ES2275534T3

ES2275534T3 - Anticuerpos monoclonales contra tacrolimus y procedimientos de inmunoensayo para tacrolimus.

Info

Publication number: ES2275534T3
Application number: ES00953792T
Authority: ES
Inventors: Kenneth C. Kasper; Henry Jeong; Dariush Davalian; Hshiou-Ting Liu; Paul L. Miller; Denise L. Williams
Original assignee: Dade Behring Inc
Current assignee: Dade Behring Inc
Priority date: 1999-08-03
Filing date: 2000-08-02
Publication date: 2007-06-16
Anticipated expiration: 2020-08-02
Also published as: WO2001009190A3; JP2003506336A; US20090087865A1; US20060216770A1; AU6618100A; WO2001009190A2; EP1206493B1; JP4753514B2; EP1206493A2; US7078495B1; DE60031858D1; DE60031858T2; US8030458B2

Abstract

Un anticuerpo monoclonal contra tacrolimus que es un anticuerpo monoclonal IgG1lambda que tiene una afinidad de unión por el tacrolimus de aproximadamente 3, 7x109 litros/mol, que reacciona de manera cruzada con 13-desmetil tacrolimus, y que tiene menos de aproximadamente 8% de reactividad cruzada con todos los metabolitos de tacrolimus siguientes: 15-desmetil tacrolimus; 31-desmetil tacrolimus; 13, 31-didesmetil tacrolimus; 15, 31-didesmetil tacrolimus;y 12-hidroxi tacrolimus.

Description

Anticuerpos monoclonales contra tacrolimus y procedimientos de inmunoensayo para tacrolimus.

Campo de la invención

Esta invención está dirigida a anticuerpos monoclonales contra tacrolimus, procedimientos para la producción de dichos anticuerpos monoclonales, y derivados de tacrolimus útiles para la producción de dichos anticuerpos monoclonales.

Antecedentes de la invención

El tacrolimus es un macrólido aislado a partir de Streptomyces tsukubaensis. El tacrolimus tiene el nombre químico [3S-[3R^{*}[E(1S^{*},3S^{*},4S^{*})],4S^{*},5R^{*}, 8S^{*},9E,12R^{*},14R^{*},15S^{*},16R^{*},18S^{*},19S^{*},26aR^{*}]]-5,6,8,11,12,13,14,15,16,17,18,19,
24,25,26,26a-hexadecahidro-5,19-dihidroxi-3-[2-(4-hidroxi-3-metoxiciclohexil)-1-metiletenil]-14,16-dimetoxi-4,10,
12,18-tetrametil-8-(2-propenil)-15,19-epoxi-3H-pirido[2,1-c][1,4]-oxaazaciclotricosino-1,7,20,21 (4H,23H) tetrona. La estructura del tacrolimus, indicando la numeración, se muestra más adelante en la Figura 16.

El tacrolimus es igualmente conocido como FR-900506 o FK-506. El tacrolimus tiene actividad inmunosupresora y actividad antimicrobiana.

La actividad inmunosupresora del tacrolimus es particularmente importante y ha conducido al uso ampliamente creciente de este fármaco. La inmunosupresión se usa clínicamente en un cierto número de situaciones, las más importantes en la prevención del rechazo en el trasplante de órganos. Los fármacos inmunosupresores se administran igualmente en la prevención de la enfermedad hemolítica del Rh de recién nacidos y en el tratamiento de trastornos autoinmunes. El tacrolimus inhibe la activación de las células T mediante la unión a una proteína citosólica conocida como FKBP (proteína de unión de FK-506). El complejo fármaco-proteína de unión se asocia de manera estable con calcineurina. Esto inhibe la actividad serina-treonina fosfatasa de esta enzima dependiente del Ca^{2+}. Esto inhibe la activación dependiente de la calcineurina de la expresión, apoptosis, y desgranulación de la linfocina (G. Wiederrecht y otros, "The Mechanism of Action of FK-506 and Cyclosporin A", Ann. N.Y. Acad. Sci., vol. 696, págs. 9-19
(1993)).

El tacrolimus puede administrarse intravenosamente en una infusión corta o continua, u oralmente. El tacrolimus, al igual que otros agentes inmunosupresores, tiene un espectro de toxicidad. La toxicidad principal asociada con el uso clínico del medicamento es la nefrotoxicidad. Además, la neurotoxicidad puede desarrollar, asociada con dolor de cabeza, temblor, insomnio, dolor, u otros síntomas. Adicionalmente, puede desarrollar toxicidad gastrointestinal manisfestada mediante diarrea o náuseas, al igual que la toxicidad cardiovascular puede manifestarse mediante la hipertensión.

Adicionalmente, puede desarrollar toxicidad metabólica manifestada mediante el desarrollo de síntomas tales como hipercalemia, hipomagnesemia, o hiperglucemia. Además, la inmunosupresión a largo plazo con tacrolimus puede producir riesgo incrementado de todo tipo de infecciones, no solamente los patógenos bacterianos, víricos y fúngicos usuales, sino también además diversas infecciones oportunistas no usuales.

Adicionalmente, existe un riesgo incrementado de linfomas y enfermedades malignas relacionadas, asociadas con la administración de tacrolimus (M.L. Cleary y J. Sklar, "Lymphoproliferative Disorders in Cardiac Transplant are Multiclonal Lymphomas", Lancet, vol. 2, págs. 49-493, (1984); L.J. Swinnem y otros, "Increased Incidence of Lymphoproliferative Disorder After Immunosuppression with Monoclonal Antibody OKT3 in Cardiac-Transplant Recipients", New Engl. J. Med., vol. 323, págs. 1723-1728 (1990)). Al menos alguna de estas enfermedades malignas están relacionadas con respuestas inmunes inadecuadas al virus Epstein-Barr (B.Z. Katz y otros, "Latent and Replicating Forms of Epstein-Barr virus DNA and Lymphomas in Lymphoproliferative Diseases", J. Infect. Dis., vol. 160, págs. 589-598 (1989)).

La potencia y el espectro de toxicidades del tacrolimus requiere procedimientos sensibles, reproducibles y fiables para el control de la concentración en sangre de estos compuestos después de la administración a un paciente, tal como un paciente al que se le ha realizado un trasplante de órganos. Es importante que dichos procedimientos sean lo suficientemente sensibles como para detectar bajas concentraciones de tacrolimus. Igualmente, es importante que dichos procedimientos sean fiables y reproducibles, y eviten la interferencia procedente de otros compuestos tales como metabolitos de tacrolimus.

El Documento EP-A 293 892 y el Clinical Biochemistry, vol. 31, págs. 613-617, (1998), describen, ambos, anticuerpos monoclonales y policlonales contra tacrolimus. Sin embargo, estas referencias no describen anticuerpos monoclonales del tacrolimus que tengan reactividad cruzada limitada contra todos los metabolitos de tacrolimus siguientes: 15-desmetil tacrolimus; 31-desmetil tacrolimus; 13,31-didesmetil tacrolimus; 15,31-didesmetil tacrolimus; y 12-hidroxi tacrolimus.

Aunque existen anticuerpos e inmunoensayos contra tacrolimus, y están descritos, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. No. 5.532.137, de Niwa y otros, existe una necesidad aún del desarrollo de anticuerpos e inmunoensayos específicos mejorados para tacrolimus. En particular, existe una necesidad de anticuerpos monoclonales mejorados contra tacrolimus que puedan usarse para desarrollar un inmunoensayo sensible, fiable y reproducible para
tacrolimus.

El desarrollo de un inmunoensayo fiable para tacrolimus se complica por el hecho de que el tacrolimus tiene un cierto número de metabolitos que se encuentran en la sangre de un individuo que está siendo tratado con tacrolimus. La conversión del tacrolimus a estos metabolitos implica de desmetilación, hidroxilación y formación de anillos. Es importante que los anticuerpos del tacrolimus tengan la menor reactividad cruzada posible con estos derivados.

De acuerdo con ello, existe una necesidad del desarrollo de anticuerpos monoclonales mejorados del tacrolimus que sean útiles para inmunoensayos para tacrolimus y que posean un grado mínimo de reactividad cruzada con metabolitos de tacrolimus. Igualmente, existe una necesidad de inmunoensayos mejorados que usen dichos anticuerpos monoclonales para la detección y determinación de tacrolimus en la sangre de pacientes a los que se está administrando tacrolimus.

Sumario

Los presentes autores han descubierto que el tacrolimus, cuando se deriva en el dominio de no unión, puede acoplarse a un vehículo de alto peso molecular, tal como una proteína, para inmunización con el fin de producir anticuerpos. Las células que producen el anticuerpo resultante pueden usarse para generar anticuerpos monoclonales mediante la fusión de células. Estos anticuerpos monoclonales tienen propiedades deseables, incluyendo reactividad cruzada reducida con metabolitos de tacrolimus.

Una realización de la presente invención es un anticuerpo monoclonal contra tacrolimus que es un anticuerpo monoclonal designado como 1H6 y que tiene menos de aproximadamente 8% de reactividad cruzada con cada uno de 15-desmetil tacrolimus, 31-desmetil tacrolimus, 13,31-didesmetil tacrolimus, 15,31-didesmetil tacrolimus y 12-hidroxi tacrolimus.

