JP2004149542A - ラパマイシン結合体及び抗体 - Google Patents

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Abstract

【課題】ラパマイシン結合体及びその抗体の提供する。
【解決手段】ラパマイシン又はその誘導体に特異的な抗体の産生、ラパマイシン又はその誘導体の量の測定、ラパマイシン結合タンパク質の単離及びラパマイシン又はその誘導体に特異的な抗体の検出のための免疫原性分子として有用なラパマイシン結合体を提供する。この発明はさらに、ラパマイシン又はラパマイシンの開環誘導体に特異的なモノクローナル抗体を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）又はその開環誘導体に特異的な抗体の産生、ラパマイシン又はその誘導体の量の測定、ラパマイシン結合タンパク質の単離及びラパマイシン又はその誘導体に特異的な抗体の検出のための免疫原性分子として有用なラパマイシン誘導体に関する。
ラパマイシンは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓによって産生されるマクロサイクリックトリエン抗生物質であり、特にｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのいずれにおいてもＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓに対して抗真菌活性を有することが見いだされた〔Ｃ．Ｖｅｚｉｎａら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．２８，７２１（１９７５）；Ｓ．Ｎ．Ｓｅｈｇａｌら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．２８，７２７（１９７５）；Ｈ．Ａ．Ｂａｋｅｒら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．３１，５３９（１９７８）；米国特許第３，９２９，９９２号；及び米国特許第３，９９３，７４９号〕。
ラパマイシン単独（米国特許第４，８８５，１７１号）又はピシバニールと組み合わせたラパマイシン（米国特許第４，４０１，６５３号）は抗腫瘍作用を有することが示されている。Ｒ．Ｍａｒｔｅｌら〔Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５，４８（１９７７）〕は、ラパマイシンが多発性硬化症用のモデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎モデル、リューマチ性関節炎モデルであるアジュバント関節炎モデルに有効であり、且つＩｇＥ様抗体の形成を有効に阻害し得ることを開示した。
ラパマイシンの免疫抑制作用は、ＦＡＳＥＢ ３，３４１１（１９８９）に開示されている。他のマクロサイクリック分子であるシクロスポリンＡ及びＦＫ−５０６も免疫抑制剤として有効であり、従って移植片拒否反応の予防に有用であることが示されている〔ＦＡＳＥＢ ３，３４１１（１９８９）；ＦＡＳＥＢ ３、５２５６（１９８９）；Ｒ．Ｙ．Ｃａｌｎｅら，Ｌａｎｃｅｔ １１８３（１９７８）；及び米国特許第５，１００，８９９号〕。
ラパマイシンはまた、全身性エリテマトーデス〔米国特許第５，０７８，９９９号〕、肺の炎症〔米国特許第５，０８０，８９９号〕、インシュリン依存性真性糖尿病〔Ｆｉｆｔｈ Ｉｎ．Ｃｏｎｆ．Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．Ａｓｓｏｃ．１２１（Ａｂｓｔｒａｃｔ），（１９９０）〕、成人のＴ細胞白血病／リンパ腫〔欧州特許出願公開第５２５，９６０号〕、並びに平滑筋細胞増殖及び脈管損傷後の血管内膜厚化〔Ｍｏｒｒｉｓ，Ｒ．Ｊ．Ｈｅａｒｔ Ｌｕｎｇ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １１（第２部）：１９７（１９９２）〕の予防及び治療にも有用であることが示されている。
ラパマイシンのモノ及びジアシル化誘導体（２８位及び４３位でエステル化された）は、抗真菌剤（米国特許第４，３１６，８８５号）として有用であることが示されており、ラパマイシンの水溶性プロドラッグ（米国特許第４，６５０，８０３号）の製造に用いられている。最近、ラパマイシンのナンバリング規約が変わった。従って、ケミカルアブストラクト命名法によれば、上記のエステルは３１位及び４２位に存在する。米国特許第５，１００，８８３号はラパマイシンのフッ素化エステルを開示している。
米国特許第５，１１８，６７７号はラパマイシンのアミドエステルを開示している。
米国特許第５，１１８，６７８号はラパマイシンのカルバメートを開示している。
米国特許第５，１３０，３０７号はラパマイシンのアミノエステルを開示している。
米国特許第５，１７７，２０３号はラパマイシンのスルホネート及びスルファメートを開示している。
米国特許第５，１９４，４４７号はラパマイシンのスルホニルカルバメートを開示している。
ＰＣＴ出願公開ＷＯ９２／０５１７９号はラパマイシンのカルボン酸エステルを開示している。
Ｙａｔｓｃｏｆｆは、ＨＰＬＣ法を用いてラパマイシンの量を１ｎｇ／ｍｌの感度で定量し得ると報告している〔Ｔｈｅｒ．ＤｒｕｇＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇ １４：１３８（１９９２）〕。この方法は時間がかかり、各試料は個別に検定しなければならない。
多くのタンパク質並びにシクロスポリンＡ〔Ｍｏｒｒｉｓ，Ｒ．Ｇ．，Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ １４：２２６−（１９９２）〕及びＦＫ５０６〔Ｔａｍｕｒａ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．１９：２３（１９８７）；Ｃａｄｏｆｆ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．２２：５０（１９９０）〕を含む種々の薬剤用のイムノアッセイが開発されている。タンパク質又は化合物の測定に開発された多種のイムノアッセイは、拮抗阻害、二重抗体、受容体−抗体相互作用、抗原の捕獲、ディップスティック、抗体又は受容体の捕捉、又はアフィニティークロマトグラフィーに基づいている。ラパマイシン類縁体がマトリックスに共有結合しているラパマイシンを有するアフィニティーカラムが報告されている〔Ｆｒｅｔｚ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：１４０９（１９９１）〕。これらのカラムはラパマイシン結合タンパク質の単離に用いられている。
本発明の説明
本発明は、構造
Figure 2004149542
 〔式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、水素又は−（Ｒ３−Ｌ−Ｒ４）ａ−であり；
Ｌは結合基であり；
Ｒ３は、カルボニル、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｐ（Ｏ）２−、−Ｐ（Ｏ）（ＣＨ３）−、−Ｃ（Ｓ）−及び−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択され；
Ｒ４は、カルボニル、−ＮＨ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−及び−Ｏ−からなる群から選択され；
ａ＝１〜５であり；
ｘ＝０〜１であり；
ｙ＝０〜１であり；
ｚは約１〜約１２０であり；
担体は、免疫原性担体材料、ディテクター担体材料若しくは固体マトリックス又はその塩であり、但し、Ｒ１及びＲ２は共に水素ではなく、ａが１より大きい場合には各Ｌ基は同一でも異なっていてもよく、さらに、Ｒ１が水素の場合ｘは０であり、Ｒ２が水素の場合ｙは０であり、ｘ及びｙが共に１の場合、担体部分はどちらの場合も同一である〕
を有する式Ｉのラパマイシン結合体を提供する。
結合基Ｌは、一方の末端に基Ｒ３を、他方の末端にＲ４を含み、従って、結合基が一方の末端ではラパマイシンの４２−及び／又は３１−ヒドロキシル基に結合し、他方の末端では別の結合基又は免疫原性担体材料、ディテクター材料又はマトリックスに結合し得る任意の部分である。ａが１より大きい場合、各Ｌ基は同一でも異なっていてもよい。そのような場合、第１のＬ基はＬ１、第２のＬ基はＬ２というように称される。本発明のラパマイシン結合体は多岐にわたる結合基（Ｌ）及び末端官能基Ｒ４を含むように製造し得る。例えば、Ｌは、１〜１５個までの範囲、より一般的には１０個未満、通常６個未満の炭素原子を含む直鎖又は分枝鎖アルキレン（即ち、メチレン、エチレン、ｎ−プロピレン、ｉｓｏ−プロピレン、ｎ−ブチレンなど）であってよい。さらに、そのようなアルキレンは、シアノ、アミノ（置換アミノを含む）、アシルアミノ、ハロゲン、チオール、ヒドロキシル、カルボニル基、カルボキシル（置換カルボキシル、例えば、エステル、アミド及び置換アミドを含む）のような他の置換基を含んでいてよい。結合基Ｌは、置換若しくは非置換アリール、アラルキル又はヘテロアリール基（例えば、フェニレン、フェネチレンなど）も含んでいてよい。さらに、そのような結合基は、エーテル、エステル、アミド、アミノ、チオエーテル、アミジノ、スルホン又はスルホキシドの形態の、窒素、硫黄及び酸素から選択される１個以上のヘテロ原子を含んでいてよい。またそのような結合基は、オレフィン又はアセチレン結合、ジスルフィド、イミノ又はオキシイミノ基のような不飽和基を含んでいてよい。Ｌが、水素を除く１〜約２０個の原子、より一般的には１〜１０個の原子、そのうち０〜５個は好ましくは窒素、酸素及び硫黄から選択される原子を含む一般に脂肪族の鎖であるのが好ましい。従って、結合基Ｌの選択は、本発明にあっては重要ではなく、安定な化合物を確実に生成させるための通常の予防処置を講じて当業者が選択し得る。
本発明の好ましい実施態様は、構造
Figure 2004149542
 〔式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に水素又は−Ｒ３−Ｌ−Ｒ４−であり；
Ｌは−Ａ−（ＣＲ５Ｒ６）ｂ〔Ｂ−（ＣＲ７Ｒ８）ｄ〕ｅ−であり、
Ａは−ＣＨ２−又は−ＮＲ９−であり；
Ｂは−Ｏ−、−ＮＲ９−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−又は−Ｓ（Ｏ）２−であり；
Ｒ３は、カルボニル、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２、−Ｐ（Ｏ）２−、−Ｐ（Ｏ）（ＣＨ３）−、−Ｃ（Ｓ）−及び−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択され；
