JPS59211861A - オキシトシン測定用酵素標識オキシトシンの製造法 - Google Patents
オキシトシン測定用酵素標識オキシトシンの製造法Info
- Publication number
- JPS59211861A JPS59211861A JP8715783A JP8715783A JPS59211861A JP S59211861 A JPS59211861 A JP S59211861A JP 8715783 A JP8715783 A JP 8715783A JP 8715783 A JP8715783 A JP 8715783A JP S59211861 A JPS59211861 A JP S59211861A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- toxin
- oxy
- oxytocin
- group
- labeled
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ド垂体ホルモンであるオキシトシンの酵素免
疫測定法ｌこよる測定を目的♂する酵素標識オキシトシ
ンの製造法に関する。
疫測定法ｌこよる測定を目的♂する酵素標識オキシトシ
ンの製造法に関する。
オキシトシンは膨下垂体より分泌される平滑筋収縮作用
を有するホルモンであって妊娠、分娩時および授乳時に
血中レベルの上昇がみられるアミノ酸９個からなるペプ
チドホルモンである。
を有するホルモンであって妊娠、分娩時および授乳時に
血中レベルの上昇がみられるアミノ酸９個からなるペプ
チドホルモンである。
ペプチドホルモンの測定方法としては、生物学的測定法
と免疫化学的測定法が用いられるが、後者がその簡便さ
のために望ましい方法である。
と免疫化学的測定法が用いられるが、後者がその簡便さ
のために望ましい方法である。
オキソしシンの如き低分子量ペプチドホルモンに対する
免疫化学的測定法としては、そのホルモンをウシ血清ア
ルブミン等と結合せしめたものを抗原として動物に免疫
して作製した抗体に対して、あらかじめ用意された既知
量の標識ペプチドホルモンと検体中のペプチドホルモン
を競合的に反応せしめた後、木結合の標識ペプチドホル
モンと抗体と結合した標識ペプチドホルモンを分離し、
抗体と結合し１こ標識ペプチドホルモンの垣を測定する
いわゆる競合反応法が用いられる。
免疫化学的測定法としては、そのホルモンをウシ血清ア
ルブミン等と結合せしめたものを抗原として動物に免疫
して作製した抗体に対して、あらかじめ用意された既知
量の標識ペプチドホルモンと検体中のペプチドホルモン
を競合的に反応せしめた後、木結合の標識ペプチドホル
モンと抗体と結合した標識ペプチドホルモンを分離し、
抗体と結合し１こ標識ペプチドホルモンの垣を測定する
いわゆる競合反応法が用いられる。
１ｒでにオキシトシンに対［７ても、標識ヘフチ！２ミ
ドホルモンとして Ｌの如き放射性同位元素（以下１
’−Ｉｔ Ｉ Ｊという）による標識体を使用するラジ
オイムノアッセイ法（以下１− ＩＬ Ｉ Ａ法」とい
う）が開発され利用されてきた。〔大板ら、日本内分泌
学会誌５２．９４１〜９４９（１９８１））しかしなか
らこのＲＩ Ａ法はＲＩの使用に起因する種々の大きな
欠点を有する。例えば放射線にまる人体障害の危険性、
放射能の拡散防止のための特殊な施設を要すること、Ｒ
Ｉの半減期が短いことから保存期聞か限定される等の欠