Otra realización de la presente invención es un anticuerpo monoclonal contra tacrolimus que:

(1) compite con el anticuerpo monoclonal IgG_{1}\lambda designado como 1H6 al menos aproximadamente 80% tan eficazmente sobre una base molar comparado con el anticuerpo monoclonal IgG_{1}\lambda designado como 1H6 medido mediante ensayos de competencia; y

(2) tiene menos de aproximadamente 10% de reactividad cruzada con cada uno de 15-desmetil tacrolimus, 31-desmetil tacrolimus, 13,31-didesmetil tacrolimus, 15,31-didesmetil tacrolimus, y 12-hidroxi tacrolimus. Preferiblemente, el anticuerpo monoclonal contra tacrolimus compite al menos aproximadamente 90% tan eficazmente sobre una base molar como el anticuerpo monoclonal designado como 1H6 y tiene menos de aproximadamente 8% de reactividad cruzada con cada uno de 15-desmetil tacrolimus, 31-desmetil tacrolimus, 13,31-didesmetil tacrolimus, 15,31-didesmetil tacrolimus, y 12-hidroxi tacrolimus.

Otra realización de la presente invención es un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal IgG_{1}\lambda contra tacrolimus designado como 1H6, tal como se ha descrito anteriormente.

Otra realización aún de la presente invención es un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que:

(2) tiene menos de aproximadamente 10% de reactividad cruzada con cada uno de 15-desmetil tacrolimus, 31-desmetil tacrolimus, 13,31-didesmetil tacrolimus, 15,31-didesmetil tacrolimus, y 12-hidroxi tacrolimus.

Otra realización de la presente invención es un anticuerpo monoclonal que:

(2) tiene menos de aproximadamente 10% de reactividad cruzada con cada uno de 15-desmetil tacrolimus, 31-desmetil tacrolimus, 13,31-didesmetil tacrolimus, 15,31-didesmetil tacrolimus, y 12-hidroxi tacrolimus, en el que al menos algunas de las regiones constantes del anticuerpo están reemplazadas por regiones constantes humanas, de manera tal que el anticuerpo monoclonal está humanizado.

Otra realización aún de la presente invención es un anticuerpo recombinante de cadena sencilla (sFv), que incluye en él las regiones variables de un anticuerpo contra tacrolimus, que:

\newpage

Otra realización todavía de la presente invención es un anticuerpo monoclonal contra tacrolimus producido mediante fusión de células que producen anticuerpos procedentes de un mamífero que produce anticuerpos inmunizado con tacrolimus derivado con un resto carboximetil oxima en un átomo de carbono en el dominio de no unión del tacrolimus conjugado con una proteína de alto peso molecular con una pareja de fusión adecuada. Preferiblemente, el átomo de carbono en el dominio de no unión del tacrolimus es el carbono 22. Preferiblemente, la proteína de alto peso molecular es hemocianina de lapa tipo ojo de cerradura.

Otra realización aún de la presente invención es un anticuerpo monoclonal contra tacrolimus que es un anticuerpo monoclonal IgG_{1}\lambda, que tiene una afinidad de unión por el tacrolimus de aproximadamente 3,7x10^{9} litros/mol, que reacciona de manera cruzada con 13-desmetil tacrolimus y que tiene menos de aproximadamente 8% de reactividad cruzada con todos los metabolitos de tacrolimus siguientes: 15-desmetil tacrolimus; 31-desmetil tacrolimus; 13,31-didesmetil tacrolimus; 15,31-didesmetil tacrolimus; y 12-hidroxi tacrolimus.

Otro aspecto de la presente invención es anticuerpos, incluyendo anticuerpos policlonales, producidos mediante inmunización de un mamífero que produce anticuerpos con tacrolimus derivado con un resto carboximetil oxima en un átomo de carbono en el dominio de no unión del tacrolimus conjugado con una proteína de alto peso molecular. Preferiblemente, el átomo de carbono en el dominio de no unión del tacrolimus es el carbono 22. Preferiblemente, la proteína de alto peso molecular es hemocianina de lapa tipo ojo de cerradura.

Otro aspecto de la presente invención es un conjugado que comprende un anticuerpo de acuerdo con la presente invención directa o indirectamente conjugado con un marcador detectable. El marcador detectable puede estar seleccionado entre el grupo que consiste en un marcador de enzima, un marcador radiactivo, un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente, un marcador bioluminiscente, y un marcador en partículas. En muchas aplicaciones, el marcador es, preferiblemente, un marcador de enzima.

Otro aspecto aún de la presente invención es un procedimiento de detección o de determinación de tacrolimus, que comprende las etapas de:

(1) suministro de una muestra sospechosa de contener tacrolimus;

(2) reacción de la muestra con:

(a): un anticuerpo de acuerdo con la presente invención; y

(b): opcionalmente, un análogo de tacrolimus; en el que uno de los anticuerpos o el análogo de tacrolimus se marca con un marcador que produce una señal detectable; y

(3) observación o medición de uno de:

(a): la señal asociada con tacrolimus unido al anticuerpo;

(b): la señal asociada con tacrolimus no unido al anticuerpo; o

(c): la señal total presente;

con el fin de detectar o determinar la presencia o concentración de tacrolimus en la muestra.

Típicamente, en este procedimiento, la muestra se hace reaccionar con un análogo de tacrolimus marcado con un marcador de enzima y la señal total presente se observa o mide para detectar o determinar la presencia o concentración de tacrolimus en la muestra.

Otro aspecto de la presente invención es un kit de ensayo que comprende, envasado en recipientes separados:

(1) un anticuerpo de acuerdo con la presente invención; y

(2) un análogo de tacrolimus marcado directa o indirectamente con un marcador de enzima.

Otro aspecto aún de la presente invención, es un derivado de tacrolimus que comprende tacrolimus que está derivado con un resto carboximetil oxima en un átomo de carbono en el dominio de no unión del tacrolimus. Preferiblemente, el átomo de carbono en el dominio de no unión del tacrolimus es el carbono 22.

Otro aspecto aún de la presente invención es un conjugado que comprende un derivado de tacrolimus, tal como se ha descrito anteriormente, conjugado con una proteína de alto peso molecular. Preferiblemente, la proteína de alto peso molecular es hemocianina de lapa tipo ojo de cerradura.

Otro aspecto todavía de la presente invención es un procedimiento de derivación de tacrolimus que comprende la reacción de tacrolimus con carboximetoxilamina para producir un derivado carboximetil oxima de tacrolimus, estando el resto carboximetil oxima localizado en el átomo de carbono 22.

Otro aspecto aún de la presente invención es un procedimiento de producción de un conjugado de tacrolimus con una proteína de alto peso molecular, que comprende:

(1) la reacción de tacrolimus con carboximetoxilamina para producir un derivado carboximetil oxima de tacrolimus, estando el resto carboximetil oxima localizado en el átomo de carbono 22;

(2) la activación de la carboximetil oxima para producir éster de N-hidroxisuccinimida reactivo; y

(3) la reacción del éster de N-hidroxisuccinimida con la proteína de alto peso molecular para producir el conjugado.

Otro aspecto de la presente invención es un derivado de tacrolimus que comprende tacrolimus substituido con un resto carboximetil oxima en el átomo de carbono 22, ligado a través de un conector a un resto biotina. En una realización preferida de este aspecto de la presente invención, el conector tiene la estructura NH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-(CH_{2})_{5}-NH, y un grupo amina del conector forma un enlace amida con el grupo carboxilo de la carboximetil oxima y el otro grupo amina del conector forma un enlace amida con el grupo carboxilo de la biotina.

Otro aspecto aún de la presente invención es un procedimiento de derivación de tacrolimus, que comprende:

(1) la reacción de tacrolimus con carboximetoxilamina para producir un derivado carboximetil oxima de tacrolimus, estando el derivado carboximetil oxima localizado en la posición 22;

(3) la reacción del éster de N-hidroxisuccinimida con el grupo carboxilo de biotina o un derivado o análogo de biotina.

Otro aspecto aún de la presente invención es un derivado de tacrolimus que comprende tacrolimus que está derivado con un resto bromoacetilo en un átomo de carbono en el dominio de no unión del tacrolimus. Preferiblemente, el átomo de carbono en el dominio de no unión del tacrolimus es el carbono 22. A continuación, estos derivados pueden hacerse reaccionar con una enzima u otra proteína para producir un conjugado que contiene el derivado conjugado con una proteína, tal como una enzima. En una realización preferida, la proteína es una muteína que contiene cisteína de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.

De acuerdo con ello, otro aspecto de la presente invención es un procedimiento de derivación de tacrolimus, que comprende:

(3) la reacción del éster de N-hidroxisuccinimida con la sal del ácido trifluoroacético de bromoacetiletilendiamina para producir un derivado bromoacetilo de tacrolimus.

