JPH0435710B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規なステロイド化合物に関し、さら
に詳しくは11位にヘミサクネート−抗原性蛋白質
を有する17α−ヒドロキシプロゲステロン測定用
抗原から誘導される抗血清に関する。 副腎皮質ホルモンであるコルチゾールは体内で
プロゲステロンから17α−ヒドロキシプロゲステ
ロン、11−デソキシコルチゾールを経て生合成さ
れることが知られている。即ち、17α−ヒドロキ
シプロゲステロンからコルチゾールの生合成にお
いては21−水酸化酵素の存在が必要となる。 先天性副腎過形性（CAH）は小児に認められ
る副腎性器症侯群の最も普遍的なものであり、副
腎皮質のコルチゾール産生系酵素の先天的欠損に
よつて起こる疾患で、副腎性男性ステロイド過剰
生成がその生因となつている。該CAHの大部分
は21−水酸化酵素欠損症であることが知られてお
り、その結果、17α−ヒドロキシプロゲステロン
から11−デソキシコルチゾールの生合成が阻害さ
れ、血中の17α−ヒドロキシプロゲステロンが増
加する。 かくして、17α−ヒドロキシプロゲステロンの
測定は、CAHを診断する上で極めて重要である。 従来、17α−ヒドロキシプロゲステロンに特異
的に反応する抗血清を製造するための抗原とし
て、17α−ヒドロキシプロゲステロン−３−カル
ボキシメチルオキシム−BSAあるいは17α−ヒド
ロキシプロゲステロン−6α−サクシネート−
BSAを用いる方法が知られていた〔ホルモンと
臨床28巻773（1980）参照〕。 しかしながら、上記の方法では、17α−ヒドロ
キシプロゲステロンの３位をオキシム化して
BSA（牛血清アルブミン）を結合した化合物、若
しくは６位にヘミサクシネート−BSAを結合し
た化合物を抗原として抗体を製造しているが、こ
れらの抗体は被検液中に含まれるプロゲステロ
ン、17α−ヒドロキシプレグネノロン、20α−ヒ
ドロキシプロゲステロンなどと反応し特異性が低
いという欠点があつた。 本発明者らは上記の如き欠点をもたない17α−
ヒドロキシプロゲステロンの検出方法につき鋭意
研究を行つた結果、下記式 式中、Ｙは抗原性蛋白質を示す、 で表わされる新規な17α−ヒドロキシプロゲステ
ロン−11−ヘミサクシネート−抗原蛋白質結合物
を抗原とし、該抗原を哺乳動物に免疫して得られ
る抗血清を使用することにより17α−ヒドロキシ
プロゲステロンを免疫学的に極めて感度よく且つ
特異的に検出・定量できることを見出した。 本願発明で使用する17α−ヒドロキシプロゲス
テロン−11−ヘミサクシネートは公知の方法（例
えば、アメリカ特許第4013688号公報参照）によ
り製造することができる。かくして、下記式（
−ａ）で表わされる17α−ヒドロキシプロゲステ
ロン−11−ヘミサクシネートが得られる。 次いで上記式（）の17α−ヒドロキシプロゲ
ステロン−11−ヘミサクシネート−抗原性蛋白質
結合物を得るには、上記式（−ａ）の17α−ヒ
ドロキシプロゲステロン−11−ヘミサクシネート
と抗原性蛋白質を結合せしめる。 本明細書において、「抗原性蛋白質」とは、哺
乳動物に免疫せしめた時に、それに対する抗体を
形成せしめる能力のある蛋白質を意味し、例え
ば、牛血清アルブミン（BSA）、ウサギ血清アル
ブミン（RSA）、ヒト血清アルブミン（HSA）、
卵アルブミン（EA）等が挙げられるが、本発明
では、中でも、BSA及びRSAが好適に使用され
る。 式（−ａ）のステロイド化合物をかかる抗原
性蛋白質に結合する方法は、それ自体公知であ
り、例えばB.F.Erlanger et al.J.Biol.Chem
234 1090（1959）等の公知文献に記載の方法に従
つて行うことができる。例えば、 (1) 混合酸無水物法 式（−ａ）のステロイド化合物を先ずハロ
炭酸アルキルエステル（例：クロルギ酸イソブ
チル）で処理して11−位の側鎖のカルボキシル
