JPH0269196A - 抗体、抗体産生細胞および抗体の作製方法 - Google Patents
抗体、抗体産生細胞および抗体の作製方法Info
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- JPH0269196A JPH0269196A JP63220932A JP22093288A JPH0269196A JP H0269196 A JPH0269196 A JP H0269196A JP 63220932 A JP63220932 A JP 63220932A JP 22093288 A JP22093288 A JP 22093288A JP H0269196 A JPH0269196 A JP H0269196A
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は低分子を抗原とした抗体、あるいは抗体産生細
胞、モノクローナル抗体の作製におおいて、高性能抗体
を得るための方法に関する。
胞、モノクローナル抗体の作製におおいて、高性能抗体
を得るための方法に関する。
従来の技術
抗体は一般に多種類のアミノ酸配列の抗体の混合物であ
るポリクローナル抗体と、単一のアミノ酸配列を有する
モノクローナル抗体とに大別される。ポリクローナル抗
体は免疫原を注射した動物の血清、腹水等の体液あるい
はこれらを精製して得られる。また、免疫原を注射した
動物の細胞(通常肺臓細胞)とミエローマ細胞とを融合
して抗体産生細胞が得られる。この抗体産生細胞のうち
、特に良好な細胞ラインを選択(クローニング)し、培
養した後培養上清を精製するとモノクローナル抗体が得
られる。
るポリクローナル抗体と、単一のアミノ酸配列を有する
モノクローナル抗体とに大別される。ポリクローナル抗
体は免疫原を注射した動物の血清、腹水等の体液あるい
はこれらを精製して得られる。また、免疫原を注射した
動物の細胞(通常肺臓細胞)とミエローマ細胞とを融合
して抗体産生細胞が得られる。この抗体産生細胞のうち
、特に良好な細胞ラインを選択(クローニング)し、培
養した後培養上清を精製するとモノクローナル抗体が得
られる。
抗原が分子量致方の蛋白質等の場合は抗原をそのまま免
疫原として注射できるが、低分子(ハプテン)の場合は
適当な蛋白質にこれを結合し、疑似的に分子量を高くし
た免疫原を注射する必要がある。通常ハプテンはアミン
基、カルボキシル基、水酸基、メルカプト基等の官能基
および、炭素数4から10程度のスペーサーを導入した
抗原誘導体を合成した後、架橋試薬等で蛋白と結合を行
うのが一般的である。例えばメタンフェタミン(MA)
の場合は、装置、福田岸田、高欄、日本法医学雑誌(T
amakl、 Fukuda、 K15hlda an
d Takahashl、 Jpn、 J、 Lega
l Med、、 37(4)、 417(1983))
に記載されているように、MAのアミン基にアミノブチ
ル基などを導入しくABMA)、さらに蛋白を結合して
免疫原とするのが通例である。
疫原として注射できるが、低分子(ハプテン)の場合は
適当な蛋白質にこれを結合し、疑似的に分子量を高くし
た免疫原を注射する必要がある。通常ハプテンはアミン
基、カルボキシル基、水酸基、メルカプト基等の官能基
および、炭素数4から10程度のスペーサーを導入した
抗原誘導体を合成した後、架橋試薬等で蛋白と結合を行
うのが一般的である。例えばメタンフェタミン(MA)
の場合は、装置、福田岸田、高欄、日本法医学雑誌(T
amakl、 Fukuda、 K15hlda an
d Takahashl、 Jpn、 J、 Lega
l Med、、 37(4)、 417(1983))
に記載されているように、MAのアミン基にアミノブチ
ル基などを導入しくABMA)、さらに蛋白を結合して
免疫原とするのが通例である。
発明が解決しようとする課題
しかしながら上記の免疫原を用いて作製した抗体は、目
的の抗原(例えばMA)よりもむしろ抗原誘導体(例え
ばABMA)に対して高いアフィニティーを何している
ことが発明者らの検討により明らかになった。即ち従来
の方法では、あ(まで抗原誘導体に対する抗体を産生ず
る方向を有した生体内免疫系の交差反応によって抗原の
抗体が作られるから、本来目的とする抗原に対しては高
いアフィニティーの抗体を作るのは困難であるという問
題がある。この結果、酵素免疫法、ラジオイムノアッセ
イ等で抗原測定を行う際、高感度に検出することが不可
能となる。
的の抗原(例えばMA)よりもむしろ抗原誘導体(例え
ばABMA)に対して高いアフィニティーを何している
ことが発明者らの検討により明らかになった。即ち従来
の方法では、あ(まで抗原誘導体に対する抗体を産生ず
る方向を有した生体内免疫系の交差反応によって抗原の
抗体が作られるから、本来目的とする抗原に対しては高
いアフィニティーの抗体を作るのは困難であるという問
