung 1H6 und weist jeweils weniger als etwa 8% Kreuzreaktivität mit diesen Tacrolimusmetaboliten auf.
Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung handelt es sich um eine Hybridomzelle, die einen wie oben beschriebenen monoklonalen Antikörper produziert. Dazu gehört eine Hybridomzelle, die den monoklonalen IgG₁λ-Antikörper gegen Tacrolimus mit der Bezeichnung 1H6 produziert. Ebenso gehört dazu eine Hybridomzelle, die einen wie oben beschriebenen monoklonalen Antikörper produziert, der mit in bezug auf Molarität mindestens etwa 80% Effektivität mit jenem Antikörper konkurriert und einen begrenzten Grad an Kreuzreaktivität mit Tacrolimusmetaboliten, wie oben beschrieben, aufweist.
Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich um humanisierte monoklonale Antikörper. Dabei ist es bei einigen Anwendungen bevorzugt, im Besitz humanisierter monoklonaler Antikörper zu sein, bei denen wenigstens einige der konstanten Bereiche des Antikörpers durch menschliche konstante Bereiche ersetzt sind, so daß der monoklonale Antikörper humanisiert ist. Typischerweise werden bei derartigen Verfahrensweisen die Komplementaritätsbestimmungsbereiche (complementarity-determining regions, CDRs) der Maus auf einen menschlichen Antikörper aufgepfropft. Dabei können zusätzliche Änderungen einzelner Aminosäuren innerhalb des Gerüsts notwendig sein, um die antigenbindende Stelle wiederherzustellen. Typischerweise wird bei dieser Technik die Amplifikation von cDNA für die schweren und leichten variablen Ketten der Maushybridomzelle unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) mit einer Teilmenge an synthetischen Oligonukleotidprimern mit einem niedrigen Niveau an Degeneriertheit durchgeführt. Falls eine Mutagenese erforderlich ist, so kann diese mit Standardverfahren ausgeführt werden. Typischerweise werden die variable Bereiche tragenden humanisiserten V-Gene in geeignete Expressionsvektoren kloniert und in Zellen, wie z. B. COS-Zellen oder CHO-K1-Zellen exprimiert. Weitere Mutationen können je nach Bedarf erzeugt werden. Die Herstellung derartiger humanisierter monoklonaler Antikörper ist im Fachgebiet allgemein bekannt und beispielsweise bei C. A. K. Borrebaeck, "Antibody Engineering," 2. Aufl. Oxford University Press, New York, (1995), hiermit durch Bezugnahme aufgenommen, beschrieben.
Daher handelt es sich bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung um einen rekombinanten Einketten-Antikörper (sFv) mit den darin enthaltenen variablen Bereichen eines Antikörpers gegen Tacrolimus, der:

Strategien zur Herstellung von sFv-Einketten-Antikörpern sind im Fachgebiet allgemein bekannt und beispielsweise bei C. A. K. Borrebaeck, "Antibody Engineering", supra, beschrieben. Im allgemeinen werden bei der Konstruktion eines sFV variable Bereiche der schweren und leichten Ketten manipuliert, die auf der Genebene durch eine Oligonukleotidsequenz von Codons für einen entsprechenden Peptidlinker verbunden sein müssen. Der Linker muß die V_H- und V_L-Domänen des gewählten Fv verbinden, ohne daß dabei Kontakte zwischen den Domänen oder die Faltung der Domänen gestört werden. Ein typischerweise verwendeter Linker ist ein Peptid aus 15 Resten, das aus drei sich wiederholenden Einheiten besteht, die jeweils vier Glycinreste und einen sich daran anschließenden Serinrest aufweisen (J. S. Huston et al., "Protein Engineering of Antibody Binding Sites: Recovery of Specific Activity in an Anti-Digoxin Single-Chain Fv Analog Produced in Escherichia coli, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879–5883 (1988)). Typischerweise werden derartige Einketten-Antikörper in Einschlußkörperchen in Bakterien produziert. Für die Aktivität müssen die exprimierten Polypeptide typischerweise aus den Einschlußkörperchen wieder gefaltet werden; Bedingungen zur Durchführung davon sind im allgemeinen gut bekannt.
Dementsprechend sind derartige Einketten-Antikörper bzw. sFv ebenso von der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Bei noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich um einen monoklonalen Antikörper gegen Tacrolimus, der durch Fusion von antikörperproduzierenden Zellen aus einem mit mit einer Carboxymethyloxim-Gruppierung an einem Kohlenstoffatom in der nichtbindenden Tacrolimusdomäne, die an ein Protein mit hohem Molekulargewicht konjugiert ist, derivatisiertem Tacrolimus immunisierten, antikörperproduzierenden Säuger mit einem geeigneten Fusionspartner produziert wird. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Kohlenstoffatom in der nichtbindenden Tacrolimusdomäne um Kohlenstoff 22. Wie oben angegeben, handelt es sich bei dem für die Immunisierung verwendeten Protein mit hohem Molekulargewicht typischerweise um Keyhole limpet-Hämocyanin.
Die Herstellung monoklonaler Antikörper ist im Fachgebiet allgemein bekannt und braucht hier nicht weiter beschrieben zu werden. Beispielsweise ist die Produktion monoklonaler Antikörper bei J. W. Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice" (2. Aufl. Academic Press, London, 1986) beschrieben.