Breve descripción de los dibujos

Estas y otras características, aspectos, y ventajas de la presente invención se entenderán mejor con referencia a la descripción siguiente, reivindicaciones adjuntas, y dibujos acompañantes, en los que:

la Figura 1 es un espectrograma de masas del producto resultante de la reacción de carboximetoxilamina con el antibiótico macrólido FK-520, íntimamente relacionado estructuralmente con el tacrolimus;

la Figura 2 es una porción del espectrograma de masas de la Figura 1, mostrado en resolución ampliada centrada alrededor del pico predominante;

la Figura 3 es un espectrograma de masas del producto resultante de la reacción de carboximetoxilamina con tacrolimus;

la Figura 4 es una porción del espectrograma de masas de la Figura 3, mostrado en resolución ampliada centrada alrededor del pico predominante;

la Figura 5 es un espectro ^{1}H NMR a 250 MHz en CDCl_{3} del producto resultante de la reacción de carboximetoxilamina con tacrolimus;

la Figura 6 es un espectro ^{13}C NMR a 250 MHz en CDCl_{3} del producto resultante de la reacción de carboximetoxilamina con tacrolimus;

la Figura 7 es un espectro ^{13}C NMR a 500 MHz en CDCl_{3} de tacrolimus mostrado como referencia;

la Figura 8 es un espectrograma de masas del producto resultante de la reacción de LC-biotina con monooxima de tacrolimus;

la Figura 9 es una porción del espectrograma de masas de la Figura 8, mostrado en resolución ampliada centrado alrededor del pico predominante;

la Figura 10 es un espectro ^{1}H NMR a 250 MHz en CDCl_{3} del producto resultante de la reacción de LC-biotina con monoxima de tacrolimus;

la Figura 11 es una curva de calibración de un inmunoensayo de enzima homogéneo de tacrolimus usando un anticuerpo monoclonal producido mediante inmunización de ratones con un conjugado de tacrolimus derivado en la posición 22 con una carboximetil oxima ligada a hemocianina de lapa tipo ojo de cerradura y fusión de células de las células que producen el anticuerpo resultante con una pareja de fusión;

la Figura 12 es una gráfica que muestra la correlación entre los resultados para el ensayo de tacrolimus usando un inmunoensayo de enzima homogéneo con el anticuerpo monoclonal para el cual se muestra la curva de calibración en la Figura 11 y los resultados para el ensayo de tacrolimus usando un procedimiento que usa cromatografía de gases y espectroscopía de masas en tándem (LC/MS/MS);

la Figura 13 es una gráfica que muestra la correlación entre los resultados para el ensayo de tacrolimus usando el inmunoensayo de enzima homogéneo y usando LC/MS/MS sobre un panel de 70 pacientes con lesión de hígado a los cuales se les había administrado tacrolimus;

la Figura 14 es una gráfica que muestra la correlación entre los resultados para el ensayo de tacrolimus usando el inmunoensayo de enzima homogéneo y usando un inmunoensayo disponible comercialmente para tacrolimus para el panel de 70 pacientes de la Figura 13;

la Figura 15 es una gráfica que muestra una representación del análisis de diferencias Bland-Altman para los resultados de las Figura 13-14; y

la Figura 16 es un dibujo de la fórmula estructural para tacrolimus, que muestra la numeración de la molécula.

Descripción Definiciones

Tal como se usa aquí, los términos definidos más adelante tienen los significados siguientes, salvo que se indique lo contrario:

"Anticuerpo": Tal como se usa aquí, el término "anticuerpo" incluye tanto moléculas de anticuerpo intactas de la especificidad apropiada, y fragmentos de anticuerpo (incluyendo Fab, F(ab'), Fv y F(ab')_{2}), como moléculas de anticuerpo intactas y fragmentos de anticuerpo modificados químicamente, incluyendo anticuerpos híbridos ensamblados mediante asociación in vitro de subunidades. Igualmente incluidos se encuentran moléculas de anticuerpo de cadena sencilla generalmente denominadas mediante el término sFv y anticuerpos humanizados en los cuales alguna o la totalidad de las regiones constantes originales no humanas están reemplazadas con regiones constantes originales derivadas a partir de secuencias de anticuerpos humanos. Tanto los anticuerpos monoclonales como policlonales se encuentran incluidos, salvo que se especifique lo contrario; en un cierto número de contextos, los anticuerpos monoclonales son específicamente especificados. Adicionalmente, se encuentran incluidos los anticuerpos modificados o anticuerpos conjugados con marcadores u otras moléculas que no bloquean o alteran la capacidad de unión del anticuerpo.

"Secuencia de ácido nucleico": La expresión "secuencia de ácido nucleico" incluye tanto DNA como RNA salvo que se especifique lo contrario, y, salvo que se especifique lo contrario, incluye tanto ácido nucleicos monohebra como de doble hebra. Igualmente incluidos se encuentran los hibridos tales como híbridos de DNA-RNA. En particular, la referencia a DNA incluye RNA que tiene o bien la secuencia de bases equivalente excepto por la substitución de uracilo en el RNA por timina en el DNA, o bien tiene una secuencia de bases complementaria excepto por la substitución de uracilo por timina, estando determinada la complementariedad de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases de Watson-Crick. Adicionalmente, una referencia a una secuencia de ácido nucleico incluye su complemento de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases de Watson-Crick, salvo que se especifique lo contrario.

Los presentes autores han desarrollado un anticuerpo monoclonal mejorado contra tacrolimus basado en el uso de tacrolimus derivado en un átomo de carbono dentro del dominio de no unión, preferiblemente el carbono 22. En primer lugar, se obtuvieron anticuerpos policlonales producidos mediante la inmunización de animales que producen anticuerpos con este inmunógeno. A continuación, las células que producen los anticuerpos resultantes se usaron para la fusión de células con una pareja de fusión adecuada con el fin de producir hibridomas. Los anticuerpos monoclonales resultantes producidos por los hibridomas son partícularmente útiles en inmunoensayos para la detección de tacrolimus.

I. Derivados de tacrolimus

De acuerdo con ello, un aspecto se refiere a derivados de tacrolimus derivados en un átomo de carbono dentro del dominio de no unión del tacrolimus. Preferiblemente, el derivado se deriva en la posición en la posición del carbono 22. Una clase particularmente preferida de derivados implica la reacción del grupo ceto en la posición 22 con una amina para producir una oxima. Una amina particularmente preferida es carboximetoxilamina. La reacción de tacrolimus con carboximetoxil amina produce una carboximetil oxima.

Esta reacción implica la reacción de tacrolimus con carboximetoxilamina en metanol en presencia de acetato sódico para dar la oxima. De acuerdo con ello, otro aspecto de la presente invención es un procedimiento de derivación de tacrolimus que comprende la reacción de tacrolimus con carboximetoxilamina para producir un derivado carboximetil oxima de tacrolimus, estando localizado el resto oxima en el carbono 22. En el Ejemplo 1 se muestran detalles adicionales de esta reacción.

De acuerdo con ello, otro aspecto se refiere a un conjugado que comprende el derivado de tacrolimus, el cual comprende tacrolimus derivado con un resto carboximetil oxima en la posición 22 conjugado con una proteína de alto peso molecular a través del resto oxima. Típicamente, la proteína de alto peso molecular es una proteína que es un vehículo adecuado para haptenos y puede ser, pero sin estar necesariamente limitada a ellas, proteínas tales como albúmina de suero bovino, tiroglobulina, ovalbúmina, fibrinógeno, o hemocianina de lapa tipo ojo de cerradura. Un vehículo particularmente preferido es hemocianina de lapa tipo ojo de cerradura. Como alternativa, la proteína de alto peso molecular puede ser una enzima, tal como una enzima que produce una señal detectable, tal como glucosa-6-fosfato deshidrogenasa o fosfatasa alcalina. Dichos conjugados son particularmente útiles en inmunoensayos para tacrolimus, tal como se expone a continuación.

La preparación de estos conjugados se establece con más detalle más adelante en el Ejemplo 2. Sin embargo, en general, un procedimiento de preparación del conjugado de tacrolimus con la proteína de alto peso molecular es como sigue: (1) preparación de la carboximetil oxima de tacrolimus tal como se ha descrito anteriormente; (2) activación de la carboximetil oxima para producir un éster de N-hidroxisuccinimida reactivo; y (3) reacción del éster de N-hidroxisuccinimida con la proteína de alto peso molecular con el fin de producir el conjugado. Esta reacción se expone en detalle en el Ejemplo 2. La activación de la carboximetil oxima para producir el éster de N-hidroxisuccinimida se lleva a cabo, típicamente, usando un agente de acoplamiento tal como una carbodiimida soluble en agua. Una carbodiimida soluble en agua preferida es clorhidrato de 3-(3-dimetilaminopropil-1-etil-3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDAC). Otras carbo-diimidas solubles en agua son conocidas en la técnica y pueden igualmente usarse.

Además de la formación de conjugados con proteínas de alto peso molecular tal como hemocianina de lapa tipo ojo de cerradura, la presente invención abarca también derivados de tacrolimus substituidos con un resto carboximetil oxima en el carbono 22 ligado a través de un ligador a un resto biotina. El conector puede adoptar cualquiera de entre un cierto número de formas y puede tener diferentes longitudes. El uso de conectores entre biotina y un hapteno o antígeno es bien conocido en la técnica y no necesita ser descrito con más detalle aquí. En un derivado particularmente preferido, el conector tiene la estructura NH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-(CH_{2})_{5}-NH. Uno de los grupos amina del conector forma un enlace amida con el grupo carboxilo de la carboximetil oxima, y el otro grupo amina forma un enlace amida con el grupo carboxilo de la biotina.

La longitud de este espaciador puede cambiarse mediante la inserción o supresión de uno o más grupos CH_{2} (metileno) en los dos sitios en el espaciador que tienen 2 o más grupos metileno.

Los derivados pueden formarse mediante la reacción de un éster de N-hidroxisuccinimida tal como se ha descrito anteriormente con el grupo carboxilo de biotina o un derivado o análogo de biotina. Esta reacción puede llevarse a cabo tal como se ha descrito anteriormente.