題がある。この結果、酵素免疫法、ラジオイムノアッセ
イ等で抗原測定を行う際、高感度に検出することが不可
能となる。
課題を解決するための手段
目的抗原(例えばMA)のアルキル基が水素原子で置き
変わった疑似抗原(例えばアンフェタミン、AP)を用
いて抗原誘導体(例えばA B A P)を作製し、蛋
白と結合して免疫原とする。
変わった疑似抗原(例えばアンフェタミン、AP)を用
いて抗原誘導体(例えばA B A P)を作製し、蛋
白と結合して免疫原とする。
作用
上記の構成は、免疫原作製の際の抗原の分子構造、特に
結合部分の構造に注目して検討を行った結果によるもの
で、これにより、結果的には目的抗原(例えばMA)の
アルキル基がスペーサーで置換された抗原誘導体(例え
ばABAP)を得ることができる。このような目的抗原
と抗原誘導体は構造の類似性が高いため、目的抗原に対
して高いアフィニティーを有する抗体の作製が可能とな
る。
結合部分の構造に注目して検討を行った結果によるもの
で、これにより、結果的には目的抗原(例えばMA)の
アルキル基がスペーサーで置換された抗原誘導体(例え
ばABAP)を得ることができる。このような目的抗原
と抗原誘導体は構造の類似性が高いため、目的抗原に対
して高いアフィニティーを有する抗体の作製が可能とな
る。
実施例
本発明の一実施例としてメタンフェタミン(MA)を目
的抗原とした場合について説明する。本実施例において
は、MAのN−アルキル基が水素原子に置換された構造
を宵するアンフェタミン(AP)に、スペーサーとして
アミノブチル基を導入した抗原誘導体(ABAP)を合
成し、これにキャリア蛋白としてスカシ貝由来ヘモンア
ニ7(KLH)を結合して免疫原とした(AP−KLH
)。
的抗原とした場合について説明する。本実施例において
は、MAのN−アルキル基が水素原子に置換された構造
を宵するアンフェタミン(AP)に、スペーサーとして
アミノブチル基を導入した抗原誘導体(ABAP)を合
成し、これにキャリア蛋白としてスカシ貝由来ヘモンア
ニ7(KLH)を結合して免疫原とした(AP−KLH
)。
この免疫原を動物に注射することにより動物の血清中に
抗MA抗体が産生される。この時の動物としては、は乳
類であればすべて適用できるが実験の簡便さからマウス
を選択した。マウスの系統はA/Jが最も免疫応答が高
く、好適である。
抗MA抗体が産生される。この時の動物としては、は乳
類であればすべて適用できるが実験の簡便さからマウス
を選択した。マウスの系統はA/Jが最も免疫応答が高
く、好適である。
以下にMAl AP、ABMAl ABAPの構造式を
示す。これらの構造式から、MAとABAPは高い類似
性があることがわかる。
示す。これらの構造式から、MAとABAPは高い類似
性があることがわかる。
[APコ
[ABAPコ
[MAコ
[ABMA]
以下、本実施例を手順を追って説明する。
■ABAPの合成法
A P 2.OOgと4.17gl7)N−ブロモブチ
ルフタルイミドおよび炭酸ナトリウム3.14gをベン
ゼンIOmL中16時間リフラックスした。反応液から
溶媒を溜去した後、分取用薄層クロマトグラフィー(シ
リカゲル、展開溶媒:アンモニア飽和、メタノール/ク
ロロフォルム=5/95、Rf:Q、7、抽出溶媒メタ
ノール)で精製した。1.59gのN−(4−フタルイ
ミジルブチル)アンフェタミン(P r BAP)が得
られた。
ルフタルイミドおよび炭酸ナトリウム3.14gをベン
ゼンIOmL中16時間リフラックスした。反応液から
溶媒を溜去した後、分取用薄層クロマトグラフィー(シ
リカゲル、展開溶媒:アンモニア飽和、メタノール/ク
ロロフォルム=5/95、Rf:Q、7、抽出溶媒メタ
ノール)で精製した。1.59gのN−(4−フタルイ
ミジルブチル)アンフェタミン(P r BAP)が得
られた。
P I B A Pl、50gを95%!−タノール5
mLに溶解し、0.25gのヒドラジン1永和物を加え
て1.5時間リフラックスしたところ少量の自沈が生じ
た。ろ過し、ろ液を緩やかに溜去し約0.501Lまで
濃縮するとさらに自沈が生した。再びろ過後、ろ液をI
N塩酸で酸性にし、生じた自沈を除去した後、水酸化ナ
トリウムでアルカリ性にすると、油層が分離した。油層
をンエチルエーテルで抽出し、溜去後、前項と同条件の
薄層クロマトグラフィーで精製した。目的物は薄層上、
ニンヒドリン試薬で青紫の発色によって確認できた。最
終的に0.75gのN−(4−アミノブチル)アンフェ
タミン(ABAP)が得られた。
mLに溶解し、0.25gのヒドラジン1永和物を加え
て1.5時間リフラックスしたところ少量の自沈が生じ
た。ろ過し、ろ液を緩やかに溜去し約0.501Lまで
濃縮するとさらに自沈が生した。再びろ過後、ろ液をI
N塩酸で酸性にし、生じた自沈を除去した後、水酸化ナ
トリウムでアルカリ性にすると、油層が分離した。油層
