FI86145B - Histaminderivat, immmunogenkonjugater och mot dessa producerade antikroppar. - Google Patents

Description

1 86145

Histamiinijohdannaiset, inununogeenikonjugaatlt ja niitä vastaan tuotetut vasta-aineet

Histamiini on voimakas vasoaktiivinen välittäjä, 5 jota erittyy herkistyneistä kudoksen syöttösoluista ja basofiileistä allergeenialtistuksen seurauksena, siten laukaisten allergisen oireen yksilössä. Allergisen reaktion in vivo-diagnoosi voidaan suorittaa allergeeni-iho-testillä, mutta sellainen testi voi olla vaarallinen ana-10 fylaktisen reaktion vuoksi, voi herkistää potilaan allergeenille ja on yleensä epämiellyttävä. On saatavissa in vitro-koemenetelmiä, jotka mittaavat allergeenispesifisen IgE-vasta-aineen määrää seerumissa, kuitenkin uskotaan, että hyödyllisempi määritys olisi histamiinineritys, joka 15 voi kuvata tarkemmin in vivo-allergiaoireita. Tämä kek sintö käsittää histamiinijohdannaisia, mainituista histamiini johdannaisista koostuvia immunogeenikonjugaatteja yhdistettynä immunogeenisiin kantaja-aineisiin ja sellaisia Immunogeenikonjugaatteja vastaan tuotettuja vasta-ai-20 neita. Sellaiset vasta-aineet ovat hyödyllisiä immunolo gisissa määrityksissä, histamiinin määrittämisessä biologisista tai laboratorionesteistä, kuten esimerkiksi, kun herkistyneitä basofiilejä on käsitelty allergeenisarjal-V·! la.

: 25 Eurooppalainen patenttihakemus EPO 110640 kuvaa re- septoripohjaisen kompetitiivisen inhibitiomääritysmene-telmän histamiinimäärien määrittämiseksi keho- tai labo-ratorionesteestä. Lisäksi kuvataan "histamiini-indikaattori "-konjugaatte ja kuten histamiinipiparjuuriperoksidaa-30 sikonjugaatti ja histamiini-emäksinen fosfataasikonju- . . gaatti, viimemainittu konjugoituna histamiiniin 1-etyyli- 3-(3-dimetyyliaminopropyyli )-karbodi-imidireatkion avulla. Yllämainittu julkaistu patenttihakemus käsittelee :*·*: erilaisia muita menetelmiä histamiinin kvantitatiiviseen ‘. 35 määrittämiseen, kuten muunnelmat ortoftalaldehydikonju- gaatiomäärityksestä ja kromatografiset menetelmät.

2 86145

Julkaisussa Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Voi. 81, ss 2572-2576 (huhtikuu 1984) on kuvattu histamiinianti-seerumin käyttö rotan aivojen histamiinia sisältävien solujen immunohistokemiallisessa tutkimuksessa. Mainittu 5 tutkimus tehtiin sen selvittämiseksi, toimiiko histamiini hermovälittäjänä nisäkkään keskushermostossa.

Mitä ym. (Agents and Actions, Voi 14, 5/6, 1984) kuvaavat useita hapteenikantajakonjugaatteja käytettynä yrityksessä kehittää polyklonaalinen vasta-aine histamii-10 nille. Kirjoittajat kuitenkin toteavat, että yritys kehittää spesifinen vasta-aine histamiinille ei onnistunut.

Tämä keksintö koskee tiettyjä seuraavaan ryhmään kuuluvia histamiinijohdannaisia: 15 | | CHgCHgNH — R — X (J)

HN\^N

?H2

20 f=I-CH2CH _ R _ X

ch9nh, I 2 2

r— I CH — R — X

i X (III)-> ... 25 . .·. jossa R on kytkentäryhmä, joka koostuu lineaarisesta ali- faattisesta ryhmästä, jossa on 1 - 10 hiiliatomia ja X on 30 terminaalinen funktionaalinen ryhmä, joka on karboksyyli, . . amino, tioli tai hydroksyyli, sillä edellytyksellä että kun johdannaisella on yllä kohdassa (II) esitetty kaava • 1 « ’·[ X:n ollessa OH, R ei ole metyleeniryhmä -CH2-.

·’·1: Lisäksi kuvataan histamiini johdannaisiin kytkeyty- 35 neistä immunogeenisista kantajista muodostuneita hista- • · · 1 · • 1> · · • · • 1 • · · 3 86145 miini-immunogeenikonjugaatteja, jotka kuuluvat seuraavaan ryhmään: 5 r=p-CH2CH2NH — R — X'-- HN„ A kantaja (V);

— _ P

10 Γ Γ* Ί r- - i CHrCH — R — X'-- I I c kantaja mu — P 15 ch,nh9 ““ I 2 2 I | CH — R — V-- 20 kantaja (yn);

_ _I P

jossa R on kytkentäryhmä, Joka koostuu lineaarisesta ali-faattisesta ryhmästä, jossa on 1 - 10 hiiliatomia ja X' on :**[: 25 jäännös, joka jää jäljelle terminaalisesta funktionaali-sesta ryhmästä X, joka on karboksyyli, amino, tioli tai : hydroksyyli, sillä edellytyksellä että kun johdannaisella . .·. on yllä kohdassa (VI) esitetty kaava, X:n ollessa OH, R ei ole metyleeniryhmä -CH2-, p on noin l:stä 120reen ja kan- • · · 30 taja on immunogeeninen kantaja-aine.

Keksintö koskee lisäksi edellä kuvattuja konju-** gaatteja vastaan tuotettuja monoklonaalisia vasta-aineita ja niiden käyttöä testipakkauksissa sekä immunologisia menetelmiä histamiinin määrittämiseksi biologisista tai • ♦ .***. 35 laboratorionesteistä.