点である。
’−Ｉｔ Ｉ Ｊという）による標識体を使用するラジ
オイムノアッセイ法（以下１− ＩＬ Ｉ Ａ法」とい
う）が開発され利用されてきた。〔大板ら、日本内分泌
学会誌５２．９４１〜９４９（１９８１））しかしなか
らこのＲＩ Ａ法はＲＩの使用に起因する種々の大きな
欠点を有する。例えば放射線にまる人体障害の危険性、
放射能の拡散防止のための特殊な施設を要すること、Ｒ
Ｉの半減期が短いことから保存期聞か限定される等の欠
点である。
これらの几１１Ｌ法のもつ欠点を解決するｆこめに酵斯
を標識物質とした醋素免＆副定法（以下「１５ＩＡ注」
という）か開発され、ＲＩＡ法と向等の５０度を得る１
こめ柚々の物質の測定に対して多くの試みが行なわれて
いる。しかるに本発明の目的でＪ〕るオキシトシンの測
定においてはＥｉＡ法による測定は報告されておらず、
ＲＩＡ法にかわってＥｉＡ法により測定可能とすること
はそのもたらす利益は大きく臨床家に強く要望されてい
るところである。
を標識物質とした醋素免＆副定法（以下「１５ＩＡ注」
という）か開発され、ＲＩＡ法と向等の５０度を得る１
こめ柚々の物質の測定に対して多くの試みが行なわれて
いる。しかるに本発明の目的でＪ〕るオキシトシンの測
定においてはＥｉＡ法による測定は報告されておらず、
ＲＩＡ法にかわってＥｉＡ法により測定可能とすること
はそのもたらす利益は大きく臨床家に強く要望されてい
るところである。
ところでこのＥ Ｉ Ａ法による測定法を確立するため
の技術的な問題点の一つは酵素標識法である。オキシト
シンの如き抗原を競合反応法でＥＩＡ法ｌζよる測定を
行なうには、測定すべき抗原と同等の抗体結合性を有し
、かつ十分な酵素活性を自回゛るＩ＃素標識抗原を製造
する技術が重要である。
の技術的な問題点の一つは酵素標識法である。オキシト
シンの如き抗原を競合反応法でＥＩＡ法ｌζよる測定を
行なうには、測定すべき抗原と同等の抗体結合性を有し
、かつ十分な酵素活性を自回゛るＩ＃素標識抗原を製造
する技術が重要である。
このｔこめ抗原と６を素を結合させるための種々の化学
結合剤が検討されてきた。「エンザイムイムノアッセイ
Ｊ （Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｔｎｕｎｏａｓｓａｙ 、
１９８１ 。
結合剤が検討されてきた。「エンザイムイムノアッセイ
Ｊ （Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｔｎｕｎｏａｓｓａｙ 、
１９８１ 。
１ＧａｋｕＬ−８ｈｏｔｎ ） （ＩＩ） ５４頁〜１
０５頁に、種々の物質に対して酵素標識を行なうための
化学結合剤の例が記載されている。高感度の６ｉＵ疋を
行なうためには、標識酵素として、β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ（以下「β−〇ａｌｌという）が望まし、いこと
が知られでいる。β−（ｉａｊは酵素活性に関与しない
チオール基を有する。したがってこのβ−Ｕａｌのチオ
ール基と抗原側のアミノ基を利用して、結合可能な化学
結合剤を介して、β−Ｇａｌと抗原とを結合させＺｌの
が一般的である。特に”７ Ｌ−イミド基を有するカル
ホン酸のＮ−ハイドロキンサクシンイミドエステル体カ
望ま（〕いことが多くの文献に記載されてい乙。
０５頁に、種々の物質に対して酵素標識を行なうための
化学結合剤の例が記載されている。高感度の６ｉＵ疋を