をンエチルエーテルで抽出し、溜去後、前項と同条件の
薄層クロマトグラフィーで精製した。目的物は薄層上、
ニンヒドリン試薬で青紫の発色によって確認できた。最
終的に0.75gのN−(4−アミノブチル)アンフェ
タミン(ABAP)が得られた。
■免疫原の作製法
19.1mgのABAPを0.5N塩酸201Lに溶解
し、リン酸バッファー4.8mLで希釈した。この溶液
に5PDP (ファルマシア社製) 12.5111g
のImLのエタノール溶液を混合し、30分撹拌した。
し、リン酸バッファー4.8mLで希釈した。この溶液
に5PDP (ファルマシア社製) 12.5111g
のImLのエタノール溶液を混合し、30分撹拌した。
TLC(シリカゲル、展開溶媒:アンモニア飽和、メタ
ノール/クロロフォルム: 5/95、U V光の吸収
で判別)上で5PDPのスポットが消失したのを確認し
た(AP−SPDP)。
ノール/クロロフォルム: 5/95、U V光の吸収
で判別)上で5PDPのスポットが消失したのを確認し
た(AP−SPDP)。
KLl((分子量は一般的取扱に従い、100,000
と仮定) 32[i、5mgをリン酸バッフy −(p
H7,0,0,1M、 NaCl O,IM含仲)溶液
(2,2mg/mL) 50mLに、SP D P 5
1.3mg/ エタノール4.2mL溶液を滴下した。
と仮定) 32[i、5mgをリン酸バッフy −(p
H7,0,0,1M、 NaCl O,IM含仲)溶液
(2,2mg/mL) 50mLに、SP D P 5
1.3mg/ エタノール4.2mL溶液を滴下した。
常温で12時間攪拌後、ファデクスG25充填カラム(
ファルマシア、直径4cmX長50CII1% m速E
i、9mL/m1n)でゲルろ過した。
ファルマシア、直径4cmX長50CII1% m速E
i、9mL/m1n)でゲルろ過した。
ジチオスレイトール(DTT) 100mMリン酸バッ
ファー溶液1.8mLを上記の流出液に添加し還元を行
った。これをゲル濾過した後、溶液106mLにAP−
8PDP溶液を徐々に加え、30分後ゲル濾過した。こ
の結果、KLHI分子あたり14.3分子のAPが導入
された(AP−KLH)。
ファー溶液1.8mLを上記の流出液に添加し還元を行
った。これをゲル濾過した後、溶液106mLにAP−
8PDP溶液を徐々に加え、30分後ゲル濾過した。こ
の結果、KLHI分子あたり14.3分子のAPが導入
された(AP−KLH)。
■免疫方法
AP−KLH溶液(K L H8度でImg/mL)と
ヒト結核死菌含有コンプリートフロインドアジュバント
を同量混合し、ホモジナイザーで乳化したものをマウス
(A/J)の腹腔に100 μL/mouse注射した
。
ヒト結核死菌含有コンプリートフロインドアジュバント
を同量混合し、ホモジナイザーで乳化したものをマウス
(A/J)の腹腔に100 μL/mouse注射した
。
A P −K L Hによる免疫後18週が経過したマ
ウスの血清を用いて抗原固相酵素免疫測定法(ELIS
A法)によるMAおよびABMAのインヒビジョン感度
を測定した結果を図(実線)に示す。ここで低い濃度で
インヒビジョンがかかるほど検出感度が高いといえる。
ウスの血清を用いて抗原固相酵素免疫測定法(ELIS
A法)によるMAおよびABMAのインヒビジョン感度
を測定した結果を図(実線)に示す。ここで低い濃度で
インヒビジョンがかかるほど検出感度が高いといえる。
図において縦軸は相対吸光度であり、固相抗原に結合し
ている抗体量の相対値を示している。また、比較例とし
てM A −K L Hによる免疫後18週が経過した
マウスの血清について同じ検討を行った結果を同じく図
(点線)に示す。なお、ELISAにおいて抗血清はい
ずれも10000倍希釈した。また、B5A1分子あた
り0.4分子のABMAが結合したものをプレートに吸
若させて固相抗原とした。
ている抗体量の相対値を示している。また、比較例とし
てM A −K L Hによる免疫後18週が経過した
マウスの血清について同じ検討を行った結果を同じく図
(点線)に示す。なお、ELISAにおいて抗血清はい
ずれも10000倍希釈した。また、B5A1分子あた
り0.4分子のABMAが結合したものをプレートに吸
若させて固相抗原とした。
図の結果について、まずMA−KLHで免疫したものに
ついてインヒビジョンによる半減値を見ると、MA(曲
線a)では10−35MまたABMA(曲線b)では■
0−6・2Mである。即ち抗原誘導体(ABMA)がM
Aよりも50倍高いアフィニティーを有している。すな
わち、いわゆるヘテロロガスアッセイの逆の現象が生じ
て検出感度を低下させていることが推察される。一方A
P−KLHによって免疫した抗血清はインヒビジョンに
よる半減値を見るとMA(曲線C)では10−10−6
5M1AB曲線d)ではlo−6・8Mである。つまり
上記の例とは逆に抗原誘導体(ABMA)よりもMAに