En general, el procedimiento de formación de dichos derivados de biotina comprende:

(2) la activación de la carboximetil oxima para producir un éster de N-hidroxisuccinimida reactivo; y

En una realización preferida, tal como se expone más adelante en el Ejemplo 3, la oxima se hace reaccionar con EDAC y N-hidroxisuccinimida en dimetilformamida (DMC). A continuación, el producto activado se hace reaccionar con la biotina que contiene el ligador, tal como LC-biotina.

Otra realización aún de conjugados de tacrolimus derivados en un átomo de carbono dentro del dominio de no unión de tacrolimus, preferiblemente la posición 22, es un derivado bromoacetilo. La preparación de derivados bromoacetilo de tacrolimus derivados en la posición 22, se describe en el Ejemplo 4. En general, la preparación de derivados de este tipo comprende:

(1) la reacción con tacrolimus con carboximetoxilamina para producir un derivado carboximetil oxima de tacrolimus, estando el derivado carboximetil oxima localizado en la posición 22;

(3) la reacción del éster de N-hidroxisuccinimida con la sal del ácido trifluoroacético de bromoacetiletilendiamina para producir un derivado bromoacetilo.

El derivado carboximetil oxima usado en este procedimiento se prepara tal como se ha descrito anteriormente.

Dichos derivados bromoacetilo pueden usarse para producir conjugados de enzimas de tacrolimus mediante la reacción del resto bromoacetilo con un grupo sulfhidrilo de una enzima, tal como una muteína de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa que contiene un resto cisteína. El derivado bromoacetilo puede reaccionar con otros grupos cisteína en otras enzimas o proteínas para producir otros conjugados de enzima o proteína de tacrolimus.

II. Anticuerpos e hibridomas monoclonales y policlonales

Otro aspecto de la presente invención es la producción de anticuerpos e hibridomas monoclonales, así como anticuerpos policlonales producidos mediante inmunización de animales que producen anticuerpos con derivados de tacrolimus tal como se ha descrito anteriormente.

Una realización preferida de un anticuerpo monoclonal de la presente invención es un anticuerpo monoclonal múrido contra tacrolimus que es un anticuerpo monoclonal IgG_{1}\lambda designado como 1H6. Este anticuerpo monoclonal reacciona con 13-desmetil tacrolimus pero tiene menos de aproximadamente 8% de reactividad cruzada con todos los metabilitos de tacrolimus siguientes: 15-desmetil tacrolimus; 31-desmetil tacrolimus; 13,31-didesmetil tacrolimus; 15,31-didesmetil tacrolimus; y 12-hidroxi tacrolimus. Este anticuerpo monoclonal tiene una afinidad estimada de unión al tacrolimus de 3,7x10^{9} litros/mol.

Otro anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente invención es un anticuerpo monoclonal contra tacrolimus que: (1) compite con el anticuerpo monoclonal IgG_{1}\lambda designado como 1H6 al menos aproximadamente 80% tan eficazmente sobre una base molar comparado con el anticuerpo monoclonal IgG_{1}\lambda designado como 1H6 medido mediante ensayos de competencia; y (2) tiene menos de aproximadamente 10% de reactividad cruzada con cada uno de los metabolitos de tacrolimus siguientes: 15-desmetil tacrolimus; 31-desmetil tacrolimus; 13,31-didesmetil tacrolimus; 15,31-didesmetil tacrolimus; y 12-hidroxi tacrolimus.

Preferiblemente, el anticuerpo monoclonal compite al menos aproximadamente 90% tan eficazmente sobre una base molar como el anticuerpo monoclonal designado como 1H6 y tiene menos de aproximadamente 8% de reactividad cruzada con cada uno de estos metabolitos de tacrolimus.

Otro aspecto de la presente invención es un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal tal como se ha descrito anteriormente. Esto incluye un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal IgG_{1}\lambda contra tacrolimus designado como 1H6. Igualmente, esto incluye igualmente un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal tal como se ha descrito anteriormente que compite al menos aproximadamente 80% tan eficazmente sobre una base molar con dicho anticuerpo y tiene un grado limitado de reactividad cruzada con los metabolitos de tacrolimus descritos anteriormente.

Otra realización de la presente invención es anticuerpos monoclonales humanizados. En algunas aplicaciones, se prefiere tener anticuerpos monoclonales humanizados en los cuales al menos algunas de las regiones constantes del anticuerpo estén reemplazadas por regiones constantes humanas, de manera tal que el anticuerpo monoclonal esté humanizado. Típicamente, dichos procedimientos implican el injertado de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) del múrido sobre un anticuerpo humano. Adicionalmente, pueden ser necesarias alteraciones de aminoácidos individuales dentro del marco conservado para recrear el sitio de unión del antígeno. Típicamente, esta técnica implica la amplificación del cDNA para las cadenas variables pesada y ligera del hibridoma múrido usando la reacción de cadena de polimerasa (PCR) con un subconjunto de cebadores oligonucleótidos de síntesis con pequeño nivel de degeneración. La mutagénesis, si es que se precisa, puede llevarse a cabo mediante procedimientos estándar. Típicamente, los genes V humanizados que portan las regiones variables son clonados dentro de vectores de expresión adecuados y expresados en células tales como células COS o células CHO-K1. Caso de ser necesario, pueden realizarse otras mutaciones. La preparación de dichos anticuerpos monoclonales humanizados es conocida de manera general en la técnica y se encuentra descrita, por ejemplo, por C.A.K. Borrebaeck, en Antibody Engineering, 2ª Ed., Oxford University Press, Nueva York (1995), que se incorpora aquí mediante esta referencia.

De acuerdo con ello, otra realización de la presente invención es un anticuerpo recombinante de cadena sencilla (sFv) que incluye en él las regiones variables de un anticuerpo contra tacrolimus que: (1) compite con el anticuerpo monoclonal IgG_{1}\lambda designado como 1H6 y descrito anteriormente al menos aproximadamente 80% tan eficazmente sobre una base molar comparado con el anticuerpo monoclonal IgG_{1}\lambda designado como 1H6 medido mediante ensayos de competencia; y (2) tiene menos de aproximadamente 10% de reactividad cruzada con cada uno de los 15-desmetil tacrolimus, 31-desmetil tacrolimus, 13,31-didesmetil tacrolimus, 15,31-didesmetil tacrolimus, y 12-hidroxi tacrolimus.

Las estrategias para la producción de anticuerpos de cadena sencilla sFv son bien conocidas en la técnica y se encuentran descritas, por ejemplo, por C.A.K. Borrebaeck, en Antibody Engineering, (véase cita anterior). En general, la construcción de un sFv implica la manipulación de regiones variables de cadena pesada y ligera, las cuales deben conectarse al nivel de gen mediante una secuencia oligonucleótida de codones para un conector péptido apropiado. El conector debe conectarse a los dominios V_{H} y V_{L} del Fv elegido sin perturbar los contactos interdominios o interferir con el plegamiento de dominios. Un conector típicamente usado es un péptido de 15 restos que consiste en 3 unidades repetidas, cada una de las cuales tiene cuatro restos glicina seguidos de un resto serina (J.S. Huston y otros, "Protein Engineering of Antibody Binding Sites: Recovery of Specific Activity in an Anti-Digoxin Single-Chain Fv Analog produced in Escherichia coli", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 85, págs. 5879-5883 (1988)). Típicamente, dichos anticuerpos de cadena sencilla se producen en cuerpos de inclusión en bacterias. Típicamente, la actividad requiere el replegamiento de los polipéptidos expresados procedentes de cuerpos de inclusión; las condiciones para la realización son generalmente bien conocidas.

De acuerdo con ello, dichos anticuerpos de cadena sencilla o sFv están igualmente dentro del alcance de la presente invención.

Otra realización todavía de la presente invención es un anticuerpo monoclonal contra tacrolimus producido mediante fusión de células que producen anticuerpos procedentes de un mamífero que produce anticuerpos inmunizado con tacrolimus derivado con un resto carboximetil oxima en un átomo de carbono en el dominio de no unión del tacrolimus conjugado con una proteína de alto peso molecular con una pareja de fusión adecuada. Preferiblemente, el átomo de carbono en el dominio de no unión del tacrolimus es el carbono 22. Tal como se ha indicado anteriormente, típica-
mente, la proteína de alto peso molecular usada para la inmunización es hemocianina de lapa tipo ojo de cerradura.

La preparación de anticuerpos monoclonales es bien conocida en la técnica y no necesita ser descrita con más detalle aquí. Por ejemplo, la producción de anticuerpos monoclonales está descrita por J.W. Goding, en Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, (2ª. Ed., Academic Press, Londres (1986)).

En general, la primera etapa del procedimiento es la producción de anticuerpos monoclonales mediante técnicas convencionales, tal como inmunización de un animal que produce anticuerpos tal como un ratón, una rata, una cabra, una oveja, o una vaca, con el antígeno. Típicamente, el antígeno se acopla a un vehículo de alto peso molecular tal como una proteína de alto peso molecular, tal como se ha expuesto anteriormente. La inmunización puede llevarse a cabo con o sin un adyuvante tal como adyuvante de Freund completo u otros adyuvantes tal como adyuvante monofosforil lípido A y dicorinomicolato de tetrahalosa sintético; generalmente, se prefiere inmunizar con un adyuvante. La siguiente etapa es aislar células de bazo procedentes de animales que producen anticuerpos y fusionar las células de bazo que producen anticuerpos con una pareja de fusión apropiada, típicamente una célula de mieloma, tal como mediante el uso de polietilenglicol u otras técnicas. Típicamente, las células de mieloma usadas son aquellas que se desarrollan normalmente en medio de hipoxantina-timidina (HT), pero que no pueden desarrollarse en medio de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), usado para la selección de las células fusionadas. La siguiente etapa es la selección de las células fusionadas, típicamente mediante selección en medio HAT. La siguiente etapa es rastrear los híbridos clonados para determinar la producción del anticuerpo apropiado usando inmunoensayos tal como el ensayo inmunoenzimático (ELISA) u otros inmunoensayos apropiados para rastreo. Al igual que anteriormente, estas etapas son bien conocidas en la técnica y no necesitan ser descritas con más detalle aquí.