行なうためには、標識酵素として、β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ（以下「β−〇ａｌｌという）が望まし、いこと
が知られでいる。β−（ｉａｊは酵素活性に関与しない
チオール基を有する。したがってこのβ−Ｕａｌのチオ
ール基と抗原側のアミノ基を利用して、結合可能な化学
結合剤を介して、β−Ｇａｌと抗原とを結合させＺｌの
が一般的である。特に”７ Ｌ−イミド基を有するカル
ホン酸のＮ−ハイドロキンサクシンイミドエステル体カ
望ま（〕いことが多くの文献に記載されてい乙。
ペプチドホルモンのいくつかについても、マレイミド基
を有するカルボン酸のへ−ハイドロキシ−リフシンイミ
ドエステルを化学結合剤としてβ−Ｇｕｍ標識ペプチド
ホルモンを製造し、これを用いたＥｉＡ法での測定がす
でｌこ知られている。例えば、アミノ酸１０個からなる
ペプチドホルモンであるアンギオテンシン■のＥＩＡ法
での測定の例か’＋２ｉＪ出の「エンサイムイムノアツ
セイＪ （Ｅｎｚｙｍｅ １ｎｕｎｕ＋＋５ａｓｏａｙ
） ｌ ６３ ＠ ニ記載さオｔている。この方法に
よるとアンギオテンシン■とβ−Ｃ））ｌ Ｉとの結合
において、化学結合剤としてＮ −（メクーマしノイミ
ドベンゾイロキシ）ゆクンンイミド（以下ｉ ｓｔ Ｂ
Ｓ Ｊといつ）カ使用さＩしている、１ｒ４られたβ
−Ｇａ１ｇ識アノギオテノノノ１を用いζアノギオテ゛
ノシン１の競合反応法による１“：■、〜測定が行なＫ
）れ、ｉｔ Ｉ Ａ法と同等の感度がｆ’Ｕられｆコと
ノ小べＣいる。特開昭５６−１０６４７号公報にはオキ
ソトレンを含むド垂体ホルモンの競合ｉｉ ！、Ｊ法に
まるＥＩＡ法での測定法に関する記載があり、β−（ｊ
ａｌを標識酵素としｊ、＝ ＩＪ−Ｇａｌ標識１Ｚ垂体
ホル七ンの製造法についでこτ及している。この中でも
化学結合剤さしてマレイミド基を含む芳香族あるいは脂
環式カルボン酸のＮ−ハイドロキシサクシンイミドエス
テル体例えばＭＢＳあるいはＮ −（４−カルボキシシ
クロへキシルメチル）マレイミドのＮ−ヒドロキシサク
シンイミドエステル（以下［Ｃｋｌ Ｍ Ｊという）等
を用１．）ｔこ製造法か望ましいと記載されている。
を有するカルボン酸のへ−ハイドロキシ−リフシンイミ
ドエステルを化学結合剤としてβ−Ｇｕｍ標識ペプチド
ホルモンを製造し、これを用いたＥｉＡ法での測定がす
でｌこ知られている。例えば、アミノ酸１０個からなる
ペプチドホルモンであるアンギオテンシン■のＥＩＡ法
での測定の例か’＋２ｉＪ出の「エンサイムイムノアツ
セイＪ （Ｅｎｚｙｍｅ １ｎｕｎｕ＋＋５ａｓｏａｙ
） ｌ ６３ ＠ ニ記載さオｔている。この方法に
よるとアンギオテンシン■とβ−Ｃ））ｌ Ｉとの結合
において、化学結合剤としてＮ −（メクーマしノイミ
ドベンゾイロキシ）ゆクンンイミド（以下ｉ ｓｔ Ｂ
Ｓ Ｊといつ）カ使用さＩしている、１ｒ４られたβ
−Ｇａ１ｇ識アノギオテノノノ１を用いζアノギオテ゛
ノシン１の競合反応法による１“：■、〜測定が行なＫ
）れ、ｉｔ Ｉ Ａ法と同等の感度がｆ’Ｕられｆコと
ノ小べＣいる。特開昭５６−１０６４７号公報にはオキ
ソトレンを含むド垂体ホルモンの競合ｉｉ ！、Ｊ法に
まるＥＩＡ法での測定法に関する記載があり、β−（ｊ
ａｌを標識酵素としｊ、＝ ＩＪ−Ｇａｌ標識１Ｚ垂体
ホル七ンの製造法についでこτ及している。この中でも
化学結合剤さしてマレイミド基を含む芳香族あるいは脂