Ｒ４は、カルボニル、−ＮＨ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−及び−Ｏ−からなる群から選択され；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ独立に、水素、１〜６個の炭素原子を含むアルキル、２〜７個の炭素原子を含むアルケニル、２〜７個の炭素原子を含むアルキニル、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、７〜１０個の炭素原子を含むアリールアルキル、１〜６個の炭素原子を含むアミノアルキル、１〜４個の炭素原子を含むヒドロキシアルキル、１〜６個の炭素原子を含むアルコキシ、２〜７個の炭素原子を含むカルボアルコキシ、シアノ、アミノ、ＣＯ２Ｈ、又は１〜６個の炭素原子を含むアルキル、１〜６個の炭素原子を含むアルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、ハロ、ニトロ、２〜７個の炭素原子を含むカルボアルコキシ、トリフルオロメチル、アミノ又は−ＣＯ２Ｈから選択される置換基で任意にモノ、ジー又はトリ置換されるフェニルであり；
Ｒ９は、水素、１〜６個の炭素原子を含むアルキル又は７〜１０個の炭素原子を含むアラルキルであり；
ｂ＝０〜１０であり；
ｄ＝０〜１０であり；
ｅ＝０〜２であり；
ｘ＝０〜１であり；
ｙ＝０〜１であり；
ｚは約１〜約１２０であり；
担体は、免疫原性担体材料、ディテクター担体材料若しくは固体マトリックス、又はその塩であり、但し、Ｒ１及びＲ２は共に水素ではなく、ｂが１より大きい場合ＣＲ５Ｒ６基は同一でも異なっていてもよく、ｄが１より大きい場合、各ＣＲ７Ｒ８はそれぞれ同一でも異なっていてもよく、さらにＲ１が水素の場合ｘは０であり、Ｒ２が水素の場合ｙは０であり、ｘ及びｙは共に１の場合担体部分はどちらの場合も同一である〕
を有する式IIの結合体を提供する。
本発明の第２の好ましい実施態様は、構造
Figure 2004149542
 〔式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、水素又は−（Ｒ３−Ｌ１−Ｒ４）ｆ−（Ｒ１０−Ｌ２−Ｒ１１）ｇ−担体であり；
Ｌ１は−（ＣＨ２）ｈ−ＣＨＲ１２−（ＣＨ２）ｊ−であり；
Ｌ２は−（ＣＨ２）ｋ−Ｄ−（ＣＨ２）ｍ−Ｅ−であり；
Ｄは−ＣＨ２−、−Ｓ−Ｓ−又は
Figure 2004149542
 であり；
Ｅは−ＣＨ２−又は
Figure 2004149542
 であり；
Ｒ３及びＲ１０はそれぞれ独立に、カルボニル、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２、−Ｐ（Ｏ）２−、−Ｐ（Ｏ）（ＣＨ３）−、−Ｃ（Ｓ）−及び−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択され；
Ｒ４及びＲ１１はそれぞれ独立に、カルボニル、−ＮＨ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−及び−Ｏ−からなる群から選択され；
Ｒ１２は、水素、１〜６個の炭素原子を含むアルキル、７〜１０個の炭素原子を含むアリールアルキル、２〜７個の炭素原子を含むアルケニル、２〜７個の炭素原子を含むアルキニル、−（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｒ１３、−（ＣＨ２）ｐＮＲ１４Ｒ１５、２〜３個の炭素原子を含むカルバミルアルキル、１〜４個の炭素原子を含むアミノアルキル、１〜４個の炭素原子を含むヒドロキシアルキル、２〜４個の炭素原子を含むグアニルアルキル、１〜４個の炭素原子を含むメルカプトアルキル、２〜６個の炭素原子を含むアルキルチオアルキル、インドリルメチル、ヒドロキシフェニルメチル、イミダゾイルメチル、ハロ、トリフルオロメチル、又は１〜６個の炭素原子を含むアルキル、１〜６個の炭素原子を含むアルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、ハロ、ニトロ、２〜７個の炭素原子を含むカルボアルコキシ、トリフルオロメチル、アミノ又は−ＣＯ２Ｈから選択される置換基で任意にモノ−、ジ−又はトリ置換されるフェニルであり；
Ｒ１４及びＲ１５はそれぞれ独立に、水素、１〜６個の炭素原子を含むアルキル又は７〜１０個の炭素原子を含むアリールアルキルであり；
Ｒ１３は、水素、１〜６個の炭素原子を含むアルキル、７〜１０個の炭素原子を含むアリールアルキル、２〜７個の炭素原子を含むアルケニル、２〜７個の炭素原子を含むアルキニル、又は１〜６個の炭素原子を含むアルキル、１〜６個の炭素原子を含むアルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、ハロ、ニトロ、２〜７個の炭素原子を含むカルボアルコキシ、トリフルオロメチル、アミノ又は−ＣＯ２Ｈから選択される置換基で任意にモノ−、ジ−又はトリ置換されるフェニルであり；
ｆ＝０〜３であり；
ｇ＝０〜１であり；
ｈ＝０〜１０であり；
ｊ＝０〜１０であり；
ｋ＝０〜１０であり：
ｍ＝０〜１０であり：
ｎ＝０〜６であり；
ｐ＝０〜６であり；
ｘ＝０〜１であり；
ｙ＝０〜１であり；
ｚは約１〜約１２０であり；
担体は、免疫原性担体材料、ディテクター担体材料若しくは固体マトリックス、又はその塩であり、但し、Ｒ１及びＲ２は共に水素ではなく、ｆ及びｇは共に０ではなく、ｆが１より大きい場合、各−（Ｒ３−Ｌ１−Ｒ４）−部分は同一でも異なっていてもよく、さらにＲ１が水素の場合ｘは０であり、Ｒ２が水素の場合ｙは０であり、ｘ及びｙが共に１の場合、担体部分はどちらの場合も同一である〕
を有する式IIIの結合体を提供する。
本発明はさらに、構造
Figure 2004149542
 〔式中、Ｒ１は−ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｑＲ４−であり；
Ｒ４は、カルボニル、−ＮＨ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−及び−Ｏ−からなる群から選択され；
ｑ＝０〜６であり；
ｚは約１〜約１２０であり；
担体は、免疫原性担体材料、ディテクター担体材料若しくは固体マトリックス又はその塩である〕
を有する式IVの結合体を提供する。
免疫原性担体材料は、慣用的に用いられている公知の任意の材料から選択してよい。大抵の場合、担体はタンパク質又はポリペプチドであろうが、十分なサイズと免疫原性を有する炭水化物、多糖類、リポ多糖、核酸などのような他の材料を用いてもよい。大抵の場合、免疫原性タンパク質及びポリペプチドは、５，０００〜１０，０００，０００の範囲、好ましくは１５，０００より大きく、より一般的には４０，０００より大きい分子量を有している。
一般に、１つの動物種から採取したタンパク質は、他の種の血流中に導入されると免疫原性になる。特に有用なタンパク質は、アルブミン、グロブリン、酵素、ヘモシアニン、グルテリン又は有意な非タンパク性成分、例えば、糖タンパク質などを有するタンパク質のようなタンパク質である。慣用の免疫原性担体材料及び該担体材料にハプテンを結合させる方法に関する最新技術は以下の文献を参照されたい：Ｐａｒｋｅｒ，Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ（Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ Ｃｌｉｆｆｓ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ，１９７６），Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．７：１−２４（１９７５）及びＰｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．２９（２）；１０３−１６３（１９７８）；Ｗｅｉｎｒｙｂ及びＳｈｒｏｆｆ，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．１０：２７１−２８３ページ（１９７５）；Ｂｒｏｕｇｈｔｏｎ及びＳｔｒｏｎｇ，Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ２２：７２６−７３２ （１９７６）；並びにＰｌａｙｆａｉｒら，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．３０：２４−３１（１９７４）。本発明に用いるのに好ましい免疫原性担体材料は、オボアルブミン及びＫＬＨである。本発明に用いるのに特に好ましい担体材料はオボアルブミンである。ディテクター担体材料は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼのような酵素、フルオレセインセン又はフルオレセイン誘導体、テキサスレッド又はローダミンのような蛍光部分、化学発光部分などに結合したラパマイシン結合部分であってよい。固体マトリックス担体材料は、樹脂ビーズ、ＥＬＩＳＡプレート、ラジオイムノアッセイに慣用的に用いられているガラス板、プラスチックビーズ、一般にディップスティックタイプのアッセイに用いられる固体マトリックス材料であってよい。ラパマイシンが固体マトリックスに結合すると、得られた結合体は、本発明に開示されているように、抗体の親和性精製用又はラパマイシン結合タンパク質単離用のディップスティックアッセイに用いることができる。
上記の特異的ラパマイシン結合体を表す式に用いられている場合、ｚは担体材料に結合したラパマイシンの数を表す。値ｚは、免疫原、ディテクター又は固体マトリックスのエピトープ密度と称されることもあり、通常、平均して約１〜約１２０の範囲、より一般的には１〜５０の範囲である。
しかし該密度は用いられる特定の担体材料に応じて大きく変化し得る。
本発明の化合物がどれでも、アリール又はアリールアルキル部分を含む場合、該アリール部分は、１〜６個の炭素原子を含むアルキル、７〜１０個の炭素原子を含むアリールアルキル、１〜６個の炭素原子を含むアルコキシ、シアノ、ハロ、ニトロ、２〜７個の炭素原子を含むカルボアルコキシ、トリフルオロメチル、アミノ、アルキル基１個当たり１〜６個の炭素原子を含むジアルキルアミノ、１〜６個の炭素原子を含むアルキルチオ、−ＳＯ３Ｈ及び−ＣＯ２Ｈから選択される基で任意にモノ−、ジ−又はトリ置換されるよい、フェニル、ナフチル、ピリジル、キノリル、イソキノリル、キノオキサリル、チエニル、チオナフチル、フリリル、ベンゾフリル、ベンゾジオキシル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル又はベンゾジオキソリル基であるのが好ましい。アリール部分が、１〜６個の炭素原子を含むアルキル、７〜１０個の炭素原子を含むアリールアルキル、１〜６個の炭素原子を含むアルコキシ、シアノ、ハロ、ニトロ、２〜７個の炭素原子を含むカルボアルコキシ、トリフルオロメチル、アミノ、アルキル基１個当たり１〜６個の炭素原子を含むジアルキルアミノ、１〜６個の炭素原子を含むアルキルチオ、−ＳＯ３Ｈ及び−ＣＯ２Ｈから選択される基で任意にモノ−、ジ−又はトリ置換されるフェニル基であるのがより好ましい。