Im allgemeinen besteht der erste Schritt des Verfahrens in der Herstellung polyklonaler Antikörper mit Standardtechniken, wie beispielsweise der Immunisierung eines antikörperproduzierenden Tiers, wie z. B. einer Maus, einer Ratte, einer Ziege, eines Schafs oder einer Kuh, mit dem Antigen. Dabei wird das Antigen typischerweise an einen hochmolekularen Träger, wie beispielsweise ein Protein mit hohem Molekulargewicht, wie oben erörtert, gekoppelt. Die Immunisierung kann mit einem oder ohne ein Adjuvans, wie beispielsweise komplettem Freundschem Adjuvans oder anderen Adjuvantien, wie z. B. Monophosphoryllipid A und synthetischem Trehalose-DicorynomycolatAdjuvans ausgeführt werden; dabei ist die Immunisierung mit einem Adjuvans allgemein bevorzugt. Der nächste Schritt besteht in der Isolierung von Milzzellen aus antikörperproduzierenden Tieren und der Fusion der antikörperproduzierenden Milzzellen mit einem entsprechenden Fusionspartner, typischerweise einer Myelomzelle, wie etwa durch Verwendung von Polyethylenglykol oder anderer Techniken. Typischerweise handelt es sich bei den verwendeten Myelomzellen um solche Zellen, die in Hypoxanthin-Thymidin (HT)-Medium normal wachsen, jedoch nicht im Hypoxanthin-aminopterin-thymidin (HAT)-Medium, wachsen können, wobei letzteres für die Reaktion der fusionierten Zellen verwendet wird. Der nächste Schritt besteht in der Selektion der fusionierten Zellen, wobei typischerweise in HAT-Medium selektioniert wird. Der nächste Schritt besteht im Screening der klonierten Hybride auf eine entsprechende Antikörperproduktion unter Verwendung von Immuntests, wie beispielsweise ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) oder anderen für das Screening geeigneten Immuntests. Diese Schritte sind ebenfalls im Fachgebiet allgemein bekannt und brauchen nicht weiter ausführlich beschrieben zu werden.
Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich um einen Antikörper gegen Tacrolimus, bei dem es sich um einen polyklonalen Antikörper handeln kann, der durch Immunisierung eines antikörperproduzierenden Säugers mit mit einer Carboxymethyloxim-Gruppierung an einem Kohlenstoffatom in der nichtbindenden Tacrolimusdomäne, die an ein Protein mit hohem Molekulargewicht, wie oben beschrieben, konjugiert ist, derivatisiertem Tacrolimus produziert wird. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Kohlenstoffatom in der nichtbindenden Tacrolimusdomäne um Kohlenstoff 22.
Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein Konjugat, umfassend einen wie oben beschriebenen Antikörper der vorliegenden Erfindung, der direkt oder indirekt an eine nachweisbare Markierung konjugiert ist. Dabei kann der Antikörper direkt an die nachweisbare Markierung konjugiert sein, so daß zwischen der Markierung und dem Antikörper eine kovalente Verknüpfung besteht. Derartige Verfahren sind im Fachgebiet allgemein bekannt, solche Techniken sind beispielsweise bei G. T. Hermanson, "Bioconjugate Techniques" (Academic Press, San Diego, 1996) beschrieben. Im allgemeinen werden bei solchen Techniken reaktive Gruppen auf dem Antikörper bzw. der Markierung verknüpft, und zwar typischerweise über einen Linker oder Abstandhalter. Die Länge des Linkers bzw. Abstandhalters läßt sich zur Aufrechterhaltung der Aktivität und Spezifität des Antikörpers sowie um sicherzustellen, daß die Markierung das nachweisbare Signal produziert, ohne dabei die Aktivität des Antikörpers zu stören, einstellen.
Derartige Markierungen sind im Fachgebiet allgemein bekannt und brauchen nicht ausführlich beschrieben zu werden. Zu solchen Markierungen lassen sich, ohne darauf beschränkt zu sein, eine Enzymmarkierung, eine radioaktive Markierung, eine Fluoreszenzmarkierung, eine Chemilumineszenzmarkierung, eine Biolumineszenzmarkierung oder eine partikuläre Markierung zählen.
Enzymmarkierungen sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Dabei handelt es sich bei dem verwendeten Enzym typischerweise um eines, das ein optisch nachweisbares Signal produziert, wie z. B. ein gefärbtes Produkt oder ein unlösliches Produkt. Zu den verwendbaren Enzymen zählen unter anderem Meerrettichperoxidase, β-Galactosidase, alkalische Phosphatase, Glucose-Oxidase, Urease, Catalase, Lysozym, Malat-Dehydrogenase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase und Ribonuklease A. Andere, für Immuntests verwendbare Enzyme sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
Zu den verwendbaren partikulären Markierungen zählen unter anderem Latex-Markierungen sowie kolloidale Metallmarkierungen, wie beispielsweise kolloidales Gold, Silber, Zinn und andere Metalle.
Im Fachgebiet sind viele verschiedene radioaktive, Fluoreszenz-, Chemilumineszenz- und Biolumineszenzmarkierungen bekannt. Diese Markierungen brauchen hier nicht weiter beschrieben zu werden.
Als Alternative zu einer direkten kovalenten Verknüpfung zwischen dem Antikörper und der Markierung kann die Verknüpfung indirekt, beispielsweise über eine Biotin-Avidin-Verknüpfung, erfolgen. Bei der Bindung von Biotin an Avidin oder dessen bakteriellem Analogon Streptavidin handelt es sich um einen im Fachgebiet allgemein verstandenen Vorgang. Dies Bindung ist hochspezifisch und weist eine extrem hohe Affinität auf. Typischerweise wird der Antikörper an eine Biotingruppierung konjugiert und die Markierung an Avidin oder Streptavidin gebunden. Andere Anordnungen können auch verwendet werden. Die Verwendung einer Avidin-Biotin-Verknüpfung ist beispielsweise bei G. T. Hermanson, supra, S. 570–592, beschrieben.
III. IMMUNTESTS
Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung handelt es sich um Immuntests für Tacrolimus unter Verwendung der oben beschriebenen Antikörper. Dabei handelt es sich bei einem derartigen Immuntest im allgemeinen um ein Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung von Tacrolimus. Der Begriff "Nachweis", wie er hier verwendet wird, bezieht sich dabei auf einen qualitativen Test, mit dem das Vorhandensein bzw. die Abwesenheit von Tacrolimus in einer Probe nachgewiesen wird, während sich der Begriff "Bestimmung" auf einen quantitativen bzw. halbquantitativen Test bezieht, bei dem die Tacrolimuskonzentration in der Probe bestimmt wird.