• ♦ • · · 4 86145 Tämän keksinnön histamiinijohdannaiset voidaan valmistaa siten, että ne sisältävät hyvin erilaisia kytkeviä ryhmiä R ja terminaalisia funktionaalisia ryhmiä X. Esimerkiksi, R voi olla lineaarinen aikeeni, jossa on 1 - 10 5 ja yleensä alle 6 hiiliatomia (siis metyleeni, eteeni, n-propeeni, n-buteeni jne). Lisäksi sellaiset alkeenit voivat sisältää muita substituenttiryhmiä kuten syano, amino (myös substituoitu amino), asyyliamino, halogeeni, tioli, hydroksyyli, karbonyyliryhmiä, karboksyyli (myös 10 substituoituja karboksyylejä kuten estereitä, amideja ja substituoituja amideja). Kytkevä ryhmä R voi myös sisältää substituoituja tai substituoitumattomia aryyli-, aralkyy-li- tai heteroaryyliryhmiä (esim. fenyleeni, fenetyleeni ja niin edelleen), tai koostua niistä. Lisäksi sellaiset 15 liitokset voivat sisältää yhden tai useampia heteroatomeja ryhmästä typpi, happi, rikki, eetteri-, esteri-, amido-, amino-, tioeetteri-, amidiino-, sulfoni-, tai sulfoksidi-muodossa. Myöskin sellaiset liitokset voivat sisältää tyy-dyttymättömiä ryhmittymiä kuten olefiini- tai asetyleeni-20 sidoksia, imino- tai oksiminoryhmiä. Edullisesti R on ali-faattinen ketju, joka koostuu vetyä lukuunottamatta 1-20, tavallisemmin 1-10 atomista, joista 0-5 ovat heteroatome ja ryhmästä typpi, happi, rikki. Siksi kytkentäryhmän R ‘ · laji ei ole tämän keksinnön kannalta kriittinen, vaan sen : : 25 voi valita tavallisten tietojen perusteella, kunhan pitää tavalliseen tapaan huolta siitä, että syntyvät tuotteet : ovat pysyviä. Samalla tavoin terminaalinen funktionaalinen . .·. ryhmä X voi vaihdella. Edullisista johdannaisista seuraava johdannainen on erityisen edullinen.

’ 30 . . f=-1 CH2CH2NH— CH2CH2— COOH (X) ::n hn^n

Edustavia menetelmiä erilaisia kytkentäryhmiä R ja ."·. 35 terminaalisia funktionaalisia ryhmiä X sisältävien hista-*, miinijohdannaisten valmistamiseksi esitetään seuraavassa.

5 86145

Kaavan I histamiinijohdannaisia, joissa X on kar-boksyyli, voidaan valmistaa histamiinin ja omega-bromial-kaanihappojen (eli Br(CH2)nCOOH, jossa n on noin 1-10) reaktion avulla. Niitä kaavan I histamiinijohdannaisia, 5 joissa X on amino, voidaan valmistaa histamiinin ja ome-ga-bromialkyyliftalimidien reaktion avulla, josta tulee kaavan 0

II

10 |=r w + ch2 ^__nQQ) HN il (XI) 0 mukainen välituote, jossa n:n arvo on noin 1-10. Väli-15 tuotteen XI jatkokäsittely hydratsiinilla tuottaa vastaavan aminofunktionalisoidun kaavan I histamiinijohdannaisen, (jossa R on (CH2)n ja X on amino).

Kaavan I histamiinijohdannaisia joissa X on tioli voidaan valmistaa vastaavan aminoyhdisteen ja N-sukkin-20 imidyl-3-(2-pyridylditio)propionaatin reaktiolla J. Carlsonin ym., Biochem. J., 173, 723 (1978), menetelmän mukaan, johon täten viitataan, samoin kuin muihin tässä mainittuihin lähteisiin. Syntyvän suojaavan ryhmän poistaminen tuottaa kaavan I johdannaisen, jonka kaava on ' : 25 0

|--1 CH2CH2NH CH2 -¼ NH — C — CH2CH2 — SH

(XII) 30 jossa n:n arvo on noin 1-10. Vaihtoehtoisesti kaavan I . . johdannaisia, joissa X on tioli voidaan myös valmistaa *; ’· vastaavan aminoyhdisteen ja SAMSA-reagenssin reaktiolla, mikä on kuvattu julkaisussa Klotz ja Heiney, Arch. Bio-:***: chem. Biophys., 95, 605 (1964). Syntyvän suojaavan ryhmän .···. 35 poistaminen tuottaa kaavan I johdannaisen, jonka kaava on • · » 6 86145

O COOH

j I—CI^C^NH -f- CH2 NH — C — CH2—CH

SH (XIII) 5 jossa n:n arvo on noin 1-10.

Kaavan I histamiinijohdannaisia, joissa X on hyd-roksyyli, voidaan helposti valmistaa esimerkiksi vastaavan karboksyylijohdannaisen litium-alumiinihydridipelkis-tyksellä, esim.

10 p —ij.i CH2CH2NH ”4” CH2 COOH Li AI H^ HN^N " * r=T—ch2ch2nh -f- ch2 -4^-oh HN A 15 jossa n on noin 1-10.

Kaavan II histamiinijohdannaisia voidaan valmistaa esimerkiksi L-histidinolin kemiallisella muunnoksella 20 (Isn ja Casy, J.Med.Chem., 13.1027, 1970) seuraavanlaisen reaktioketjun mukaisesti: 0 NM ·· Γ2 NHC0C(CH3)

V-i 25 J-1 CH2CH CH20h r==-r~CH2—CH-CH?OCH?CH?CN

HN-> hnn^n (XIV) (XV) - : : 30 TH2 |~~ j r.H;CH — ch2och2ch9ch2nh9

* HN-^N

: V 35 (XVI) • » · • ft · 7 86145 L-histidinolin (XIV) aminofunktionaalisuus säilyy, kun t-boc-johdannainen ja hydroksyyliryhmä reagoivat ak-ryylonitriilin kanssa tuottaen välituotteen XV (R.T. Buckler ja F.E. Ward, US-patentti 4495281). Syanoryhmän 5 katalyyttinen pelkistyminen, jota seuraa suojaavan t-boc-ryhmän poisto laimealla HCl:llä tuottaa yhdisteen XVI (eli kaavan II histamiinijohdannaislajin, jossa R on -CH2OCH2CH2CH2- ja X on NH2).

Kaavan III funktionalisoituja histamiinijohdannai-10 siä voidaan valmistaa esimerkiksi imidatsoli-4-asetoni-triilin XVII N-trifenylmetyl- (eli trityl-)johdannaisesta (J.I. DeGraw ym J.Med.Chem., 20, 1671, 1977) seuraavan laisen reaktioketjun mukaisesti:

CN

15 J------| CH.CN p=rj-CH{CH2f4C00C2H5 trity "»H/HHPTA tritylA^-"

Br(CH^,C00C,H; (XVII) C ά 5 (XVIII) 20 CH9NH9 I 2 2 φ

r | CH-tCH^COO ^ NH4 W

1. NaOH(dil) N A

-—-> trityl 2. H2,NH3,Ni, HC1 25 150 atm.