Otra realización de la presente invención es un anticuerpo, el cual puede ser anticuerpo policlonal, contra tacrolimus producido mediante inmunización de un mamífero que produce anticuerpos con tacrolimus derivado con un resto carboximetil oxima en un átomo de carbono en el dominio de no unión del tacrolimus conjugado con una proteína de alto peso molecular tal como se ha descrito anteriormente. Preferiblemente, el átomo de carbono en el dominio de no unión del tacrolimus es el carbono 22.

Otro aspecto de la presente invención es un conjugado que comprende un anticuerpo de la presente invención tal como se ha descrito anteriormente, directa o indirectamente conjugado con un marcador detectable. El anticuerpo puede conjugarse directamente al marcador detectable de manera tal que exista un enlace covalente entre el marcador y el anticuerpo. Dichos procedimientos son bien conocidos en la técnica; dichas técnicas están descritas, por ejemplo, por G.T. Hermanson, en Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996). En general, dichas técnicas ligan grupos reactivos sobre el anticuerpo y el marcador, típicamente a través de un conector o espaciador. La longitud del conector o espaciador puede ajustarse para preservar la actividad y especificidad del anticuerpo y para asegurar que el marcador produce la señal detectable sin interferir con la actividad del anticuerpo.

Dichos marcadores son bien conocidos en la técnica y no necesitan ser descritos con más detalle aquí. Dichos marcadores pueden incluir, pero sin limitarse a ellos, un marcador de enzima, un marcador radioactivo, un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente, un marcador bioluminiscente, o un marcador en partículas.

Los marcadores de enzima son bien conocidos en la técnica. Típicamente, la enzima usada es una que produce una señal detectable visualmente tal como un producto coloreado o un producto insoluble. Entre las enzimas que pueden usarse se encuentran la peroxidasa de rábano picante, \beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa, ureasa, catalasa, lisozima, malato deshidrogenasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, y ribonucleasa A. Otras enzimas que pueden usarse para inmunoensayos son bien conocidas en la técnica.

Entre los marcadores en partículas que pueden usarse están los marcadores de látex y marcadores de metal coloidal tal como oro, plata, estaño y otros metales coloidales.

Una gran variedad de marcadores radiactivos, fluorescentes, quimio-luminiscentes, y bioluminiscentes son conocidos en la técnica. Estos marcadores no necesitan ser descritos con más detalle aquí.

Como una alternativa a un enlace directo covalente entre el anticuerpo y el marcador, el enlace puede ser indirecto a través de un enlace biotina-avidina. La unión de biotina a avidina o su análogo bacteriano estreptavidina es bien conocida en la técnica. Esta unión es altamente específica y tiene una afinidad extremadamente alta. Típicamente, el anticuerpo se conjuga a un resto biotina y el marcador se une a avidina o estreptavidina. Igualmente, pueden usarse otras disposiciones. El uso de un enlace avidina-biotina está descrito, por ejemplo, por G.T. Hermanson, véase cita anterior, págs. 570-592.

III. Inmunoensayos

Otro aspecto de la presente invención son inmunoensayos para tacrolimus que usan los anticuerpos descritos anteriormente. En general, un inmunoensayo de este tipo es un procedimiento de detección o determinación de tacrolimus. El término "detección" se usa aquí para referirse a un ensayo cualitativo que detecta la presencia o ausencia de tacrolimus en una muestra, en tanto que el término "determinación" se refiere a un ensayo cuantitativo o semicuantitativo que determina la concentración de tacrolimus en la muestra.

En general, un procedimiento de inmunoensayo comprende las etapas de:

(1) suministro de una muestra sospechosa de contener tacrolimus;

(2) reacción de la muestra con:

(a): un anticuerpo frente a tacrolimus tal como se ha descrito anteriormente; y

(b): opcionalmente, con un análogo de tacrolimus; en el que uno del anticuerpo o el análogo de tacrolimus se marca con un marcador que produce una señal detectable; y

(3) observación o medición de uno de:

(a): una señal asociada con tacrolimus unido al anticuerpo;

(b): una señal asociada con tacrolimus no unido al anticuerpo; o

(c): la señal total presente para detectar o determinar la presencia o concentración de tacrolimus en la muestra.

Dichos ensayos se describen o bien como homogéneos o bien como heterogéneos. En un ensayo heterogéneo, el anticuerpo unido al antígeno se separa del anticuerpo no unido al antígeno. Esta separación puede realizarse mediante un cierto número de etapas bien conocidas en la técnica, tales como solubilidad diferencial, reactividad con otro anticuerpo, u otras propiedades. Dichos ensayos son bien conocidos en la técnica y no necesitan ser descritos con más detalle aquí. Si, o bien la señal asociada con tacrolimus unido al anticuerpo o bien la señal asociada con tacrolimus no unido al anticuerpo ha de ser detectada o determinada, se realiza un ensayo heterogéneo. Por el contrario, en un ensayo homogéneo, se detecta o determina la señal total presente. En un ensayo homogéneo, la existencia de un complejo antígeno-anticuerpo modula la señal de manera tal que el nivel de señal cambia sin una exigencia de separación del antígeno unido al anticuerpo del antígeno no unido al anticuerpo.

Aunque muchos formatos de inmunoensayos heterogéneos son bien conocidos en la técnica, en el contexto de la presente invención, generalmente se prefiere usar un sistema de inmunoensayo homogéneo. Un ejemplo de un sistema de inmunoensayo homogéneo preferido para el inmunoensayo de tacrolimus usando anticuerpos de acuerdo con la presente invención, es el sistema de inmunoensayo conocido como EMIT, tal como ha sido descrito por D.D. Schottelius, en "Homogeneous Immunoassay System (EMIT) for Quantitation of Antiepileptic Drugs in Biological Fluids", Antiepileptic Drugs: Quantitative Analysis and Interpretation, C.E. Pipenger y otros, Raven Press, Nueva York, Cap. 10, págs. 98-101 (1978) y descrito adicionalmente en la Patente de EE.UU. No. 3.817.837, de Rubenstein y otros.

En general, en este ensayo, una enzima tal como glucosa-6-fosfato deshidrogenasa se conjuga con el analito (en este caso, tacrolimus) a ensayar de una forma tal que no altera de manera significativa la actividad de la enzima. Sin embargo, cuando este conjugado enzima-analito se une al anticuerpo por el analito, la configuración es tal que el sitio activo de la enzima se bloquea y, de esta forma, excluye al substrato. Esto da como resultado que se reduzca la actividad de la enzima. Cuando el complejo no está unido, el sitio activo está disponible para interactuar con el substrato. Si existe analito libre presente en la muestra desconocida, en ese caso, el analito libre se une al anticuerpo. Esto previene la unión del conjugado enzima-analito y disminuye la activación inducida por el anticuerpo de la actividad de la enzima en proporción a la concentración del analito en la muestra. De acuerdo con ello, en un ensayo homogéneo de este tipo, cuanto mayor sea la concentración del analito en la muestra, mayor será la señal producida por el marcador de enzima. Esto es un ensayo homogéneo tal como se ha descrito anteriormente.

IV. Kits de ensayo

Otro aspecto de la presente invención es un kit de ensayo, particularmente para uso en el inmunoensayo homogéneo EMIT descrito anteriormente.

Un kit de ensayo de este tipo comprende, envasado en recipientes separados:

(1) un anticuerpo tal como se ha descrito anteriormente; y

El análogo de tacrolimus puede ser marcado bien directa o bien indirectamente; generalmente, se prefiere que el análogo de tacrolimus esté marcado indirectamente con una molécula de tacrolimus biotinilada y una enzima estreptavidinilada. No obstante, el tacrolimus puede acoplarse al carbono 22 con una enzima adecuada para uso en el ensayo EMIT tal como se ha descrito anteriormente.

Igualmente, los kits de ensayo puede incluir, en recipientes envasados por separado, otros ingredientes tales como substratos, tampones, estabilizadores, coenzimas, y otros ingredientes requeridos para la realización del inmunoensayo.

La invención se ilustra mediante los Ejemplos siguientes. Los Ejemplos son únicamente con fines ilustrativos, no estando destinados a limitar la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de derivados de tacrolimus substituidos en el carbono 22

Con el fin de determinar la posibilidad de derivación de tacrolimus en el carbono 22, como un modelo para esta molécula, se llevó a cabo la derivación de la molécula relacionada íntimamente FK-520. La FK-520 tiene la misma estructura que el tacrolimus, excepto que tiene un grupo etilo en lugar de uno alilo en el carbono 21.