Im allgemeinen wird bei einem solchen Immuntestverfahren in den folgenden Schritten:

(1) eine Probe bereitstellt, von der vermutet wird, daß sie Tacrolimus enthält,
(2) die Probe mit
(a) einem Antikörper gegen Tacrolimus, wie oben beschrieben und
(b) gegebenenfalls einem Tacrolimusanalogon reagieren läßt, wobei entweder der Antikörper oder das Tacrolimusanalogon mit einer ein nachweisbares Signal produzierenden Markierung markiert ist, und
(3) entweder
(a) das mit an Antikörper gebundenem Tacrolimus assoziierte Signal,
(b) das mit nicht an Antikörper gebundenem Tacrolimus assoziierte Signal oder
(c) das vorhandene Gesamtsignal

Derartige Tests werden entweder als homogen oder heterogen beschrieben. Bei einem heterogenen Test wird der an Antigen gebundene Antikörper von nicht an Antigen gebundenen Antikörpern getrennt. Diese Trennung läßt sich mit einer Reihe von im Fachgebiet allgemein bekannten Schritten durchführen, wie beispielsweise differentieller Löslichkeit, Reaktivität mit einem anderen Antikörper oder anderen Eigenschaften. Solche Tests sind im Fachgebiet allgemein bekannt und brauchen hier nicht weiter ausführlich beschrieben zu werden. Ein heterogener Test wird durchgeführt, wenn entweder das mit an Antikörper gebundenem Tacrolimus assoziierte Signal oder das mit nicht an Antikörper gebundenem Tacrolimus assoziierte Signal nachgewiesen bzw. bestimmt werden soll. Im Gegensatz dazu wird in einem homogenen Test das vorhandene Gesamtsignal nachgewiesen bzw. bestimmt. Bei einem homogenen Test wird das Vorhandensein eines Antigen-Antikörper-Komplexes moduliert, so daß sich das Signalniveau verändert, ohne daß eine Trennung von an die Antikörper gebundenem Antigen von nicht an die Antikörper gebundenem Antigen erforderlich ist.
Zwar sind im Fachgebiet viele heterogene Immuntestformate allgemein bekannt, doch ist im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines homogenen Immuntestsystems allgemein bevorzugt. Ein bevorzugtes homogenes Immuntestsystem für den Tacrolimus-Immuntest unter Verwendung von Antikörpern gemäß der vorliegenden Erfindung ist beispielsweise das unter dem Namen EMIT bekannte homogene Testsystem, wie es bei D. D. Schottelius, "Homogeneous Immunoassay System (EMIT) for Quantitation of Antiepileptic Drugs in Biological Fluids "in Antiepileptic Drugs: Quantitative Analysis and Interpretation (C. E. Pippenger et al., Raven Press, New York, 1978, Kap. 10, S. 98–101 und ferner im US-Patent Nr. 3,817,837 an Rubenstein et al. beschrieben ist.
Im allgemeinen wird bei diesem Test ein Enzym, wie beispielsweise Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase an zu testenden Analyten (hier: Tacrolimus) in solch einer Weise konjugiert, daß dadurch die Aktivität des Enzyms nicht signifikant verändert wird. Wenn allerdings dieses Analyt-Enzym-Konjugat an den Antikörper für den Analyten gebunden wird, so liegt eine solche Konfiguration vor, daß das aktive Zentrum des Enzyms blockiert und das Substrat somit ausgeschlossen wird. Dies führt zu einer verringerten Enzymaktivität. Ist der Komplex nicht gebunden, so steht das aktive Zentrum zur Wechselwirkung mit dem Substrat zur Verfügung. Liegt in der unbekannten Probe freier Analyt vor, so bindet der freie Analyt in diesem Fall an den Antikörper. Dadurch wird die Bindung des Analyt-Enzym-Konjugats verhindert und die Antikörper-induzierte Aktivierung der Enzymaktivität im Verhältnis zur Analytkonzentration in der Probe reduziert. Somit gilt bei einem derartigen homogenen Test, daß das durch die Enzymmarkierung produzierte Signal um so größer ist, je größer die Analytkonzentration in der Probe ist. Hier handelt es sich um einen wie oben beschriebenen homogenen Test.
IV. TESTKITS
Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung handelt es sich um einen Testkit, insbesondere zur Verwendung in dem oben beschriebenen EMIT-Immuntest.
Ein solcher Testkit umfaßt in in getrennten Behältern abgepackter Form:

(1) einen wie oben beschriebenen Antikörper und
(2) ein direkt oder indirekt mit einer Enzymmarkierung markiertes Tacrolimusanalogon.

Das Tacrolimusanalogon kann entweder direkt oder indirekt markiert werden; dabei ist es allgemein bevorzugt, daß das Tacrolimusanalogon indirekt mit einem biotinierten Tacrolimusmolekül und einem mit Streptavidin versehenen Enzym markiert wird. Das Tacrolimus kann jedoch am Kohlenstoff 22 mit einem zur Verwendung im EMIT-Test, wie oben beschrieben, geeigneten Enzym gekoppelt werden.
Testkits können auch in getrennt abgepackten Behältern weitere Bestandteile, wie beispielsweise Substrate, Puffer, Stabilisatoren, Coenzyme sowie andere für die Durchführung des Immuntests benötigte Bestandteile enthalten.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht. Dabei dienen die Beispiele lediglich der Veranschaulichung und sollen keine Beschränkung der Erfindung darstellen.
BEISPIELE
Beispiel 1
Herstellung von an Kohlenstoff 22 substituierten Tacrolimusderivaten
Zur Bestimmung der Durchführbarkeit der Derivatisierung von Tacrolimus an Kohlenstoff 22 wurde die Derivatisierung des eng verwandten Moleküls FK-520 als Modell für dieses Molekül durchgeführt. FK-520 weist die gleiche Struktur wie Tacrolimus auf, mit Ausnahme davon, daß es anstatt einer Allylgruppe an Kohlenstoff 21 eine Ethylgruppe aufweist.
Für diese Experimente wurden Reagentien und Lösungsmittel in der im Handel üblichen Qualität wie geliefert, d. h. ohne weitere Aufreinigung, verwendet. Die Reaktion mit FK-520 wurde im kleinen Maßstab (0,9 mg) wie folgt durchgeführt: eine Lösung von FK-520 (0,9 mg, 1,1 μmol) in 0,23 ml Methanol wurde mit Natriumacetat (1,5 mg, 18,3 μmol, 16 Äquiv.) sowie Carboxymethoxylamin-Hydrochlorid (3,0 mg, 13,7 μmol, 12 Äquiv.) versetzt. Der Ansatz wurde drei Stunden bei Raumtemperatur unter Argon gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel mit einem Argonstrom abgezogen. Eine Dünnschichtchromatographie des Rückstands in 5:6:1,1:0,5% (CH₂Cl₂/EtOAc/MeOH/HOAc) auf Analtech-Platten (gerillt, 10 × 20 cm, 250 Mikrometer) ergab zwei geometrische Isomere von FK-520-Monooximen, und war genug für die Analyse mittels Massenspektroskopie mit schnellem Atomgeschoß. Bei der LSIMS von C₄₅H₇₂N₂O₁₄ würde man als Ergebnis einen [M-H]^–-Wert von 863,3 erwarten. Die relevanten Teile der Ergebnisse der Massenspektroskopie sind in 1 und 2 dargestellt. Bei 2 handelt es sich um einen Teil des in 1 gezeigten Spektrums, der um den zentralen Spitzenwert herum vergrößert dargestellt ist.
