JP2600325B2 - 抗体、抗体産生細胞および抗体の作製方法 - Google Patents
抗体、抗体産生細胞および抗体の作製方法Info
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- JP2600325B2 JP2600325B2 JP63220932A JP22093288A JP2600325B2 JP 2600325 B2 JP2600325 B2 JP 2600325B2 JP 63220932 A JP63220932 A JP 63220932A JP 22093288 A JP22093288 A JP 22093288A JP 2600325 B2 JP2600325 B2 JP 2600325B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は低分子を抗原とした抗体、あるいは抗体産生
細胞、モノクローナル抗体の作製におおいて、高性能抗
体を得るための方法に関する。
細胞、モノクローナル抗体の作製におおいて、高性能抗
体を得るための方法に関する。
従来の技術 抗体は一般に多種類のアミノ酸配列の抗体の混合物で
あるポリクローナル抗体と、単一のアミノ酸配列を有す
るモノクローナル抗体とに大別される。ポリクローナル
抗体は免疫原を注射した動物の血清、腹水等の体液ある
いはこれらを精製して得られる。また、免疫原を注射し
た動物の細胞（通常脾臓細胞）とミエローマ細胞とを融
合して抗体産生細胞が得られる。この抗体産生細胞のう
ち、特に良好な細胞ラインを選択（クローニング）し、
培養した後培養上清を精製するとモノクローナル抗体が
得られる。
あるポリクローナル抗体と、単一のアミノ酸配列を有す
るモノクローナル抗体とに大別される。ポリクローナル
抗体は免疫原を注射した動物の血清、腹水等の体液ある
いはこれらを精製して得られる。また、免疫原を注射し
た動物の細胞（通常脾臓細胞）とミエローマ細胞とを融
合して抗体産生細胞が得られる。この抗体産生細胞のう
ち、特に良好な細胞ラインを選択（クローニング）し、
培養した後培養上清を精製するとモノクローナル抗体が
得られる。
抗原が分子量数万の蛋白質等の場合は抗原をそのまま
免疫原として注射できるが、低分子（ハプテン）の場合
は適当な蛋白質にこれを結合し、疑似的に分子量を高く
した免疫原を注射する必要がある。通常ハプテンはアミ
ノ基、アルボキシル基、水酸基、メルカプト基等の官能
基および、炭素数４から10程度のスペーサーを導入した
抗原誘導体を合成した後、架橋試薬等で蛋白と結合を行
うのが一般的である。例えばメタンフェタミン（MA）の
場合は、玉置、福田岸田、高橋、日本法医学雑誌（Tama
ki,Fukuda,Kishida and Takahashi,Jpn.J.Legal Med.,3
7（４）,417（1983））に記載されているように、MAの
アミノ基にアミノブチル基などを導入し（ABMA）、さら
に蛋白を結合して免疫原とするのが通例である。
免疫原として注射できるが、低分子（ハプテン）の場合
は適当な蛋白質にこれを結合し、疑似的に分子量を高く
した免疫原を注射する必要がある。通常ハプテンはアミ
ノ基、アルボキシル基、水酸基、メルカプト基等の官能
基および、炭素数４から10程度のスペーサーを導入した
抗原誘導体を合成した後、架橋試薬等で蛋白と結合を行
うのが一般的である。例えばメタンフェタミン（MA）の
場合は、玉置、福田岸田、高橋、日本法医学雑誌（Tama
ki,Fukuda,Kishida and Takahashi,Jpn.J.Legal Med.,3
7（４）,417（1983））に記載されているように、MAの
アミノ基にアミノブチル基などを導入し（ABMA）、さら
に蛋白を結合して免疫原とするのが通例である。
発明が解決しようとする課題 しかしながら上記の免疫原を用いて作製した抗体は、
目的の抗原（例えばMA）よりもむしろ抗原誘導体（例え
ばABMA）に対して高いアフィニティーを有していること
が発明者らの検討により明らかになった。即ち従来の方