基を活性化し、しかる後BSA、RSA等の抗原
性蛋白質の水−有機溶媒溶液中に滴下すること
により行うことができる。 (2) カルボジイミド法 式（−ａ）のステロイド化合物をジメチル
ホルムアミド、ジオキサンなどの溶媒に溶解し
たのち、カルボジイミド化合物（例：ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド）及びBSA、RSA等
の抗原蛋白質を加え、脱水縮合によりアミド結
合を形成させる。 (3) 活性エステル法 式（−ａ）のステロイド化合物をジメチル
ホルムアミド、ジオキサンなどの溶媒に溶解し
たのち、活性エステル（例：ｐ−ニトロフエノ
ール）を加えて11−位の側鎖のカルボキシル基
を活性エステル誘導体にかえた後、BSA、
RSA等の抗原性蛋白質を加え、縮合せしめる
ことにより行うことができる。 このようにして形成された17α−ヒドロキシプ
ロゲステロン−11−ヘミサクシネート−抗原性蛋
白質結合物は、次いでそれ自体公知の方法に従
い、哺乳動物に免疫して、抗血清を調製すことが
できる。 免疫用の哺乳動物としては、例えば家兎、山
羊、めん羊、モルモツト、等が挙げられ、これら
哺乳動物の上記抗原による免疫は常法に従つて行
われる。その際、例えばコンプリ−トフロインド
アジユバンド等のアジユバントを併用することに
より有効に抗血清をつくることができる。 得られた抗血清は、それ自体公知の方法に従
い、前記抗原をつくる際に用いたと同じ抗原性蛋
白質で吸収し、アルコール沈殿又は塩析等の手段
で分画することにより、精製することができる。 本発明においては、特に、前記式（）の抗原
を家兎又は山羊に２〜５ケ月間追加免疫をするこ
とにより得られる、抗体力価が10000〜50000倍、
好ましくは25000〜50000倍の範囲内で且つ抗体の
結合親和定数が、103〜1011／mol、好ましくは
1010〜1011／molの範囲の抗体が好適である。 ここで「抗体力価」とは、得られた抗体を使用
したRIA法において、最適な標準曲線が得られる
至適倍数を表わし、また、「抗体の結合親和定数」
は、抗原と抗体とが結合した時の親和力を一般に
結合親和性と呼び、実験的には結合した抗原と非
結合抗原との比率が１の時の抗原の濃度をＫ値で
示したものである。 本発明により提供される上記抗体は、後記実施
例に示す如く、それぞれの親化合物との交叉反応
率がほぼ100％で且つ他の代謝物あるいは構造類
似物との交叉反応率は大体３％以下であつて、極
めて特異性の高い抗血清でありこれはそのまま或
いは適当な担体に感作乃至結合させた後、ラジオ
イムノアツセイ、免疫学的凝集反応、凝集阻止反
応、フオトイムノアツセイによる17α−ヒドロキ
シプロゲステロンの検出・定量のための試薬とし
て極めて有利に使用することができる。 これらラジオイムノアツセイ、免疫学的凝集反
応、凝集阻止反応、フオトイムノアツセイの操作
それ自体はいずれも周知のものであり、例えば、
栃木武一ら、ホルモンと臨床24 69（1976）；花田
芳郎ら、ホルモンと臨床24 59（1976）；特公昭58
−11575号公報等の文献に記載されており、これ
らの方法は本発明の抗体に対してもそのまま適用
することができる。 次に参考例及び実施例により本発明をさらに説
明する。 参考例 17α−ヒドロキシプロゲステロン−11−ヘミサ
クシネート−BSAの製造 17α−ヒドロキシプロゲステロン−11−ヘミサ
クシネート30mgをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
0.75mlに溶解し、これに４℃以下でトリ−ｎ−ブ
チルアミン16μを添加したのち、イソブチルク
ロロカーボネート8.4μを加え30分間撹拌を続け
た。該溶液に予めBSA（牛血清アルブミン）87.8
mgを2.1mlの精製水にて溶解し、1N水酸化ナトリ
ウム液112.5μ及びジメチルホルムアミド1.5ml