環式カルボン酸のＮ−ハイドロキシサクシンイミドエス
テル体例えばＭＢＳあるいはＮ −（４−カルボキシシ
クロへキシルメチル）マレイミドのＮ−ヒドロキシサク
シンイミドエステル（以下［Ｃｋｌ Ｍ Ｊという）等
を用１．）ｔこ製造法か望ましいと記載されている。
本発明者らはオキソトレンのｉ；ｉＡｉによる測定を可
能にすべく鋭意検討を行なつｆコ結果、従来望ましいと
されているマレイミド基を含むβ−Ｕａｌ標識オキ標識
オキモトシンを達し得す、一般式［１］ ％式％［］ で表わされる化学結合剤を用いた場合ζこ、競合法によ
るＥＩＡ法での筒感度オキシトシンの定量が可能である
ことを見出し、本発明に到った。
能にすべく鋭意検討を行なつｆコ結果、従来望ましいと
されているマレイミド基を含むβ−Ｕａｌ標識オキ標識
オキモトシンを達し得す、一般式［１］ ％式％［］ で表わされる化学結合剤を用いた場合ζこ、競合法によ
るＥＩＡ法での筒感度オキシトシンの定量が可能である
ことを見出し、本発明に到った。
一般式〔ＩＪにおけるＸとしては、一般的に蛋白を変性
させない温和な条件下で蛋白の有するＳＲ４と反応して
、スルフィド結合ま１こはジスルフィド結合を形成して
蛋白と結合し得る公知の官能基のいずれでも良い。
させない温和な条件下で蛋白の有するＳＲ４と反応して
、スルフィド結合ま１こはジスルフィド結合を形成して
蛋白と結合し得る公知の官能基のいずれでも良い。
蛋ＨＯ）８Ｈ）ｉ、とスルフィド結合を形成し得る官能
参の例と（７ては、１７１素、臭素、ヨード専のハロゲ
ン覗あるいはマレイミド基が挙げられるが、好ま（７〈
は塩素、臭素、ヨードであり、特にヨードが泥和ｊｆ条
件で反応［７得るこにから望まし１）。
参の例と（７ては、１７１素、臭素、ヨード専のハロゲ
ン覗あるいはマレイミド基が挙げられるが、好ま（７〈
は塩素、臭素、ヨードであり、特にヨードが泥和ｊｆ条
件で反応［７得るこにから望まし１）。
蛋白の８１ｉ基とジスルフィド結合を形成し得る官能基
の例としては、一般式−５−Ｚ（Ｚは隣りの硫黄原子と
共に粘性ジスルフィドゐ（を形成Ｌ〕得るノ１（を表わ
す。）で表わされる活１１゛ジスルフィド基である。２
の具体例としては２−ピことができるか、特に２−ピリ
ジルチオ基が望ましい。
の例としては、一般式−５−Ｚ（Ｚは隣りの硫黄原子と
共に粘性ジスルフィドゐ（を形成Ｌ〕得るノ１（を表わ
す。）で表わされる活１１゛ジスルフィド基である。２
の具体例としては２−ピことができるか、特に２−ピリ
ジルチオ基が望ましい。
Ａとしては、炭素数１〜３の直鎮状アルキレン基であり
、好ましくはメチレン基またはエチレン基である。
、好ましくはメチレン基またはエチレン基である。
Ｙとしては、アミノ基と反応してペプチド結合を形成し
得るカルボキシル基、またはその反応性誘導体であるが
、カルボキシル基の反応性誘導体であることが望ましい
。
得るカルボキシル基、またはその反応性誘導体であるが
、カルボキシル基の反応性誘導体であることが望ましい
。
ここでカルボキシル基の反応性誘導体とは、ペプチド結
合を形成するために、ペプチド合成の分野で通常用いら
れる反応性誘導体であり、例えば活性エステル基が該当
する。活性エステル基としては、射−ヒドロキシサクシ
ンイミドエステル基、ｐ−ニトロフェニルエステル基な
どが反応性が高いので望ましい。
合を形成するために、ペプチド合成の分野で通常用いら
れる反応性誘導体であり、例えば活性エステル基が該当