法では、あくまで抗原誘導体に対する抗体を産生する方
向を有した生体内免疫系の交差反応によって抗原の抗体
が作られるから、本来目的とする抗原に対しては高いア
フィニティーの抗体を作るのは困難であるという問題が
ある。この結果、酸素免疫法、ラジオイムノアッセイ等
で抗原測定を行う際、高感度に検出することが不可能と
なる。
目的の抗原（例えばMA）よりもむしろ抗原誘導体（例え
ばABMA）に対して高いアフィニティーを有していること
が発明者らの検討により明らかになった。即ち従来の方
法では、あくまで抗原誘導体に対する抗体を産生する方
向を有した生体内免疫系の交差反応によって抗原の抗体
が作られるから、本来目的とする抗原に対しては高いア
フィニティーの抗体を作るのは困難であるという問題が
ある。この結果、酸素免疫法、ラジオイムノアッセイ等
で抗原測定を行う際、高感度に検出することが不可能と
なる。
課題を解決するための手段 目的抗原（例えばMA）のアルキル基が水素原子で置き
変わった疑似抗原（例えばアンフェタミン、AP）を用い
て抗原誘導体（例えばABAP）を作製し、蛋白と結合して
免疫原とする。
変わった疑似抗原（例えばアンフェタミン、AP）を用い
て抗原誘導体（例えばABAP）を作製し、蛋白と結合して
免疫原とする。
作用 上記の構成は、免疫原作製の際の抗原の分子構造、特
に結合部分の構造に注目して検討を行った結果によるも
ので、これにより、結果的には目的抗原（例えばMA）の
アルキル基がスペーサーで置換された抗原誘導体（例え
ばABAP）を得ることができる。このような目的抗原と抗
原誘導体は構造の類似性が高いため、目的抗原に対して
高いアフィニティーを有する抗体の作製が可能となる。
に結合部分の構造に注目して検討を行った結果によるも
ので、これにより、結果的には目的抗原（例えばMA）の
アルキル基がスペーサーで置換された抗原誘導体（例え
ばABAP）を得ることができる。このような目的抗原と抗
原誘導体は構造の類似性が高いため、目的抗原に対して
高いアフィニティーを有する抗体の作製が可能となる。
実施例 本発明の一実施例としてメタンフェタミン（MA）を目
的抗原とした場合について説明する。本実施例において
は、MAのＮ−アルキル基が水素原子に置換された構造を
有するアンフェタミン（AP）に、スペーサーとしてアミ
ノブチル基を導入した抗原誘導体（ABAP）を合成し、こ
れにキャリア蛋白としてスカシ貝由来へモシアニン（KL
H）を結合して免疫原とした（AP−KLH）。
的抗原とした場合について説明する。本実施例において
は、MAのＮ−アルキル基が水素原子に置換された構造を
有するアンフェタミン（AP）に、スペーサーとしてアミ
ノブチル基を導入した抗原誘導体（ABAP）を合成し、こ
れにキャリア蛋白としてスカシ貝由来へモシアニン（KL
H）を結合して免疫原とした（AP−KLH）。
この免疫原を動物に注射することにより動物の血清中
に抗MA抗体が産生される。この時の動物としては原理的
には全ての脊推動物が使用可能であるが、公序良俗の観
点から当然ヒトは除外される。さらに、通常使用される
実験動物のうち実験の簡便さからマウスを選択した。マ
ウスの系統はA/Jが最も免疫応答が高く、好適である。
に抗MA抗体が産生される。この時の動物としては原理的
には全ての脊推動物が使用可能であるが、公序良俗の観
点から当然ヒトは除外される。さらに、通常使用される
実験動物のうち実験の簡便さからマウスを選択した。マ
ウスの系統はA/Jが最も免疫応答が高く、好適である。
以下にMA、AP、ABMA、ABAPの構造式を示す。これらの
構造式から、MAとABAPは高い類似性があることがわか
る。
構造式から、MAとABAPは高い類似性があることがわか
る。
以下、本実施例を手順を追って説明する。
ABAPの合成法 AP2.00gと4.17gのＮ−ブロモブチルフタルイミドおよ
び炭酸ナトリウム3.14gをベンゼン10mL中16時間リフラ
ックスした。反応液から溶媒を溜去した後、分取用薄層
クロマトグラフィー（シリカゲル、展開溶媒：アンモニ
ア飽和、メタノール／クロロフォルム＝5/95、Rf＝0.