Anschließend wurde eine analoge Vorgehensweise zur Herstellung des Tacrolimus-Monooxims verwendet. Dabei wurde Tacrolimus als Feststoffgemisch in einer Kapsel mit 1,02 mg Tacrolimus-Monohydrat und einem ungefähr sechsfachen Überschuß an Natriumdodecylsulfat (SDS) bereitgestellt. Die Feststoffgemische aus 30 Kapseln wurden zusammengegeben und viermal mit jeweils 12 ml Essigester extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden im Vakuum eingeengt, so daß 49 mg Tacrolimus im Rohzustand erhalten wurden, die dann direkt in der folgenden Reaktion eingesetzt wurden.
49 mg rohes Tacrolimus (theoretisch 36,5 μmol) in 3,5 ml Methanol wurden mit Natriumacetat (16,7 mg, 204 μmol, 5,6 Äquiv.) sowie Carboxymethoxylamin-Hydrochlorid (40 mg, 183 μmol, 5 Äquiv.) versetzt. Der Ansatz wurde zwölf Stunden unter Argon bei Raumtemperatur gerührt. Lösungsmittel und flüchtige Materialien wurden bei vermindertem Druck unter Erhalt eines rohen Feststoffrückstandes abgetrennt. Die präparative Dünnschichtchromatographie des Rohprodukts auf vorbeschichteten Kieselgelplatten von Analtech (20 × 20 cm, 1000 Mikrometer) mit 30:70:11:0,6 (CH₂CL₂/EtOAc/MeOH/HOAc) ergab geometrische Isomere von Tacrolimus-Monooxim in Form eines weißen Feststoffs. Bei der LSIMS an C₄₆H₇₂N₂O₁₄ wurde als Ergebnis für [M + Na]⁺ ein Wert von 899,4 sowie für [N + K]⁺ ein Wert von 915,4 erwartet. Die Ergebnisse sind in 3 und 4 dargestellt. Dabei sind die Daten aus 3 in 4 mit einer höheren Auflösung mit Zentrum um den relevanten Teil des Spektrums dargestellt.
¹H-NMR (250 MHz, in CDCl₃) des Produkts der Reaktion von Carboxymethoxylamin-Hydrochlorid mit Tacrolimus ist in 5 dargestellt. ¹³C-NMR (250 MHz, in CDCl₃ des Produkts der Reaktion von Carboxymethoxylamin-Hydrochlorid mit Tacrolimus ist in 6 dargestellt. In 7 ist das ¹³C-NMR-Spektrum (500 MHz in CDCl₃) von Tacrolimus als Referenz (d. h. nichtderivatisiertes Tacrolimus) dargestellt. Alle NMR-Spektren wurden an Bruker-Instrumenten aufgenommen.
Beispiel 2
Herstellung von Tacrolimus-Keyhole limpet-Hämocyanin-Konjugat
Eine Lösung von Tacrolimus-Monooxim (32,3 mg, 36,8 μmol) in 1,05 ml wasserfreiem Dimethylformamid wurde mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydrochlorid (EDAC) (11 mg, 57,4 μmol, 1,5 Äquiv.) sowie N-Hydroxysuccinimid (7,3 mg, 63,4 μmol, 1,7 Äquiv.) versetzt. Der Ansatz wurde eine Stunde unter Argon bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Gemisch über eine Spritze zu einer Lösung von Keyhole limpet-Hämocyanin (74 mg, 54% rein) in 5,0 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (0,1 M, pH 8,0) und 0,25 ml Dimethylformamid zugetropft. Nach zweistündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die erhaltene Suspension gegen (1 × 4 l, 4°C, 2 h) dialysiert (10 mM, pH 7,0).
Anschließend wurde das erhaltene Gemisch 3 × mit CH₂Cl₂ zur Abtrennung eventuell vorhandener Spuren an nichtumgesetztem Tacrolimus-Monooxim extrahiert. Die quantitative Analyse des Gemisches wurde unter Verwendung von Bicinchoninsäure (BCA)-Proteintestlösung ausgeführt, so daß 50 mg Immunogen in 8 ml of PBS (10 mM, pH 7,0) erhalten wurden.
Die Bestimmung der Haptenzahl unter Verwendung des TNBS-Verfahrens (A. F. S. A. Habeeb, Anal. Biochem. 14: 328 (1966)) ergab eine Haptenzahl von 1300. Das Immunogen wurde sofort unter Verwendung eines Trockeneis-Acetonbads eingefroren und zur Lagerung bei –20°C aufbewahrt.
Beispiel 3
Herstellung von Tacrolimus-Biotin-Konjugat
Eine Lösung von Tacrolimus-Monooxim (12 mg, 13,7 μmol) in 0,3 ml wasserfreiem Dimethylformamid wurde mit EDAC (4 mg, 20,9 μmol, 1,5 Äquiv.) sowie N-Hydroxysuccinimid (2,7 mg, 23,4 μmol, 1,7 Äquiv.) versetzt. Der Ansatz wurde 1 h unter Argon bei Raumtemperatur gerührt und dann mit Triethylamin (10 μl, 75 μmol) sowie einer Lösung von LC-Biotin (10 mg, 25 μmol, 2 Äquiv.) in 1,0 ml DMF versetzt. Anschließend wurde nochmals drei Stunden gerührt und das Gemisch dann im Hochvakuum eingeengt, so daß ein farbloser Rückstand erhalten wurde. Die präparative Umkehrphasen-Dünnschichtchromatographie (PTLC) des Rohprodukts auf einer C-18-Platte der Firma Whatman (PKLCO₁₈F, 20 × 20 cm, 1000 Mikrometer) (13:7 MeOH/H₂O) ergab 8 mg des Produkts in Form eines weißen Feststoffs. Als Ergebnis der LSIMS von C₆₄H₁₀₃N₇O₁₆S wird ein Wert von 1258,5 für [M + H]⁺ erwartet. Die Ergebnisse der Massenspektroskopie sind in 8 und 9 dargestellt. Dabei ist in 9 ein Abschnitt des Spektrums aus 8 mit höherer Auflösung um den interessierenden Bereich herum dargestellt. ¹H-NMR wurde bei 350 MHz in CDCl₃ durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 10 dargestellt.