する。活性エステル基としては、射−ヒドロキシサクシ
ンイミドエステル基、ｐ−ニトロフェニルエステル基な
どが反応性が高いので望ましい。
一般式［ＩＪで表わされる化学結合剤として特に望まし
いものは、Ｎ−サクシンイミジルヨードアセテート（以
下［ＮＩＩＩＡＪという）〔■〕おまびヘーサクシンイ
ミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（以
ド［５ＰＤＰＪという） ［１１１］である。
いものは、Ｎ−サクシンイミジルヨードアセテート（以
下［ＮＩＩＩＡＪという）〔■〕おまびヘーサクシンイ
ミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（以
ド［５ＰＤＰＪという） ［１１１］である。
前者はその製造法が文献（Ｒｅｃｔｏｒら： Ｊ、Ｉｍ
ｍｕｎｏｊ。
ｍｕｎｏｊ。
Ｍｅｒｂｏｄｓ ２４．３２１〜３８６ （１９７８）
）に記載されている公知の化合物であって、ジオキサン
等の有機溶媒中でＮ−ハイドロキシサクシンイミドをジ
シクロへキシルカルボジイミドの存在下、ヨード酢酸と
反応せしめて得ることが出来る。
）に記載されている公知の化合物であって、ジオキサン
等の有機溶媒中でＮ−ハイドロキシサクシンイミドをジ
シクロへキシルカルボジイミドの存在下、ヨード酢酸と
反応せしめて得ることが出来る。
後者はすでにファルマシア社（スウェーデン）より市販
されている公知の化合物である。
されている公知の化合物である。
これらの化学結合剤を用いてβ−Ｇａｌ標識オキシトシ
ンを製造するには、まず化学結合剤のカルボキシル基あ
るいはその反応性誘導体とオキシトシンのアミン基を反
応させた後、未反応の化学結合剤を除去する。Ｙがカル
ホキシル基である場合ｌζは、カルボジイミド誘導体等
の縮合剤の存在下でアミノ基と反応せしめてペプチド結
合を形成する。一方Ｙがカルボキシル基の反応性誘導体
である場合には縮合剤は不要であり、取扱いも容易なこ
とから望ましい。このようにして得られた化学結合剤の
反応したオキシトシンとβ−Ｇａｌの８Ｈ基とを反応せ
しめ、その結果得られたβ−Ｇａｌ標識オキシトシンを
分離精製する。
ンを製造するには、まず化学結合剤のカルボキシル基あ
るいはその反応性誘導体とオキシトシンのアミン基を反
応させた後、未反応の化学結合剤を除去する。Ｙがカル
ホキシル基である場合ｌζは、カルボジイミド誘導体等
の縮合剤の存在下でアミノ基と反応せしめてペプチド結
合を形成する。一方Ｙがカルボキシル基の反応性誘導体
である場合には縮合剤は不要であり、取扱いも容易なこ
とから望ましい。このようにして得られた化学結合剤の
反応したオキシトシンとβ−Ｇａｌの８Ｈ基とを反応せ
しめ、その結果得られたβ−Ｇａｌ標識オキシトシンを
分離精製する。
オキシトシンと該化学結合剤との反応は、Ｙがカルボキ
シル基である場合には、オキシトシンをｐｌｌ ５．０
〜７．５の緩衝液に０．０１〜１０（Ｗ／Ｗ ）％の濃
度で溶解し、これに該化学結合剤を１〜１００倍モル、
望ましくは１〜５倍モル加え、さらに水溶性カルボジイ
ミド等の縮合剤を１〜１０００倍モル望ましくは１〜５
０倍モル加えて０〜５０℃で５分〜２４時間反応せしめ
た後、ゲル口過またはアセトン等の有機溶媒洗浄に誹り
未反応の化学結合剤を除去する。
シル基である場合には、オキシトシンをｐｌｌ ５．０
〜７．５の緩衝液に０．０１〜１０（Ｗ／Ｗ ）％の濃
度で溶解し、これに該化学結合剤を１〜１００倍モル、