対して50倍高いアフィニティーを仔している。事実、
結果としてMAに対するインヒビジョン感度はMA−K
LHで免疫した抗血清よりも約1000倍の高い感度で
インヒビンヨンがかかった。なお、上記の考え方に基づ
(抗原の分子設計、免疫方法は本実施例に示したM A
以外についても分子Lllooo以下の程度のハプテン
系に対する免疫方法について一般的に適用可能である。
ついてインヒビジョンによる半減値を見ると、MA(曲
線a)では10−35MまたABMA(曲線b)では■
0−6・2Mである。即ち抗原誘導体(ABMA)がM
Aよりも50倍高いアフィニティーを有している。すな
わち、いわゆるヘテロロガスアッセイの逆の現象が生じ
て検出感度を低下させていることが推察される。一方A
P−KLHによって免疫した抗血清はインヒビジョンに
よる半減値を見るとMA(曲線C)では10−10−6
5M1AB曲線d)ではlo−6・8Mである。つまり
上記の例とは逆に抗原誘導体(ABMA)よりもMAに
対して50倍高いアフィニティーを仔している。事実、
結果としてMAに対するインヒビジョン感度はMA−K
LHで免疫した抗血清よりも約1000倍の高い感度で
インヒビンヨンがかかった。なお、上記の考え方に基づ
(抗原の分子設計、免疫方法は本実施例に示したM A
以外についても分子Lllooo以下の程度のハプテン
系に対する免疫方法について一般的に適用可能である。
さらに、本実施例で感作した動物の肺臓細胞とミエロー
マ細胞を常法にしたかって融合したハイブリドーマ細胞
から産生される抗体(モノクローナル抗体)も当然間等
の効果を示す。
マ細胞を常法にしたかって融合したハイブリドーマ細胞
から産生される抗体(モノクローナル抗体)も当然間等
の効果を示す。
発明の効果
本発明によれば、免疫的測定方法で目的物質を高感度に
測定可能な高性能抗体の作製が可能となる。
測定可能な高性能抗体の作製が可能となる。
図は、本発明の実施例で作製した高性能抗体および従来
方法で作製した抗体を用いたELISA法によるMAお
よびABMAの検出結果を示すグラフである。 代理人の氏名 弁理士 粟野重孝 はか1名−8−7−
、g −,5−4 J!へと 〔rづハ (門)〕
方法で作製した抗体を用いたELISA法によるMAお
よびABMAの検出結果を示すグラフである。 代理人の氏名 弁理士 粟野重孝 はか1名−8−7−
、g −,5−4 J!へと 〔rづハ (門)〕
Claims (6)
- (1)分子量2000以下の低分子化合物を抗原とする
抗体の作製において、前記抗原のアルキル基が水素原子
で置換された疑似抗原を化学的にタンパク質と結合した
ものを免疫原とすることを特徴とする抗体の作製方法。 - (2)抗原がメタンフェタミンである請求項1に記載の
抗体の作製方法。 - (3)疑似抗原がアンフェタミンである請求項1に記載
の抗体の作製方法。 - (4)請求項1に記載の抗体の作製方法により免疫注射
された感作動物の体液から得られる抗体。 - (5)請求項1に記載の抗体の作製方法により免疫注射
された感作動物の細胞とミエローマ細胞を融合して得ら
れる抗体産生細胞。 - (6)請求項1に記載の抗体の作製方法により免疫注射
された感作動物の細胞とミエローマ細胞を融合して得ら
れる抗体産生細胞を培養した培養上清を精製して得られ
るモノクローナル抗体。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63220932A JP2600325B2 (ja) | 1988-09-02 | 1988-09-02 | 抗体、抗体産生細胞および抗体の作製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63220932A JP2600325B2 (ja) | 1988-09-02 | 1988-09-02 | 抗体、抗体産生細胞および抗体の作製方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0269196A true JPH0269196A (ja) | 1990-03-08 |
JP2600325B2 JP2600325B2 (ja) | 1997-04-16 |
Family
ID=16758816
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63220932A Expired - Lifetime JP2600325B2 (ja) | 1988-09-02 | 1988-09-02 | 抗体、抗体産生細胞および抗体の作製方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2600325B2 (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1331219A1 (en) * | 2002-01-23 | 2003-07-30 | Drug Abuse Sciences, Inc. | New amphetamine derivatives, antibodies against them and pharmaceutical compositions containing them |