を順次加え、８℃とした溶液を添加混合した。次
いでこれを８℃で撹拌し、１時間後に1N水酸化
ナトリウム液7.5μを加え、さらに3.5時間撹拌
した。次いでセフアデツクスＧ−25によるゲル
過を行い、未反応の17α−ヒドロキシプロゲステ
ロン−11−ヘミサクシネート及びトリ−ｎ−ブチ
ルアミン等の低分子試薬を分離した。次いで該溶
液を精製水に対し透析したのち、凍結乾燥して
17α−ヒドロキシプロゲステロン−11−ヘミサク
シネート−BSAを粉末として得た。 BSA1モル当りの17α−ヒドロキシプロゲステ
ロン−11−ヘミサクシネートの結合モル数は17α
−ヒドロキシプロゲステロン−11−ヘミサクシネ
ート−BSA、17α−ヒドロキシプロゲステロン−
11−ヘミサクシネート及びBSAそれぞれの一定
濃度度溶液の紫外部吸収スペクトルから求めた結
果28モルであつた。 実施例 １ 抗17α−ヒドロキシプロゲステロン−11−ヘミ
サクシネート抗体の製造 参考例で製造した17α−ヒドロキシプロゲステ
ロン−11−ヘミサクシネート−BSA ２mgを１ml
の生理食塩水に溶解し、同量のコンプリートフロ
インドアジユパンドで乳化し、成熟家兎の皮下及
び足蹠に注射した。この注射を１ケ月間隔で行
い、抗体価の上昇を確認後全採血を行い抗血清を
得た。この抗血清を56℃30分間非働化後BSAで
吸収し、抗17α−ヒドロキシプロゲステロン−11
−ヘミサクシネート抗体を得た。 上記で得られた抗17α−ヒドロキシプロゲステ
ロン−11−ヘミサクシネート抗体は17α−ヒドロ
キシプロゲステロンとの交叉反応を100％とした
時、他のステロイドホルモンとは交叉反応がほと
んどなく、極めて特異性の高いものである。その
交叉反応率を下記第１表に示す。また、上記抗体
の特異性を、神戸川ら（ホルモンと臨床28巻773
頁、1980年）の製造した17α−ヒドロキシプロゲ
ステロン−３−カルボキシメチルオキシム−
BSA及び17α−ヒドロキシプロゲステロン−6α−
ヘミサクシネート−BSAを抗原として家兎に免
疫して得た抗血清と、本発明者が製造した17α−
ヒドロキシプロゲステロン−11−ヘミサクシネー
ト−BSAの抗血清と比較した。その結果を第１
表に併せて表示する。 【表】 上記第１表から、11位にヘミサクシネート−抗
原性蛋白質結合体を用いて製造した抗血清の方が
３位又は６位に抗原性蛋白質をつけたものより交
叉反応性が低い。特に17α−ヒドロキシプレグネ
ノロン及プロゲステロンに対しては従来と較べ交
叉反応が約１／２〜１／４と極めて低い。よつて
本発明による抗血清は極めて特異性の高いもので
あり、被検液中の17α−ヒドロキシプロゲステロ
ンを正確に測定することができる。
に詳しくは11位にヘミサクネート−抗原性蛋白質
を有する17α−ヒドロキシプロゲステロン測定用
抗原から誘導される抗血清に関する。 副腎皮質ホルモンであるコルチゾールは体内で
プロゲステロンから17α−ヒドロキシプロゲステ
ロン、11−デソキシコルチゾールを経て生合成さ
れることが知られている。即ち、17α−ヒドロキ
シプロゲステロンからコルチゾールの生合成にお
いては21−水酸化酵素の存在が必要となる。 先天性副腎過形性（CAH）は小児に認められ
る副腎性器症侯群の最も普遍的なものであり、副
腎皮質のコルチゾール産生系酵素の先天的欠損に
よつて起こる疾患で、副腎性男性ステロイド過剰
生成がその生因となつている。該CAHの大部分
は21−水酸化酵素欠損症であることが知られてお
り、その結果、17α−ヒドロキシプロゲステロン
から11−デソキシコルチゾールの生合成が阻害さ
れ、血中の17α−ヒドロキシプロゲステロンが増
加する。 かくして、17α−ヒドロキシプロゲステロンの
測定は、CAHを診断する上で極めて重要である。 従来、17α−ヒドロキシプロゲステロンに特異
的に反応する抗血清を製造するための抗原とし
て、17α−ヒドロキシプロゲステロン−３−カル
ボキシメチルオキシム−BSAあるいは17α−ヒド