望ましくは１〜５倍モル加え、さらに水溶性カルボジイ
ミド等の縮合剤を１〜１０００倍モル望ましくは１〜５
０倍モル加えて０〜５０℃で５分〜２４時間反応せしめ
た後、ゲル口過またはアセトン等の有機溶媒洗浄に誹り
未反応の化学結合剤を除去する。
Ｙか活性エステル等のカルホキシル基の反応性誘導体で
ある場合には、水溶性カルボジイミド等の縮合剤を使わ
ない他は、上述のＹがカルボキシル基である場合と同様
の方法で行うことができる。得られた化学結合剤と反応
したオキシトシンの鷲は以下の如くして求められる。す
なわち化学結合剤とβ−Ｇａｌ （７） ８ ｋｌ基と
の結合かスルフィド結合となる場合は、反応体を一定過
剰Ｍの２−メルカプトエタノールと反応させ、その残飯
を４．４′−ジチオジピリジンにより逆ｌ丙疋しで求め
る。β−ＧａｌのＳＩｉ基との結合がジスルフィド結合
となる場合は、反応体を過剰の２−メルカプトエタノー
ルと反応せしめ、遊離したピリジン誘導体を分光学的に
測定して求めることが出来る。
ある場合には、水溶性カルボジイミド等の縮合剤を使わ
ない他は、上述のＹがカルボキシル基である場合と同様
の方法で行うことができる。得られた化学結合剤と反応
したオキシトシンの鷲は以下の如くして求められる。す
なわち化学結合剤とβ−Ｇａｌ （７） ８ ｋｌ基と
の結合かスルフィド結合となる場合は、反応体を一定過
剰Ｍの２−メルカプトエタノールと反応させ、その残飯
を４．４′−ジチオジピリジンにより逆ｌ丙疋しで求め
る。β−ＧａｌのＳＩｉ基との結合がジスルフィド結合
となる場合は、反応体を過剰の２−メルカプトエタノー
ルと反応せしめ、遊離したピリジン誘導体を分光学的に
測定して求めることが出来る。
上記反応体とβ−Ｇａｌの反応は、ｐ Ｈ５，０〜９．
０好ましくはＰ Ｒ６，０〜８．０の緩衝液中で、β−
（Ｊａｌ ｏ）５〜１０００倍モル望ましくは１０〜２
００倍モルの上記反応体を用いて、０〜４０℃で１０分
〜４８時間反応せしめる。反応後ゲル濾過を行ない、β
−Ｇａｊと反応しなかった上記反応体を除去する。
０好ましくはＰ Ｒ６，０〜８．０の緩衝液中で、β−
（Ｊａｌ ｏ）５〜１０００倍モル望ましくは１０〜２
００倍モルの上記反応体を用いて、０〜４０℃で１０分
〜４８時間反応せしめる。反応後ゲル濾過を行ない、β
−Ｇａｊと反応しなかった上記反応体を除去する。
得られた生成物が目的のβ−Ｇａｌ標識オキシトシンで
あることは、ゲル沖過の相当画分の分子基がβ−Ｇａｌ
の分子量にほぼ相当するものであり、β−ｕａｌの酵素
粘性を有し、かつオキシトシン特異的抗体との免疫化学
的結合性を有することから確認することが出来る。
あることは、ゲル沖過の相当画分の分子基がβ−Ｇａｌ
の分子量にほぼ相当するものであり、β−ｕａｌの酵素
粘性を有し、かつオキシトシン特異的抗体との免疫化学
的結合性を有することから確認することが出来る。
オキシトシン特異抗体を得る方法は低分子量物質いわゆ
るハブテンに対する特異抗体を作製する公知の方法を適
用することかできる。代表的方法としては、牛血清アル
ブミンをキャリヤー蛋白とする方法で、Ｔ、 Ｌ、 ｕ
ｏｏｄｌ’ｒｉｅｎｄら（５ｃｉｅｎｃｅ １４４ 、
１１１４４ （１９６４年））の文献に記載されてい
る。すなわち、オキシトシンと牛血清アルブミンをカル
ボジイミド法で結合後、この反応液を透析し、得られた
オキシトシンと牛血清アルブミンの結合物を等量の完全