塩は、ナトリウム、カリウムなどのような無機カチオン、アルキル基１個につき１〜６個の炭素原子を含むモノ−、ジ−及びトリアルキルアミン及びアルキル基１個につき１〜６個の炭素原子を含むモノ−、ジ−、トリヒドロキシアルキルアミンなどのような有機塩基、並びに有機酸及び無機酸、例えば、酢酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、マロン酸、グルコン酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、メタンスルホン酸及び同様な公知の許容し得る酸から誘導されたものである。
本発明の化合物は、ラパマイシンの４２及び／又は３１−ヒドロキシル基とリンカー基部分としての役割を果たす適当な求電子試薬とを反応させて製造し得る。以下の特許明細書は、本発明の化合物を製造するための結合基として使用し得るラパマイシンの４２及び／又は３１−誘導体の製造を示している。ラパマイシンのフッ素化エステルの製造は、米国特許第５，１００，８８３号明細書に記載されている。
アミドエステルの製造は米国特許第５，１１８，６７７号明細書に開示されている。
ラパマイシンのカルバメートの製造は米国特許第５，１１８，６７８号明細書に開示されている。ラパマイシンのアミノエステルの製造は米国特許第５，１３０，３０７号明細書に記載されている。
ラパマイシンのスルホネート及びスルファメートの製造は米国特許第５，１７７，２０３号明細書に記載されている。
ラパマイシンのスルホニルカルバメートの製造は米国特許第５，１９４，４４７号明細書に記載されている。
上記に引用した米国特許の開示は本明細書に参考として組み込むものとする。
これらの特許から、カルバメートの製造に用いられるイソシアナート又はスルホネートの製造に用いられるスルホニルクロリドのような反応性求電子剤は活性化剤を用いる必要なしに、ラパマイシンのヒドロキシル基と反応し得ることがわかる。
カルボン酸を用いてラパマイシンのヒドロキシル基をエステル化するために、通常ＤＣＣ又はその水溶性類縁体、例えばジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＤＡＥＣ）のような結合試薬を用いた活性化が必要とされる。ラパマイシン結合基部分の製造の代表的な例を以下に実施例として示す。ラパマイシンの他の誘導体は実施例１８に開示されている方法を用いて達成し得る。
リンカー基が４２−ヒドロキシル基又は３１，４２−ヒドロキシル基に結合している本発明の化合物の場合は、求電子剤（又は活性化求電子剤）をラパマイシンと反応させて、典型的にはクロマトグラフィーによって分離可能な４２−及び３１，４２−誘導体化ラパマイシン混合物を得る。リンカー基がラパマイシンの３１−ヒドロキシルに結合している本発明の化合物の場合は、４２−ヒドロキシル基を適当な保護基、例えばｔ−ブチルジメチルシリル基で保護しなければならない。次いで３１−ヒドロキシルを適当な求電子剤と反応させて、誘導体化ラパマイシンを得、その後で４２−ヒドロキシル基の脱保護をする。ラパマイシンの４２−Ｏ−シリルエーテルの製造及びその後の脱保護は、米国特許第５，１２０，８４２号明細書に記載されており、該明細書は本明細書に参考として組み込むものとする。
種々のリンカーを３１位及び４２位に含む化合物は、先ず４２−誘導体化化合物を製造し、次いで種々のリンカーを用いて３１位を誘導体化することにより製造し得る。２７−オキシム結合基は、米国特許第５，０２３，２６４号明細書に開示されている方法を用い、実施例２１に記載のようにして製造することが可能である。
該特許明細書は、本明細書に参考として組み込むものとする。
ラパマイシンに結合したリンカー基は、ペプチド文献に記載されている標準的な方法を用い、典型的にはＤＣＣタイプの結合試薬若しくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて又は活性化エステル若しくは無水物として求電子部分を活性化することにより、第２のリンカー基に結合させることができる。次いで一方の結合部分の活性化求電子末端が他方のリンカー部分の求核末端と反応させることが可能である。
ラパマイシン結合基部分と免疫原性担体との結合は、標準的な文献記載条件下に行うことが可能である。一般に、免疫原性担体材料上の求核基との反応の場合は、結合基上のカルボン酸のような求電子部分をＮ−ヒドロキシスクシンイミドのような適当な活性化剤で活性化し、次いで免疫原性担体材料上の求核部分と反応させる。実施例２及び３は特にこの方法を示すものである。同様な方法が結合基上の求核部分と免疫原性担体材料上の求電子部分との結合に用いられる。そのような場合、免疫原性担体材料上の求電子部分を上記のように活性化し、次いで結合基の求核性末端と反応させる。
本発明の化合物の製造に用いられる試薬は、市販のものでもよいし、当該文献に開示されている方法により製造してもよい。
本発明はさらに、２９−デメトキシラパマイシン〔米国特許第４，３７５，４６４号明細書、Ｃ．Ａ．命名法下では３２−デメトキシラパマイシン〕；１−、３−及び／又は５位の二重結合が還元されているラパマイシン誘導体〔米国特許第５，０２３，２６２号明細書〕；４２−オキソラパマイシン〔米国特許第５，０２３，２６２号明細書〕；ラパマイシンの２７−オキシム〔米国特許第５，０２３，２６４号明細書〕；ラパマイシンの２７−ヒドラゾン〔米国特許第５，１２０，７２６号明細書〕；２９−デスメチルラパマイシン〔米国特許第５，０９３，３３９号明細書、Ｃ．Ａ．命名法下では３２−デスメチルラパマイシン〕；７，２９−ビスデスメチルラパマイシン〔米国特許第５，０９３，３３８号明細書、Ｃ．Ａ．命名法下では７，３２−デスメチルラパマイシン〕；並びに１５−ヒドロキシ−ラパマイシン及び１５，２７−ビスヒドロキシ−ラパマイシン〔米国特許第５，１０２，８７６号明細書〕のような他のラパマイシンの同類の結合体も包含し得るが、それらには限定されない。上記に引用した米国特許明細書に開示されている内容は本明細書に参考として組み込むものとする。ジエチルアジドジカルボキシレートが付加されたラパマイシン１，３−ディールス−アルダー付加化合物及びフェニルトリアゾリンジオンが付加されたラパマイシン１，３−ディールス−アルダー付加化合物の結合体も包含される。これらの化合物の製造は実施例１４及び１５に記載されている。
本発明の化合物は、ラパマイシン及びその誘導体に特異的な抗体の産生及び検出、生物学的又は実験用流体におけるラパマイシン若しくはその誘導体の量の測定及びラパマイシン結合タンパク質の単離のために有用なラパマイシンの免疫原、ディテクター及びマトリックスが結合した結合体である。本明細書に定義されているラパマイシン誘導体は、ラパマイシン核、ラパマイシン代謝物又は開環ラパマイシン（例えば、本明細書に参考として組み込まれる米国特許第５，２５２，５７９号に記載のセコラパマイシン）を含む化合物である。該化合物においては、１つ以上のヒドロキシル基がカルボン酸エステル、カルバメート、スルホン酸エステル、アミドなどにエステル化されているか、あるいは１つ以上のケトンがヒドロキシル基に還元されているか、あるいは１つ以上の二重結合が還元されているか、あるいは１つのケトンがオキシム又はヒドラゾンに変換されている。本発明の化合物を抗体量の測定又は抗体の産生に用い得る他のラパマイシン誘導体は、本発明の開示を基にすれば当業者には明らかであろう。
本発明のラパマイシン免疫原結合体を用いたラパマイシン又はその誘導体に特異的な抗体は、当該技術において公知の標準法により産生し得る。一般的には、宿主動物の１カ所以上の部位に免疫原結合体を単独又はアジュバントと組み合わせて接種する。典型的な宿主哺乳類には、マウス、ヤギ、ウサギ、モルモット、ヒツジ又はウマが含まれるが、それらには限定されない。十分なタイターを有する抗体が産生されるまで引き続き注射を行ってよい。本発明のラパマイシン免疫原結合体から産生した抗体は、ラパマイシン量の測定、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ及び蛍光イムノアッセイなど多くのイムノアッセイに用いることが可能である。多くの異種イムノアッセイ（抗原捕獲、抗体捕獲、拮抗阻害又は２抗体イムノアッセイ）を用いることが可能ではあるが、以下のような基本的な拮抗阻害イムノアッセイを行うことが可能である：リガンド特異抗体は通常マトリックスに結合する。溶液を加えて、リガンドとマトリックスの非特異的結合を弱める。場合によって、過剰物をリンスした後で抗体結合マトリックスを貯蔵し得るように処理する。拮抗阻害アッセイでは、リガンド標準曲線を作成し、ラパマイシンディテクター結合体を加えて、ラパマイシン特異抗体に結合するために競合させる。必要に応じて過剰物を除去する。当業者により用いられている標準法によりディテクター分子を検出する。ディップスティックアッセイ、ＦＰＩＡ、ＥＭＩＴ、ＥＬＩＳＡ、ＶＩＳＴＡ、ＲＩＡ及びＭＥＩＡを含む種々のフォーマットを用いてよいがそれらには限定されない。本発明のディテクター結合体を製造して上記のアッセイに用いることが可能である。例えば、ディテクター結合体は標識蛍光部分、化学発光部分又は酵素部分を含む担体材料であってよい。
本発明はさらに、市販し得る試験キットにおけるラパマイシン免疫原結合体又はラパマイシン若しくはその誘導体に特異的な抗体の使用を提供する。該試験キットは、生物学的又は実験用流体におけるラパマイシン量の測定に用い得る。試験キットの成分は、ラパマイシン若しくはその誘導体に対する抗体、抗血清又はラパマイシン担体結合体を含んでいてよい。結合体又は抗体は固体マトリックスに結合し得、ラパマイシン誘導体又は抗体はアッセイに必要な場合には放射標識し得る。標準濃度曲線を生成し得るようにラパマイシンの標準濃縮物を含んでいてよい。適当な容器、マイクロタイタープレート、固体支持体、試験管、トレイもそのようなキットに含まれていてよい。用いられるアッセイのタイプに応じてキット中に多様な試薬を含んでいてよい。
以下に、ラパマイシン又はその誘導体に特異的な抗体を産生するための及びＥＬＩＳＡフォーマットイムノアッセイを用いて該抗体を検出するための本発明のラパマイシン免疫原結合体の使用を示す。完全フロイントアジュバント中のグルタル酸とのラパマイシン３１，４２−ジエステルとＫＬＨとの結合体５０μｇで５匹のマウスに脾臓内免疫感作し、約１カ月後、完全フロイントアジュバント中のグルタル酸とのラパマイシン３１，４２−ジエステルとＫＬＨとの結合体５０μｇでフットパッド中に追加免疫した。マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ Ｉ）を一晩１００μｌのヤギ抗マウス抗体〔１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中１０μｇ／ｍｌ〕を用いて４℃でコーティングした。プレートを軽く振り、リン酸緩衝塩水中１００μｌの１％ウシ血清アルブミンを用いて４℃で一晩ブロックした。プレートを軽く振り、１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０５）、３０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び０．００４％のチメロサール洗浄緩衝液で３回洗浄した後、ウエルにリン酸緩衝溶液で希釈した各マウス血清１００μｌを加え、室温で一晩インキュベートした。プレートを軽く振り、洗浄緩衝液で３回洗浄した後、グルタル酸とのラパマイシン３１，４２−ジエステルと西洋ワサビペルオキシダーゼとの結合体〔実施例１０の化合物（１００μｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ）〕を加え、室温で１時間暗所でインキュベートした。プレートを軽く振り、洗浄緩衝液で３回洗浄した後、Ｈ２Ｏ２と共にテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を加え、プレートを室温で３０分間暗所でインキュベートした。４５０ｎｍの分光光度計で光学密度を読み取った。表１に示されているように、５匹のマウス全部がグルタル酸とのラパマイシン３１，４２−ジエステルと西洋ワサビペルオキシダーゼとの結合体（実施例１０の化合物）に反応性の抗体を有していた。