Hier handelt es sich um ein Beispiel der Derivatisierung von Tacrolimus an Position 22.
Beispiel 4
Herstellung eines Bromacetylderivats von Tacrolimus
Bei einem weiteren an Position 22 derivatisierten Tacrolimusderivat handelt es sich um ein Bromacetylderivat. Das Bromacetylderivat ist in der Lage, mit einem Sulfhydrylrest eines Enzyms oder eines anderen Proteins unter Erhalt eines Tacrolimus-Enzym-Konjugats zu reagieren.
Zur Bildung des Bromacetylderivats von Tacrolimus wird zunächst eine Lösung von Bromessigsäuresuccinimidylester (740 mg, 3,14 mmol) in 6 ml Tetrahydrofuran (THF) bei 4°C unter Argon durch Zutropfen über eine Spritze mit reinem Mono-N-BOC-Ethylendiamin versetzt. Nach beendeter Zugabe wurde der Ansatz auf Raumtemperatur erwärmt und drei Stunden gerührt. Anschließend wurde die Reaktionslösung im Vakuum konzentriert und der Rückstand in Essigester gelöst. Die Essigesterschicht wurde einmal mit H₂O, zweimal mit gesättigtem wäßrigen NaHCO₃ und einmal mit Kochsalzlösung gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und unter Erhalt von 440 mg eines rohen weißen Feststoffs zur Trockne eingeengt. Die Reinigung an Kieselgel mittels Chromatotron (1:19 MeOH/CH₂Cl₂) ergab 386 mg reines Bromoacetyl-ethylendiamin-mono-t-BOC in Form eines weißen Feststoffs.
Eine Lösung von Bromacetylethylendiamin-mono-t-BOC (50 mg, 0,178 mmol) in 2 ml CH₂Cl₂ bei Raumtemperatur wurde durch Zutropfen über eine Spritze mit reiner Trifluoressigsäure (TFA) (0,29 ml, 3,76 mmol) versetzt. Der Ansatz wurde 3 h gerührt und anschließend im Vakuum eingeengt. Spuren an TFA wurden azeotropisch mit Toluol abgetrennt, und das erhaltene gelbe ölige Produkt, das TFA-Salz von Bromacetylethylendiamin, wurde im nächsten Reaktionsschritt direkt eingesetzt.
Eine Lösung des Carboxymethyloximderivats von Tacrolimus (derivatisiert an Position 22) (100 mg, 0,14 mmol) sowie N-Hydroxysuccinimid (NHS) (19 mg, 0,165 mmol) in 2 ml THF unter Argon wurde über eine Spritze mit reinem Diisopropylcarbodiimid (DIC) (23 μl, 0,147 mmol) versetzt. Der Ansatz wurde 3 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend über eine Spritze in eine Lösung des TFA-Salzes von Bromacetylethylendiamin (0,178 mmol) in 3 ml THF eingetragen. Diese Reaktionslösung wurde dann mit reinem Diisopropylethylamin (DIEA) (40 μl), 0,23 mmol) versetzt. Anschließend wurde noch 2,5 h gerührt, und der Ansatz im Vakuum unter Erhalt eines rohen Öls eingeengt. Die Reinigung auf präparativer Dünnschichtchromatographie (TLC) (7:3:1 EtOAc/CH₂Cl₂/MeOH) ergab 44 mg (37%) von Bromacetyltacrolimus in Form eines farblosen Feststoffs.
Beispiel 5
Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen Tacrolimus
Die Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen Tacrolimus wurde wie folgt durchgeführt. Bei dem Immunogen handelt es sich um das Tacrolimuskonjugat mit Keyhole limpet-Hämocyanin aus Beispiel 2. Dieses Immunogen wurde zur Immunisierung von Balb/c-Mäusen verwendet. Die erste Immunisierung erfolgte intraperitoneal mit 25 μg in einem Volumen von 200 μl mit Monophosphoryllipid A und synthetischen Trehalose-Dicorynomycolat-Adjuvans (RIBI MPL + TDM Emulsion, RIBI ImmunoChem Research Inc.). Fünf Wochen später wurde eine Auffrischimmunisierung mit 25 μg des Immunogens in 200 μl Monophosphoryllipid A und synthetischen Trehalose-Dicorynomycolat-Adjuvans intraperitoneal gegeben. Anschließend wurde nach weiteren acht Wochen eine Präfusionsauffrischung mit den 25 μg des Immunogens in 200 μl Hanks' Balanced Salt Solution intravenös und intraperitoneal gegeben.
Drei Tage später wurde die Fusion mit Standardverfahren unter Verwendung einer nichtsezernierenden Maus-Myelomzelle mit der Bezeichnung P3x63-AG8.653 durchgeführt.
Die Klonierung erfolgte nach Standardverfahren.
