JPH081435B2 - １，５−アンヒドログルシトールの定量方法及び抗体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は糖尿病の診断マーカーと
して期待される１，５−アンヒドログルシトール（以下
「１，５−ＡＧ」という）の定量方法及びその測定に使
用する抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術】１，５−ＡＧはヒト髄液及び血漿中に存
在し、ある種の疾患、特に糖尿病において血漿中の量が
低下することが報告されている化合物である。この１，
５−ＡＧと反応する抗体の作成が可能であることは知ら
れておらず、従来、１，５−ＡＧの測定は主にガスクロ
マトグラフィーによりおこなわれていた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかし、従来の方法で
は試料の前処理及び分析機器の維持、管理に高度の技術
を必要とし、簡便な１，５−ＡＧの測定法が要望されて
いた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは１，５−Ａ
Ｇの簡便な測定法を鋭意研究した結果、一般にハプテン
抗体作成が困難とされている低分子化合物で、かつ血清
成分である１，５−ＡＧに特異的に反応する抗体の作成
が可能であることを見い出し、この作成した抗体を１，
５−ＡＧの定量に応用し本発明を、完成した。

【０００５】即ち、本発明は、（１）１，５−アンヒド
ログルシトール含有被検液に、１，５−アンヒドログル
シトールに特異反応性を有する抗体と、標識した１，５
−アンヒドログルシトールとを加えて免疫反応せしめ次
いで、免疫反応によって生じた標識した１，５−アンヒ
ドログルシトールと該抗体との結合物と、未結合の標識
した１，５−アンヒドログルシトールとを分離後、分離
されたもののいづれか一方の標識を測定することによっ
て該被検液中の１，５−アンヒドログルシトールを定量
することを特徴とする１，５−アンヒドログルシトール
の定量方法、及び（２）１，５−アンヒドログルシトー
ルに特異反応性を有する抗体、に関する。

【０００６】本発明で用いられる被検液としては、１，
５−ＡＧの濃度を測定したいものであれば特に制限はな
く、例えば髄液、血漿、血清や尿及び１，５−ＡＧ濃度
を測定しやすいようにこれらの被検液を処理した処理液
などがあげられる。

【０００７】本発明で用いられる特異反応性を有する抗
体とは、血清に存在することが知られている糖類との反
応性が、１，５−ＡＧと比較して、無視し得る程度か、
又は全く反応しないものである。１，５−ＡＧの免疫測
定方法においては特に、血清に多量に存在し、１，５−
ＡＧと類似した構造を有するグルコースなどが問題とな
る。グルコースの場合、これに対する反応性が１，５−
ＡＧの１０％以下、さらに好ましくは、１％以下である
抗体が望ましい。

【０００８】本発明で用いられる標識した１，５−ＡＧ
としては、通常のハプテンの免疫測定法に用いられてい
る様な標識化の方法で標識した１，５−ＡＧがあげられ
る。これまで、標識体を用いる免疫測定法として、標識
物質（トレーサー）の種類により、多数の方法が提案さ
れてきたが、これらのいづれの方法を用いてもよい。一
例をあげれば、トレーサーが放射性物質である放射免疫
測定法（ＲＩＡ）においては１，５−ＡＧそのものの構
成元素を放射性同位体で置換したものが利用できる。ま
た、１，５−ＡＧの３位、４位、又は６位の水酸基に放
射活性なヨウ素を導入した側鎖を有する１，５−ＡＧ誘
導体も含まれる。具体的なトレーサーの導入例として
は、１，５−ＡＧの１位にトリチウム（ ³Ｈ）を導入し
たものや、１，５−ＡＧの炭素原子を¹⁴Ｃで置換したも
のなどがあげられる。

【０００９】トレーサーが酵素である酵素免疫測定法
（ＥＩＡ）においては、標識する酵素及び１，５−ＡＧ
との結合方法の選択が問題となる。本発明のＥＩＡに使
用し得る酵素は、一般にＥＩＡに使用されているもので
あればいづれであっても良く、ホースラディシュペルオ
キシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びβ−ガラク
トシダーゼなどが使用し得る。１，５−ＡＧとの結合方
法については、１，５−ＡＧ誘導体である後記一般式
（Ｉ）の化合物を用い、側鎖の官能基Ａのアミノ基やカ
ルボキシル基を介して直接又は間接に酵素タンパク質に
結合することができる。これらＥＩＡ用の酵素に必要と
される条件及び結合の方法に関しては、成書等（たとえ
ば、酵素免疫測定法、石川栄治等編集医学書院出版）で
詳細に述べられている。

【００１０】トレーサーがケイ光物質であるケイ光免疫
測定法（ＦＩＡ）においては、１，５−ＡＧ誘導体であ
る後記一般式（Ｉ）の化合物を用い、側鎖の官能基Ａの
アミノ基やカルボキシル基を介して結合できケイ光強度
が強く、安定なものであれば、いづれであっても良い。
また、ケイ光物質の標識密度を高くするために、適当な
担体を介して１分子の１，５−ＡＧ誘導体に多数のケイ
光物質を結合しても良い。具体的なケイ光物質として
は、フルオレッセインイソチオシアネート、ローダミ
ン、ダンシルクロライド、クマリンなどが使用し得る。