Figure 2004149542
表１の結果は、マウス６９０４が実施例１０の化合物に対して最高量の抗体を産生したことを示している。標準法を用いてハイブリドーマを産生した。実施例４の化合物を用いて免疫感作し、３回追加免疫したマウスの脾摘の後で、脾臓細胞をＳＰ２０と融合させてハイブリドーマを産生した。以下に簡単に説明するＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ラパマイシン又はその誘導体に特異的な抗体の産生についてハイブリドーマを評価した。
１００μｌのヤギ抗マウス抗体〔１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中１０μｇ／ｍｌ）を用いてマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ Ｉ）を一晩４℃でコーティングした。プレートを軽く振り、リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）中１００μｌの１％ウシ血清アルブミンを用いて一晩４℃でブロックした。プレートを軽く振り、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び０．００４％チメロサールを含む０．２×ＰＢＳで３回洗浄した後、ウエルに各ハイブリドーマ上清１００μｌを加え、室温で一晩インキュベートした。プレートを軽く振り、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び０．００４％チメロサールを含む０．２×ＰＢＳで３回洗浄した後、実施例２２の化合物（１００μｌ、０．１７μＭ）を加え、４℃で１時間インキュベートした。プレートを軽く振り、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び０．００４％チメロサールを含む０．２×ＰＢＳで３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（１００μｌ、 ０．２μｇ／ｍｌ）に結合したストレプトアビジン又はアビジンを加え、室温で１時間暗所でインキュベートした。プレートを軽く振り、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び０．００４％チメロサールを含む０．２×ＰＢＳで３回洗浄した後、ＴＭＢ基質及びＨ２Ｏ２を加え、プレートを被覆して室温で３０分間暗所でインキュベートした。４５０ｎｍの分光光度計で光学密度を読み取った。読み取られた光学密度が０．２５〜３の範囲であったことは、特異的抗体結合を示している。表２の結果は、ウエルＰ４Ｇ１由来のハイブリドーマが実施例２２の化合物に正の結合をしており、従ってラパマイシン又はその誘導体に特異的であることを示している。
Figure 2004149542
Ｐ４Ｇ１のハイブリドーマ細胞系を限界希釈によりクローン化し、ハイブリドーマ細胞系ＲＡＰ−４２−ＯＶＡＦ２＃１ｈｃ−と称する。蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）において、コハク酸とのラパマイシン４２−エステルと５−グリシニルフルオレセインアミンとの結合体（実施例２３ａ）を１０ｍＭの濃度でトレーサーとして用い、１００ｎＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）中、７７ｍＰの偏光を示した。過剰なＦＫＢＰ１２を添加した後では、測定された偏光は１９５ｍＰであり、過剰なＲＡＰ−４２−ＯＶＡＦ２＃１ＭｏＡｂを添加した後では、偏光は８４ｍＰであった。上記トレーサーの開環非酵素的転換産物（コハク酸とのセコラパマイシン４２−エステルと５−グリシニルフルオレセインアミンとの結合体、実施例２４）をＴＬＣプレート上で単離した（５０クロロホルム：４メタノール：０．５酢酸；３種の化合物の中最も遅く移動した）。
実施例２３及び２４のラパマイシン−及びセコラパマイシン−フルオレセイン誘導体は、ＦＫＢＰ１２及びＲＡＰ−４２−ＯＶＡＦ２＃１ＭｏＡｂに結合することを特徴としていた。１０ｎＭのラパマイシン−フルオレセイン１．００ｍＬに０．０１μｇのＦＫＢＰ１２を添加すると、蛍光偏光が５７ｍＰから１４８ｍＰに増大したが、セコラパマイシン−フルオレセイン誘導体の蛍光偏光は４９ｍＰから５８ｍＰに増大したにすぎず、これは、セコ誘導体がはるかに弱くしか結合しないことを示している。ラパマイシン誘導体に５μｇ／ｍｌのＲＡＰ−４２−ＯＶＡＦ２＃１ＭｏＡｂを添加すると、蛍光偏光は５８ｍＰで変わらないが、セコラパマイシン誘導体の蛍光偏光は４４ｍＰから１３６ｍＰに増大した。ＲＡＰ−４２−ＯＶＡＦ２＃１ＭｏＡｂがセコラパマイシン−フルオレセイン誘導体に特異的に結合するが、そのラパマイシン−フルオレセイン前駆体には結合しないことを示している。
これら２つの系の特異性はアッセイフォーマットでも示された。５００μｌの１０μｇ／ｍｌＲＡＰ−４２−ＯＶＡＦ２＃１に、ラパマイシン又はセコラパマイシンを加えて、０〜１００ｎＭの範囲の最終濃度にした。５００μＬの２０ｎＭセコラパマイシン−フルオレセインを添加すると、分析物の不在下では蛍光偏光は１２４ｍＰであり、１００ｎＭのラパマイシンの存在下での蛍光偏光は１２０ｍＰであり、１００ｎＭのセコラパマイシンの存在下では７４ｍＰであった。従って、セコラパマイシンはＲＡＰ−４２−ＯＶＡＦ２＃１に対するセコラパマイシンフルオレセイン誘導体の結合を阻害したが、ラパマイシンは何の作用もしなかった。逆の実験では、０．０２μｇ／ｍｌのＦＫＢＰ１２に、ラパマイシン又はセコラパマイシンを加えて、０〜１００ｍＭの最終濃度にした。２０ｎＭのラパマイシン−フルオレセイン５００μｌを加えると、分析物の存在下での蛍光偏光は１２８ｍＰであり、１００ｎＭのラパマイシンの存在下では６１ｍＰであり、１００ｎＭのセコラパマイシンの存在下では１２２ｍＰであった。この場合、ラパマイシンは結合を阻害したが、セコラパマイシンは何の作用もしなかった。
ラパマイシンに特異的な３４−２９４−１６３ＭｏＡｂと称される第２の抗体を以下のようにして製造した。６〜８週齢のメスＰＢＦ／ＤｎＪマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）を、フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）中で乳化したヘミスクシネートリンカーを含むウシ血清アルブミンに４２位で結合したラパマイシン（ＲＡＰＡ−４２−ＨＳ−ＢＳＡと称する）を用いて免疫感作した。フロイント完全アジュバントを用いて一次免疫感作し、次いでフロイント不完全アジュバントを用いて免疫追加した。この長期免疫感作動物用の動物の追加免疫間隔は、１、３、９及び１９週であり、動物１匹当たりそれぞれ５０、２５、２５及び１００μｇの用量レベルで、その都度２カ所の皮下位置で行った。動物に１４週の休養期間を与え、その後で融合の３日前に脾臓に５μｇの融合前追加免疫を投与した。
融合当日に、素早く頸管を脱きゅうさせてマウスを安楽死させ、脾臓を取り出した。脾臓細胞をＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）中で１度洗浄し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心した。ペレット化した脾臓細胞をＳＰ２／０骨髄腫細胞（Ｄｒ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）と１：１の割合で合わせ、ＩＭＤＭ中で洗浄、遠心した。上清を除去し、ペレットに１ｍｌの５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を１分間で加え、その間、ペレットがゆっくり分散するように軽くたたいたりかき回したりした。混合物にＩＭＤＭ３０ｍｌを加え、上記のように遠心した。上清をデカントし、ペレットをヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン（ＨＡＴ）（ＧＩＢＣＯ）及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）と共にＩＭＤＭに最懸濁した。融合頻度を高めるために、９６ウエルの組織培養プレートに入った融合細胞懸濁液に、０．５％のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍマイトジェンｖ／ｖ（ＳＴＭ；ＲＩＢＩ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔａｎａ）及び１％ｖ／ｖＯＲＩＧＥＮ（Ｉｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を加えた。
融合の一次スクリーニングは１０日目の集密期培養時に行った。ＥＩＡを用いて、上清試料中の抗ラパマイシンの反応性を検出した。マイクロタイターウエルを、リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）中２μｇ／ｍｌの４２−ＨＳ−ＢＳＡ溶液１００μｌでコーティングし、室温で２時間インキュベートした。プレートを１ウエル当たり２００μｌのＰＢＳ中３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間ブロックした。プレートを蒸留水で３回洗浄した後、１ウエル当たり１００μｌの培養上清を加え、３０分間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、３０分間のインキュベート時間中に、プレートに、ブロック溶液に希釈した１ウエル当たり１００μｌのヤギ抗マウスＩｇＧ＋Ｍ−ＨＲＰＯ結合体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を加えた。最後のプレート洗浄を行い、発色に、ｏ−フェニレンジアミン：２ＨＣｌ（ＯＰＤ）（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を用いる。光学密度読み取りの相対強度から、陰性対照である正常なマウス血清（ＮＭＳ）（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ−Ｃａｐｐｅｌ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）の少なくとも５倍のハイブリッド３４−２９４を同定し、該ハイブリッドをクローニング及びその後の評価用の候補として選択した。１−１００〜１−１００、０００の範囲の限界希釈によりハイブリッド＃３４−２９４をクローン化した。用いたクローニング培地は、１０％ｖ／ｖＦＢＳ及び１％ｖ／ｖ ＨＴ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ）を含むＩＭＤＭであった。組織培養プレート中の各９６ウエルに２００μｌの細胞懸濁液を加えた。