Die Klone wurden einem Screening mit den folgenden reversen ELISA-Immuntestverfahren gemäß der folgenden Vorschrift unterzogen. Platten wurden mit jeweils 100 μl pro Vertiefung polyklonalem Ziege-anti-Maus-IgG (IgG + IgA + IgM) (Zymed) (5 μg/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung) beschichtet. Die Beschichtung der Platten erfolgte über einen Zeitraum von zwei Stunden oder länger bei Raumtemperatur oder über Nacht bei etwa 4°C; die Platten konnten mehrere Tage bei etwa 4°C in Folie eingepackt aufbewahrt werden. Anschließend wurden die Platten durch abschütteln getrocknet und mit 300 μl Blockierungspuffer-Verdünnungsmittel (0,5% Rinderserumalbumin, 0,05% Tween 20 in PBS) pro Vertiefung blockiert. Die Blockierung der Platten erfolgte durch Inkubation über einen Zeitraum von 15 Minuten oder länger bei Raumtemperatur, wobei die Platten geschüttelt wurden. Anschließend wurden die Platten durch Abschütteln getrocknet. Danach wurde der dem Screening zu unterziehende monoklonale Antikörper in jede Vertiefung wie folgt gegeben: 50 μl Blockierungspuffer-Verdünnungsmittel pro Vertiefung wurde zusammen mit 50 μl des von der entsprechenden Vertiefung in der Fusionswachstumsplatte übertragenen Kulturüberstands pro Vertiefung zugegeben. Die Inkubation erfolgte über eine Stunde bei Raumtemperatur, wobei die Platten geschüttelt wurden. Anschließend wurde die Platte mit dem Plattenwaschgerät Titerteck Plus mit S20-Ablage ("Stacker") gewaschen, wobei als Waschpuffer PBS mit 0,05% Tween 20 verwendet wurde. Anschließend wurden die Vertiefungen jeweils mit 100 μl eines in Blockierungspuffer-Verdünnungsmittel auf 1:4000 verdünnten Enzymkonjugats von kovalent an Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase gekoppeltem Tacrolimus versetzt. Die Inkubation erfolgte über einen Zeitraum von etwa einer Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln. Anschließend wurde die Platte gewaschen und eine chromogene Lösung in einem Volumen von 100 μl pro Vertiefung zugegeben. Die chromogene Lösung enthielt 0,593 mM p-Iodnitrotetrazoliumviolett, 0,02 M NAD, 0,033 M Glucose-6-phosphat, 0,055 M Tris, 0,02% Natriumazid sowie eine 1:4000-Verdünnung von Diaphorase (Lipoyl-Dehydrogenase) (Sigma, St. Louis, MO). BSA war in einer Konzentration von 1% (Vol/Vol) einer 5% (Gew/Vol) BSA-Lösung vorhanden. BSA diente als Hilfe zur Verhinderung eines schnellen Ausfällens von reduziertem p-Iodnitrotetrazoliumviolett.
Aus dem Screening wurde eine einen geeigneten monoklonalen Antikörper produzierende Hybridomzelle ausgewählt. Dieser Antikörper wird mit 1H6 bezeichnet und ist ein IgG₁λ-Antikörper. Dieser Antikörper weist eine Bindungsaffinität für Tacrolimus von etwa 3,7 × 10⁹ Liter/Mol auf, die mit 13-Demethyltacrolimus kreuzreagiert und jeweils weniger als etwa 8% Kreuzreaktivität gegenüber den folgenden Tacrolimusmetaboliten aufweist: 15-Demethyltacrolimus; 31-Demethyltacrolimus; 13,31-Didemethyltacrolimus; 15,31-Didemethyltacrolimus und 12-Hydroxytacrolimus.
Beispiel 6
Vergleich des monoklonalen Antikörpers aus Beispiel 4 mit anderen Antikörpern hinsichtlich der Kreuzreaktivität mit Tacrolimusmetaboliten
Der Antikörper aus Beispiel 5, ein weiterer aus der Klonierung hervorgegangener Antikörper mit der Bezeichnung 14H04 sowie andere Antikörper wurden auf die Kreuzreaktivität von Tacrolimusmetaboliten (13-Demethyltacrolimus 15-Demethyltacrolimus; 31-Demethyltacrolimus; 13,31-Didemethyltacrolimus; 15,31-Didemethyltacrolimus und 12-Hydroxytacrolimus) getestet. Alle diese Metabolite wurden mit Ausnahme von 12-Hydroxytacrolimus in verschiedenen Konzentrationen in Hämolysat mit 10 ng/ml Tacrolimus getestet; 12-Hydroxytacrolimus wurde bei 10 ng/ml getestet, wobei in der Probe kein Tacrolimus vorlag. Bei diesen Tests wurden methanolische Extrakte verwendet. Die für diese Tests erzeugte Standardkurve wurde unter Verwendung von MORE-Immunosuppressiva-Kontrollen, Stufe 1–4, einer Standardkontrolle für diese Tests (More Diagnostics, Los Osos, Kalifornien), verifiziert.
Alle Antikörper zeigten einen unterschiedlichen Grad an Kreuzreaktivität gegenüber 13-Demethyltacrolimus. Die Kreuzreaktivität wurde mit der folgenden Formel berechnet: (Kreuzreaktionswert in ng/ml) – Lösungsmittelkontrollwert (ng/ml) × 100)/mit Metabolit versetztes Ziel (ng/ml) = % Kreuzreaktivität.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Mit Ausnahme von 13-Demethyltacrolimus wies der 1H6-Antikörper aus Beispiel 5 weniger als 8% Kreuzreaktivität mit den anderen getesteten Analyten auf.
TABELLE 1 KREUZREAKTIVIVITÄT VON ANTIKÖRPERN MIT TACROLIMUSMETABOLITEN
Beispiel 7
Homogener Immuntest mit monoklonalem Antikörper gegen Tacrolimus
Ein homogener Immuntest auf Tacrolimus auf Grundlage des EMIT-Verfahrens wurde gemäß der folgenden Vorschrift durchgeführt. Ein Volumen (200 μl) Probe bzw. Eichstandard wurde in ein Mikrozentrifugenröhrchen pipettiert. In das gleiche Röhrchen wurden 50 μl 300 mM CuSO₄ zusammen mit 200 μl Methanol pipettiert. Der Ansatz wurde verschlossen und zehn Sekunden verwirbelt sowie fünf Minuten bei 20 800 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein Probengefäß des Analysegeräts Roche Cobas Mira nach Standardparametern für dieses Analysegerät abgegossen. Die folgenden Reagentien wurden in das Reagentiengestell des Analysegeräts gestellt: "Reagent A" enthielt NaCl, Na₂EDTA, monoklonalen Anti-Tacrolimus-Antikörper (1H6), Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD), Glucose-6-phosphat, Detergens (Pluronic 25R2), Natriumazid sowie n-Methylisothiazolon bei pH 5,5. Bei "Reagent B" handelte es sich um Tris, pH 8,2, mit Na₂EDTA, Detergens (Pluronic 25R2), Natriumazid und n-Methylisothiazolon. Bei "Reagent C" handelte es sich um Tacrolimus-glucose-6-phosphat-Dehydrogenase-Konjugat bei pH 7,0 in Na₂HPO₄, Na₂EDTA, Rinderserumalbumin, Detergens (Pluronic 25R2) und Natriumazid. Die Probe sowie die Reagentiengestelle werden in das Analysegerät geladen und der Lauf gemäß den voreingestellten Parametern gestartet. Die Enzymgeschwindigkeiten werden während des Laufs als milli-od/min ausgedruckt. Die Eichkurven sind in 11 für 1H6 und einen weiteren monoklonalen Antikörper mit der Bezeichnung 14H04 dargestellt.