【００１１】トレーサーが発光物質である発光免疫測定
法（ＬＩＡ）においては、１，５−ＡＧ誘導体である後
記一般式（Ｉ）の化合物を用い、側鎖の官能基Ａのアミ
ノ基やカルボキシル基を介してイソルミノール化合物等
を化学結合させたものが使用し得る。また、上述の各免
疫測定法における１，５−ＡＧと標識化合物の結合に、
アビジンとビオチンの結合反応を介する各種方法も利用
できる。

【００１２】本発明で用いられる標識した１，５−ＡＧ
と抗体の結合物及び未結合の標識した１，５−ＡＧとを
分離する方法としては、通常の免疫測定法で使用されて
いるＢＦ分離操作が適宜使用される。例えば、抗体を固
相担体上に固定せしめた「固相法」と称するものを利用
する場合には、固相担体の表面上に、物理的、化学的又
は免疫学的に結合した、１，５−ＡＧに特異的に反応す
る抗体に対して、被検液中の１，５−ＡＧ（抗原）と標
識した１，５−ＡＧを競争的に免疫反応（競合法）させ
た後、固相担体を洗浄することによって、抗体に結合し
た標識した１，５−ＡＧを得ることができる。

【００１３】一方、未結合の標識した１，５−ＡＧは、
免疫反応した液を集めれば良い。一般に使用されている
固相担体としては、各種合成樹脂を用いて成形されたビ
ーズ、マイクロタイタープレート、ラテックス、フィル
ター状のものが知られているが、いづれも使用し得る。

【００１４】本発明で用いられる標識を定量する方法と
しては、各種標識物質を高感度に測定できる方法であれ
ば、いづれであっても良く、測定原理及び装置により限
定されるものではない。

【００１５】本発明で用いられる抗体を作成するために
使用する１，５−ＡＧ誘導体から作成される抗原につい
て説明する。ここで抗原とは、１，５−ＡＧに特異的に
反応する抗体を作成するために必要な動物感作用の抗
原、即ち免疫原であり、後記一般式（Ｉ）で表わされる
１，５−ＡＧ誘導体に抗原性キャリア物質を化学結合し
たものである。抗原性キャリア物質は、この目的のため
に従来知られているあらゆるタンパク質もしくはポリペ
プチドから選択することができる。大部分の抗原性蛋白
質及びポリペプチドは、５，０００〜１０，０００，０
００好ましくは１５，０００以上、更に好ましくは５
０，０００以上の分子量を有する。

【００１６】一般に、ある動物種から採取した蛋白質は
他種の血流中に導入された場合に抗原となる。特に有用
な蛋白質には、アルブミン、グロブリン、酵素、ヘモシ
アニン、グルテリン、かなりの非蛋白質成分を有する蛋
白質（例えば糖蛋白質）などがある。分子量３０，００
０〜２００，０００のアルブミン及びグロブリンが特に
好ましい。合成ポリペプチドを使用してもよい。従来の
抗原性キャリア物質に関する技術を示す他の参考文献と
しては、以下のものが挙げられる。

【００１７】Parker, Radioimmunoassay of Biological
ly Active Compounds, Prentice-Hall (Englewood Clif
fs, New Jersey USA, 1976); Butler, J. Immunol. Met
h.,7, 1-24 (1975); Weinryb and Shoroff, Drug Meta
b. Rev., 10, 271-283 (1975); Broughton and Strong,
Clin. Chem., 22, 726-732 (1976) and Playfair eta
l., Br. Med. Bull., 30, 24-31 (1974).

【００１８】抗原決定基（エピトープ）密度、すなわち
キャリアに結合したハプテン部分の平均数は理論的に
は、選択されたキャリア分子上の有効な結合部位数によ
ってのみ制限される。しかしながら、キャリアがアルブ
ミンの如き天然蛋白質であるような通常の場合は、平均
して、１〜約５０、より普通には２〜約２０である。結
合の方法については、前述したＥＩＡ用の酵素標識１，
５−ＡＧの作成法の場合と全く同様の方法で実施するこ
とができる。

【００１９】１，５−ＡＧ誘導体から誘導される抗原を
用いて抗体を作成する方法は、いかなる従来技術に従っ
ても良いが、（例えば、パーカー（Parker）のRadioimm
unoassay of Biologically Active Compounds, Prentic
e-Hall (Englewood Cliffs,New Jersey USA, 1976) 参
照）通常の場合、ウサギ、ヤギ、マウス、モルモット
（Guinea Pig）及びウマのような宿主動物に、免疫原複
合体を、通常、アジュバントと混合した上で、１以上の
各種部位に注射する。更に、同一又は異なる部位から規
則的又は不規則的間隔で注射を行い、しかる後、採血し
て、最適な力価に達したことが測定されるまで抗体力価
を調べる。宿主動物から採血して適切な容量の特定の抗
血清を得る。所望であれば、実際の分析を行う際に使用
する抗血清として適切であるか否かを判断する前に、精
製工程において、非特異的抗体のような望ましくない物
質を除去してもよい。

【００２０】抗体（例えば、通常、モノクローン抗体と
称される抗体）は、体細胞交配（融合）技術（somati c
ell hybridization techniques）により得ることもでき
る。（Lymphocyte Hybridomas, ed. Melchers et al, S
pringer-Verlag, New York,(1978), Nature 266, 495
(1977), Science, 208, 692 (1980)、及び、Methodsin
Enzymology, 73 (Part B), 3-46 (1981) 参照）