Para estos experimentos, los reactivos y disolventes fueron de calidad comercial y se usaron tal como fueron suministrados sin purificación adicional. La reacción con FK-520 en una escala pequeña (0,9 mg) se llevó a cabo tal como sigue: A una solución de FK-520 (0,9 mg, 1,1 \mumol) en 0,23 ml de metanol se agregó acetato sódico (1,5 mg, 18,3 \mumol, 16 equiv.) y clorhidrato de carboximetoxil amina (3,0 mg, 13,7 \mumol, 12 equiv.). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas bajo argón. A continuación, se evaporó el disolvente mediante purgado con una corriente de argón. La cromatografía de capa fina en CH_{2}Cl_{2}/EtOAc/MeOH/HOAc (5:6:1,1:0,5%) sobre placas de Analtech (tamaño 10x20 cm, 250 micras) del residuo, proporcionó 2 isómeros geométricos de monooximas de FK-250, suficientes para ser analizados mediante espectrometría de masas por bombardeo de átomos rápidos. La LSIMS de C_{45}H_{72}N_{2}O_{14} era de esperar que proporcionara un [M-H]^{-} de 863,3. En las Figuras 1 y 2 se muestran las partes relevantes de los resultados de la espectroscopía de masas. La Figura 2 es una parte del espectro mostrado en la Figura 1 ampliado alrededor del pico central.

A continuación, se usó un procedimiento análogo para preparar la monooxima de tacrolimus. El tacrolimus se suministró en forma de una mezcla sólida en una cápsula que contenía 1,02 mg de monohidrato de tacrolimus y aproximadamente un exceso de 6 veces de dodecilsulfato sódico (SDS). La mezcla sólida procedente de 30 cápsulas se combinó y se extrajo 4 veces con 12 ml cada vez de acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se concentraron bajo un vacío, proporcionando 49 g de tacrolimus bruto, el cual se usó directamente en la reacción siguiente.

A los 49 mg de tacrolimus bruto (teóricamente 36,5 \mumol) en 3,5 ml de metanol, se agregó acetato sódico (16,7 mg, 204 \mumol, 5,6 equiv.), y clorhidrato de carboximetoxilamina (40 mg, 183 \mumol, 5 equiv.). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 12 horas bajo argón. El disolvente y los materiales volátiles se eliminaron a presión reducida, proporcionando un residuo sólido bruto. La cromatografía de capa fina preparativa sobre placas de Analtech (20x20 cm, 1.000 micras) en CH_{2}Cl_{2}/EtOAc/MeOH/HOAc (30:70:11:0,6) del producto bruto, proporcionó isómeros geométricos de monooximas de tacrolimus en forma de sólido de color blanco. La LSIMS de C_{46}H_{72}N_{2}O_{14} era de esperar que proporcionara 899,4 en forma de [M+Na]^{+} y 915,4 en forma de [N+K]^{+}. En las Figuras 3 y 4 se muestran los resultados. La Figura 4 representa los datos de la Figura 3 a una mayor resolución centrada alrededor de la parte relevante del espectro.

La ^{1}H NMR a 250 MHz en CDCl_{3} del producto de la reacción del clorhidrato de carboximetoxilamina con tacrolimus se muestra en la Figura 5. La ^{13}C NMR a 250 MHz en CDCl_{3} del producto de la reacción del clorhidrato de carboximetoxilamina con tacrolimus se muestra en la Figura 6. La ^{13}C NMR a 500 MHz en CDCl_{3} mostrada en la Figura 7 es la del tacrolimus como una referencia (es decir, tacrolimus no derivado). Todos los espectros de NMR se registraron sobre instrumentos Bruker.

Ejemplo 2 Preparación de conjugado de tacrolimus-hemocianina de lapa tipo ojo de cerradura

A una solución de monooxima de tacrolimus (32,3 mg, 36,8 \mumol) en 1,05 ml de dimetilformamida anhidra se agregó clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil)carbodiimida (EDAC) (11 mg, 57,4 \mumol, 1,5 equiv.) y N-hidroxisuccinimida (7,3 mg, 63,4 \mumol, 1,7 equiv.). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora bajo argón. A continuación, la mezcla se agregó gota a gota mediante una jeringa a una solución de hemocianina de lapa de tipo ojo de cerradura (74 mg, 54% de pureza) en 5,0 ml de solución salina tamponada con fosfato (0,1 M, pH 8,0) y 0,25 ml de dimetilformamida. Después de agitación a temperatura ambiente durante 2 horas, la suspensión resultante se dializó (1x4 l, 4ºC, 2 horas) frente a PBS (10 mM, pH 7,0).

A continuación, la mezcla resultante se extrajo 3X con CH_{2}Cl_{2} para eliminar cualquier cantidad traza de monooximas de tacrolimus sin reaccionar. El análisis cuantitativo de la mezcla se llevó a cabo usando solución de ensayo de proteína de ácido bicinconínico (BCA), proporcionando 50 mg de inmunógeno en 8 ml de PBS (10 mM, pH 7,0).

La determinación del número de haptenos usando el procedimiento TNBS (A.F.S.S. Habeeb, Anal. Biochem., vol. 14, pág. 328 (1966)), proporcionó un número de haptenos de 1300. El inmunógeno se congeló inmediatamente usando un baño de hielo-acetona y se mantuvo a -20ºC para almacenamiento.

Ejemplo 3 Preparación de conjugado de tacrolimus-biotina

A una solución de monooxima de tacrolimus (12 mg, 13,7 \mumol) en 0,3 ml de dimetilformamida anhidra se agregó EDAC (4 mg, 20,9 \mumol, 1,5 equiv.) y N-hidroxisuccinimida (2,7 mg, 23,4 \mumol, 1,7 equiv.). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora bajo argón. A esta se agregó trietilamina (10 \mul, 75 \mumol) y una solución de LC-biotina (10 mg, 25 \mumol, 2 equiv.) en 1,0 ml de DMF. La agitación se continuó durante otras 3 horas y la mezcla se concentró bajo vacío, proporcionando un residuo incoloro. La cromatografía de capa fina preparativa de fase inversa (PTLC) del producto bruto sobre una placa C-18 de Whatman (PKLC_{18}F, 20x20 cm, 1.000 micras) en MeOH/H_{2}O (13:7), proporcionó 8 mg del producto en forma de sólido de color blanco. El resultado esperado procedente de la LSIMS de C_{64}H_{103}N_{7}O_{16}S era [M+H]^{+} de 1258,5. En las Figuras 8 y 9 se muestran los resultados de la espectroscopía de masas. La Figura 9 representa una sección del espectro de la Figura 8 a mayor resolución centrada alrededor de la región de interés. Se realizó la ^{1}H NMR a 350 MHz en CDCl_{3}; los resultados se muestran en la Figura 10.

Este es un ejemplo de derivación de tacrolimus en la posición 22.

Ejemplo 4 Preparación de derivado bromoacetilo de tacrolimus

Otro derivado de tacrolimus derivado en la posición 22 es un derivado bromoacetilo. El derivado bromoacetilo puede reaccionar con un resto sulfhidrilo de una enzima u otra proteína para producir un conjugado tacrolimus-enzima.

Para formar el derivado bromoacetilo de tacrolimus, se agregó, en primer lugar, a una solución de bromoacetato de succinimidilo (740 mg, 3,14 mmol) en 6 ml de tetrahidrofurano (THF) a 4ºC bajo argón, gota a gota mediante una jeringa, mono-N-BOC-etilenodiamina pura. Una vez completada la adición, la reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 3 horas. A continuación, la solución de la reacción se concentró en vacío, y el residuo se disolvió en acetato de etilo. La capa de acetato de etilo se lavó con H_{2}O una vez, con NaHCO_{3} acuoso saturado dos veces, y con salmuera una vez, se secó sobre MgSO_{4}, y se evaporó hasta sequedad, proporcionando 440 mg de sólido bruto de color blanco. La purificación sobre gel de sílice usando Chromatotron (MeOH/CH_{2}Cl_{2}, 1:19), proporcionó 386 mg de bromoacetiletilendiamina-mono-t-BOC en forma de un sólido de color blanco.

A una solución de bromoacetiletilendiamina-mono-t-BOC (50 mg, 0,178 mmol) en 2 ml de CH_{2}Cl_{2} a temperatura ambiente, se agregó gota a gota mediante una jeringa ácido trifluoroacético (TFA) puro (0,29 ml, 3,76 mmol). La reacción se agitó durante 3 horas y, a continuación, se concentró bajo vacío. Las cantidades traza de TFA se eliminaron azeotrópicamente con tolueno, y el producto aceitoso de color amarillo resultante, la sal TFA de bromoacetiletilendiamina, se usó directamente en la reacción siguiente.

A una solución del derivado carboximetil oxima de tacrolimus (derivado en la posición 22) (100 mg, 0,14 mmol) y N-hidroxisuccinimida (NHS) (19 mg, 0,165 mmol) en 2 ml de THF bajo argón, se agregó mediante una jeringa diisopropilcarbodiimida (DIC) (23 \mul, 0,147 mmol) pura. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas y, a continuación, se transfirió mediante una jeringa a una solución de la sal TFA de bromoacetiletilendiamina (0,178 mmol) en 3 ml de THF. A continuación, a esta solución de reacción se agregó diisopropiletilamina (DIEA) (40 \mul, 0,23 mmol) pura. La agitación se continuó durante 2,5 horas y la reacción se concentró en vacío, proporcionando un aceite bruto. La purificación sobre cromatografía de capa fina preparativa (TLC) (EtOAc/CH_{2}Cl_{2}/MeOH, 7:3:1), proporcionó 44 mg (37%) de bromoacetil tacrolimus en forma de un sólido incoloro.