(XIX) CH9NH0 I Z 2

p=j“CH4CH2^COOH

30 .·. : .·:·] Yhdiste XVII alkyloidaan etyyli-5-bromivaleraatil- la (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin) natrium- : *.* 35 hydridin ja heksametylfosforitriamidin (HMPTA) läsnäol- • · • · • · · • ♦ ·«· 8 86145 lessa. Tuote XVIII pelkistyy välituotteeksi XIX kun este-rifunktio hydrolysoidaan laimealla emäksellä. Tähän pelkistykseen voidaan käyttää erilaisia olosuhteita, kuten Raney-nikkeli-ammoniakki-vety 150 ilmakehän paineessa 5 (esim. G.J. Durant ym., GB-patentti 1341376; Chem.Abs., 80P, 95958g, 1974). Suojaavan trityyliryhmän poisto tuottaa XX:n, kaavan III histamiinijohdannaisen, jossa R on (CH2)4 ja X on karboksyyli.

Histamiinijohdannaisia voidaan sitten käyttää kyt-10 kemään mainitut johdannaiset immunogeeniseen kantaja- aineeseen johdannaisten liittävän ryhmän R ja terminaalisen funktionaalisen ryhmän X avulla. Immunogeeninen kantaja-aine voidaan valita mistä tahansa yleisesti tunnetusta. Useimmissa tapauksissa kantaja on valkuaisaine tai 15 polypeptidi, vaikka muita aineita, kuten hiilihydraatteja, polysakkarideja, lipopolysakkarideja, nukleiinihappoja ja muita riittävän suuria ja immunogeenisiä voidaan myöskin käyttää. Useimmiten immunogeenisten valkuaisaineiden ja polypeptidien molekyylipaino on 5000 ja 20 10 000 000 välillä, edullisesti yli 15 000 ja tavallisem min yli 50 000. Yleensä yhden eläinlajin valkuaisaineet ovat immunogeenisiä joutuessaan toisen lajin verenkiertoon. Erityisen käyttökelpoisia valkuaisaineita ovat ne, kuten albumiinit, globuliinit, entsyymit, hemosyaniitit, - " 25 gluteliinit tai proteiinit, joissa on merkittäviä ei-pro-teiinisia osia, esim. glykoproteiinia yms. Lisää tietoa tavanomaisista immunogeenisista kantaja-aineista ja tek-nilkoista, joilla hapteeneja voidaan kytkeä niihin, löytyy seuraavista lähteistä: Parker, Radioimmunoassay of Bio- 30 logically Active Compounds, Prentice-Hall (Englewood

Cliffs, New-Jersey, USA, 1976); Butler, J. Immunol. Meth.

. 7:1-24 (1975) ja Pharmacol. Rev. 29(2):103-163 (1978); !..* Weinryb ja Shroff, Drug Metab. Rev. 10:271-283 (1975); • · «

Broughton ja Strong, Clin. Chem. 22:726-732 (1976); ja : 35 Playfair ym., Br. Med. Bull. 30:24-31 (1974). Edullisia • · • · · « · · · 9 86145 immunogeenisiä kantaja-aineita tälle keksinnölle ovat naudan seerumin albumiini ja "keyhole limpet" hemosyanii-ni. Niinpä erityisen edullinen immunogeeninen konjugaatti on konjugaatti, joka muodostuu, kun kytketään kaavan X 5 histamiinijohdannainen "keyhole limpet" hemosyaniiniin.

Histamiinijohdannaiset ovat kytkettävissä immuno-geenisiin kantaja-aineisiin hyvin tunnettujen menetelmien avulla. Esimerkiksi kun histamiinijohdannaisen terminaalinen funktionaalinen ryhmä on amino, mainittu johdannai-10 nen voidaan liittää suoraan kantajaan seuraavalla tavalla. Histamiiniosan aminoryhmä voidaan kiinnittää amino-ryhmän sisältäviin kantajiin (esim. valkuaisaine- tai po-lypeptidikantajiin) tolueeni-2,4-di-isosyanaatilla [A.F. Schick ja S.J. Singer, J.Biol.Chem. 244:406 (1969)]; glu-15 taraldehydillä [L.A. Frohman ym., Endocrinol. 87:1055 (1970)]; bis-imidaateilla [A.Dutton ym., Biochem. Bio-phys. Res. Comm. 23:730 (1966)]; ja klooritriatsiinilla [T. Lang ym., J.C.S. Perkin 4:2189 (1977)]. Mainittuja aminoryhmiä voidaan liittää myös karboksyyliryhmän sisäl-20 täviin kantajiin (esim. jälleen valkuaisaine- tai poly-peptidikantajiin) tavallisilla peptidisidoksia muodostavilla reaktioilla anhydridiseosten, aktivoitujen esterien, asyyliatsidin muodostuksen, karbodi-imidien ja muiden vastaavien avulla. Katso Peptides, toim. Goodman ja 25 Meinhofer, John Wiley & Sons (New York, 1977) s 6 alkaen Y.‘ ja The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Voi. 1, Y.: Academic Press (New York, 1979). Samat menetelmät sopivat myöskin karboksyloitujen johdannaisten (eli niiden hista-miini-johdannaisten, joissa terminaalinen funktionaalinen •Y; 30 ryhmä X on karboksyyli) kiinnittämiseen aminoryhmän sisältäviin kantajiin.

.·. : Tioloituja histamiini johdannaisia (eli niitä his- -Y tamiinijohdannaisia, joissa terminaalinen funktionaalinen ryhmä X on tioli) voidaan valmistaa vastaavista aminoyh- «* · : Y 35 disteitä I.M. Klotzin ja R.E. Heineyn menetelmällä, Arch.

10 861 45

Biochem. Biophys. 95:605 (1962) ja ne voidaan kiinnittää tiolia sisältäviin polymeereihin (IgG tai tioloidut proteiinit) disulfidivaihtomenetelmällä (J.Martin, et ai, Biochem. 20:4229 (1981)]. Vaihtoehtoisesti voidaan antaa 5 aminoryhmän sisältävän polymeerin reagoida MBS-reagenssin kanssa ja tuote liittää tiolia sisältäviin johdannaisiin menetelmällä, jonka T. Kitagawa ja T.Aikawa, J. Biochem. 79:233 (1976) ovat kuvanneet. Monia muitakin menetelmiä on olemassa normaalitaidot alalta omaaville tämän keksinnön 10 erilaisten histamiinijohdannaisten liittämiseksi tavan omaisiin immunogeenisiin kantaja-aineisiin.

Konjugaatin jäännös X' tietysti vaihtelee sen mukaan mikä terminaalinen funktionaalinen ryhmä käytetyssä histamiinijohdannaisessa on ja se voi olla imino, sulfo, 15 okso, tms.