【００２１】抗原を作成するために用いられる１，５−
ＡＧ誘導体は、一般式（Ｉ）で示される１，５−ＡＧの
３位、４位又は６位の−ＯＨ基を介して側鎖を導入した
新規化合物である。

【００２２】

【化１】

【００２３】（式中、Ｘ、Ｙ、Ｚのいづれか１つが式Ａ
−アルキレン−Ｂ−であり、他の２つは−ＯＨを示す。
ここで、Ａは−ＮＨ₂ 又は−ＣＯＯＨを示し、Ｂは−Ｏ
−又は−ＣＯＯ−を示し、アルキレンとしては炭素数が
１〜１２のものを示す。）

【００２４】一般式（Ｉ）において、アルキレンとして
は、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレ
ンなど炭素数１〜１２程度のものがあげられる。これら
は分枝していてもよく、炭素数２〜１０程度のものが好
ましく、より好ましくは、エチレン、プロピレン、ブチ
レンなどがあげられる。本発明の一般式（Ｉ）の化合物
としては、例えば、次の表１の化合物があげられる。

【００２５】

【表１】 表 １ 化合物No. Ｘ Ｙ Ｚ １ H₂NCH₂COO- -OH -OH ２ HOOC(CH₂)₂COO- -OH -OH ３ HOOCCH₂O- -OH -OH ４ HOOC(CH₂)₂CH₂O- -OH -OH ５ -OH HOOC(CH₂)₂CH₂O- -OH ６ -OH -OH HOOC(CH₂)₂CH₂O- ７ H₂N(CH₂)₅COO- -OH -OH ８ H₂N(CH₂)₁₀COO- -OH -OH

【００２６】本発明のこれら化合物は次のようにして合
成される。即ち一般式（II）

【００２７】

【化２】

【００２８】（式中、Ｒ₁ 、Ｒ₂ 、Ｒ₃ のいづれか１つ
が式Ａ−アルキレン−Ｂ−であり、他の２つ及びＲ₄ は
−ＯＢｎ、−ＯＴｒ、−Ｏ−ＴＨＰ、−Ｏ−Ｃ（ＣＨ₃)
₂ −Ｏ−を示す。ここでＡは−ＮＨ・ＣＢＺ、−ＣＯＯ
Ｈ、又は−ＣＯＯＢｎを示しＢは−Ｏ−又は−ＣＯＯ−
を示し、アルキレンとしては炭素数が１〜１２のものを
示す。また、ＣＢＺはベンジルオキシカルボニル、Ｂｎ
はベンジル、Ｔｒはトリフェニルメチル、ＴＨＰはテト
ラヒドロピラニルを表す。）で表わされる化合物を必要
に応じて酸加水分解あるいは接触還元に付し保護基を除
去することにより一般式（Ｉ）の１，５−ＡＧ誘導体を
得ることができる。

【００２９】酸加水分解は、水溶媒中酸の存在下に２０
℃〜１００℃、好ましくは２５℃〜６０℃で１〜５時間
程度行えばよい。酸としては、塩酸、硫酸などの鉱酸、
ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸などのＣ₁ 〜Ｃ₄ の低級
脂肪酸などが使用でき、好ましいものは塩酸、酢酸など
である。酸の添加量は、鉱酸を使用する場合は反応液中
の濃度が０．０１〜５Ｎ、好ましくは０．１〜２Ｎ程度
になるように、又、脂肪酸を使用する場合は反応液中の
濃度が５０％以上、好ましくは６０〜８０％程度になる
ように添加すればよい。

【００３０】接触還元は、通常溶媒中、触媒の存在下に
２０℃〜８０℃、好ましくは２５℃〜３５℃で１〜１２
時間程度行えばよい。溶媒として、メタノール、エタノ
ールなどのアルコール類、テトラヒドロフラン、ジオキ
サンなどのエーテル類、水、ジメチルホルムアミド、酢
酸などを必要に応じて単独もしくは混合して使用でき好
ましいものはメタノール、エタノールなどである。

【００３１】また触媒としては、パラジウム炭素、パラ
ジウム黒、塩化パラジウム、水酸化パラジウムなどが使
用でき、好ましくはパラジウム黒、塩化パラジウムなど
である。触媒量は、原料化合物量の１０〜２０％程度添
加すればよい。原料として使用される一般式（II）の代
表的化合物を次に示す。

【００３２】

【化３】

【００３３】また、一般式（II）の化合物は、次の（II
I ）、（IV）、（Ｖ）のいづれかの反応経路を経て合成
される。

【００３４】

【化４】

【００３５】本発明の一般式（Ｉ）の化合物は、反応液
より通常の方法で単離、精製され遊離酸、遊離塩基とし
て得られる。

【００３６】

【実施例】次に本発明につき実施例により説明する。 実施例 １ 検量線の作成 試験管に、１，５−ＡＧ又はグルコースの標品を０．１
％ＢＳＡを含むＰＢＳで連続希釈したサンプル０．１ｍ
ｌ、化合物４とＢＳＡの結合物を家兎に免疫して作成し
た１，５−ＡＧ抗血清を、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ
で１０００倍希釈した溶液０．１ｍｌ、化合物２とホー
スラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の結合物を
０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１０００倍希釈した溶液
０．１ｍｌ及び上記の０．３％ＢＳＡを含むＰＢＳでブ
ロッキング処理したＤＡＳＰビーズ１個を加え４℃で一
夜免疫反応した。