ロキシプロゲステロン−6α−サクシネート−
BSAを用いる方法が知られていた〔ホルモンと
臨床28巻773（1980）参照〕。 しかしながら、上記の方法では、17α−ヒドロ
キシプロゲステロンの３位をオキシム化して
BSA（牛血清アルブミン）を結合した化合物、若
しくは６位にヘミサクシネート−BSAを結合し
た化合物を抗原として抗体を製造しているが、こ
れらの抗体は被検液中に含まれるプロゲステロ
ン、17α−ヒドロキシプレグネノロン、20α−ヒ
ドロキシプロゲステロンなどと反応し特異性が低
いという欠点があつた。 本発明者らは上記の如き欠点をもたない17α−
ヒドロキシプロゲステロンの検出方法につき鋭意
研究を行つた結果、下記式 式中、Ｙは抗原性蛋白質を示す、 で表わされる新規な17α−ヒドロキシプロゲステ
ロン−11−ヘミサクシネート−抗原蛋白質結合物
を抗原とし、該抗原を哺乳動物に免疫して得られ
る抗血清を使用することにより17α−ヒドロキシ
プロゲステロンを免疫学的に極めて感度よく且つ
特異的に検出・定量できることを見出した。 本願発明で使用する17α−ヒドロキシプロゲス
テロン−11−ヘミサクシネートは公知の方法（例
えば、アメリカ特許第4013688号公報参照）によ
り製造することができる。かくして、下記式（
−ａ）で表わされる17α−ヒドロキシプロゲステ
ロン−11−ヘミサクシネートが得られる。 次いで上記式（）の17α−ヒドロキシプロゲ
ステロン−11−ヘミサクシネート−抗原性蛋白質
結合物を得るには、上記式（−ａ）の17α−ヒ
ドロキシプロゲステロン−11−ヘミサクシネート
と抗原性蛋白質を結合せしめる。 本明細書において、「抗原性蛋白質」とは、哺
乳動物に免疫せしめた時に、それに対する抗体を
形成せしめる能力のある蛋白質を意味し、例え
ば、牛血清アルブミン（BSA）、ウサギ血清アル
ブミン（RSA）、ヒト血清アルブミン（HSA）、
卵アルブミン（EA）等が挙げられるが、本発明
では、中でも、BSA及びRSAが好適に使用され
る。 式（−ａ）のステロイド化合物をかかる抗原
性蛋白質に結合する方法は、それ自体公知であ
り、例えばB.F.Erlanger et al.J.Biol.Chem
234 1090（1959）等の公知文献に記載の方法に従
つて行うことができる。例えば、 (1) 混合酸無水物法 式（−ａ）のステロイド化合物を先ずハロ
炭酸アルキルエステル（例：クロルギ酸イソブ
チル）で処理して11−位の側鎖のカルボキシル
基を活性化し、しかる後BSA、RSA等の抗原
性蛋白質の水−有機溶媒溶液中に滴下すること
により行うことができる。 (2) カルボジイミド法 式（−ａ）のステロイド化合物をジメチル
ホルムアミド、ジオキサンなどの溶媒に溶解し
たのち、カルボジイミド化合物（例：ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド）及びBSA、RSA等
の抗原蛋白質を加え、脱水縮合によりアミド結
合を形成させる。 (3) 活性エステル法 式（−ａ）のステロイド化合物をジメチル
ホルムアミド、ジオキサンなどの溶媒に溶解し
たのち、活性エステル（例：ｐ−ニトロフエノ
ール）を加えて11−位の側鎖のカルボキシル基
を活性エステル誘導体にかえた後、BSA、
RSA等の抗原性蛋白質を加え、縮合せしめる
ことにより行うことができる。 このようにして形成された17α−ヒドロキシプ
ロゲステロン−11−ヘミサクシネート−抗原性蛋
白質結合物は、次いでそれ自体公知の方法に従
い、哺乳動物に免疫して、抗血清を調製すことが
できる。 免疫用の哺乳動物としては、例えば家兎、山
羊、めん羊、モルモツト、等が挙げられ、これら
哺乳動物の上記抗原による免疫は常法に従つて行
われる。その際、例えばコンプリ−トフロインド
アジユバンド等のアジユバントを併用することに
より有効に抗血清をつくることができる。 得られた抗血清は、それ自体公知の方法に従