Ejemplo 5 Preparación del anticuerpo monoclonal contra tacrolimus

La preparación del anticuerpo monoclonal contra tacrolimus se llevó a cabo tal como sigue. El inmunógeno fue el conjugado de tacrolimus con hemocianina de lapa tipo ojo de cerradura del Ejemplo 2. Este inmunógeno se usó para inmunizar ratones Balb/c. La primera inmunización fue de 25 \mug en un volúmen de 200 \mul con monofosforil lípido A y adyuvante dicorinomicolato de trehalosa síntético (emulsión RIBI MPL + TDM, RIBI ImmunoChem Research Inc.) intraperitonealmente. Cinco semanas después se administró una inmunización de refuerzo con 25 \mug del inmunógeno en 200 \mul de monofosforil lípido A y adyuvante dicorinomicolato de trehalosa síntético intraperitonealmente. Posteriormente, después de otras 8 semanas, se administró una prefusión de refuerzo de los 25 \mug del inmunógeno en 200 \mul de solución salina equilibrada de Hanks intravenosa e intraperitonealmente.

Tres días después se llevó a cabo la fusión mediante procedimientos convencionales usando un mieloma múrido no secretante designado como P3x63-AG8.653.

La clonación se realizó mediante procedimientos convencionales.

Los clones se rastrearon mediante el siguiente procedimiento de inmunoensayo ELISA inverso, de acuerdo con el protocolo siguiente. Las placas se recubrieron con IgG anti-ratón de cabra policlonal (IgG + IgA + IgM) (Zymed) a una concentración de 5 \mug/ml en solución salina tamponada de fosfato a razón de 100 \mul por pocillo. El recubrimiento de la placa se llevó a cabo durante 2 horas o más a temperatura ambiente, o durante una noche a aproximadamente 4ºC; las placas se pueden almacenar envueltas en una película a aproximadamente 4ºC durante varios días. A continuación, las placas se secaron con pequeñas sacudidas y se bloquearon con 300 \mul por pocillo de diluyente de tampón de bloqueo (albúmina de suero bovino al 0,5%, Tween 20 al 0,05% en PBS). El bloqueo de la placa se llevó a cabo mediante incubación durante 15 minutos o más a temperatura ambiente con sacudimiento de la placa. A continuación, las placas se secaron con pequeñas sacudidas. El anticuerpo monoclonal a rastrear se agregó, a continuación, a cada pocillo tal como sigue: se agregaron 50 \mul por pocillo de diluyente de tampón de bloqueo conjuntamente con 50 \mul por pocillo de sobrenadante de cultivo transferido a partir del pocillo correspondiente en la placa de desarrollo por fusión. La incubación tuvo lugar durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente con sacudimiento de las placas. La placa se lavó usando un lavador de placas Titerteck Plus con apilador S20 siendo el tampón de lavado PBS con Tween 20 al 0,05%. A 100 \mul por cavidad, se agregó un conjugado de enzima de tacrolimus covalentemente acoplado con glucosa-6-fosfato deshidrogenasa diluido en diluyente de tampón de bloqueo a una relación de 1:4000. La incubación se llevó a cabo durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente con sacudimiento. A continuación, la placa se lavó y se agregó una solución cromogénica a un volúmen de 100 \mul por cavidad. La solución cromogénica contenía violeta de p-yodonitrotetrazolio 0,593 mM, NAD 0,02 M, glucosa-6-fosfato 0,003 M, Tris 0,055 M, azida sódica al 0,02%, y una dilución 1:4000 de diaforasa (lipoil deshidrogenasa) (Sigma, St. Louis, MO). El BSA estaba presente al 1% (vol/vol) de una solución de BSA al 5% p/vol. El BSA se usó para ayudar a prevenir la rápida precipitación de violeta de p-yodonitrotetrazolio reducido.

A partir del rastreo, se seleccionó un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal adecuado. Este se designó como 1H6 y es un anticuerpo IgG1\lambda. Este anticuerpo tiene una afinidad de unión por el tacrolimus de aproximadamente 3,7x10^{9} litros/mol, que reacciona de manera cruzada con 13-desmetil tacrolimus, y que tiene menos de aproximadamente 8% de reactividad cruzada con todos los metabolitos de tacrolimus siguientes: 15-desmetil tacrolimus; 31-desmetil tacrolimus; 13,31-didesmetil tacrolimus; 15,31-didesmetil tacrolimus; y 12-hidroxi tacrolimus.

Ejemplo 6 Comparación de reactividad cruzada con metabolitos de tacrolimus para el anticuerpo monoclonal del Ejemplo 4 y otros anticuerpos

El anticuerpo del Ejemplo 5, otro anticuerpo resultante de la clonación y designado como 14H04, y otros anticuerpos, se ensayaron para determinar su reactividad cruzada de metabolitos de tacrolimus (13-desmetil tacrolimus, 15-desmetil tacrolimus, 31-desmetil tacrolimus, 13,31-didesmetil tacrolimus, 15,31-didesmetil tacrolimus, y 12-hidroxi tacrolimus). Todos estos metabolitos, excepto el 12-hidroxi tacrolimus, se ensayaron a diversos niveles en hemolisato que contenía 10 ng/ml de tacrolimus; el 12-hidroxi tacrolimus se ensayó a 10 ng/ml sin tacrolimus en la muestra. En este ensayo, se usaron los extractos metanólicos. La curva patrón generada para este ensayo se verificó usando controles de fármaco inmunosupresor MORE al nivel 1-4, un control patrón para estos ensayos (More Diagnostics, Los Osos, California).

Todos los anticuerpos mostraron reactividad cruzada frente al 13-desmetil tacrolimus en grados variables. La reactividad cruzada se calculó mediante la fórmula siguiente: (valor de reacción cruzada (ng/ml) - valor de control del disolvente (ng/ml) x 100)/metabolito diana inoculado (ng/ml) = % de reactividad cruzada.

Los resultados se muestran en la Tabla 1. Con la excepción del 13-desmetil tacrolimus, el anticuerpo 1H6 del Ejemplo 5 tenía menos de 8% de reactividad cruzada con los otros analitos ensayados.

TABLA 1 Reactividad cruzada de anticuerpos con metabolitos de tacrolimus

1

Ejemplo 7 Inmunoensayo homogéneo usando anticuerpo monoclonal contra tacrolimus

Se llevó a cabo un inmunoensayo homogéneo contra tacrolimus basado en el procedimiento EMIT de acuerdo con el siguiente protocolo. Se pipeteó un volúmen (200 \mul) de muestra o patrón de calibración dentro de un tubo de microcentrífuga. Dentro del mismo tubo, se pipetearon 50 \mul de CuSO_{4} 300 mM conjuntamente con 200 \mul de metanol. La mezcla se tapó y batió durante 10 segundos y se centrifugó durante 5 minutos a 20.800xg. El sobrenadante se decantó dentro de un pocillo de muestras de un analizador Roche Cobas Mira de acuerdo con los parámetros patrón para dicho analizador. Dentro del soporte de reactivos del analizador se colocaron los reactivos siguientes: Reactivo A que contenía NaCl, Na_{2}EDTA, anticuerpo monoclonal anti-tacrolimus (1H6), nicotina-mida adenina dinucleótido (NAD), glucosa-6-fosfato, detergente (Pluronic 25R2), azida sódica, y n-metilisotiazolona a pH 5,5. El Reactivo B era Tris, pH 8,2, con Na_{2}EDTA, detergente (Pluronic 25R2), azida sódica, y n-metilisotiazolona. El Reactivo C era un conjugado de tacrolimus-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa a pH 7,0, en Na_{2}HPO_{4}, Na_{2}EDTA, albúmina de suero bovino, detergente (Pluronic 25R2), y azida sódica. Los soportes de muestra y reactivos se cargaron sobre el analizador y el ensayo se inició de acuerdo con los parámetros que se habían prefijado. Las velocidades de enzima se imprimieron durante el ensayo en términos de mili-od/min. En la Figura 11 se muestran las curvas de calibración para 1H6 y otro anticuerpo monoclonal designado como 14H04.

Ejemplo 8 Correlación entre el ensayo para tacrolimus usando anticuerpo monoclonal de la presente invención y el ensayo EMIT con el procedimiento LC/MS/MS

Se ensayaron una serie de muestras procedentes de 70 pacientes a los cuales se les habían administrado tacrolimus con el inmunoensayo homogéneo EMIT usando el anticuerpo monoclonal 1H6 de la presente invención, comparado con el procedimiento LC/MS/MS. El procedimiento LC/MS/MS es un procedimiento de ensayo para tacrolimus que usa cromatografía líquida seguida de espectroscopía de masas en tándem (P.J. Taylor y otros, "Sensitive, Specific Quantitative Analysis of Tacrolimus (FK506) in Blood by Liquid Chromatography-Electrospray Tandem Mass Spectrometry", Clin. Chem., vol. 42, págs. 279-285 (1996)). Los resultados se muestran en la Figura 12. Los resultados muestran una correlación muy alta, con un coeficiente de correlación de 0,929.