【００３７】反応後ビーズを、０．１％ＢＳＡを含むＰ
ＢＳで４回洗浄後、０．０５％のｐ−ヒドロキシフェニ
ルプロピオン酸と０．００１％の過酸化水素を含む０．
０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（気質液）１ｍｌを
入れた新しい試験管に移し、３７℃で１時間酵素反応を
行った。この反応液に１．５％アジ化ソーダを含む０．
２５Ｎ水酸化ナトリウム溶液（ストッパー）０．１ｍｌ
を加え反応停止後、ケイ光測定装置（富士レビオ社製、
Ａｕｔｏ ＦＰ−１）を用い、励起波長３１３ｎｍ、検
出波長４０５ｎｍで反応液のケイ光強度を測定し図１の
如く検量線を作成した。

【００３８】図１の１，５−ＡＧの検量線から明らかな
様にこの測定法での１，５−ＡＧの検出限界は０．１μ
ｇ／ｍｌであり、充分臨床サンプル測定に応用できる感
度をもっていた。また、抗体のグルコースとの交差反応
性はわずか０．２％であった。従って本発明の定量法は
１，５−ＡＧの実用的な定量法として利用できる。

【００３９】なお本実施例中で使用した化合物２とＨＲ
Ｐの結合物は次の方法により作成した。化合物２、６．
７ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド７．３ｍｇ及び
ＤＣＣ８．４ｍｇを０．４ｍｌのジオキサンに溶解し、
室温下に攪拌しながら５時間反応した。活性エステル化
反応によって生じたウレイドを濾過によって除去し、さ
らに濾過残渣を０．０５ｍｌのジオキサン洗浄すること
により、化合物２の活性エステルのジオキサン溶液を得
た。次に、ＨＲＰ（東洋紡製、ＲＺ＝３．４１）２５．
２ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）４．２ｍ
ｌで溶解した溶液に、上記活性エステル溶液を加え、室
温下に攪拌しながら５時間反応した。反応液中の沈澱物
を遠心分離によって除いてから、０．９％塩化ナトリウ
ムを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（以下
ＰＢＳという）に対して透析し、目的の結合物を得た。
次にこの結合物の溶液を限外濾過膜ＰＭ１０をセットし
た濃縮装置を用いて濃縮し、０．２μｍの濾過滅菌を行
って１，５−ＡＧのＨＲＰ標識体４．４ｍｌ（ＨＲＰ濃
度６．１ｍｇ／ｍｌ、タンパク回収率１００％、ＨＲＰ
活性回収率１００％）を得た。

【００４０】又、ＤＡＳＰビーズは次の方法で作成し
た。ＥＩＡ用ポリスチレンビーズ（積水製、６．５ｍｍ
φ）３００個を２％濃度のスコアロール９００（花王
製）に、室温下一夜浸漬した。次に、気泡が出なくなる
まで水洗し、水を十分切ってから濾紙上に広げ風乾し
た。アフィニティー精製ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）
抗体（ジャクソンイムノリサーチ社製）２ｍｇを、０．
１％アジ化ソーダを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．５）１００ｍｌに溶解した溶液に、上記洗浄ビーズ
を漬け、室温下に２日間放置して抗体を物理吸着させ
た。この様にして作成した第二抗体固相化ビーズ（以下
ＤＡＳＰビーズという）は使用前に０．３％ＢＳＡを含
むＰＢＳ溶液に漬け、４５℃で１０時間インキュベート
することにより非特異吸着をブロッキングしＥＩＡに供
した。

【００４１】以下、１，５−ＡＧ誘導体の作成、抗原の
作成、抗体の作成、１，５−ＡＧ免疫測定法の順に、具
体例により本発明を詳述する。

【００４２】合成例 １． １，５−アンヒドロ−６−
Ｏ−グリシル−Ｄ−グルシトール（表１の化合物１）の
製造 参考例１に示した方法で得た１，５−ＡＧ誘導体（III
）４３４ｍｇとベンジルオキシカルボニルグリシン塩
化物３９７ｍｇをジオキサン溶媒、ピリジンの存在下、
室温で２０時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮し、シリ
カゲルクロマトグラフィーにて精製を行い、２６６ｍｇ
の油状物質を得た。このものは、重クロロホルムを用い
た ¹Ｈ−ＮＭＲにおいて７．３ｐｐｍに芳香族水素由来
の２０Ｈ分に相当するプロトンが観測された。マトリッ
クスとしてグリセリンおよびＤＭＳＯの混合物を用いて
正イオンおよび負イオンＦＡＢ−ＭＳを測定したとこ
ろ、（Ｍ＋Ｈ）⁺ に相当する６２６および、（Ｍ−Ｈ）
^- に相当する６２４を、おのおのの基準ピークとして観
測した。