On syytä huomata, että kaavoissa jotka kuvaavat näitä immunokonjugaatteja, "p" edustaa kantajaan konju-goituneiden histamiiniosien lukumäärää. Lukua p kutsutaan joskus immunogeenin epitooppiseksi tiheydeksi ja on ta-20 vallisessa tilanteessa keskimäärin 1-120, tavallisemmin noin 1-50. Nämä tiheydet voivat kuitenkin vaihdella suuresti riippuen käytetystä kantaja-aineesta.

Spesifisten vasta-aineiden valmistaminen näitä im-munogeenikonjugaatteja käyttäen voi tapahtua millä tahan-; 1 25 sa tavallisella tekniikalla. On saatavissa lukuisia julkaisuja, joissa kuvataan vasta-aineenmuodostuksen perus-asioita; esimerkiksi voidaan mainita Parker, Radioimmuno-V·; assay of Biologically Active Compounds, Prentice-Hall (Englewood Cliffs, New Jersey, USA, 1976). Tavallisesti 30 isäntäeläimeen, kuten kaniiniin, vuoheen, hiireen, marsuun tai hevoseen ruiskutetaan yhteen tai useampaan koh-: taan immunogeenikonjugaattia, usein seoksena adjuvant in kanssa. Samoihin tai eri paikkoihin annetaan lisää ruiskeita säännöllisin tai epäsäännöllisin väliajoin ja ote- • · 1 : ’.· 35 taan verinäytteitä, joista määritetään vasta-aineen kon- • · · • » · · · • · 1 il 86145 sentraatio kunnes saavutetaan optimikonsentraatio. Isän-täeläimestä otetaan verta niin, että saadaan sopiva määrä spesifistä antiseerumia. Jos halutaan, voidaan suorittaa puhdistusvaiheita ei-toivotun materiaalin kuten epäspesi-5 fisten vasta-aineiden poistamiseksi ennen kuin antiseerumin katsotaan olevan sopivaa varsinaisissa määrityksissä käytettäväksi.

Keksinnön toteutuksessa vasta-aineet saadaan somaattisten solujen hybridisaatiotekniikalla, sellaisia 10 vasta-aineita kutsutaan yleensä monoklonaalisiksi vasta-aineiksi. Monoklonaalisten vasta-aineiden tuottaminen kuvataan yksityiskohtaisesti alla, kuvauksia sellaisista monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamismenetelmistä löytyy seuraavista julkaisuista: Lymphocute Hubridomas, 15 toim. Melchers ym., Springer-Verlag (New York 1978);

Nature 266:495 (1977); Science 208:692 (1980); ja Methods in Enzymology 73 (Part B): 3-46 (1981).

Tämän keksinnön immunogeeneistä muodostettuja vasta-aineita voidaan käyttää erilaisissa immunologissa mää-20 rityksissä ja vastaavissa reagenssikeinoissa histamiinin määrittämiseksi, joihin kuuluvat agglutinaatiotekniikat, radioimmunologiset määritykset heterogeeniset entsyyml-immunologiset määritykset (esim. US Pat. No 3654090), he-: terogeeniset fluoresenssi-immunologiset määritykset 25 (esim. US patentit No 4201763, 4171311, 4133639 ja 3992631 ja homogeeniset (ilman erotusta) immunologiset määritykset. Sellaisiin homogeenisiin immunologisiin määrityksiin kuuluvat sellaiset tekniikat, kuten fluoresens-sivaimennus tai -vahvistus (esim. US pat. No 4160016), 30 fluoresenssipolarisaatio (J. Exp. Med. 122:1029 (1965), entsyymisubs-traattileimattu immunologinen määritys (US Pat. No 4279992 ja UK Pat. Spec. 1552607), prosteetti-silla ryhmillä leimattu immunologinen määritys (US Pat. No 4238565), entsyymimodulaattorileimattu immuunimääritys, • 1 35 esim. inhibiittorimerkkiainetta käyttäen (US patentit No · · · • · · i2 861 45 4134792 ja 4273866), entsyymileimattu immunologinen määritys (esim. US Pat No 3817837), energiansiirto-immunolo-ginen määritys (US Pat No 3996345), kemiallisesti viritetty fluoresenssi-immunologinen määritys (US Pat No 5 4238195) ja kaksoisvasta-aine-steerinen este-immunologi nen määritys (US-patentit nro 3935074 ja 3998943). Lisäksi tämän keksinnön johdannaisia voidaan käyttää valmistettaessa leimattuja konjugaatteja, joita tarvitaan yllä kuvattujen immunologisten määritysten suorittamisessa. 10 Sopivia johdannaisia voi esimerkiksi leimata radioaktii-visesti, leimata fluoresoivilla osilla, kerniluminoivi11a osilla ja muilla vastaavilla tavallisin menetelmin. Samoin homogeenisille tekniikoille sopiva leimaosa, esim. entsyymisubstraatti, prosteettinen ryhmä, entsyymimodu-15 laattori tai entsyymi (joka on proteiini ja voidaan liittää immunogeeniseen kantajaan kuten yllä on kuvattu) voidaan liittää johdannaisiin, jotta saataisiin aikaan leimattuja konjugaatteja. Edullisessa toteutustavassa hista-miininerityksen immunologinen määritys suoritetaan tavan-20 omaisesti entsyymi-immuunimäärityksen avulla, jossa mono-klonaalinen vasta-aine on kytketty entsyymiin, kuten pi-parjuuriperoksidaasiin, emäksiseen fosfataasiin, lysot-syymiin, glukoosi-6-fosfaattiperoksidaasiin tai vastaa-; vaan. Kytkentä saadaan aikaan tavanomaisilla tekniikoilla 25 käyttäen erilaisia silloitusaineita kuten glutaraldehy-;; diä, dimaleimidiä tai tiolireagensseja, kuten on kuvattu julkaisussa J.W. Freytag, ym. , Clin. Chem., 30, 417-420 " (1984). Sitten annetaan entsyymisubstraattia (kuten kro- mogeenistä entsyymisubstraattia), ja antigeenikonsentraa- • : - 30 tio voidaan helposti korreloida standardiantigeenikonsen- traatioiden kanssa.

:*·,· Sellaisia määrityksiä tehdään tyypillisesti biolo- gisista tai laboratorionesteistä. Sanonta "biologiset tai laboratorionesteet" tarkoittaa tässä käytettynä nesteval- • » · : ·' 35 misteita kuten esimerkiksi erilaisista biologisista ai- • · • · • · « ··· • * i3 861 45 neista kuten juustosta, kalasta, viinistä, ym. valmistettuja uutteita samoin kuin luonnollisia biologisia aineita kuten veri, virtsa, sylki tms. Sanonta viittaa myös mihin tahansa aineeseen, jonka histamiinipitoisuus on määritet-5 tävä, sisältäen histokemian alat, joissa on tarpeen määrittää histamiinin sijaintipaikka annetussa näytteessä.