集密期培養のクローン上清の追加のＥＩＡスクリーニングに基づいてさらに評価するために、クローン＃３４−２９４−１６３（３４−２９４−１６３ｈｃと称する）を選択した。用いたＥＩＡスクリーニングプロトコルは上記のものであった。
マウスモノクローナル抗体イソタイプ化キット、ＲＰＮ２９（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，１１）で、３４−２９４−１６３（３４−２９４−１６３ＭｏＡｂと称する）として識別される細胞系から分泌されたモノクローナル抗体のイソタイプを決定した。販売業者の推薦に従って検定を行ったが、その結果は、ＩｇＧＩ、κＬ鎖のイソタイプを示している。
実施例１２及び１３の化合物は、以下に記載するラパマイシン又はその誘導体に特異的なポリクローナル及びモノクローナル抗体の検出用アッセイに用いることが可能である。
マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ Ｉ）を１００μｌのヤギ抗マウス抗体〔１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中１０μｇ／ｍｌ）を用い、一晩４℃でコーティングした。プレートを軽く振り、リン酸緩衝塩水中１００μｌの１％ウシ血清アルブミンで一晩４℃でブロックした。プレートを軽く振り、洗浄緩衝液で３回洗浄した後、ウエルにリン酸緩衝塩水中１：５に希釈したウサギ血清１００μｌを加え、室温で一晩インキュベートした。プレートを軽く振り、洗浄緩衝液で３回洗浄した後、３−〔３−（４−イミノブチルチオ）スクシンイミジル〕フェナシルグリシンとのラパマイシン４２−エステルと西洋ワサビペルオキシダーゼとの結合体（実施例１２の化合物）（１００μｌ，０．５ｎｇ／ｍｌ）又は（Ｎ−（３−カルボキシフェニル）−３−チオスクシンイミジル）グリシンとのラパマイシン４２−エステルと西洋ワサビペルオキシダーゼとの結合体（実施例１３の化合物）（１００μｌ，０．５ｎｇ／ｍｌ）を加え、室温で１時間暗所でインキュベートした。プレートを軽く振り、洗浄緩衝液で３回洗浄した後、Ｈ２Ｏ２と共にＴＭＢ基質を加え、プレートを被覆して室温で３０分間暗所でインキュベートした。４５０ｎｍの分光光度計で光学密度を読み取った。結果を表３に示す。
Figure 2004149542
表３に示されているデータは、ウサギ番号８１に見られるように、実施例１２及び１３の化合物を用いて、哺乳類におけるラパマイシン又はその誘導体に特異的な抗体を検出し得ることを示している。
下記は、ラパマイシンに特異的な抗体を用い、ＥＬＩＳＡフォーマットにより、ラパマイシンに対する拮抗阻害アッセイを用いたラパマイシン濃度の測定の例である。マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ Ｉ）を１００μｌのヤギ抗マウス抗体〔１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中１０μｇ／ｍｌ）を用いて一晩４℃でコーティングした。プレートを軽く振り、リン酸緩衝塩水中１００μｌの１％ウシ血清アルブミンを用いて４℃で一晩ブロックした。プレートを軽く振り、洗浄緩衝液で３回洗浄した後、各ウエルに上記のラパマイシン特異抗体（１μｇ／ｍｌ、１００μｌ）加え、室温で１〜４時間インキュベートした。プレートを軽く振り、洗浄緩衝液で３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼとのラパマイシン３１，４２−ビス（ヘミグルタレート）結合体（１００μｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ）を加え、室温で１時間暗所でインキュベートした。プレートを軽く振り、洗浄緩衝液で３回洗浄した後、ＴＭＢ基質を加え、プレートを被覆して室温で５分間暗所でインキュベートした。４５０ｎｍの分光光度計で光学密度を読み取った。マウス血清に結合する、ラパマイシンと、グルタル酸とのラパマイシン３１，４２−ジエステルと西洋ワサビペルオキシダーゼとの結合体との競合の結果を表４に示す。これらの結果から、標準曲線の構築及び試料中のラパマイシンの濃度の測定が可能である。
Figure 2004149542
実施例１１の化合物（Ｎ−〔９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル〕グリシンとのラパマイシン４２−エステル）は、実施例１２に用いた手順により脱保護し、固体マトリックスに結合させることが可能である。該化合物は、いくつかのディップスティックイムノアッセイ法又はラパマイシン結合タンパク質の単離に用いられるラパマイシン又はその誘導体に特異的な抗体に結合し得る。以下の実施例は、実施例１１の化合物の８０３共鳴単位（ＲＵ）がＢＩＡｃｏｒｅに用いられるＥＤＣ及びＮＨＳに基づいたＢＩＡｃｏｒｅ標準プロトコルを用いて固体マトリックス上に固定化し得ることを示している。このマトリックスはラパマイシン特異抗体の１４０１ＲＵ単位に結合した。試験した各濃度の抗体（０．６２５、１．２５、２．５、５．０、１０．０μｇ／ｍｌ）について会合及び解離動力学を測定した。これらのデータは、実施例１１の化合物が、マトリックスに結合している場合でさえ、開環ラパマイシン特異抗体による結合にアクセスし得、相互作用の特性決定も可能であることを示している。同様な手順を用いて、ラパマイシン結合タンパク質を、脱保護されたＮ−〔９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル〕グリシンとのラパマイシン４２−エステル結合マトリックスに結合させることが可能である。このマトリックスは、当業者により実践されているように新規な結合タンパク質の単離にも用いることができる。脱保護されたＮ−〔９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル〕グリシンとのラパマイシン４２−エステルを用いて、以下の方法の中のいずれかによりラパマイシン−ＦＫＢＰ結合体の結合タンパク質を単離することが可能である。一つの方法において、適切なプロテアーゼインヒビターを含む組織又は細胞溶解物と、脱保護されたＮ−〔９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル〕グリシンとのラパマイシン４２−エステル結合マトリックスでインキュベートしてあるＦＫＢＰとを結合に十分な時間インキュベートする。種々の緩衝液を用いて非特異的結合しているタンパク質を洗浄する。
ラパマイシン核−ＦＫＢＰと結合タンパク質との間の結合を壊わす追加の緩衝液を添加するとタンパク質が遊離する。
ハイブリドーマ細胞系、ＲＡＰ−４２−ＯＶＡＦ２＃１ｈｃを、ブタペスト条約の下に、１９９４年３月１０日、米国メリーランド州、ロックビル、パークローンドライブ １２３０１に所在のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託し、受託番号ＨＢ１１５６８で寄託された。
ハリブリドーマ細胞系３４−２９３−１６３ｈｃも、１９９４年４月６日、ブタペスト条約の下にＡＴＣＣに寄託され、受託番号ＨＢ１１６０６で寄託された。
以下の実施例は本発明の代表的な化合物の製造を表す。
コハク酸とのラパマイシン４２−エステル
１５ｍｌの塩化メチレン中５ｇ（５．５ｍｍｏｌ）のラパマイシン及び８８０μｌのピリジンの撹拌溶液に、無水コハク酸１．１ｇ（１１ｍｍｏｌ）及びジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）４００ｍｇを加えた。反応混合物を２日間室温で撹拌し、塩化メチレンで希釈、１ＮのＨＣｌ５０ｍｌずつで３回洗浄した。次いで有機層をＮａ２ＳＯ４上で脱水、真空下に濃縮して、粗生成物を得た。溶離剤として５５％アセトニトリル／水を用いる逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより純粋物質を得、標記化合物１ｇ（１８％）を得た。スペクトルデータは以下の通り：１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）４．６５０（ｍ，１Ｈ，Ｈ２ＣＯＣ＝Ｏ），４．１６８（ｄ，１Ｈ，Ｈ２ＣＯＨ），２．７９５（ｓ，４Ｈ，ＯＣ＝ＯＣＨ２ＣＨ２Ｃ＝Ｏ）。
（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ヘミスクシネート））とのラパマイシン４２−エステル
３ｍｌの酢酸エチル中コハク酸とのラパマイシン４２−エステル１００ｍｇの撹拌溶液にＤＣＣ２１ｍｇ（０．０９８ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド１２ｍｇ（０．０９８ｍｍｏｌ）を加えた。
反応混合物を室温で一晩撹拌し、濾過、真空下に濃縮して粗生成物を得た。
溶離剤として８０％アセトニトリル／水を用いる逆相ＨＰＬＣにより純粋物質を得、標記化合物７５ｍｇ（６９％）を得た。スペクトルデータは以下の通り：１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）４．６５０（ｍ，１Ｈ，Ｈ２ＣＯＣ＝Ｏ），４．１６８（ｄ，１Ｈ，Ｈ２ＣＯＨ），２．９５１（ｍ，２Ｈ，ＯＣ＝ＯＣＨ２），２．７９５（ｍ，４Ｈ，ＯＣ＝ＯＣＨ２ＣＨ２Ｃ＝Ｏ），２．７０５（ｍ，２Ｈ，ＯＣ＝ＯＣＨ２）；ＭＳ（負イオンＦＡＢ）１１１０（Ｍ−），１０５６，１０１２，９１３，１４８（１００）。
コハク酸とのラパマイシン４２−エステルとＫＬＨとの結合体
１，４−ジオキサン３ｍｌ中（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ヘミスクシネート））とのラパマイシン４２−エステル３７ｍｇの撹拌溶液に、０．０５Ｍのリン酸緩衝液６ｍｌ中１９７ｍｇのＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）を加え、反応材料を３日間４℃で撹拌した。次いで反応混合物を４℃で２４時間０．０５Ｍのリン酸緩衝液１５００ｍｌで透析し、さらに精製することなく使用可能な標記化合物を得た。
ＫＬＨ当たりのコハク酸とのラパマイシン４２−エステル部分の数は約４２：１であった。