【００４３】次いで上記化合物２５０ｍｇをメタノー
ル、酢酸、水の混合液中、パラジウム黒を触媒に用い接
触還元を行い、重水を用いた ¹Ｈ−ＮＭＲにてベンジル
エーテル、ベンジルオキシカルボニル基に由来する芳香
族水素の除去された標記化合物１０４ｍｇを得た。化合
物１は、マトリックスにグリセリンおよびＤＭＳＯの混
合物を用い、正イオンＦＡＢ−ＭＳを測定したところ、
（Ｍ＋Ｈ）⁺ に相当する２２２に基準ピークを観測し
た。又、薄膜法によるＩＲにおいて、１７５０ｃｍ^-1に
エステルに基づく吸収、１６３０ｃｍ^-1にアミンの吸
収、他に、１５１０、１４２０、１２４０、１１００、
１０５０ｃｍ^-1にそれぞれ吸収が観測された。

【００４４】合成例 ２． １，５−アンヒドロ−６−
Ｏ−（３−カルボキシ−プロピオニル）−Ｄ−グルシト
ール（表１の化合物２）の製造 ベンジルコハク酸クロリド３．１７ｇに３．５ｇの１，
５−ＡＧのＤＭＦ溶液（１０ｍｌ）を０℃で加え、次い
で１．７ｇのジメチルアミノピリジンを加え、室温で１
５時間攪拌した。反応液を氷水で希釈し、酢酸エチル７
５ｍｌで２回抽出後、１規定塩酸洗い、水洗を行い、硫
酸ナトリウムで乾燥した。次いでシリカゲルクロマトグ
ラフィーにて精製を行い、６８０ｍｇの油状物質を得
た。

【００４５】上記化合物６５０ｍｇを、メタノール、酢
酸、水の混合液中、パラジウム黒を触媒として接触還元
を行い、標記化合物４８０ｍｇを得た。化合物２は、合
成例１と同様に正イオンＦＡＢ−ＭＳで（Ｍ＋Ｈ）⁺ に
相当する２６５に基準ピークを、負イオンＦＡＢ−ＭＳ
で（Ｍ−Ｈ）^- に相当する２６３に基準ピークを観測し
た。又、薄膜法によるＩＲにおいて、２９３０、１７３
０（−ＣＯ−Ｏ−）、１４００、１０８０ｃｍ^-1にそれ
ぞれ吸収が観測された。

【００４６】合成例 ３． １，５−アンヒドロ−６−
Ｏ−カルボキシメチル−Ｄ−グルシトール（表１の化合
物３）の製造 二頸フラスコに水素化ナトリウム５３ｍｇをとり、窒素
気流下、ＤＭＦ１０ｍｌを加え、攪拌しながら、参考例
１の方法で得られた１，５−ＡＧ誘導体（III）４３０
ｍｇを加える。３０分攪拌後、クロル酢酸１１３ｍｇを
加え、室温にて１５時間攪拌を行った。反応液に水７５
ｍｌを加え、酢酸エチルで２回抽出を行った後、飽和食
塩水、次いで水で洗浄を行いシリカゲルクロマトグラフ
ィーにて精製を行い、１７０ｍｇの油状物質を得た。こ
のものは、正イオンＦＡＢ−ＭＳで（Ｍ＋Ｈ）⁺ に相当
する４９３に基準ピークを、負イオンＦＡＢ−ＭＳで
（Ｍ−Ｈ）^- に相当する４９１に基準ピークを観測し
た。

【００４７】上記化合物１４０ｍｇをメタノール、酢
酸、水の混合液中、パラジウム黒を触媒として接触還元
を行い、標記化合物５５ｍｇを得た。化合物３は、正イ
オンＦＡＢ−ＭＳで（Ｍ＋Ｈ）⁺ に相当する２２３に基
準ピークを、負イオンＦＡＢ−ＭＳで（Ｍ−Ｈ）^- に相
当する２２１に基準ピークを観測した。又、薄膜法によ
るＩＲにおいて、３３５０、２９３０、１７４０、１２
５０、１１００、１０６０ｃｍ^-1にそれぞれ吸収が観測
された。

【００４８】合成例 ４． １，５−アンヒドロ−６−
Ｏ−（３−カルボキシ−プロピル）−Ｄ−グルシトール
（表１の化合物４）の製造 二頸フラスコに水素化ナトリウム１８０ｍｇをとり、窒
素気流下、ＤＭＦ２０ｍｌを加え、攪拌しながら、参考
例１に示した方法で得た１，５−ＡＧ誘導体（III ）
１．３ｇを滴下する。３０分攪拌後５−ブロム−１−ペ
ンテン６７１ｍｇを加え、室温にて１５時間攪拌した。
反応液に水７５ｍｌを加え、酢酸エチル７５ｍｌで２回
抽出を行った後、飽和食塩水、次いで水洗を行い、シリ
カゲルクロマトグラフィーにて精製を行い、１．０１ｇ
の油状物質を得た。

【００４９】上記化合物９８０ｍｇを８ｍｌのアセトン
に溶解し、攪拌を行いながら、１０ｍｌの水および８ｍ
ｌのアセトンに溶解した２．４ｇのＮａＩＯ₄ を滴下す
る。次いで０℃に冷却しながら、４ｍｌの水に溶解した
８０ｍｇのＫＭｎＯ₄ を加え、室温で１時間攪拌後、さ
らに６００ｍｇのＮａＩＯ₄ を加え、１時間攪拌を行っ
た。反応液に１００ｍｌの水を加え、酢酸エチル７５ｍ
ｌで２回抽出を行った後、飽和食塩水、次いで水洗後、
シリカゲルクロマトグラフィーにて精製を行い、６６０
ｍｇの油状物質を得た。