Beispiel 8
Korrelation zwischen dem Test auf Tacrolimus unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung und dem EMIT-Test mit dem LC-MS/MS-Verfahren
Eine Probenreihe aus 70 Patienten, denen Tacrolimus verabreicht worden war, wurde mit dem homogenen EMIT-Immuntest unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 1H6 der vorliegenden Erfindung im Vergleich mit dem LC/MS/MS-Verfahren getestet. Bei dem LC/MS/MS-Verfahren handelt es sich um ein Testverfahren für Tacrolimus, bei dem Flüssigkeitschromatographie mit anschließender Tandem-Massenspektroshpie eingesetzt wird (P. J. Taylor et al.,"Sensitive, Specific Quantitative Analysis of Tacrolimus (FK506) in Blood by Liquid Chromatography-Electrospray Tandem Mass Spectrometry," Clin. Chem. 42: 279–285 (1996)). Die Ergebnisse sind in 12 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen eine sehr hohe Korrelation mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,929.
Beispiel 9
Vergleich der Ergebnisse unter Verwendung des homogenen EMIT-Immuntests und LC/MS/MS mit Präparaten aus Patienten mit Leberfehlfunktion
Obwohl der monoklonale Antikörper 1H6 eine weitgehend minimierte Kreuzreaktivität zu Tacrolimusmetaboliten mit Ausnahme von 13-Demethyltacrolimus aufweist, verbleibt eine gewisse Kreuzreaktivität mit 13-Demethyltacrolimus. Um zu bestimmen, ob die Kreuzreaktivität mit 13-Demethyltacrolimus die Verwendung dieses Antikörpers in einem Immuntest stören würde oder nicht, wurde eine Liste von Präparaten aus 70 Patienten, die an schwerer Leberfehlfunktion litten und auf eine Transplantation warteten, während sie mit Tacrolimus behandelt wurden, mit dem EMIT-Immuntest unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 1H6, mit dem LC/MS/MS-Verfahren sowie mit einem anderen im Handel erhältlichen Immuntest auf Tacrolimus, dem von der Firma Abbott hergestellten IMx-Immuntest, getestet. Solche Proben enthalten typischerweise höhere Spiegel an Tacrolimusmetaboliten als solche aus Patienten, bei denen eine Organtransplantation durchgeführt wurde, die jedoch eine normale Leberfunktion aufweisen. Die Tacrolimusspiegel der Liste von Proben wurde unter Verwendung dieser drei Tests gemessen.
Die Ergebnisse sind in 13 für den Vergleich zwischen dem EMIT-Test und dem LC/MS/MS-Test sowie in
14 für den Vergleich zwischen dem EMIT-Test und dem IMx-Test (Abbott) dargestellt. Zur Interpretation der Ergebnisse wurde eine Regressionsanalyse nach Deming verwendet; die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Bezogen auf die Steigerung der Ergebnisse (siehe Tabelle 2) stimmte der EMIT-Test mit dem monoklonalen Antikörper 1H6 besser mit LC/MS/MS als mit dem Abbott-IMx-Test überein, wobei die Steigerung bei EMIT 1,11 und bei IMx 1,45 betrug. Die durchschnittliche Konzentration der 70 Proben betrug 6,79 ng/ml mit MC/MS/MS, 6,96 ng mit EMIT unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 1H6 sowie 7,93 ng/ml mit Abbott-IMx. Lediglich im IMx-Test lagen zwei Proben oberhalb des Bereichs. Die Bland-Altman-Analyse der 70 Ergebnisse ist in 15 für EMIT mit monoklonalem Antikörper 1H6 und Abbott-IMx gegen LC/MS/MS dargestellt. Diese graphischen Auftragungen zeigen, daß bei Proben um 10 ng/ml allgemein eine erkennbare Variabilität der Ergebnisse gegenüber LC/MS/MS auftritt. Das Unterschiedsmuster bei LC/MS/MS mit Immuntest war ähnlich beim EMIT-Test unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 1H6 und dem Abbott-IMx-Test.
Tabelle 2 Korrelation zwischen Ergebnissen der Tacrolimus-Tests bei Patienten mit Leberschädigung
Selbst bei denjenigen Patienten, die hohe Spiegel an Tacrolimusmetaboliten aufwiesen, zeigte der Test unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 1H6 in einem homogenen EMIT-Immuntest einen relativ zu anderen Verfahren hohen Grad an Korrelation. Daher dürfte sich eine Leberfehlfunktion nicht stark auf diesen Test mit diesem Antikörper auswirken, und die Ergebnisse implizieren, daß sich die klinische Behandlung von Patienten mittels Immuntest in ähnlicher Weise unter Verwendung des EMIT-Immuntests mit dem monoklonalen Antikörper 1H6 oder des bereits zur Verfügung stehenden Abbott-IMx-Immuntests für Tacrolimus bewerkstelligen läßt. Damit wird die klinische Fähigkeit des monoklonalen Antikörpers 1H6 gezeigt.
VORTEILE DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Durch die vorliegende Erfindung wird ein monoklonaler Antikörper gegen Tacrolimus bereitgestellt, der die Kreuzreaktivität mit Tacrolimusmetaboliten minimiert. Der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung läßt sich in einem verbesserten Immuntest für Tacrolimus einsetzten, der gut mit anderen Immuntestverfahren und nichtimmunologischen Testverfahren für Tacrolimus korreliert. Ein Immuntest unter Einsatz eines monoklonalen Antikörpers eignet sich zur klinischen Überwachung von Patienten, die Tacrolimus erhalten, einschließlich Patienten mit beeinträchtigter Leberfunktion, bei denen erwartet wird, daß ihr Serum hohe Spiegel an Tacrolimusmetaboliten aufweist.

