SU1097337A1 - Способ получени антисыворотки к катехоламину - Google Patents

Abstract

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИСЫВОРОТКИ К КАТЕХОЛАМИНУ путем иммунизаДии животного антигеном, ковалентно св занным с носителем, с последук цим забором крови и выделением из нее антисыворотки, отличаю щ и и с   тем, что, с целью повьппени  специфичности целевого продукта, в качестве антигена истюльзуют остаток катехоламина, ковалентно св занньй с белком-носителем по следующей формуле Н Н - I - Б . К - ( (снр, N N Н I N где К - остаток катехоламина, содержавший первичную аминогруппу; Н - I Б - остаток антигенного белN ка-носител  . (СН) - алифатическа  цепочкаi 2. Способ по п. 1,отличаю (Л щ и и с   тем, что в качестве белканосител  используют сывороточный G: альбумин, бычий тиреоглобулин или гемоцйанин улитки.

Description

со

Слд СО

Изобретение относитс  к иммунохимии , в частности к способам получени  антител к катехоламинам, и может быть использовано в медицине, диагно стической и исследовательской работе Известен способ получени  антисыBopoTioi к катехоламину.путем иммунит зации животного антигеном, представл кмцим собой катсхоламин, фенильное  дро которого ковалентно св зано с полипептидом или протеином U. Недостатками данного способа  вл  ютс  низкие специфичность и сродств получаемых антител к катехоламину. Известен также- способ получени  антисьторотки к катехоламину путем иммунизации животного антигеном, ковалентно св занным с носителем, при этом аминогруппа катехоламина ковалентно св зана с карбоксильной группой белка или полипептида 2J. Однако известный способ позвол ет получить антитела к катехоламину, обладакщие низкими специфичностью и сродством, поскольку в используемом дл  иммунизации конъюгированном антигене остаток катехоламина близко расположен к антигенным детерминантам белка или полипептида, вз тых в качестве носител  целевого антигена. Целью изобретени   вл етс  повышение специфичности целевого продукта . Цель достигаетс  тем, что согласн способу к катехоламину путем иммунизации животного антигеном, ковалентно св занным с носителем, с последую щим забором крови и выделением из нее антисьшоротки, в качестве интиге на используют остаток катехоламина, ковалентно св занный с белком-носите лем по следующей формуле . НН К - I -. (СН РУ - I -Б где К остаток катехоламина, со держшций первичную амино группу; остаток антигенного белка-носител . алифатическа:  цепочка; В качестве белка-носител  исполь зуют сывороточный альбумин, бычий тиреоглобулин или гемоцианин улитки Пример. Синтез конъюгата осуществл ют с помощьп сочетающего реагента - глутарового альдегида. В качестве антигенных носителей используют бычий сывороточный альбумин, бычий тиреоглобулин и гемоцианин улит ки. В 5 мл 0,05 М фосфатного буфера рН 7,2 раствор ют 5 мМ катехоламина, например норадреналина, дофамина, дофа или норметанефрина, в 0,001 мМ белка-носител . В этому раствору прибавл ют при посто нном перемешивании по капл м 2 мл 0,05 М раствора глутарового альдегида. По истечении 30 мин инкубации при комнатной температуре добавл ют 0,2 мл 0,2 М раствора глутарового альдегида. Реакционную смесь перемешивают 3ч, затем к ней приливают 0,2 мл 1%-ного раствора боргидрида натри  и оставл ют при комнатной температуре 1 ч.. Далее раствор диализуют против физиологического раствора 24 ч при . Содержание св занного катехоламина в конъюгатах оценивают радиационным методом с применением меченого тритием катехоламина и спектрофотометрическим методом. Иммунизацию кроликов провод т по следующей схеме: первую инъекцию (0,1 мл смеси равных объемов полного адъюванта Фрейнда и раствора антигена с концентрацией 1 мг/мл) делают в лимфатический узел бедра задней лапы. Через 3 недели 0,5 мл смеси ввод т внутрикожно во множество точек в область шеи. Затем через 2 недели инъецируют смесь с неполным адъювантом Фрейнда (1 мл) внутримышечно в бедро задней лапы. Последующие инъекции (0,5 мл смеси с неполным адъювантом) провод т внутрикожно с мес чным интервалом. Через 7 дней после введени  антигена производ т забор крови. Полученную антисыворотку инактивируют нагреванием при 30 мин, раздел ют на аликвоты и хран т при -20С. Антитела к катехоламину идентифицируют методами встречной двухмерной диффузии