【００５０】上記化合物６３０ｍｇを、メタノール、酢
酸、水の混合液中、パラジウム黒を触媒に用い接触還元
を行い、標記化合物２９０ｍｇを得た。化合物４は、正
イオンＦＡＢ−ＭＳで（Ｍ＋Ｈ）⁺ に相当する２５１に
基準ピークを、負イオンＦＡＢ−ＭＳで（Ｍ−Ｈ）^- に
相当する２４９に基準ピークを観測した。又、薄膜法に
よるＩＲにおいて、２９３０、１７２０、１４２０、１
３７０、１２６０、１０８０ｃｍ^-1にそれぞれ吸収が観
測された。

【００５１】合成例 ５． １，５−アンヒドロ−４−
Ｏ−（３−カルボキシ−プロピル）−Ｄ−グルシトール
（表１の化合物５）の製造 二頸フラスコに水素化ナトリウム１６９ｍｇをとり、窒
素気流下、ＤＭＦ１０ｍｌを加え、攪拌しながら、化合
物（IV）１．２４ｇを滴下する。３０分攪拌後、５−ブ
ロム−１−ペンテン６３０ｍｇを加え、室温にて１５時
間攪拌した。反応液に冷水５０ｍｌを加え、酢酸エチル
７５ｍｌで２回抽出を行った後、シリカゲルクロマトグ
ラフィーにて精製を行い、８５０ｍｇの油状物質を得
た。

【００５２】上記化合物８２０ｍｇを８ｍｌのアセトン
に溶解し、攪拌を行いながら、１０ｍｌの水および８ｍ
ｌのアセトンに溶解した１．４ｇのＮａＩＯ₄ を滴下す
る。次いで０℃に冷却しながら、４ｍｌの水に溶解した
５０ｍｇのＫＭｎＯ₄ を加え、室温で１時間攪拌後、さ
らに、３５０ｍｇのＮａＩＯ₄ を加え、１時間攪拌を行
った。反応液を塩酸酸性にして酢酸エチルで抽出を行っ
た後、シリカゲルクロマトグラフィーを行い６００ｍｇ
の油状物質を得た。上記化合物５６０ｍｇに８０％酢酸
を加え、６５℃で２時間攪拌を行った。反応液に５０ｍ
ｌの水を加え、酢酸エチル抽出を行った後、シリカゲル
クロマトグラフィーにて精製を行い、３２０ｍｇの油状
物質を得た。

【００５３】上記化合物２８０ｍｇを、メタノール、酢
酸、水の混合液中、パラジウム黒を触媒に用いて接触還
元を行い、標記化合物１５０ｍｇを得た。化合物５は、
正イオンＦＡＢ−ＭＳで（Ｍ＋Ｈ）⁺ に相当する２５１
に基準ピークを、負イオンＦＡＢ−ＭＳで（Ｍ−Ｈ）^-
に相当する２４９に基準ピークを観測した。又、薄膜法
によるＩＲにおいて、２９３０、１７２０、１４６０、
１３８０ｃｍ^-1にそれぞれ吸収が観測された。

【００５４】合成例 ６． １，５−アンヒドロ−３−
Ｏ−（３−カルボキシ−プロピル）−Ｄ−グルシトール
（表１の化合物６）の製造 二頸フラスコに水素化ナトリウム２００ｍｇをとり、窒
素気流下、ＤＭＦ１０ｍｌを加え、攪拌しながら、化合
物（Ｖ）７２０ｍｇを滴下する。３０分攪拌後、５−ブ
ロム−１−ペンテン７４４ｍｇを加え、室温にて１５時
間攪拌した。反応液に冷水５０ｍｌを加え、酢酸エチル
７５ｍｌで２回抽出を行った後、シリカゲルクロマトグ
ラフィーにて精製を行い、５６０ｍｇの油状物質を得
た。

【００５５】くり返し合成した上記化合物１．３ｇを、
エタノールに溶解し、触媒量のｐ−トルエンスルホン酸
の存在下、６５℃で１時間攪拌を行い、保護基を除去し
た。次いで、参考例２と同様の方法で、２位、４位、６
位の水酸基をベンジル化した後、実施例４、５と同様
に、ＮａＩＯ₄ 、ＫＭｎＯ₄ 処理を行った後、パラジウ
ム黒触媒を用いて、接触還元を行い、標記化合物９０ｍ
ｇを得た。化合物６は、負イオンＦＡＢ−ＭＳで（Ｍ−
Ｈ）^- に相当する２４９に基準ピークを観測した。又、
薄膜法によるＩＲにおいて、２９５０、１７２０、１２
５０ｃｍ^-1にそれぞれ吸収が観測された。

【００５６】合成例 ７． １，５−アンヒドロ−６−
Ｏ−（６−アミノ−ヘキサノイル）−Ｄ−グルシトール
（表１の化合物７）の製造 参考例１に示した化合物（III ）４３４ｍｇをピリジン
１０ｍｌに溶解し、室温にて、ベンジルオキシカルボニ
ル−ε−アミノカプロン酸クロリド５３５ｍｇを滴下す
る。室温にて１５時間攪拌した後、反応液に水７５ｍｌ
を加え、酢酸エチルで２回抽出を行い、シリカゲルクロ
マトグラフィーにて精製を行い、３６６ｍｇの油状物質
を得た。