7、抽出溶媒メタノール）で精製した。1.59gのＮ−（４
−フタルイミジルブチル）アンフェタミン（PIBAP）が
得られた。
び炭酸ナトリウム3.14gをベンゼン10mL中16時間リフラ
ックスした。反応液から溶媒を溜去した後、分取用薄層
クロマトグラフィー（シリカゲル、展開溶媒：アンモニ
ア飽和、メタノール／クロロフォルム＝5/95、Rf＝0.
7、抽出溶媒メタノール）で精製した。1.59gのＮ−（４
−フタルイミジルブチル）アンフェタミン（PIBAP）が
得られた。
PIBAP1.50gを95％エタノール5mLに溶解し、0.25gのヒ
ドラジン１水和物を加えて1.5時間リフラックスしたと
ころ少量の白沈が生じた。ろ過し、ろ液を緩やかに溜去
し約0.5mLまで濃縮するとさらに白沈が生じた。再びろ
過後、ろ液を1N塩酸で酸性にし、生じた白沈を除去した
後、水酸化ナトリウムでアルカリ性にすると、油層が分
離した。油層をジエチルエーテルで抽出し、溜去後、前
項と同条件の薄層クロマトグラフィーで精製した。目的
物は薄層上、ニンヒドリン試薬で青紫の発色によって確
認できた。最終的に0.75gのＮ−（４−アミノブチル）
アンフェタミン（ABAP）が得られた。
ドラジン１水和物を加えて1.5時間リフラックスしたと
ころ少量の白沈が生じた。ろ過し、ろ液を緩やかに溜去
し約0.5mLまで濃縮するとさらに白沈が生じた。再びろ
過後、ろ液を1N塩酸で酸性にし、生じた白沈を除去した
後、水酸化ナトリウムでアルカリ性にすると、油層が分
離した。油層をジエチルエーテルで抽出し、溜去後、前
項と同条件の薄層クロマトグラフィーで精製した。目的
物は薄層上、ニンヒドリン試薬で青紫の発色によって確
認できた。最終的に0.75gのＮ−（４−アミノブチル）
アンフェタミン（ABAP）が得られた。
免疫原の作製法 19.1mgのABAPを0.5N塩酸200μＬに溶解し、リン酸バ
ッファー4.8mLで希釈した。この溶液にSPDP（ファルマ
シア社製）12.5mgの1mLのエタノール溶液を混合し、30
分撹拌した。TLC（シリカゲル、展開溶媒：アンモニア
飽和、メタノール／クロロフォルム＝5/95、UV光の吸収
で判別）上でSPDPのスポットが消失したのを確認した
（AP−SPDP）。
ッファー4.8mLで希釈した。この溶液にSPDP（ファルマ
シア社製）12.5mgの1mLのエタノール溶液を混合し、30
分撹拌した。TLC（シリカゲル、展開溶媒：アンモニア
飽和、メタノール／クロロフォルム＝5/95、UV光の吸収
で判別）上でSPDPのスポットが消失したのを確認した
（AP−SPDP）。
KLH（分子量は一般的取扱に従い、100,000と仮定）32
6.5mgリン酸バッファー（pH7.0,0.1M,NaCl 0.1M含有）
溶液（2.2mg/mL）50mLに、SPDP51.3mg/エタノール4.2mL
溶液を滴下した。常温で12時間撹拌後、ファデクスG25
充填カラム（ファルマシア、直径4cm×長50cm、流速6.9
mL/min）でゲルろ過した。
6.5mgリン酸バッファー（pH7.0,0.1M,NaCl 0.1M含有）
溶液（2.2mg/mL）50mLに、SPDP51.3mg/エタノール4.2mL
溶液を滴下した。常温で12時間撹拌後、ファデクスG25
充填カラム（ファルマシア、直径4cm×長50cm、流速6.9
mL/min）でゲルろ過した。
ジチオスレイトール（DTT）100mMリン酸バッファー溶
液1.8mLを上記の流出液に添加し還元を行った。これを
ゲル濾過した後、溶液106mLにAP−SPDP溶液を徐々に加
え、30分後ゲル濾過した。この結果、KLH1分子あたり1
4.3分子のAPが導入された（AP−KLH）。
液1.8mLを上記の流出液に添加し還元を行った。これを
ゲル濾過した後、溶液106mLにAP−SPDP溶液を徐々に加
え、30分後ゲル濾過した。この結果、KLH1分子あたり1
4.3分子のAPが導入された（AP−KLH）。
免疫方法 AP−KLH溶液（KLH濃度で1mg/mL）とヒト結核死菌含有
コンプリートフロイントアジュバンドを同量混合し、ホ
モジナイザーで乳化したものをマウス（A/J）の腹腔に1
00μL/mouse注射した。
コンプリートフロイントアジュバンドを同量混合し、ホ
モジナイザーで乳化したものをマウス（A/J）の腹腔に1
00μL/mouse注射した。
AP−KLHによる免疫後18週が経過したマウスの血清を
用いて抗原固相酵素免疫測定法（ELISA法）によるMAお
よびABMAのインヒビション感度を測定した結果を図（実
線）に示す。ここで低い濃度でインヒビションがかかる
ほど検出感度が高いといえる。図において縦軸は相対吸
光度であり、固相抗原に結合している抗体量の相対値を
示している、また、比較例としてMA−KLHによる免疫後1