и по св зыванию сыворотками радиоактивного катехоламина по способу , согласно которому к 50 мкл сыворотки в 0,1 мл 0,1 М трис-буфера рН 7,5 добавл ют 3,4 нг меченого тритием катехоламина и инкубируют при 4°С 3 ч. Радиационную смесь раздел ют на колонке с сефадексом G -25, о примен   в качествеэлюента 0,1 М трис-буфер рН 7,5, Фракщ1И (по 1 мл) смешивают с 10 мл сцинтилл ционного раствора Бре  и измер ют радиактивНОСТЬ в жидкостном СЦИНТШ1ЯЦИОННОМ спектрометре. Контролем служит сьгооротка интактного кролика. Титры антител определ ют путем ин кубации фиксированного количества меченого тритием катехоламина с сери ей двухкратных разведений антисыворотки . Дл  разведени  примен ют 0,02 М фосфатный буфер рН 7,4, содержащий 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина . Методика определени  титров, специфичности и сродства антител следую ща . К 100 мкл антисыворотки соответствукщего разведени  добавл ют 0,34 нг меченого тритием катехоламина в 0,1 МП 0,2 М фосфатного буфера рН 7,4 и 0,3 мл 0,5 %-ного раствора бычьего сывороточного альбумина, содержащего 0,9% хлористого натри  и 0,05 % кроличьего гаммаглобули а. Смесь перемешивают и инкубируют 12ч при 4С. Св занный меченый тритием катехоламин осаждают добавлением 0,5 мл Э0%-ного раствора полиэтиленгликол  и удал ют центрифугированием при 3000 об/мин 40 мин.,. К 0,2 мл над оса очной жидкости добавл ют 10 мл раствора Бре  и просчитывают на сцинтшш ционном счетчике. Иаксималь ное разведение антисыворотки, при котором св зьшание меченого тритием катехоламина составл ет 15%, приннмают за титр .антител к катехоламиНу Дл  оценки перекрестной реактивности антител используют известный прием ингибировани  св зывани  анти сывороткой меченого гаптена его род ственными соединени ми. Специфичнос антисыворотки оценивают путем добав- ., лени  аналогов, например, к норадр«налину , таких как дофамин, дофа и норметанефрин. Определение св зывающей способности антител провод т методом сатурационного анализа, Дл  количественной оценки процесса взаимодействи  антител с катехоламином используют значени  констант ассоциации (Касс, М), вычисление которых производ т исход  из графика Скэтчарда. Результаты исследовани  обраба-гаваютметодом вариационной статистики по Стьюденту-Фишеру. Положительные качества получаемых предлагаемым способом антител к катехоламину представлены в табл. № 1. .Перекрестна  реактивность, котора  характеризует специфичность антител, получаемых предлагаемым способом, ниже , чем перекрестна  реактивность антител, получаегфк по прототипу. | Это говорит о том, что специфичность антител, получаемых пре; лагаемым способом , выше. Поскольку константы ассоциации антител, получаемых предлагаемым способом, вьш1е, чем констан- ты ассоциации антител, получаеьолх по прототипу, то можно утверждать, что сродство антител, получаемых предлагаемым способом, выше. Были получены характеристики св зьгаани  катехоламина с антигенным носителем, которые сведены в табл. № 2 на примере норадреналина. , В табл. 3 представлены титры антител в полученных антисыворотках. , Из табл. № 3 видно, что титры антител в антисыворотках, полученных предлагаег4ым способом, выше тит-. ров антител в антисыворотках, полу ченных по прототипу. Дл  сравнени  использованы антисыворотки, полученные по прототипу. Таким образом, специфичность целевого продукта возросла в 3-4 раза -по сравнению с известным, что позвол ет повысить чувствительность определени  сенсибилизации организма к препаратам катехаламина.

Claims (2)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИСЫВОРОТКИ К КАТЕХОЛАМИНУ путем иммунизации животного антигеном, ковалентно связанным с носителем, с последующим забором крови и выделением из нее антисыворотки, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности целевого продукта, в качестве антигена используют оста ток катехоламина, ковалентно связанный с белком-носителем по следующей формуле

Н Н

К - I - (СН )₅ - I - Б ₍

N · N

Н где К - I - остаток катехоламина, N содержащий первичную аминогруппу;

- I - Б N ^(СНА остаток антигенного белка-носителя . алифатическая цепочка;

2. Способ поп. 1,отличаю щ и й с я тем, что в качестве белка носителя используют сывороточный альбумин, бычий тиреоглобулин или гемоцианин улитки.

SU „„1097337