【００５７】得られた化合物を、メタノール、酢酸、水
の混合液中、パラジウム黒を触媒に用い接触還元を行
い、標記化合物１０４ｍｇを得た。化合物７は、正イオ
ンＦＡＢ−ＭＳで（Ｍ＋Ｈ）⁺ に相当する２７８に基準
ピークを観測した。又、薄膜法によるＩＲにおいて、１
７４０、１４６０、１１００ｃｍ^-1にそれぞれ吸収が観
測された。

【００５８】合成例 ８． １，５−アンヒドロ−６−
Ｏ−（１１−アミノ−ウンデカノイル）−Ｄ−グルシト
ール（表１の化合物８）の製造 実施例７のベンジルオキシカルボニル−ε−アミノカプ
ロン酸クロリドをベンジルオキシカルボニル−１１−ア
ミノ−ウンデカン酸クロリド６３７ｍｇに変える以外、
全く同様に反応させ標記化合物４００ｍｇを得た。化合
物８は、正イオンＦＡＢ−ＭＳで（Ｍ＋Ｈ）⁺ に相当す
る３４８に基準ピークを観測した。また、薄膜法による
ＩＲにおいて、２９２５、１７４０、１４６０ｃｍ^-1に
それぞれ吸収が観測された。

【００５９】抗原の作成 ハプテン抗原の作成法については、上述の様に種々の方
法が知られているが、ここでは一例として、抗原性キャ
リア物質としてウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと略
す）を用い、１，５−ＡＧ誘導体（Ｉ）を化学結合した
場合の例を示す。化学結合の方法は、１，５−ＡＧ誘導
体（Ｉ）の導入側鎖末端基〔一般式（Ｉ）のＡ〕によっ
て異なるが、Ａがアミノ基の場合は水溶性カルボジイミ
ド法を用い、カルボキシル基の場合は活性エステル法に
よって直接ＢＳＡに結合した。しかし、化学結合の方法
は、これによって制限されるものではない。また、末端
基ＡとＢＳＡの結合に低分子化合物のスペーサーを介し
てもよい。

【００６０】参考例１． １，５−アンヒドロ−６−Ｏ
−グリシル−Ｄ−グルシトール（化合物１）とＢＳＡ結
合物の作成 化合物１、１６ｍｇとＢＳＡ２３．９ｍｇを１．６ｍｌ
の１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．６）に溶解した。
これに、室温下に攪拌しながら、水溶性カルボジイミド
の塩酸塩２０８ｍｇを数回に分けて加えｐＨ５〜６を保
ちながら反応させた。さらに、室温下で一夜反応の後、
反応物を生理食塩水に対して透析し、目的の結合物を得
た。次に、これを限外濾過膜ＰＭ１０（アミコン社製）
をセットした濃縮装置を用いて濃縮し、０．２μｍの濾
過滅菌（ミリポア社製）を行って免疫用の抗原とした。
全工程でのタンパク回収率は８８％であった。同様の方
法を用いて化合物７及び化合物８のＢＳＡ結合物も作成
した。

【００６１】参考例２． １，５−アンヒドロ−６−Ｏ
−（３−カルボキシ−プロピル）−Ｄ−グルシトール
（化合物４）とＢＳＡ結合物の作成 化合物４、１４５．８ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミド１３４ｍｇ、及びＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカル
ボジイミド（ＤＣＣ）１８０．３ｍｇを３．５ｍｌのジ
オキサンに溶解し、室温下に攪拌しながら３〜４時間反
応した。活性エステル化反応によって生じたウレイドを
濾過によって除去し、さらに濾過残渣を２ｍｌのジオキ
サン洗浄することにより、化合物４の活性エステルのジ
オキサン溶液を得た。次に、ＢＳＡを１５ｍｇ／ｍｌ濃
度になる様に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶
解したＢＳＡ溶液２５．７ｍｌに、上記活性エステル溶
液を加え、室温下に攪拌しながら１夜反応した。反応液
中の沈澱物を遠心分離によって除いてから生理食塩水に
対して透析し、目的の結合物を得た。次に、この結合物
の溶液を限外濾過膜ＰＭ１０をセットした濃縮装置を用
いて濃縮し、０．２μｍの濾過滅菌を行って、免疫用の
抗原とした。全工程を通してのタンパク回収率は、９８
％であった。また、同様の方法により、化合物２、３、
５及び６のＢＳＡ結合物も作成した。

【００６２】抗体の作成 免疫原として参考例１、参考例２及びそれらの方法に準
じて作成した表１に示す一般式（Ｉ）のＢＳＡ結合物を
用いて、家兎より公知の方法にてその１，５−ＡＧ抗体
を作成した。

【００６３】実施例 ２ Ｎｏ．４の化合物のＢＳＡ結合物を生理食塩水で希釈
し、２ｍｇ／ｍｌ濃度になる様に調整した。この溶液
１．５ｍｌに、１．５ｍｌのFreunds complete Adjuvan
t を加えてよく混和し、これを家兎（各抗原２〜３羽づ
つ）に１ｍｌ／羽づづ皮内注射（１週間間隔、４回投
与、その後２週間間隔、３回投与）し充分に感作せし
め、その２週間後に採血し、これを３０００ｒｐｍ×１
５分間遠心してその血清を得、これを６０℃×３０分間
熱処理した後−２０℃にて保存し、各免疫原に対応する
１，５−ＡＧ抗血清を得た。この血清に１，５−ＡＧに
対する抗体が存在することはＢＳＡを固定した樹脂に吸
収させた後、ドットイムノバインディングアッセイ法に
より確認した。Ｎｏ．１〜３、５〜８の化合物のＢＳＡ
結合物を用い上記と同様にして１，５−ＡＧ抗血清を得
た。