8週が経過したマウスの血清について同じ検討を行った
結果を同じく図（点線）に示す。なお、ELISAにおいて
抗血清はいずれも10000倍希釈した。また、BSA1分子あ
たり0.4分子のABMAが結合したものをプレートに吸着さ
せて固相抗原とした。
用いて抗原固相酵素免疫測定法（ELISA法）によるMAお
よびABMAのインヒビション感度を測定した結果を図（実
線）に示す。ここで低い濃度でインヒビションがかかる
ほど検出感度が高いといえる。図において縦軸は相対吸
光度であり、固相抗原に結合している抗体量の相対値を
示している、また、比較例としてMA−KLHによる免疫後1
8週が経過したマウスの血清について同じ検討を行った
結果を同じく図（点線）に示す。なお、ELISAにおいて
抗血清はいずれも10000倍希釈した。また、BSA1分子あ
たり0.4分子のABMAが結合したものをプレートに吸着さ
せて固相抗原とした。
図の結果について、まずMA−KLHで免疫したものにつ
いてインヒビションによる半減値を見ると、MA（曲線
ａ）では10−3.5ＭまたはABMA（曲線ｂ）では10−5.2Ｍ
である。即ち抗原誘導体（ABMA）がMAよりも50倍高いア
フィニティーを有している。すなわち、いわゆるヘテロ
ロガスアッセイの逆の現象が生じて検出感度を低下させ
ていることが推察される。一方AP−KLHによって免疫し
た抗血清はインヒジションによる半減値を見るとMA（曲
線ｃ）では10−6.5Ｍ、ABMA（曲線ｄ）では10−5.8Ｍで
ある。つまり上記の例とは逆に抗原誘導体（ABMA）より
もMAに対して50倍高いアフィニティーを有している。事
実、結果としてMAに対するインヒビション感度はMA−KL
Hで免疫した抗血清よりも約1000倍の高い感度でインヒ
ビションがかかった。なお、上記の考え方に基づく抗原
の分子設計、免疫方法は本実施例に示したMA以外につい
ても分子量1000以下の程度のハプテン系に対する免疫方
法について一般的に適用可能である。さらに、本実施例
で感作した動物の脾臓細胞とミエローマ細胞を常法にし
たがって融合したハイブリドーマ細胞から産生される抗
体（モノクローナル抗体）も当然同等の効果を示す。
いてインヒビションによる半減値を見ると、MA（曲線
ａ）では10−3.5ＭまたはABMA（曲線ｂ）では10−5.2Ｍ
である。即ち抗原誘導体（ABMA）がMAよりも50倍高いア
フィニティーを有している。すなわち、いわゆるヘテロ
ロガスアッセイの逆の現象が生じて検出感度を低下させ
ていることが推察される。一方AP−KLHによって免疫し
た抗血清はインヒジションによる半減値を見るとMA（曲
線ｃ）では10−6.5Ｍ、ABMA（曲線ｄ）では10−5.8Ｍで
ある。つまり上記の例とは逆に抗原誘導体（ABMA）より
もMAに対して50倍高いアフィニティーを有している。事
実、結果としてMAに対するインヒビション感度はMA−KL
Hで免疫した抗血清よりも約1000倍の高い感度でインヒ
ビションがかかった。なお、上記の考え方に基づく抗原
の分子設計、免疫方法は本実施例に示したMA以外につい
ても分子量1000以下の程度のハプテン系に対する免疫方
法について一般的に適用可能である。さらに、本実施例
で感作した動物の脾臓細胞とミエローマ細胞を常法にし
たがって融合したハイブリドーマ細胞から産生される抗
体（モノクローナル抗体）も当然同等の効果を示す。
発明の効果 本発明によれば、免疫的測定方法で目的物質を高感度
に測定可能な高性能抗体の作製が可能となる。
に測定可能な高性能抗体の作製が可能となる。
図は、本発明の実施例で作製した高性能抗体および従来
方法で作製した抗体を用いたELISA法によるMAおよびABM
Aの検出結果を示すグラフである。
方法で作製した抗体を用いたELISA法によるMAおよびABM
Aの検出結果を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 日本法医学雑誌，37［４］（1983) Ｐ．417−420 富山朔二他編「単クローン抗体実験マ ニュアル」（1987年11月20日）講談社 Ｐ．８−104
Claims (3)
- 【請求項１】分子量2000以下で、少なくともひとつのア
ルキル基を有する低分子化合物を抗原とする抗体の作製
において、前記抗原のアルキル基を水素原子で置換した
化学構造を有する疑似抗原を出発物質として、該疑似抗
原の該水素原子を、タンパク質と化学結合する能力を有
した官能基を有するアルキル基すなわちスペーサーと置
換した上で、該スペーサーとタンパク質を結合したもの
を免疫原とすることを特徴とした抗体の作製方法。 - 【請求項２】抗原がメタンフェタミンである請求項１に
記載の抗体の作製方法。 - 【請求項３】疑似抗原がアンフェタミンである請求項１