Claims

Monoklonaler Antikörper gegen Tacrolimus, bei dem es sich um einen monoklonalen IgG₁λ-Antikörper mit einer Bindungsaffinität für Tacrolimus von etwa 3,7 × 10⁹ Liter/Mol handelt, der mit 13-Demethyltacrolimus kreuzreagiert und jeweils weniger als etwa 8% Kreuzreaktivität gegenüber den folgenden Tacrolimusmetaboliten aufweist: 15-Demethyltacrolimus; 31-Demethyltacrolimus; 13,31-Didemethyltacrolimus; 15,31-Didemethyltacrolimus und 12-Hydroxytacrolimus.
Monoklonaler Antikörper gegen Tacrolimus, der durch Fusion antikörperproduzierender Zellen aus einem mit mit einer Carboxymethyloxim-Gruppierung an einem Kohlenstoffatom in der nichtbindenden Tacrolimusdomäne, die an ein Protein mit hohem Molekulargewicht konjugiert ist, derivatisiertem Tacrolimus immunisierten, antikörperproduzierenden nichtmenschlichen Säuger mit einem geeigneten Fusionspartner produziert wird, wobei der monoklonale Antikörper: (a) mit dem monoklonalen IgG₁λ-Antikörper gemäß Anspruch 1 mit in bezug auf Molarität mindestens 80% Effektivität im Vergleich zum monoklonalen IgG₁λ-Antikörper gemäß Anspruch 1, wie mit Kompetitionstests gemessen, konkurriert und (b) jeweils weniger als etwa 10% Kreuzreaktivität mit 15-Demethyltacrolimus, 31-Demethyltacrolimus, 13,31-Didemethyltacrolimus, 15,31-Didemethyltacrolimus und 12-Hydroxytacrolimus aufweist.
Rekombinanter Einketten-Antikörper (sFv) mit den darin enthaltenen variablen Bereichen eines Antikörpers gegen Tacrolimus, der durch Fusion antikörperproduzierender Zellen aus einem mit mit einer Carboxymethyloxim-Gruppierung an einem Kohlenstoffatom in der nichtbindenden Tacrolimusdomäne, die an ein Protein mit hohem Molekulargewicht konjugiert ist, derivatisiertem Tacrolimus immunisierten, antikörperproduzierenden nichtmenschlichen Säuger mit einem geeigneten Fusionspartner produziert wird, wobei der monoklonale Antikörper: (a) mit dem monoklonalen IgG₁λ-Antikörper gemäß Anspruch 1 mit in bezug auf Molarität mindestens 80% Effektivität im Vergleich zum monoklonalen IgG₁λ-Antikörper gemäß Anspruch 1, wie mit Kompetitionstests gemessen, konkurriert und (b) jeweils weniger als etwa 10% Kreuzreaktivität mit 15-Demethyltacrolimus, 31-Demethyltacrolimus, 13,31-Didemethyltacrolimus, 15,31-Didemethyltacrolimus und 12-Hydroxytacrolimus aufweist.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2, wobei wenigstens einige der konstanten Bereiche des Antikörpers durch menschliche konstante Bereiche ersetzt sind, so daß der monoklonale Antikörper humanisiert ist.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2, 3 oder 4, wobei der Antikörper in bezug auf Molarität mindestens etwa 90% so effektiv wie der monoklonale Antikörper gemäß Anspruch 1 konkurriert und jeweils weniger als etwa 8% Kreuzreaktivität mit 15-Demethyltacrolimus, 31-Demethyltacrolimus, 13,31-Didemethyltacrolimus, 15,31-Didemethyltacrolimus und 12-Hydroxytacrolimus aufweist.
Hybridomzelle, die einen monoklonalen IgG₁λ-Antikörper gegen Tacrolimus mit einer Bindungsaffinität für Tacrolimus von etwa 3,7 × 10⁹ Liter/Mol produziert, der mit 13-Demethyltacrolimus kreuzreagiert und jeweils weniger als etwa 8% Kreuzreaktivität gegenüber den folgenden Tacrolimusmetaboliten aufweist: 15-Demethyltacrolimus; 31-Demethyltacrolimus; 13,31-Didemethyltacrolimus; 15,31-Didemethyltacrolimus und 12-Hydroxytacrolimus.
Hybridomzelle, die den monoklonalen Antikörper nach Anspruch 2 produziert.
Antikörper gemäß Anspruch 2 oder 3, wobei das Tacrolimus an Kohlenstoffatom 22 derivatisiert ist.
Antikörper nach Anspruch 2 oder 3, wobei es sich bei dem Protein mit hohem Molekulargewicht um Keyhole Limpet-Hämocyanin handelt.
Konjugat, umfassend den direkt oder indirekt an eine nachweisbare Markierung konjugierten Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4 und 8.
Konjugat nach Anspruch 10, wobei die nachweisbare Markierung aus der aus einer Enzymmarkierung, einer radioaktiven Markierung, einer Fluoreszenzmarkierung, einer Chemilumineszenzmarkierung, einer Biolumineszenzmarkierung und einer partikulären Markierung bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Konjugat nach Anspruch 11, wobei es sich bei der Markierung um eine Enzymmarkierung handelt.
Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung von Tacrolimus, bei dem man in den folgenden Schritten: (a) eine Probe bereitstellt, von der vermutet wird, daß sie Tacrolimus enthält, (b) die Probe mit i) dem Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4 und 8 und ii) gegebenenfalls einem Tacrolimusanalogon reagieren läßt, wobei entweder der Antikörper oder das Tacrolimusanalogon mit einer ein nachweisbares Signal produzierenden Markierung markiert ist, und (c) entweder i) das mit an Antikörper gebundenem Tacrolimus assoziierte Signal, ii) das mit nicht an Antikörper gebundenem Tacrolimus assoziierte Signal oder iii) das vorhandene Gesamtsignal beobachtet oder mißt, um das Vorhandensein oder die Konzentration von Tacrolimus in der Probe nachzuweisen oder zu bestimmen.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei man die Probe mit einem mit einer Enzymmarkierung markierten Tacrolimusanalogon reagieren läßt und das vorhandene Gesamtsignal zum Nachweis oder zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Konzentration von Tacrolimus in der Probe beobachtet oder mißt.
Testkit, umfassend in in getrennten Behältern abgepackter Form: (a) den Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4 und 8 sowie (b) ein direkt oder indirekt mit einer Enzymmarkierung markiertes Tacrolimusanalogon.