【００６４】１，５−ＡＧ免疫測定法 免疫測定法としては、上記のごとく、ＲＩＡ、ＥＩＡ、
ＦＩＡ、ＬＩＡ等、種々の方法で測定可能であるが、こ
こでは一例として、ＥＩＡに応用した場合の実施例を示
し、また、ＥＩＡでの測定法としては、いわゆる第二抗
体固相法で競合法と云われるものの１例を示した。

【００６５】実施例 ３ グルコースと１，５−ＡＧをそれぞれ１０μｇ／ｍｌ、
１μｇ／ｍｌ含有するモデル被検液を作成した。これを
実施例１に示した「競合法による１，５−ＡＧのＥＩ
Ａ」の方法に従って測定し、図１の検量線を用いて定量
したところ、１，５−ＡＧの濃度は１．１μｇ／ｍｌで
あった。

【００６６】一般式（Ｉ）の化合物の原料である一般式
（II）の合成に必要な化合物（III）、（IV）、（Ｖ）
は、たとえば、以下に示した反応式に従って合成した。
具体例として（III ）の化合物の合成例を示す。

【００６７】

【化５】

【００６８】 ＴＨＰ ： テトラヒドロピラニル × ： イソプロピル Ｂｎ ： ベンジル Ｔｒ ： トリチル

【００６９】参考例３． １，５−アンヒドロ−２，
３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−グルシトール（III
）の製造 １，５−ＡＧ３．２８ｇを２０ｍｌのピリジンに溶解
し、氷冷下、攪拌しながら、塩化トリチル６．１２ｇを
滴下した。氷冷下で１時間さらに室温で１５時間攪拌し
た。反応液を２００ｍｌの水で希釈し、１５０ｍｌの酢
酸エチルで２回抽出を行った後シリカゲルクロマトグラ
フィーにて精製を行い、７．４４ｇの６−トリチル−
１，５−ＡＧを得た。このものは、重クロロホルムを用
いた ¹Ｈ−ＮＭＲで１，５−ＡＧのシグナルに加え、
７．３〜７．９ｐｐｍに芳香族水素由来の１５Ｈ分のプ
ロトンが観察された。

【００７０】二頸フラスコに水素化ナトリウム９００ｍ
ｇをとり、窒素気流化ＤＭＦを４０ｍｌ加え、攪拌しな
がら、上記化合物４．０６ｇを滴下する。３０分間室温
にて攪拌後、５．２ｍｌの塩化ベンジルを滴下し、１５
時間攪拌した。反応液に水２００ｍｌを加えて希釈し、
４００ｍｌの酢酸エチルで抽出を行った後、シリカゲル
クロマトグラフィーにて精製を行い、５．２７ｇの２，
３，４−トリベンジル−６−トリチル−１，５−ＡＧを
得た。このものは重クロロホルムを用いた ¹Ｈ−ＮＭＲ
で７．０〜７．８ｐｐｍに計３０Ｈ分の芳香族プロトン
が観測された。

【００７１】上記化合物３．３３ｇを２０ｍｌの８０％
酢酸に溶解し、６５℃で２時間攪拌した。反応液を減圧
濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーにて精製後、酢
酸エチル、ｎ−ヘキサンより再結晶を行うことにより、
１．４８ｇの無色針状結晶を得た。

【００７２】該化合物は融点８５〜８６℃を示し、重ク
ロロホルムを用いた ¹Ｈ−ＮＭＲにて１．８ｐｐｍにＤ
₂ Ｏを加えると消失する１Ｈ分のプロトン、３．０〜
４．２ｐｐｍに８Ｈ分のプロトン、４．４〜５．１ｐｐ
ｍに６Ｈ分のプロトン、７．２８ｐｐｍに１５Ｈ分のプ
ロトンが観測された。又、ＫＢｒを用いたＩＲで、３３
００、２９８０、２８７５、１５００、１５０５、１１
００ｃｍ^-1にそれぞれ吸収を示した。

【図面の簡単な説明】

【図１】１，５−ＡＧ抗体を用いたＥＩＡによる１，５
−ＡＧ及びグルコースの検量線を示したものである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】１，５−アンヒドログルシトール含有被検
   液に、１，５−アンヒドログルシトールに特異反応性を
   有する抗体と、標識した１，５−アンヒドログルシトー
   ルとを加えて免疫反応せしめ次いで、免疫反応によって
   生じた標識した１，５−アンヒドログルシトールと該抗
   体との結合物と、未結合の標識した１，５−アンヒドロ
   グルシトールとを分離後、分離されたもののいづれか一
   方の標識を測定することによって該被検液中の１，５−
   アンヒドログルシトールを定量することを特徴とする
   １，５−アンヒドログルシトールの定量方法。
2. 【請求項２】１，５−アンヒドログルシトールに特異反
   応性を有する抗体。