に記載の抗体の作製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63220932A JP2600325B2 (ja) | 1988-09-02 | 1988-09-02 | 抗体、抗体産生細胞および抗体の作製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63220932A JP2600325B2 (ja) | 1988-09-02 | 1988-09-02 | 抗体、抗体産生細胞および抗体の作製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0269196A JPH0269196A (ja) | 1990-03-08 |
| JP2600325B2 true JP2600325B2 (ja) | 1997-04-16 |
Family
ID=16758816
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63220932A Expired - Lifetime JP2600325B2 (ja) | 1988-09-02 | 1988-09-02 | 抗体、抗体産生細胞および抗体の作製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2600325B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1331219A1 (en) * | 2002-01-23 | 2003-07-30 | Drug Abuse Sciences, Inc. | New amphetamine derivatives, antibodies against them and pharmaceutical compositions containing them |
| US6991911B2 (en) | 2003-12-15 | 2006-01-31 | Dade Behring Inc. | Assay for entactogens |
| US7022492B2 (en) | 2003-12-15 | 2006-04-04 | Dade Behring Inc. | Ecstasy haptens and immunogens |
| US7037669B2 (en) | 2004-03-22 | 2006-05-02 | Dade Behring Inc. | Assays for amphetamine and methamphetamine using stereospecific reagents |
| US7115383B2 (en) | 2004-03-22 | 2006-10-03 | Dade Behring Inc. | Assays for amphetamine and methamphetamine |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5799598A (en) * | 1980-12-12 | 1982-06-21 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | Hapten antigen and its synthetic intermediate |
| JPS5799533A (en) * | 1980-12-12 | 1982-06-21 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | Hapten antigen and its synthetic intermediate |
| US4530786A (en) * | 1984-09-04 | 1985-07-23 | Colorado State University Research Foundation | Antibody for the detection and quantification of atrazine |
-
1988
- 1988-09-02 JP JP63220932A patent/JP2600325B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 富山朔二他編「単クローン抗体実験マニュアル」（１９８７年１１月２０日）講談社Ｐ．８−１０４ |
| 日本法医学雑誌，３７［４］（１９８３）Ｐ．４１７−４２０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0269196A (ja) | 1990-03-08 |
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