Lisäksi tämän keksinnön piiriin kuuluu testipakkaus, kuten esimerkiksi kaupallinen yksikkö histamiinin immunologisen määrityksen suorittamiseen. Sellaisessa 10 pakkauksessa on yksi tai useampia säiliöitä, kuten mik-rotiitterilevyjä, kiinteitä alustoja, koeputkia, telineitä, yms., sekä antiseerumeita esim. pakastekuivatussa muodossa. Pakkaus voi myös sisältää standardimääriä histamiinia, joista voidaan muodostaa standardikäyrä, ha-15 väittävän tai muuten mitattavissa olevan reaktion aikaansaamisessa tarvittavien reagenssien säiliöitä jne. Selvästikin taitava asiantuntija voi valmistaa missä tahansa immuunimäärityksessä käytettäväksi sopivan pakkauksen, jonka tarkempi fyysinen toteutustapa riippuu ajatellun 20 määrityksen tyypistä.

Edullinen testipakkaus on samoin kaupallinen yksikkö, Joka on valmistettu määrittämään solujen indusoidun histamiininerityksen biologisiin nesteisiin, kuten ,·. ; vereen, basofiileihin, virtsaan, sylkeen ja vastaaviin.

25 Sellaisen pakkauksen komponentteihin voi kuulua esimer kiksi yksi tai useampia histamiinineritystä indusoivia 1 aineita, erilaisia liuottimia ja puskureita antiseerumei- den mikrotiitterilevyjen, histamiinistandardien, reagenssien ym aiemmin kuvattujen lisäksi. Tämä pakkaus voi myös 30 sisältää histamiinikonjugaattia tai vasta-ainetta sidottuna kiinteään alustaan samoin kuin leimattua vasta-ai-netta tai leimattua histamiinikonjugaattia.

Seuraavat esimerkit on tarkoitettu valaisemaan tätä keksintöä.

• · « · 14 861 45

Esimerkki 1

Histamiinipropionihappojohdannaisen valmistus Liuos, jossa oli 1,11 grammaa (g) histamiinia (vapaana) ja 3,02 millilitraa (ml) trietyyliamiinia 10 5 ml:ssa dimetyyliformamidia (DMF) lisättiin liuokseen jossa oli 1,53 g 3-bromi-propionihappoa 5 ml:ssa DMF. Tätä liuosta sekoitettiin huoneenlämmössä kaksi tuntia ja kuumennettiin sitten 80 °C 2,5 tuntia, jonka ajan jälkeen liuottimet poistettiin haihduttamalla, jolloin jäljelle 10 jäi kumimainen jäännös. Mainittu jäännös liuotettiin 10 ml:aan puskuria, joka oli tehty seoksesta CHCl3/MeOH/NH4OH (10:5:1) ja pantiin 60 g silikageeliko-lonniin (pakattu samaan puskuriin). Kolonnia eluoitiin tällä puskurilla nopeudella noin 25 ml/fraktio. Toivottu 15 tuote yhdistettiin (fraktiot 33-63) ja haihdutettiin kuivaksi. Jäännös kiteytettiin 10 ml:11a etanolia ja saatiin 600 mg nimettyä yhdistettä (kuvattu yllä kaavalla X), sp 190-191 °C.

Laskettu analyysi CeH13N302· 1/2 H20:lle: 20 C 49,99, H 7,34, N 21,87 % Löydetty: C 50,62, H 7,51, N 21,89 %

Esimerkki 2

Histamiinipropionihappo - naudan seerumin albumiini - immunogeenikonjugaatin valmistus 1..' 25 68 mg histamiinipropionihappoa (valmistettu esi merkin 1 mukaisesti) ja naudan seerumin albumiinia (100 mg) liuotettiin 15 ml:aan H20. Syntynyt liuos jäähdytettiin jääaltaassa ja pH säädettiin 4,5:een 1-normaa-lisella (N) HCl:llä. Tähän lisättiin (sekoittaen) 320 mg */-/· 30 l-etyyli-3-( 3-dimetyyliaminopropyyli )-karbodi-imidi-vety-kloridia (EDAC) pienissä erissä. Tämän reaktioseoksen pH pidettiin arvossa 4,5-5,0 (IN HCl:llä) EDAC:in lisäyksen ajan ja seosta sekoitettiin sitten 0 °C:ssa kolme tuntia ja sitten yön yli 5 °C:ssa. Seoksen pH säädettiin sitten : ·" 35 7,0:ksi IN NaOH-lisäyksellä ja seos pantiin P-10 kolon- is 86145 niin (2,5 x 40 senttimetriä, tasapainotettu 0,025-molaa-risella fosfaattipuskurilla, pH 7,0). Samaa fosfaattipuskuria käytettiin sitten kolonnin eluoimiseen. Ensimmäinen UV-absorptioproteiinihuippu kerättiin ja proteiinikonsen-5 traatio määritettiin absorptiolla 280 nanometrissä (nm) eli A2eo nm = 0,66 liuokselle, jossa on mg/ml. Histamiini-määrä määritettiin immunogeenin jäännös-NH2-ryhmistä Habeebln TNBS-menetelmällä. Tällä menetelmällä saatiin takaisin noin 80-90 prosenttia naudan seerumin albumiinis-10 ta. Histamiini: naudan seerumin albumiini molaarisen suhteen todettiin olevan 13 ja 21 välillä.