US6991911B2 (en) | 2003-12-15 | 2006-01-31 | Dade Behring Inc. | Assay for entactogens |
US7022492B2 (en) | 2003-12-15 | 2006-04-04 | Dade Behring Inc. | Ecstasy haptens and immunogens |
US7037669B2 (en) | 2004-03-22 | 2006-05-02 | Dade Behring Inc. | Assays for amphetamine and methamphetamine using stereospecific reagents |
US7115383B2 (en) | 2004-03-22 | 2006-10-03 | Dade Behring Inc. | Assays for amphetamine and methamphetamine |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5799533A (en) * | 1980-12-12 | 1982-06-21 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | Hapten antigen and its synthetic intermediate |
JPS5799598A (en) * | 1980-12-12 | 1982-06-21 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | Hapten antigen and its synthetic intermediate |
JPS6176468A (ja) * | 1984-09-04 | 1986-04-18 | コロラド・ステイト・ユニヴアーシテイ・リサーチ・フアウンデイシヨン | 2‐クロロ‐4‐(イソプロピルアミノ)‐6‐(アミノカプロン酸)‐s‐トリアジン誘導体 |
-
1988
- 1988-09-02 JP JP63220932A patent/JP2600325B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JPS5799533A (en) * | 1980-12-12 | 1982-06-21 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | Hapten antigen and its synthetic intermediate |
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JPS6176468A (ja) * | 1984-09-04 | 1986-04-18 | コロラド・ステイト・ユニヴアーシテイ・リサーチ・フアウンデイシヨン | 2‐クロロ‐4‐(イソプロピルアミノ)‐6‐(アミノカプロン酸)‐s‐トリアジン誘導体 |
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US6991911B2 (en) | 2003-12-15 | 2006-01-31 | Dade Behring Inc. | Assay for entactogens |
US7022492B2 (en) | 2003-12-15 | 2006-04-04 | Dade Behring Inc. | Ecstasy haptens and immunogens |
US7037669B2 (en) | 2004-03-22 | 2006-05-02 | Dade Behring Inc. | Assays for amphetamine and methamphetamine using stereospecific reagents |
US7115383B2 (en) | 2004-03-22 | 2006-10-03 | Dade Behring Inc. | Assays for amphetamine and methamphetamine |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2600325B2 (ja) | 1997-04-16 |
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