Ejemplo 9 Comparación de resultados usando el inmunoensayo homogéneo EMIT y LC/MS/MS usando muestras procedentes de pacientes con disfunción del hígado

Aunque el anticuerpo monoclonal 1H6 tiene reactividad cruzada substancialmente minimizada con los metabolitos de tacrolimus distintos del 13-desmetil tacrolimus, persiste algo de reactividad cruzada con 13-desmetil tacrolimus. Con el fin de determinar si la reactividad cruzada con 13-desmetil tacrolimus pudiera o no interferir con el uso de este anticuerpo en un inmunoensayo, se ensayó un panel de muestras procedentes de 70 pacientes que tenían disfunción grave del hígado y que estaban en espera de trasplante y estaban siendo administrados con tacrolimus, con el inmunoensayo EMIT usando el anticuerpo monoclonal 1H6, con el procedimiento LC/MS/MS, y con otro inmunoensayo disponible comercialmente para tacrolimus, el inmunoensayo IMx producido por Abbott. Típicamente, dichas muestras contienen niveles más altos de metabolitos de tacrolimus que las de aquellos pacientes a los que se les ha realizado un trasplante de órganos pero que tienen una función normal del hígado. Los niveles de tacrolimus se midieron sobre el panel de muestras usando estos tres ensayos.

En la Figura 13 se muestran los resultados para la comparación entre el ensayo EMIT y el ensayo LC/MS/MS y, en la Figura 14, para la comparación entre el ensayo EMIT y el ensayo Imx (Abbott). Para interprestar los resultados se usó el análisis de regresión de Deming; en la Tabla 2 se muestran los resultados. El ensayo EMIT que usa el anticuerpo monoclonal 1H6 tenía una concordancia más próxima con el LC/MS/MS que con el ensayo IMx de Abbott, en base a la pendiente de los resultados (véase Tabla 2), con una pendiente de 1,11 para EMIT y de 1,45 para IMx. La concentración promedio de las 70 muestras era de 6,79 ng/ml mediante LC/MS/MS, 6,96 ng mediante EMIT usando el anticuerpo monoclonal 1H6, y 7,93 ng/ml mediante IMx de Abbott. Dos muestras ensayadas estuvieron por encima del intervalo mediante IMx únicamente. El análisis de Bland-Altman de los 70 resultados se muestra en la Figura 15 para EMIT que usa anticuerpo monoclonal 1H6 y IMx de Abbott frente a LC/MS/MS. Estas representaciones ilustran que, en general, la variabilidad destacable de resultados frente a LC/MS/MS se produce con muestras de aproximadamente 10 ng/ml. El patrón de diferencia para LC/MS/MS frente al inmunoensayo fue similar para el ensayo EMIT usando anticuerpo monoclonal 1H6 y el ensayo IMx de Abbott.

TABLA 2 Correlación entre resultados de ensayos para tacrolimus en pacientes con lesión de hígado

2

\newpage

Incluso en aquellos pacientes que contienen altos niveles de metabolitos de tacrolimus, el ensayo que usa el anticuerpo monoclonal 1H6 en un inmunoensayo homogéneo EMIT, mostró un alto grado de correlación con respecto a otros procedimientos. De acuerdo con ello, la disfunción del hígado no puede causar un impacto severo sobre este ensayo usando este anticuerpo y los resultados implican que el control clínico de los pacientes mediante inmunoensayo puede llevarse a cabo de manera similar usando el inmunoensayo EMIT con el anticuerpo monoclonal 1H6 o el inmunoensayo IMx de Abbott previamente disponible para tacrolimus. Esto muestra la capacidad clínica del anticuerpo monoclonal 1H6.

Ventajas de la presente invención

La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal contra tacrollimus que minimiza la reactividad cruzada con metabolitos de tacrolimus. El anticuerpo monoclonal de la presente invención puede usarse en un inmunoensayo mejorado para tacrolimus que se correlaciona bien con otros procedimientos de inmunoensayos y procedimientos de ensayo no inmunológicos para tacrolimus. Un inmunoensayo que usa un anticuerpo monoclonal es adecuado para el control clínico de pacientes que reciben tacrolimus, incluyendo pacientes con función del hígado descompensada de los cuales se espera que tengan altos niveles de metabolitos de tacrolimus en su suero.

Claims

1. Un anticuerpo monoclonal contra tacrolimus que es un anticuerpo monoclonal IgG_{1}\lambda que tiene una afinidad de unión por el tacrolimus de aproximadamente 3,7x10^{9} litros/mol, que reacciona de manera cruzada con 13-desmetil tacrolimus, y que tiene menos de aproximadamente 8% de reactividad cruzada con todos los metabolitos de tacrolimus siguientes: 15-desmetil tacrolimus; 31-desmetil tacrolimus; 13,31-didesmetil tacrolimus; 15,31-didesmetil tacrolimus;y 12-hidroxi tacrolimus.

2. Un anticuerpo monoclonal contra tacrolimus que se produce por fusión de células que producen anticuerpos a partir de un mamífero no humano que produce anticuerpos inmunizado con tacrolimus derivado con un resto carboximetil oxima en un átomo de carbono en el dominio de no unión de tacrolimus conjugado con una proteína de alto peso molecular con una pareja de fusión adecuada y que dicho anticuerpo monoclonal:

(a) compite con el anticuerpo monoclonal IgG_{1}\lambda de acuerdo con la Reivindicación 1 al menos aproximadamente 80% tan eficazmente sobre una base molar comparado con el anticuerpo monoclonal IgG_{1}\lambda de acuerdo con la Reivindicación 1, medido mediante ensayos de competencia; y

(b) tiene menos de aproximadamente 10% de reactividad cruzada con cada uno de 15-desmetil tacrolimus, 31-desmetil tacrolimus, 13,31-didesmetil tacrolimus, 15,31-didesmetil tacrolimus, y 12-hidroxi tacrolimus.

3. Un anticuerpo recombinante de cadena sencilla (sFv) que incluye en él las regiones variables de un anticuerpo contra tacrolimus que se produce por fusión de células que producen anticuerpos a partir de un mamífero no humano que produce anticuerpos inmunizado con tacrolimus derivado con un resto carboximetil oxima en un átomo de carbono en el dominio de no unión de tacrolimus conjugado con una proteína de alto peso molecular con una pareja de fusión adecuada y que dicho anticuerpo:

4. El anticuerpo monoclonal de la Reivindicación 2, en el que al menos algunas de las regiones constantes del anticuerpo están reemplazadas por regiones constantes humanas de manera tal que el anticuerpo monoclonal está humanizado.

5. El anticuerpo monoclonal de las Reivindicaciones 2, 3 ó 4, en el que el anticuerpo compite al menos aproximadamente 90% tan eficazmente sobre una base molar como el anticuerpo monoclonal de acuerdo con la Reivindicación 1 y tiene menos de aproximadamente 8% de reactividad cruzada con cada uno de 15-desmetil tacrolimus, 31-desmetil tacrolimus, 13,31-didesmetil tacrolimus, 15,31-didesmetil tacrolimus y 12-hidroxi tacrolimus.

6. Un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal IgG_{1}\lambda contra tacrolimus que tiene una afinidad de unión por el tacrolimus de aproximadamente 3,7x10^{9} litros/mol, que reacciona de manera cruzada con 13-desmetil tacrolimus, y que tiene menos de aproximadamente 8% de reactividad cruzada con todos los metabolitos de tacrolimus siguientes: 15-desmetil tacrolimus; 31-desmetil tacrolimus; 13,31-didesmetil tacrolimus; 15,31-didesmetil tacrolimus; y 12-hidroxi tacrolimus.

7. Un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de la Reivindicación 2.

8. El anticuerpo de acuerdo con la Reivindicación 2 ó 3, en el que el tacrolimus está derivado en el átomo de carbono 22.

9. El anticuerpo de la Reivindicación 2 ó 3, en el que la proteína de alto peso molecular es hemocianina de lapa tipo ojo de cerradura.

10. Un conjugado que comprende el anticuerpo de acuerdo con una de las Reivindicaciones 1, 2, 3, 4 y 8 directa o indirectamente conjugado con un marcador detectable.

11. El conjugado de la Reivindicación 10, en el que el marcador detectable está seleccionado entre el grupo que consiste en un marcador de enzima, un marcador radiactivo, un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente, un marcador bioluminiscente, y un marcador en partículas.

12. El conjugado de la Reivindicación 11, en el que el marcador es un marcador de enzima.

13. Un procedimiento de detección o de determinación de tacrolimus, que comprende las etapas de:

(a) suministro de una muestra sospechosa de contener tacrolimus;

(b) reacción de la muestra con:

(i): el anticuerpo de acuerdo con una de las Reivindicaciones 1, 2, 3, 4 y 8; y

(ii): opcionalmente, un análogo de tacrolimus;

en el que uno del anticuerpo o el análogo de tacrolimus está marcado con un marcador que produce una señal detectable, y

(c) observación o medición de uno de:

(i): la señal asociada con tacrolimus unido al anticuerpo;

(ii): la señal asociada con tacrolimus no unido al anticuerpo; o

(iii): la señal total presente;

14. El procedimiento de la Reivindicación 13, en el que la muestra se hace reaccionar con un análogo de tacrolimus marcado con un marcador de enzima y la señal total presente se observa o mide para detectar o determinar la presencia o concentración de tacrolimus en la muestra.

15. Un kit de ensayo que comprende, envasado en recipientes separados:

(a) un anticuerpo de acuerdo con una de las Reivindicaciones 1, 2, 3, 4 y 8; y

(b) un análogo de tacrolimus marcado directa o indirectamente con un marcador de enzima.