フロインドアジａバンドと混合して乳剤とし、家兎の反
内に繰返し静注することによって抗体を匣生させる。
るハブテンに対する特異抗体を作製する公知の方法を適
用することかできる。代表的方法としては、牛血清アル
ブミンをキャリヤー蛋白とする方法で、Ｔ、 Ｌ、 ｕ
ｏｏｄｌ’ｒｉｅｎｄら（５ｃｉｅｎｃｅ １４４ 、
１１１４４ （１９６４年））の文献に記載されてい
る。すなわち、オキシトシンと牛血清アルブミンをカル
ボジイミド法で結合後、この反応液を透析し、得られた
オキシトシンと牛血清アルブミンの結合物を等量の完全
フロインドアジａバンドと混合して乳剤とし、家兎の反
内に繰返し静注することによって抗体を匣生させる。
以上の方法に止っで得られたβ−１ｊａＪ標識オキシト
シンならびにオキシトシン特異抗体を用いた競合反応法
による、ｎｌＡ法によるオキシトシンの測定は以上の方
法により行なうことか出来る。すなわら検体とβ−Ｇａ
ｌ標識オキシトシンとオキシトシン特異抗体とを混合し
抗原抗体反応を行なわせた後、未反応β−Ｇａｌ標識オ
キシトシンと、オキシトシン特異抗体と結合したβ−Ｇ
ａ １ ｇ ａがキシドシンとを分離せしめ、オキシト
シン特異抗体と結合したβ−ｕａｌ標識オキシトシンの
量をβ−Ｇａｌの酵素活性から測定する。分離方法とし
ては通常のＥｉＡ法の１３／Ｆ分離法を用いることが出
来る。代表的分離方法はオキシトシン特異抗体に対する
抗体、たとえば抗つサギγ−グープリン山羊血清を加え
遠心分離を行なうパわゆる２抗体法Ｙある・得られた沈
でん物のβ−Ｇａｌ酵累活性を公知の方法により測定す
る。酵素反応の基質としては例えばｐ−ニトロフェニル
−β−カラクトシドあるいは４−メチルウンベリフェリ
ル−β−ガラクトシドが挙げられるが、後者の場合生成
物が螢光を有するため高感度測定に望ましい。なお検体
中のオキシトシンの濃度は、既知濃度の標準試料浴液を
用いて同様に操作して酵素活性を測定し、それにより作
成した検量線より定量する。特に高感度を得るには、オ
キシトシンとオキシトシン特異抗体とをあらかじめ反応
せしめた後、β−（Ｊａｌ標識オキシドノンを反応させ
るいわゆるディレィドアディジョン法（ｄｅｂλｙｅｄ
ａｃｌｄｉｔｉｏｎ法）が好ましい。
シンならびにオキシトシン特異抗体を用いた競合反応法
による、ｎｌＡ法によるオキシトシンの測定は以上の方
法により行なうことか出来る。すなわら検体とβ−Ｇａ
ｌ標識オキシトシンとオキシトシン特異抗体とを混合し
抗原抗体反応を行なわせた後、未反応β−Ｇａｌ標識オ
キシトシンと、オキシトシン特異抗体と結合したβ−Ｇ
ａ １ ｇ ａがキシドシンとを分離せしめ、オキシト
シン特異抗体と結合したβ−ｕａｌ標識オキシトシンの
量をβ−Ｇａｌの酵素活性から測定する。分離方法とし
ては通常のＥｉＡ法の１３／Ｆ分離法を用いることが出
来る。代表的分離方法はオキシトシン特異抗体に対する
抗体、たとえば抗つサギγ−グープリン山羊血清を加え
遠心分離を行なうパわゆる２抗体法Ｙある・得られた沈
でん物のβ−Ｇａｌ酵累活性を公知の方法により測定す
る。酵素反応の基質としては例えばｐ−ニトロフェニル
−β−カラクトシドあるいは４−メチルウンベリフェリ
ル−β−ガラクトシドが挙げられるが、後者の場合生成
物が螢光を有するため高感度測定に望ましい。なお検体
中のオキシトシンの濃度は、既知濃度の標準試料浴液を
用いて同様に操作して酵素活性を測定し、それにより作
成した検量線より定量する。特に高感度を得るには、オ