Esimerkki 3

Histamiinipropionihappo -"keyhole limpet"- hemo-syaani-immunogeenikonjugaatin valmistus 15 "Keyhole limpet"-hemosyaniinia (200 mg raakaa, saatavissa Cal.Biochem:istä) sekoitettiin 4 ml:aan 50 mM karbonaattipuskuria (pH 9,6) ja seosta sekoitettiin ja sonikoitiin kevyesti. Syntyvän suspension pH säädettiin 9,6:een 2N Na0H:lla ja sitä sekoitettiin huoneenlämmössä 20 yön yli. Seos sentrifugoitiin 10 000 kierrosta minuutissa 15 minuutin ajan, jonka jälkeen supernatantti otettiin talteen ja kokonaisproteiinikonsentraatio määritettiin absorptiolla 280 nm:ssa (20 mikrolitraa liuosta liuotet-.·. : tiin 2,0 ml:aan H20 ja A2eonm 1,66 käytettiin liuokseen 25 jossa oli mg/ml; noin 100 mg proteiinia saatiin talteen). 82 mg histamiinipropionihappoa (valmistettu esimerkin 1 mukaisesti) lisättiin yllämainittuun supernatanttiin ja pH säädettiin arvoon 5,0 IN HCl-lisäyksellä. Kokonaismäänä lisättiin sitten vedellä 7,5 ml:ksi ja liuos jäähdytettiin 30 jääaltaassa. l-etyyli-3-(3-dimetyyliaminopropyyli)-karbo-di-imidiä (155 mg) lisättiin jäähdytettyyn liuokseen se-koittaen ja pH pidettiin arvossa 4,7-4,9 kahden tunnin ajan (0 °C). Sitten liuoksen pH säädettiin 5,5:een ja sitä sekoitettiin 5 °C:ssä yön yli. Seos siirrettiin dialyysi-' ‘ 35 putkeen (kokoraja 12 000-14 000 daltonia) ja dialysoitiin ie 86145 fosfaattipuskuroitua suolaliuosta vastaan (1 litra) 5 °C:ssa. Viiden vaihdon jälkeen (7 vrk), suspensio putkesta otettiin talteen ja pieni osa siitä sentrifugoitiin 10 000 kierrosta/min. 15 minuutin ajan. Supernatanttia 5 käytettiin proteiinikonsentraation määrittämiseen absorp tiolla 280 nanometrissä ja histamiinimäärä määritettiin immunogeenin jäännös-NH2-ryhmistä Habeebin TNBS-menetelmäl-lä. Kaikki materiaali yhdistettiin ja liuotettiin noin 50 ml:ksi fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella toivotun 10 immunogeenikonjugaatin aikaansaamiseksi. Histamiini:"key hole limpet"hemosyaniini molaarisen suhteen todettiin olevan 83 ja 116 välillä.

Esimerkki 4

Histamiini - naudan seerumin albumiini - immuno-15 geenikonjugaatin valmistus 75 mg naudan seerumin albumiinia (BSA), 38,4 mg l-etyyli-3-(3-dimetyyliaminopropyyli)-karbodi-imidiä ja 184 mg histamiinia sekoitettiin 0,1-molaarisessa boori-happoliuoksessa kokonaismäärään 4,0 ml (pH pidettiin ar-20 vossa 4-5). Kun seosta oli sekoitettu yön yli (huoneen lämmössä) sitä dialysoitiin voimakkaasti fosfaattipuskuroitua suolaliuosta vastaan. Absorbanssi 280 nm:ssä mitattiin ja proteiinikonsentraatiot laskettiin. Histamiiniepi-. tooppitiheys määritettiin tuikelaskurilla käyttäen triti- ... 25 oitua histamiinimerkkiainetta, jolloin kaksi esimerkki- ; ajoa antoivat epitooppitiheyksiksi 17 ja 53. Näiden kah- den ajon konjugaatit yhdistettiin ja käytettiin kuten mää-·. ··. ritysmenetelmän kuvauksessa esimerkissä 6.

Esimerkki 5 ‘ i ’· 30 Vasta-aineen valmistus

Standardimenetelmiä käyttäen naaraspuolisia BALB/C

.’·· hiiriä immunisoitiin histamiinipropionihappo-naudan see- . rumin albumiini ja/tai histamiinipropionihappo - "keyhole ^ limpet"-hemosyaniini-immunogeenikonjugaateilla (valmis- : 35 tettu esimerkkien 2 ja 3 mukaisesti) ja niistä otettiin « « « • ♦ Λ • · · • · i7 861 45 verta ajoittain noin 4 kuukauden ajanjakson aikana. Immunisoitujen hiirten pernasoluja sekoitettiin ei-erittäviin myeloomasoluihin linja X63.Ag8 653 (yleisesti saatavissa American Type Culture Collection:ista numerolla CRL 1580) 5 suhteessa 2:1 ja sekoitettiin 50 % polyetyleeniglykoliin (1500 M.W.) naudan sikiön seerumia sisältämättömän RPMI 1640-valmisteen läsnäollessa. Syntyvät hybridoomat ympättiin 96-reikäisille mikrotiitterilevyille syöttösoluina hiiren tymosyytit. Peruskudosviljelmäalusta koostui 15 10 %:sta naudan sikiön seerumia ja RPMI 1640:stä joka sisälsi hypoksantiinia ja tymidiiniä. Hybridit valittiin ami-nopteriinilisäyksellä kasvualustaan.

Antihistamiiniaktiivisuus seerumissa määritettiin polyetyleeniglykoli (PEG)-saostuksella. Kymmenen mikro-15 litraa (μΐ) 3H-histamiinia (New England Nuclear), joka sisälsi 70 000-100 000 sykäystä minuutissa (cpm) inkuboi-tiin joko 100 μΐ hiiren seerumin (1:10 laimennus fosfaat-tipuskuroidulla suolaliuoksella) kanssa tai 100 μΐ kudos-viljelmäsupernatantin kanssa 2-3 tuntia huoneenlämmössä. 20 Kudosviljelmäsupernatanttien tapauksessa lisättiin 100 μΐ naudan gamma-globuliinia (2 mg/ml). Vasta-aine saostettiin 600 pl:lla polyetyleeniglykolia (PEG) 6000 (20 % w/v) . Pelletti pestiin kahdesti PEG:llä (20%), suspendoitiin uudelleen tislattuun veteen ja otettiin 3 ml:aan tuike-25 laskunestettä tuikelaskentaa varten.

Hybridoomasoluviljelmiä, jotka olivat positiivisia PEG-saostusmäärityksen suhteen lisättiin ja kloonattiin yksisoluvalintatekniikalla. Käänteismikroskoopin avulla soluja vedettiin laimeasta solususpensiosta pidennettyyn .! 30 Pasteur-pipettiin. Sen jälkeen solu ympättiin mikrotiit- terisyvennykseen, joka sisälsi riittävästi hiiren tymo-syytti-syöttösoluja.