い、前記抗原をつくる際に用いたと同じ抗原性蛋
白質で吸収し、アルコール沈殿又は塩析等の手段
で分画することにより、精製することができる。 本発明においては、特に、前記式（）の抗原
を家兎又は山羊に２〜５ケ月間追加免疫をするこ
とにより得られる、抗体力価が10000〜50000倍、
好ましくは25000〜50000倍の範囲内で且つ抗体の
結合親和定数が、103〜1011／mol、好ましくは
1010〜1011／molの範囲の抗体が好適である。 ここで「抗体力価」とは、得られた抗体を使用
したRIA法において、最適な標準曲線が得られる
至適倍数を表わし、また、「抗体の結合親和定数」
は、抗原と抗体とが結合した時の親和力を一般に
結合親和性と呼び、実験的には結合した抗原と非
結合抗原との比率が１の時の抗原の濃度をＫ値で
示したものである。 本発明により提供される上記抗体は、後記実施
例に示す如く、それぞれの親化合物との交叉反応
率がほぼ100％で且つ他の代謝物あるいは構造類
似物との交叉反応率は大体３％以下であつて、極
めて特異性の高い抗血清でありこれはそのまま或
いは適当な担体に感作乃至結合させた後、ラジオ
イムノアツセイ、免疫学的凝集反応、凝集阻止反
応、フオトイムノアツセイによる17α−ヒドロキ
シプロゲステロンの検出・定量のための試薬とし
て極めて有利に使用することができる。 これらラジオイムノアツセイ、免疫学的凝集反
応、凝集阻止反応、フオトイムノアツセイの操作
それ自体はいずれも周知のものであり、例えば、
栃木武一ら、ホルモンと臨床24 69（1976）；花田
芳郎ら、ホルモンと臨床24 59（1976）；特公昭58
−11575号公報等の文献に記載されており、これ
らの方法は本発明の抗体に対してもそのまま適用
することができる。 次に参考例及び実施例により本発明をさらに説
明する。 参考例 17α−ヒドロキシプロゲステロン−11−ヘミサ
クシネート−BSAの製造 17α−ヒドロキシプロゲステロン−11−ヘミサ
クシネート30mgをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
0.75mlに溶解し、これに４℃以下でトリ−ｎ−ブ
チルアミン16μを添加したのち、イソブチルク
ロロカーボネート8.4μを加え30分間撹拌を続け
た。該溶液に予めBSA（牛血清アルブミン）87.8
mgを2.1mlの精製水にて溶解し、1N水酸化ナトリ
ウム液112.5μ及びジメチルホルムアミド1.5ml
を順次加え、８℃とした溶液を添加混合した。次
いでこれを８℃で撹拌し、１時間後に1N水酸化
ナトリウム液7.5μを加え、さらに3.5時間撹拌
した。次いでセフアデツクスＧ−25によるゲル
過を行い、未反応の17α−ヒドロキシプロゲステ
ロン−11−ヘミサクシネート及びトリ−ｎ−ブチ
ルアミン等の低分子試薬を分離した。次いで該溶
液を精製水に対し透析したのち、凍結乾燥して
17α−ヒドロキシプロゲステロン−11−ヘミサク
シネート−BSAを粉末として得た。 BSA1モル当りの17α−ヒドロキシプロゲステ
ロン−11−ヘミサクシネートの結合モル数は17α
−ヒドロキシプロゲステロン−11−ヘミサクシネ
ート−BSA、17α−ヒドロキシプロゲステロン−
11−ヘミサクシネート及びBSAそれぞれの一定
濃度度溶液の紫外部吸収スペクトルから求めた結
果28モルであつた。 実施例 １ 抗17α−ヒドロキシプロゲステロン−11−ヘミ
サクシネート抗体の製造 参考例で製造した17α−ヒドロキシプロゲステ
ロン−11−ヘミサクシネート−BSA ２mgを１ml
の生理食塩水に溶解し、同量のコンプリートフロ
インドアジユパンドで乳化し、成熟家兎の皮下及
び足蹠に注射した。この注射を１ケ月間隔で行
い、抗体価の上昇を確認後全採血を行い抗血清を
得た。この抗血清を56℃30分間非働化後BSAで
吸収し、抗17α−ヒドロキシプロゲステロン−11
−ヘミサクシネート抗体を得た。 上記で得られた抗17α−ヒドロキシプロゲステ