コハク酸とのラパマイシン４２−エステルとオボアルブミンとの結合体
１，４ジオキサン３ｍｌ中（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−（ヘミスクシネート））とのラパマイシン４２−エステル３７ｍｇに、０．０５Ｍのリン酸緩衝液６ｍｌ中１９７ｍｇのオボアルブミンを加え、反応材料を３日間４℃で撹拌した。次いで反応混合物を２４時間４℃で０．０５Ｍのリン酸緩衝液１５００ｍｌ中で透析して、さらに精製することなく使用可能な標記化合物を得た。
コハク酸とのラパマイシン４２−エステルと西洋ワサビペルオキシダーゼとの結合体
１，４−ジオキサン４０μｌ中（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ヘミスクシネート））とのラパマイシン４２−エステル１ｍｇに、１，４ジオキサン０．４ｍｌ及び０．５％重炭酸ナトリウム０．４ｍｌ溶液中１６ｍｇの西洋ワサビペルオキシダーゼを加え、反応材料を４℃で２．５時間撹拌した。次いで反応混合物を２４時間４℃で０．０５Ｍのリン酸緩衝液１５００ｍｌ中で透析して、さらに精製することなく使用可能な標記化合物を得た。
グルタル酸とのラパマイシン３１，４２−ジエステル
実施例１に用いた方法に従って標記化合物を調製した。
（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ヘミグルタレート））とのラパマイシン３１，４２−ジエステル
ジメチルホルムアミド１６０μｌ中グルタル酸とのラパマイシン３１，４２−ジエステル１５．９ｍｇの溶液に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルエチルカルボジイミド３．６５ｍｇ及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド１．８ｍｇを加えた。
反応が完結するまで反応混合物を撹拌し、水に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。
有機層を合わせ、硫酸ナトリウム上で脱水、濾過、真空下に濃縮して、標記化合物を得、０．１Ｎのリン酸ナトリウム緩衝液中４℃で貯蔵し、さらに精製することなく使用した。
グルタル酸とのラパマイシン３１，４２−ジエステルとＫＬＨとの結合体
０．１ＭのＮａＨＣＯ３ ２ｍｌ中のＫＬＨ２０ｍｇに、（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ヘミグルタレート））とのラパマイシン３１，４２−ジエステル５５μｌを１０μｌずつ０℃で３０分かけて加えた。
反応が完結するまで溶液をゆっくりふりまぜ、６０００ｒｐｍで２０分間遠心し、結合していない出発物質をリン酸緩衝溶液を用いるＧ−２５カラム上で標記化合物から分離した。
結合体をグリセロールと５０％混合し、−７０℃で貯蔵した。
ＫＬＨ当たりのグルタル酸とのラパマイシン３１，４２−ジエステル部分の数は１７〜４５：１の範囲であった。
グルタル酸とのラパマイシン３１，４２−ジエステルとオボアルブミンとの結合体
０．１ＭのＮａＨＣＯ３ ２ｍｌ中２０ｍｇのオボアルブミンに、（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−（ヘミグルタレート））とのラパマイシン３１，４２−ジエステル５５μｌを１０μｌずつ０℃で３０分かけて加えた。反応が完結するまで、溶液をゆっくりふりまぜ、６００ｒｐｍで２０分間遠心し、結合していない出発物質をリン酸緩衝溶液を用いるＧ−２５カラム上で標記化合物から分離した。結合体をグリセロールと５０％混合して、−７０℃で貯蔵した。
グルタル酸とのラパマイシン３１，４２−ジエステルと西洋ワサビペルオキシダーゼとの結合体
０．１ＭのＮａＨＣＯ３ １ｍｌ中１０ｍｇの西洋ワサビペルオキシダーゼに、（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ヘミグルタレート））とのラパマイシン３１，４２−ジエステル１０５μｌを１０μｌずつ３０分かけて加えた。反応が完結するまで溶液をゆっくりふりまぜ、６０００ｒｐｍで２０分間遠心し、リン酸緩衝溶液を用いたＧ−２５カラムから標記化合物を溶離した。結合体をグリセロールと５０％混合し、−２０℃で貯蔵した。
Ｎ−〔９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニルグリシンとのラパマイシン４２−エステル
塩化メチレン（５ｍｌ）中のラパマイシン（０．７３ｇ，０．０８ｍｍｏｌ）の冷凍（０℃）溶液に、Ｎ−〔（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル〕グリシンペンタフルオロフェニルエステル０．６ｇ（１．１９ｍｍｏｌ）、次いでピリジン（０．８５ｍｌ，１０．５ｍｍｏｌ）及びジメチルアミノピリジン（１８ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）を加え、不均一溶液を形成し、室温に温めて均質にした。反応混合物を室温で一晩撹拌した。大過剰のＥｔＯＡｃを加えた。有機層を０．５ＮのＨＣｌ（２×）及び塩水で洗浄し、脱水（ＭｇＳＯ４）、濃縮して、オフホワイトの泡状物を得た。フラッシュクロマトグラフィー（３０〜５０％ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）にかけて、収率７１％で標記化合物（０．６７９ｇ，０．５７ｍｍｏｌ）を得た。質量スペクトル（負イオンＦＡＢ）Ｍ−：ｍ／ｚ１１９２。
３−〔３−（４−イミノブチルチオ）スクシンイミジル〕フェナシルグリシンとのラパマイシン４２−エステルと西洋ワサビペルオキシダーゼとの結合体
アセトニトリル（８４μｌ）中のＮ−〔（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル〕グリシンとのラパマイシン４２−エステル（１０ｍｇ，８．４μｍｏｌ）の溶液に、ジエチルアミン１０μｌ（０．８４Ｍ、アセトニトリル中）を加えた。反応混合物を室温で６０分間撹拌し、窒素流により溶媒を除去した。
残渣をアセトニトリル（１００μｌ）に溶解し、ヘキサン（５回、２００μｌ）で洗浄し、次いで窒素流により溶媒を濃縮した。得られたグリシンとのラパマイシン４２−エステルを、ＤＭＦ（２００μｌ）中のｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＭＢＳ）（２ｍｇ）に入れ、４℃で２時間インキュベートし、次いで５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の５０ｎＭエタノールアミン（２０μｌ）を加えた。西洋ワサビペルオキシダーゼ（５ｍｇ）及びウサギＩｇＧ（１０ｍｇ）を２−イミノチオレーンで処理し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５で精製し、次いでＭＢＳ−ラパマイシングリシンエステル付加化合物を加えた。混合物を４℃で一晩インキュベートし、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５上でゲル濾過して精製し、標記化合物を得た。
（Ｎ−（３−カルボキシフェニル）−３−チオスクシンイミジル）−グリシンとのラパマイシン４２−エステルと西洋ワサビペルオキシダーゼとの結合体
アセトニトリル（８４μｌ）中のＮ−〔（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル〕グリシンとのラパマイシン４２−エステル（１０ｍｇ，８．４μｍｏｌ）の溶液に、ジエチルアミン１０μｌ（０．８４Ｍ、アセトニトリル中）を加えた。反応混合物を室温で６０分間撹拌し、窒素流により溶媒を除去した。
残渣をアセトニトリル（１００μｌ）に溶解し、ヘキサン（５回、２００μｌ）で洗浄し、次いで窒素流により溶媒を濃縮した。得られたグリシンとのラパマイシン４２−エステルを、ＤＭＦ（２００μｌ）中のＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（２ｍｇ）に入れた。反応混合物を室温で１５分間、次いで４℃で一晩撹拌した。ラパマイシン反応混合物溶液に、ヒドロキシルアミンＨＣｌ（５０μｌのＤＭＦ中７ｍｇ）溶液を加えて１時間インキュベートし、次いでＭＢＳ−西洋ワサビペルオキシダーゼ付加化合物及びＭＢＳ−ウサギＩｇＧを加えて、標記化合物を得、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ゲル濾過により精製した。
ジエチルアジドジカルボキシレートとのラパマイシン１，３−ディールスアルダー付加化合物
ラパマイシン（１ｇ，１．０９３ｍｍｏｌ）及びジエチルアゾジカルボキシレート（０．３８１ｇ，２．１８７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍｌ）に溶解し、６５℃で一晩加熱した。
ＴＬＣにより、反応が完結したことが示された。混合物を溶離剤として酢酸エチルを用いるシリカゲルカラム上で精製して、白色固体（０．７５０ｇ）を得、ヘキサンですり砕き、風乾して、粉末として標記化合物（０．６６６ｇ）を得た。
Ｃ５７Ｈ８９Ｎ３Ｏ１７の元素分析：計算値：Ｃ，６２．９１；Ｈ，８．２４；Ｎ，３．８６；実測値：Ｃ，６２．８１；Ｈ，８．１２；Ｎ，３．９１。ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）３４５０，１７２０。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ６．１５（ｍ，１Ｈ），５．２０（ｄ，１Ｈ），３．４０（ｓ，３Ｈ），３．３０（ｓ，３Ｈ），３．１５（ｓ，３Ｈ），０．９（ｔ，３Ｈ），０．７２（ｑ，１Ｈ）。
ＭＳ（−ＦＡＢ）１０８７（Ｍ−）。
フェニルトリアゾリンジオンとのラパマイシン１，３−ディールスアルダー付加化合物
ラパマイシン（０．６６ｇ，７２１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却した。これに、ジクロロメタン（１０ｍｌ）中のフェニルトリアゾリンジオン（０．１３３ｇ，７５８ｍｍｏｌ）溶液を滴下した。溶液を一晩撹拌した。ＴＬＣにより、反応がまだ完結していないことが示された。追加のフェニルトリアゼンジオン（０．０２５ｇ，２７ｍｍｏｌ）を加えた。溶離剤として酢酸エチルを用いるＨＰＬＣ（４．１×３１ｃｍ，ＳｉＯ２）を用いて反応材料を精製して、固体として標記化合物を得た。固体をヘキサン３０ｍｌ及び酢酸エチル１ｍｌですり砕き、濾過、風乾して、粉末として標記化合物（０．３８３ｇ）を得た。
Ｃ５９Ｈ８４Ｎ４Ｏ１５の元素分析：計算値：Ｃ，６５．０５；Ｈ，７．７７；Ｎ，５．１４；実測値：Ｃ，６５．３９；Ｈ，７．９８；Ｎ，４．９２。ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）３４５０，１７１５。