'· Kloonattuja hybridoomia (107 solua/hiiri) lisättiin ‘ askiiteissa pristaanikäsitellyissä BALB/C hiirissä. Vasta- ".·. 35 aine askiiteista puhdistettiin kapryylihapposaostuksella • » · * « is 86145 seuraavasti. Kaksi osaa asetaattipuskuria (60 mM, pH 4) sekoitettiin yhteen osaan askiitteja ja pH säädettiin 4,8:aan. Kapryylihappoa (0,74 ml/10 ml askiitteja) lisättiin tipoittain huoneenlämmössä ja syntyvää suspensiota 5 sekoitettiin 30 minuuttia. 4000 x g sentrifugoinnin jälkeen supernatantti otettiin talteen ja dialysoitiin voimakkaasti fosfaattipuskuroitua suolaliuosta vastaan 4 °C:ssä jotta saataisiin Ig-fraktio. Puhdistetun Ig-frak-tion korkeatasoinen nestekromatografia paljasti selvän 10 huipun molekyylipainossa joka vastaa hiiren IgGrtä. Alalaji- ja isotooppianalyysi Chemicon Mouse isotyyppausväli-neitä käyttäen todisti, että jokainen lisätty hybridi tuotti IgGj. Vasta-aineaffiniteetit mitattiin käyttäen Muellerin RIA-inhibitiomääritystä (Methods in Enzymology, 15 92, (1983), 589-601, Academic Press). Tämä menetelmä kä sittää vasta-aineliuosfraktion määrittämisen, joka tarvitaan sitomaan tietty määrä 3H-histamiinia (määritetty PEG-saostusmäärityksellä). Sitten määritettiin kuinka paljon kylmää histamiinia tarvittiin estämään 50 % merkkiaineen 20 sitoutumisesta. Määritetyt affiniteettivakiot olivat suunnilleen 2 x 106M_1 valituille klooneille. Merkittävää on, että tällä tavoin tuotetulla vasta-aineella ei ole mainittavaa ristiinreaktiivisuutta histidiinin (histamiinin me-tabolinen esituote) tai 1-metyylihistamiinin kanssa, mikä 25 tekee mainitun vasta-aineen käyttökelpoiseksi histamiinin määrityksessä verestä. Hybridooma joka tuottaa mainittua vasta-ainetta on talletettu American Type Culture Collec-tioniin ja sille on annettu tunnusnumero HB 8831. Esimerkki 6 30 Histamiinieritysmääritys

Esimerkin 4 histamiini - naudan seerumin albumiini - konjugaattia lisättiin 0,1-molaariseen NaHC03, pH 9,6 • · · *· ” niin että konsentraatioksi tuli 75 pg/ml. 50 μΐ annoksia * tätä liuosta pantiin pyöreäpohjäisen mikrotiitterilevyn 35 (jota kutsutaan "päällystyslevyksi" ) syvennyksiin. Muuta- • · · • * · « is 86145 mat syvennyksistä jätettiin auki tai täytettiin 50 piillä naudan seerumin albumiinia (75 pg/ml) 0,1-molaarisessa

NaHC03-puskurissa kontrolleiksi. 96-tappinen kansi (esim. NUNC TSP tai Falcon FAST-kansi) asetettiin sitten päällys-5 tyslevylle ja inkuboitiin noin yksi tunti huoneenlämmössä. Kansi tappeineen poistettiin sitten ja pestiin 400 ml:11a seosta, jossa oli 0,05 prosenttia Tween 20 tislatussa vedessä. Toinen mikrotiitterilevy (jota kutsutaan "eritys-levyksi") valmistettiin histamiinin eritysprosessia var-10 ten seuraavasti. Valmistettiin histamiinistandardikäyrä panemalla 5,5 pl histamiinistandardiliuoksia rinnakkaisiin syvennyksiin. Nämä standardiliuokset sisälsivät 10 000, 3333, 1111, 370, 123 ja 41-nanomolaarista (nM) histamiinia tislatussa vedessä tai Tris ACM liuottimessa 15 (eli puskurissa jossa on 25-millimolaarista, mM, Tris (pH 7,6), 0,2-molaarista NaVl; 5 mM KC1; 0,3 mg ihmisen seerumin albumiinia; 1 mM CaCl2; ja 0,5 mM MgCl2)). Määrityksen kuluessa histamiiniliuokset laimennettiin vielä kymmenkertaisesti. Varastoallergeenia 50-prosenttisessa glyse-20 rolissa liuotettiin seitsemään kymmenkertaiseen laimennok seen käyttäen Tris ACM tai tislattua vettä liuottimena. Annokset (5,5 pl) jokaista laimennosta (varastoiiuosta lukuunottamatta) pantiin rinnakkaisiin syvennyksiin eritys-levylle. Tämä prosessi toistettiin kaikille halutuille 25 määritettäville allergeeneille, kunnes lopuksi eritysle- vyllä oli 5,5 pl joko histamiinistandardeja, allergeeni-laimennoksia tai Tris ACM-puskuria (kontrollisyvennyksis-sä) kaikissa halutuissa syvennyksissä. Sitten erityslevy 011 valmis käyttöön.

• 30 Hankittiin heparinoitua verta potilaasta ja sekoi tettiin (1:1) Tris ACM-puskuriin (jokaista levyä kohden tarvittiin noin 2,5 ml verta sekoitettuna 2,5 ml:aan Tris '· *- ACM). Valmistettiin monoklonaalinen antihistamiinivasta- :.· : aine-piparjuuriperoksidaasikonjugaatti periodaattiboori- 35 hydridikytkentämenetelmällä, jonka on kuvannut Paul 20 861 45

Nakane, Immunoassays: Clinical Laboratory Techniques for the 1980's, (Nakamura, R.M., Dito, W.R., and Tucker, E.S., toim. ), Alan R. Liss, Int., New York (1978). Pieni määrä tätä vasta-aine-entsyymikonjugaattia lisättiin Tris 5 ACM/veriseokseen, niin että saatiin oikea ennalta määrät ty konjugaattikonsentraatio (noin 0,5 μg/ml). Annoksia (50 μΐ/kaivo) tätä seosta pantiin sitten jokaiseen eri-tyslevyn syvennykseen ja inkuboitiin 15 minuuttia 37 °C, jotta histamiinia erittyisi. Sitten edelläkuvatulla ta-10 valla valmistettu 96-tappinen kansi asetettiin eritysle-vylle niin, että jokainen tappi joutui syvennykseen. Tätä yhdistelmää inkuboitiin sitten huoneenlämmössä 30 minuutin ajan, minkä jälkeen kansi tappeineen poistettiin ja pestiin kahdella 400 ml annoksella Tween 20/vesi-liuosta, 15 kuten yllä on kuvattu. Tämä kansi tappeineen pantiin sitten kolmannelle mikrotiitterilevylle (jota kutsutaan "kromageenilevyksi") johon oli lisätty 50 μΐ/kaivo seu-raavaa liuosta: 0,8 mg/ml 2,2'-atsino-di-(3-etyylibentso-atsoloni)6-sulfonihappoa (eli ABTS); ja 2 mM ureaperoksi-20 dia 0,1 M sitraattipuskurissa (pH 4,2). Sopivan inkubaa-tioajan jälkeen (noin 15 minuuttia huoneenlämmössä) tapit poistettiin ja jokaisen kromatogeenilevyn syvennyksen sisällön absorbanssi (415 nM) määritettiin ELlSA-laitteel-la. Vaihtoehtoisesti histamiinineritys voidaan määrittää • 25 visuaalisesti, varsinkin kun tapit on ensin päällystetty päällystyslevyllä histamiini-proteiinikonjugaatilla, edullisesti esimerkin 4 mukaisesti valmistetulla histamiini - naudan seerumin albumiini - kongugaatilla. Erittyneen histamiinin todelliset konsentraatiot saadaan - 30 standardikäyrältä (valmistettu kuten yllä on kuvattu) ja voidaan piirtää allergeenin laimennusta vasten, jos halutaan. Sellaisista piirroksista voidaan tehdä päätelmiä potilaan herkkyydestä allergeenille. Histamiinineritys V ' hyvin laimealla allergeenikonsentraatiolla saattaa viita- 35 ta korkeaan herkkyyteen ja päinvastoin.