ロン−11−ヘミサクシネート抗体は17α−ヒドロ
キシプロゲステロンとの交叉反応を100％とした
時、他のステロイドホルモンとは交叉反応がほと
んどなく、極めて特異性の高いものである。その
交叉反応率を下記第１表に示す。また、上記抗体
の特異性を、神戸川ら（ホルモンと臨床28巻773
頁、1980年）の製造した17α−ヒドロキシプロゲ
ステロン−３−カルボキシメチルオキシム−
BSA及び17α−ヒドロキシプロゲステロン−6α−
ヘミサクシネート−BSAを抗原として家兎に免
疫して得た抗血清と、本発明者が製造した17α−
ヒドロキシプロゲステロン−11−ヘミサクシネー
ト−BSAの抗血清と比較した。その結果を第１
表に併せて表示する。 【表】 上記第１表から、11位にヘミサクシネート−抗
原性蛋白質結合体を用いて製造した抗血清の方が
３位又は６位に抗原性蛋白質をつけたものより交
叉反応性が低い。特に17α−ヒドロキシプレグネ
ノロン及プロゲステロンに対しては従来と較べ交
叉反応が約１／２〜１／４と極めて低い。よつて
本発明による抗血清は極めて特異性の高いもので
あり、被検液中の17α−ヒドロキシプロゲステロ
ンを正確に測定することができる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 式 式中、Ｙは抗原性蛋白質を示す、 で表わされるステロイド化合物を哺乳動物に免疫
して得られる、17α−ヒドロキシプロゲステロン
に対して特異的に反応しうる抗血清。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19772790A JPH03150464A (ja) | 1983-10-06 | 1990-07-27 | １７α―ヒドロキシプロゲステロン測定用抗血清 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18600683A JPS6078919A (ja) | 1983-10-06 | 1983-10-06 | １７α―ヒドロキシプロゲステロンの測定用抗原 |
| JP19772790A JPH03150464A (ja) | 1983-10-06 | 1990-07-27 | １７α―ヒドロキシプロゲステロン測定用抗血清 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18600683A Division JPS6078919A (ja) | 1983-10-06 | 1983-10-06 | １７α―ヒドロキシプロゲステロンの測定用抗原 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03150464A JPH03150464A (ja) | 1991-06-26 |
| JPH0435710B2 true JPH0435710B2 (ja) | 1992-06-11 |
Family
ID=26503476
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19772790A Granted JPH03150464A (ja) | 1983-10-06 | 1990-07-27 | １７α―ヒドロキシプロゲステロン測定用抗血清 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03150464A (ja) |
-
1990
- 1990-07-27 JP JP19772790A patent/JPH03150464A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03150464A (ja) | 1991-06-26 |
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