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ７．５０（ｍ，３Ｈ），７．４０（ｍ，２Ｈ），３．１１（ｓ，３Ｈ），３．００（ｓ，３Ｈ），２．９５（ｓ，３Ｈ），０．８（ｑ，１Ｈ）。
ＭＳ（−ＦＡＢ）１０８８（Ｍ−）。
以下の化合物は、ラパマイシンの３１位でリンカーを介して結合し得る蛍光ラパマイシン誘導体の代表的な例である。
４２−ダンシルラパマイシン
乾燥ピリジン（２ｍｌ）中のラパマイシン（２００ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）を０℃に冷却し、ダンシルクロリド（８４０ｍｇ，３．１ｍｍｏｌ）で処理した。反応材料を室温に温め、２４時間撹拌した。反応混合物を冷却した２ＮのＨＣｌ（３０ｍｌ）に注ぎ、酢酸エチル（４×２５ｍｌ）で抽出した。酢酸エチルをプールし、塩水で洗浄、ＭｇＳＯ４上で脱水、濾過、真空下に濃縮した。残渣をベンゼン中２５％の酢酸エチルを用いるシリカクロマトグラフィーにかけ、黄色粉末として標記化合物１５０ｍｇを得た（融点：１０１−１０４℃）。
ピレン酪酸とのラパマイシン４２−エステル
ラパマイシン（４５９ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）及びピレン酪酸（２１６ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ／ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍｌ，１：１）に溶解した。該溶液に、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１４６ｍｇ，０．６７ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（１５ｍｇ）を加えた。１５時間かけて反応材料を室温に温めた。反応材料をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、５％ＨＣｌ、次いで塩水で洗浄した。溶液をＭｇＳＯ４上で脱水、濾過、蒸発させて、固体を得た。固体を３ｍｍシリカゲルクロマトロンプレートにかけ、ヘキサン中５０％の酢酸エチルで溶離して、泡状物として標記化合物１８０ｍｇを得た。この反応によりさらに、３１、４２−ジエステル化ラパマイシン１００ｍｇも得られた。
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）３４２０，１７４０。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８．３（ｄ，１Ｈ），８．１４（ｄｄ，２Ｈ），８．１０（ｄ，２Ｈ），７．８５（ｄ，１Ｈ），３．３４（ｓ，３Ｈ），３．３０（ｓ，３Ｈ），３．１１（ｓ，３Ｈ）。
ＭＳ（−ＦＡＢ）１１８３（Ｍ−）。
下記の化合物は、上記の手順によっり免疫原性担体に結合するか又は別のリンカーに結合してから該担体に結合し得るラパマイシン誘導体の代表的な例である。
ラパマイシン４２−カルボメトキシメチルエーテル及びラパマイシン４２−ビス（カルボメトキシメチルエーテル）
ラパマイシン（２．０ｇ，２．１８７ｍｍｏｌ）及び酢酸ロジウム（II）（０．３７ｇ，０．０８ｍｍｏｌ）をベンゼン中で加熱還流し、ベンゼン（１０ｍｌ）中のエチルジアゾアセテート溶液（５００ｍｌ）で１０分かけて処理した。溶液を室温に冷却し、一晩撹拌した。ＴＬＣにより、反応が完結していないことが示された。追加のエチルジアゾアセテート（３ｍｌずつ）を２回に分けて２４時間間隔で加えた。混合物を濃縮し、酢酸エチルを用いるシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにかけて精製して、油状物として４２−モノエーテル（１ｇ）及び３１，４２−ジエーテル（０．８５０ｇ）を得た。４２−モノエーテルをヘキサン、酢酸エチル及びジクロロメタン混合物中で週末にかけてすり砕き、粉末として生成物を得た。溶離剤として酢酸エチルを用いるシリカゲルカラム上のＨＰＬＣにかけてジエーテルを精製し、固体として生成物を得た。モノエーテルについての分析データ：
Ｃ５５Ｈ８５Ｎ０１５の元素分析：計算値：Ｃ，６６．０４；Ｈ，８．５７；Ｎ，１．４０：実測値：Ｃ，６５．２９；Ｈ，８．６４；Ｎ，１．６０。
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）３４２０，１７１５。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ４．８２（ｓ，１Ｈ），３．４１（ｓ，３Ｈ），３．３３（ｓ，３Ｈ），３．１３（ｓ，３Ｈ），１．２８（ｔ，３Ｈ），０．７０（ｑ，１Ｈ）。
ＭＳ（−ＦＡＢ）９９９（Ｍ−）。
ジエーテルについての分析データ：
Ｃ５９Ｈ９１Ｎ０１７の元素分析：計算値：Ｃ，６５．２３；Ｈ，８．４４；Ｎ，１．２９：実測値：Ｃ，６３．２９；Ｈ，８．４０；Ｎ，１．４４。
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）１７４０。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ６．３６（ｑ，２Ｈ），５．２４（ｓ，１Ｈ），３．３９（ｓ，３Ｈ），３．３２（ｓ，３Ｈ），３．１２（ｓ，３Ｈ），０．６５（ｑ，１Ｈ）。
ＭＳ（−ＦＡＢ）１０８５（Ｍ−）。
ラパマイシン４２−（４−ニトロフェニル）カーボネート及びラパマイシン３１，４２−ビス（４−ニトロフェニル）カーボネート
ラパマイシン（０．４５０ｇ，０．４９ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタン（１０ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却した。この溶液に、ピリジン（０．４ｍｌ，５．７ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジンの結晶を加えた。ジクロロメタン（３ｍｌ）中の４−ニトロフェニルクロロホルメート（０．３ｇ，１．４９ｍｍｏｌ）溶液を加えた。該溶液を一晩かけて室温に温め、室温で２４時間撹拌した。０．１ＮのＨＣｌ（５ｍｌ）に加えて反応を停止し、水層をジクロロメタンで洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４上で脱水、濾過、真空下に蒸発させて、黄色固体を得た。ヘキサン中の７５％酢酸エチルを用いるシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、黄色固体として４２−モノカーボネート１８０ｍｇ及び３１，４２−ジカーボネート４７ｍｇを得た。
４２−Ｏ−（フェノキシチオカルボニル）−ラパマイシン
ラパマイシン（１．０３０ｇ，１．１２ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタン（１００ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却した。この溶液に、ピリジン（０．２７ｍｌ，３．３３ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジンの結晶を加えた。反応混合物に、ジクロロメタン（５ｍｌ）中のチオフェニルクロロホルメート（０．４７ｍｌ，１．４９ｍｍｏｌ）溶液を加えた。該溶液を一晩かけて室温に温め、室温で２４時間撹拌した。０．１ＮのＨＣｌ（５ｍｌ）に加えて反応を停止し、水層をジクロロメタンで洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４上で脱水、濾過、真空下に蒸発させて、黄色固体を得た。ヘキサン中４０％〜７０％の酢酸エチルの勾配溶離を用いる４ｍｍシリカゲルクロマトロンプレート上のクロマトグラフィーにかけて、黄色泡状物として標記化合物５２０ｍｇを得た。
Ｃ５８Ｈ８３Ｎ０Ｓ１４の元素分析：計算値：Ｃ，６６．３２；Ｈ，７．９７；Ｎ，１．３３：実測値：Ｃ，６６．４８；Ｈ，８．０５；Ｎ，１．１２。
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）３４２０，１７１５。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．４１（ｔ，１Ｈ），７．２５（ｔ，２Ｈ），７．１２（ｄ，１Ｈ），３．４５（ｓ，３Ｈ），３．３３（ｓ，３Ｈ），３．１３（ｓ，３Ｈ）。
ＭＳ（−ＦＡＢ）１０４９（Ｍ−）。
ラパマイシン−Ｏ−カルボキシメチル−２７−オキシム
メタノール（６ｍｌ）中のラパマイシン６００ｍｇ（６５０μＭ）の溶液に、無水酢酸ナトリウム１００ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）及びカルボキシメトキシルアミンヘミヒドロクロリド１４０ｍｇ（６６０μＭ）を室温で加えた。室温で一晩撹拌した後で、反応が完結した。反応混合物を真空下に濃縮し、残渣を水ですり砕いた。固体を濾過し、水で完全に洗浄した。生成物を高真空下に乾燥して、白色固体５７５ｍｇ（８９．７８％）を得た。１３Ｃ及び１Ｈ ＮＭＲにより、２７位にオキシム誘導体としてＥ異性体及びＺ異性体の混合物が示された。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：３．４３及び３．４１（２ｓ，３Ｈ，ＣＨ３Ｏ），３．３０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３Ｏ），３．１８及び３．１２（２ｓ，３Ｈ，ＣＨ３Ｏ），１．８２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３Ｃ＝Ｃ），１．６９５及び１．６３３（２ｓ，３Ｈ，ＣＨ３Ｃ＝Ｃ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ＭＨｚ）：２１５．８（Ｃ＝Ｏ），２１１．５（Ｃ＝Ｏ），１９４．５（Ｃ＝Ｏ），１９１．０（Ｃ＝Ｏ），１７２．５（Ｃ＝Ｏ），１６９．０（Ｃ＝Ｏ），１６８．５（Ｃ＝Ｏ），１６７．０（Ｃ＝Ｏ），１６１．５（Ｃ＝ＮＯＣ），１６０．０（Ｃ＝ＮＯＣ），１４０．０；ＭＳ（負イオンＦＡＢ：９８５（Ｍ−Ｈ）−，５９０，１６７，１２８，９７，７５（１００％）。
Ｃ５３Ｈ８２Ｎ２Ｏ１５・０．１５Ｈ２Ｏの元素分析：計算値：Ｃ，６３．９０；Ｈ，８．４０；Ｎ，２．８１；実測値：Ｃ，６３．８１；Ｈ，８．４１；Ｎ，２．８５。
以下の化合物をラパマイシン又はその誘導体に特異的な抗体の産生に用いた。
グリシルビオチンとのラパマイシン４２−エステル