2i 86145

Taulukossa I oleva tieto on saatu ylläkuvatulla histamiinineritysmäärityksellä timoteiuutteelle herkäksi tiedetyn potilaan verinäytteestä. Tätä verinäytettä käsiteltiin erivahvuisilla timotei-uutelaimennoksilla ja 5 erittyneen histamiinin määrä mitattiin histamiinistandar-dikäyrän avulla, kuten yllä on kuvattu.

Taulukko 1 10 Histamiinin eritys timotei-uutteelle altistet taessa 3 )

Absorbanssi Suhteellinen Histamiini- c) allergeeni- konsentraatio 15 konsentraatio*3* 0,730 10'1 72 0,912 10'2 50 0,894 10'3 54 20 0,593 10-4 90 0,431 ΙΟ*5 125 0,920 10*6 42 1,518 10’7 6 1,630 0 0 25 : a * Kahden kokeen keskimääräinen kromageenilevyn jokaisen :Y: kaivon sisällön absorbanssi kannessa olevien piikkien in- kubaation jälkeen. Arvot on korjattu taustavaikutusten . . suhteen.

• 30 b = Suhteessa timoteiuutteen varastoliuokseen, joka on 1:20 (w/v) 50 % glyserolissa, c - Konsentraatio ilmaisu nanomooleina.

• · · • ·«

Claims (9)

1. 22 861 45
2. 1. Histamiinijohdannainen, tunnettu siitä, että se kuuluu seuraavaan ryhmään: 5 CH:CH:NH - R - Xj a) HN X 10 ?H2 I J CHLCH — R — X b) HN^N tai ch2nh2 15 |-|""CH — R - X C) HN^^N 1 2 3 4 5 6 jossa R on kytkentäryhmä, joka koostuu lineaarisesta ali- 2 faattisesta ryhmästä, jossa on 1 - 10 hiiliatomia ja X on 3 terminaalinen funktionaalinen ryhmä, joka on karboksyyli, 4 amino, tioli tai hydroksyyli, sillä edellytyksellä, että 5 kun johdannaisella on yllä kohdassa (b) esitetty kaava X:n 6 ollessa OH, R ei ole metyleeniryhmä -CH2-.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen histamiinijohdan-nainen, tunnettu siitä, että sillä on kaava: • · » » · A . . -CH CH-NH - CH.CHj - COOH :V: 30
4. 3. Histamiini johdannaisiin kytkettyä immunogeenista " kantaja-ainetta käsittävä immunogeenikonjugaatti, t u n - V · n e t t u siitä, että se kuuluu seuraavaan ryhmään: ·*': 35 23 861 45 a) I | CH-CH-NH - R - X'--kantaja HN Λ 5 ^ _ _P b) NH0 I 2 I |—CH2CH — R — X' - - kantaja 10 _ _Ip c) Γ” ch2nh2 ” , CH — R — V--kantaja 1C I I
5. 10 HN _ _|P jossa R on kytkentäryhmä, joka koostuu lineaarisesta ali-20 faattlsesta ryhmästä, jossa on 1 - 10 hiiliatomia ja X' on jäännös, joka jää jäljelle terminaalisesta funktionaalisesta ryhmästä X, joka on karboksyyli, amino, tioli tai hydroksyyli, sillä edellytyksellä että kun johdannaisella on yllä kohdassa (b) esitetty kaava, X:n ollessa OH, R ei 25 ole metyleeniryhmä -CH2-. : 4. Monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että se on patenttivaatimuksen 3 mukaisen konjugaa-.·. : tin vastainen. .·. 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen monoklonaalinen 30 vasta-aine, tunnettu siitä, että sen on tuottanut hybridooma-solulinja, jonka American Type Culture Collection -tunnusnumero on HB 8831.
6. 6. Hybridooma-solulinja, tunnettu siitä, että se tuottaa patenttivaatimuksen 4 mukaista monoklonaa-35 lista vasta-ainetta ja että sen American Type Culture Col- .·*·. lection -tunnusnumero on HB 8831. • · 24 861 45
7. 7. Immunologinen määritysmenetelmä histamiinin määrittämiseksi biologisesta tai laboratorionesteestä, tunnettu siitä, että siinä käytetään monoklonaa-lista vasta-ainetta, jonka on tuottanut hybridooma-solu- 5 linja, jonka American Type Culture Collection -tunnusnumero on HB 8831.
8. 8. Testipakkaus histamiinin määrittämiseksi biologisesta tai laboratorionesteestä entsyymiin perustuvalla immunologisella määritysmenetelmällä, tunnettu 10 siitä, että se koostuu mikrotiitterilevyistä ja menetelmään soveltuvista reagensseista, jolloin vasta-aine on monoklonaalinen vasta-aine ja sen on tuottanut hybridooma-solulinja, jonka American Type Culture Collection -tunnusnumero on HB 8831.
9. 9. Testipakkaus histamiinin määrittämiseksi biolo gisesta tai laboratorionesteestä immunologisella määritysmenetelmällä, tunnettu siitä, että se koostuu kiinteistä kantajakomponenteista ja menetelmään soveltuvista reagensseista, joihin kuuluu patenttivaatimuksen 3 20 mukainen histamiini-immunogeenikonjugaatti, joka on kytketty kiinteään kantajaan, ja leimattu monoklonaalinen vasta-aine, jonka on tuottanut hybridooma-solulinja, jonka American Type Culture Collection -tunnusnumero on HB 8831. » · ♦ • · 25 861 45