ＤＭＦ６０ｍｌ中のビオチン（０．８３ｇ，３．４ｍｍｏｌ）溶液に、グリシン−ｔ−ブチルエステル塩酸塩（０．５７ｇ，３．４ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルモルホリン（０．９２ｍｌ，８．３６ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（０．６１ｇ，３．９９ｍｍｏｌ）及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボ−ジイミド塩酸塩（０．６５ｇ，３．４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で７日間撹拌した。ＤＭＦを濃縮し、酢酸エチルを加え、有機層を水、０．５ＮのＨＣｌ、飽和重炭酸ナトリウム及び塩水で洗浄した。酢酸エチル層を脱水（ＭｇＳＯ４）、濃縮して、ＴＬＣ上実質的に一つのスポットを示す白色固体状のｔ−ブチルグリシルビオチン（０．６１１ｇ，１．７１ｍｍｏｌ，５０％）を得た。質量スペクトル ｍ／ｚ３５８（〔Ｍ＋Ｈ〕+）。
ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍｌ）中のｔ−ブチルグリシルビオチン（０．２７１ｇ，０．７５８ｍｍｏｌ）溶液に、トリフルオロ酢酸０．５ｍｌを加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌し、濃縮して、無水ジエチルエーテルですり砕いた。オフホワイトの沈殿物を回収して、グリシルビオチン０．２０９ｇ（０．６９４ｍｍｏｌ，９２％）を得た。質量スペクトルｍ／ｚ３０２（〔Ｍ＋Ｈ〕+）。
１−メチルピロリジノン（５ｍｌ）中のグリシルビオチン（０．６５ｇ，２．１６ｍｍｏｌ）溶液に、６ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２を加え、沈殿物を形成させて、トリエチルアミン０．３３ｍｌ（２．３６ｍｍｏｌ）を添加した後でさえ沈殿物は残留した。この不均一溶液に、ラパマイシン２ｇ（２．１９ｍｍｏｌ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩０．４３ｇ（２．２４ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ３０ｍｇ（２．４６ｍｍｏｌ）を加えた。数時間後、反応混合物は均質になり、さらに４日間撹拌した。大過剰の酢酸エチルを加え、有機層を水、０．５ＮのＨＣｌ、飽和重炭酸ナトリウム及び塩水で洗浄した。有機層を脱水（ＭｇＳＯ４）、濃縮した。薄黄色の泡状物を温無水ジエチルエーテルですり砕いて、薄黄色の固体として不純な標記化合物１．２ｇを得た。該物質中の一部（０．５ｇ）を５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３中のフラッシュクロマトグラフィーにかけ、再び温エーテルですり砕いて、少量のラパマイシンで汚染された標記化合物８７ｍｇを得た。該物質を再度クロマトグラフィー（０〜５％の勾配のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）にかけ、エーテルで最終的にすり砕いて、白色固体として純粋な標記化合物３４ｍｇ（０．０２８ｍｍｏｌ）を得た。質量スペクトルｍ／ｚ１１９６（−ＦＡＢ Ｍ−）。
ａ）コハク酸とのラパマイシン−４２−エステルと５−グリシニルフルオレセインアミンとの結合体
１０μｌのトリエチルアミンを含むメタノール２００μｌに溶解した４．２ｍｇの５−グリシニルフルオレセインアミンに、実施例２の化合物４ｍｇを加えた。２時間後、混合物の一部をシリカ薄層クロマトグラフィープレートにかけ、１００部のクロロホルム、１０部のメタノール、１部の酢酸で展開した。乾燥後、生成物を含むバンドをプレートから剥がし、メタノールを用いて生成物をシリカから溶離した。生成物は、ＦＫＢＰ１２を添加すると、水溶液の蛍光偏光が変化することを特徴としていた。
ｂ）コハク酸とのラパマイシン４２−エステルと５−アミノメチルフルオレセインとの結合体
実施例２３ａの方法に従って、２．５ｍｇの５−アミノメチルフルオレンを５−グリシニルフルオレセインの代わりに用いて標記化合物を調製した。
ｃ）コハク酸とのラパマイシン４２−エステルと４’−アミノメチルフルオレセインとの結合体
実施例２３ａの方法に従って、１．１ｍｇの４’−アミノメチルフルオレセインを５−グリシニルフルオレセインの代わりに用いて標記化合物を調製した。薄層クロマトグラフィー溶媒は、１００部のクロロホルム、８部のメタノール及び１部の酢酸であった。
コハク酸とのセコラパマイシン４２−エステルと５−グリシニルフルオレセインアミンとの結合体
実施例２３の生成物の一部をシリカ薄層クロマトグラフィープレートにかけ、５０部のクロロホルム、４部のメタノール及び０．５部の酢酸の混合物で溶離した。３つの移動蛍光バンドが観察され、変化していない出発物質は最も高いｒｆ値を有し、標記化合物は最も低いｒｆ値を有していた。目的生成物を含むシリカをプレートから剥がし、標記化合物をメタノールで溶離した。生成物は、ＲＡＰ−４２−ＯＶＡＦ２＃１ ＭｏＡｂを添加すると水溶液の蛍光偏光が変化することを特徴としていた。
ａ）アジピン酸とのラパマイシン４２−エステル
実施例２の方法の変形によりアジピン酸とのラパマイシン４２−エステルを調製した。ジメチルホルムアミド１．０ｍｌ中１４６ｍｇのアジピン酸を２００μｌのジシクロヘキシルカルボジイミドと合わせて無水アジピン酸を調製し、室温で２時間インキュベートした。該反応材料の上清３００μｌを、塩化メチレン２００μｌに溶解したラパマイシン９０ｍｇ及びジメチルアミノピリジン４５ｍｇに加えた。
５分後、混合物を遠心して、沈殿した物質を沈降させた。上清を３ｍｌの水と１００μｌの酢酸及び２×１ｍｌの塩化メチレンとに分配した。
有機層を合わせて、無水硫酸ナトリウムで脱水し、溶媒を蒸発させた。残渣を１．０ｍｌのメタノール及び０．５ｍｌのエタノールに溶解し、氷中で冷却し、５ｍｌの水を加えて沈殿させた。これを遠心し、上清を廃棄、残渣を減圧デシケーター中で乾燥して、白色粉末７８ｍｇを得た。
ｂ）アジピン酸とのラパマイシン４２−エステルとＮ−ヒドロキシスクシンイミドとのエステル
実施例２５ａの化合物３８ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド３８ｍｇ及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド４０ｍｇをジメチルホルムアミド０．４ｍｌと混合した。６０分後、追加のカルボジイミド４０ｍｇを加えた。さらに６０分間してから混合物を氷中で冷却し、水４ｍｌを激しくかき回しながら加えた。遠心して沈殿物を回収し、水５ｍｌに再懸濁し、２回遠心して洗浄し、真空デシケーターで乾燥して、白色粉末３８ｍｇを得た。
ｃ）アジピン酸とのラパマイシン４２−エステルと５−グリシニルフルオレセインアミンとの結合体
トリエチルアミン６μｌを添加して、５−グリシニルフルオレセインアミン２．３ｍｇをメタノール２００μｌに溶解した。メタノール２００μｌ中１０．６ｍｇの実施例２５ｂの化合物の溶液６０μｌを加えた。２５分後、混合物をシリカ薄層クロマトグラフィープレートにかけ、１００部のクロロホルム、１２部のメタノール及び１部の酢酸の混合物で展開した。目的生成物を含むシリカをプレートから剥がし、標記化合物をメタノールで溶離した。
ｄ）アジピン酸とのラパマイシン４２−エステルと５−アミノメチルフルオレセインとの結合体
実施例２５ｃのようにして標記化合物を調製したが、但し、５−アミノメチルフルオレセイン２．６ｍｇを用いた。
ｅ）アジピン酸とのラパマイシン４２−エステルと４’−アミノメチルフルオレセインとの結合体
実施例２５ｃのようにして標記化合物を調製したが、但し、４’−アミノメチルフルオレセイン２．５ｍｇを用いた。薄層クロマトグラフィー溶媒は、クロロホルム１００部、メタノール４部及び酢酸２部であった。

Claims (15)

  1. ラパマイシンに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体であって、４２位に結合基を有するラパマイシン、３１位に結合基を有するラパマイシン、４２位と３１位に結合基を有するラパマイシンから成る群より選択される分子を含む免疫原を用いて得られ、該分子は該記結合基を介して免疫原性担体材料と結合していることを特徴とする前記モノクローナル抗体。
  2. 前記分子が４２位に結合基を有するラパマイシンである請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  3. 前記分子がジカルボン酸とのラパマイシン４２−エステルである請求項２に記載のモノクローナル抗体。
  4. 前記ジカルボン酸がコハク酸である請求項３に記載のモノクローナル抗体。
  5. 前記免疫原性担体材料がスカシガイヘモシアニンおよび卵白アルブミンから成る群より選択されるタンパク質である請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  6. 前記免疫原が卵白アルブミンに結合したコハク酸とのラパマイシン４２−エステルである請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  7. ハイブリドーマＲＡＰ−４２−ＯＶＡＦ２＃１ｈｃ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１１５６８）によって産生される請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  8. ハイブリドーマＲＡＰ−４２−ＯＶＡＦ２＃１ｈｃ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１１５６８）。
  9. 寄託され受託番号１１５６８を付与されたハイブリドーマＲＡＰ−４２−ＯＶＡＦ２＃１ｈｃから分泌されるモノクローナル抗体が特異的に結合する抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体。
  10. （ａ）免疫原チャレンジおよび該免疫原に感作された抗体産生細胞の回収を行うために適当な動物種に前記免疫原を投与し、（ｂ）該抗体産生細胞を不死化し、（ｃ）選択された上記樹立不死化細胞株からモノクローナル抗体を回収することによって得られる請求項１、２、３、４、５および６のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
  11. 請求項１、２、３、４、５、６または９のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
  12. 請求項１０に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
  13. 請求項１、２、３、４、５、６、７および９のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む、ラパマイシンの血中レベルを測定するためのイムノアッセイキット。
  14. 請求項１０に記載のモノクローナル抗体を含む、ラパマイシンの血中レベルを測定するためのイムノアッセイキット。
  15. スカシガイヘモシアニンに結合したグルタル酸とのラパマイシン３１，４２−ジエステルを免疫原として用いて得られる請求項９に記載のモノクローナル抗体。
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