キシトシンとオキシトシン特異抗体とをあらかじめ反応
せしめた後、β−（Ｊａｌ標識オキシドノンを反応させ
るいわゆるディレィドアディジョン法（ｄｅｂλｙｅｄ
ａｃｌｄｉｔｉｏｎ法）が好ましい。
以下実施例によって本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１ オキシトシンに対する抗体の作成８０ｍ２の
合成オキシトシン（情国臓器製）と１５ｑの牛血浦アル
ブミンを０．３−の蒸留水に溶解し、この水溶液中に５
０ ＩＩ＋！／のｌ−エチル−８−（８−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミドの塩酸塩を０．２ ｔｎｔ
の蒸留水に俗解したＦｉを閥下し、２０”′Ｃで３０分
間振とうする。この反応液を４ ”Ｃの蒸留水で２４時
聞過析した。オキシトシン換算１り相当量を０、ｌ ５
ｈｌ Ｎａ１ｌ水浴液で１．０艷に希釈し、１−の完
全フロインドアジュバントと混合して乳剤とし、家兎の
皮肉に約０．０５ ｒｎｌずつ２０ケ所以上に注射し、
２週間後に開腹の上、牌内に１．５ ｍＡ注入、次いで
２週間間隔で初回と同様の皮肉注射を行ない、初回免疫
より１２週後に全面採血を行なっｆコ。
合成オキシトシン（情国臓器製）と１５ｑの牛血浦アル
ブミンを０．３−の蒸留水に溶解し、この水溶液中に５
０ ＩＩ＋！／のｌ−エチル−８−（８−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミドの塩酸塩を０．２ ｔｎｔ
の蒸留水に俗解したＦｉを閥下し、２０”′Ｃで３０分
間振とうする。この反応液を４ ”Ｃの蒸留水で２４時
聞過析した。オキシトシン換算１り相当量を０、ｌ ５
ｈｌ Ｎａ１ｌ水浴液で１．０艷に希釈し、１−の完
全フロインドアジュバントと混合して乳剤とし、家兎の
皮肉に約０．０５ ｒｎｌずつ２０ケ所以上に注射し、
２週間後に開腹の上、牌内に１．５ ｍＡ注入、次いで
２週間間隔で初回と同様の皮肉注射を行ない、初回免疫
より１２週後に全面採血を行なっｆコ。
′宿性により抗血清を分離し、その力価を調べた。””
ｌ Ｗ識オキシトシンに対して、希釈率１ ： ９００
０で約・１５％の結合率を示した。
ｌ Ｗ識オキシトシンに対して、希釈率１ ： ９００
０で約・１５％の結合率を示した。
実施例２
（１）、ＮＬＬＬＡを化学結合剤としたβ−（ｊａｌ標
識オキントシンの製造 １、００ ｍのり−；ζフラスコにＮ−ハイドロキジサ
クシンイミド４６０１’ｌｌｉ’（４ｍｍｏｌｅ ）、
ジシクロヘキシルカルボジイミド８２４ 〃ｖ（４ｎＩ
ｎｌｏ ｌ ｅ ）、ジオキサン４０ ｍｅを加え、こ
の溶故甲にヨード酢酸７２６ ｒｎｙ （３，９ｍｎｏ
）ｌｃ ）を添加し、冨温で１時間攪拌しｆコ。反発後
生成した白色性ＩＲｆｆ−Ｆ別除去し、７戸液を減圧濃
縮して淡黄色粉床ｉ、ｉｇを得ｆこ。そのうら１！をク
ロロホルム１０ゴで再結晶し、白色結晶６５６〜（２，
８２ｍｒｎｏｌｅ ） ヲ（１１コ。ｌｉ’Ａ点、マ
ススペクトル、Ｎ ｂｔ ｉｔにより１的とするＮ］ｉ
ＩＡであることを確認しｆこ。
識オキントシンの製造 １、００ ｍのり−；ζフラスコにＮ−ハイドロキジサ
クシンイミド４６０１’ｌｌｉ’（４ｍｍｏｌｅ ）、
ジシクロヘキシルカルボジイミド８２４ 〃ｖ（４ｎＩ
ｎｌｏ ｌ ｅ ）、ジオキサン４０ ｍｅを加え、こ
の溶故甲にヨード酢酸７２６ ｒｎｙ （３，９ｍｎｏ
）ｌｃ ）を添加し、冨温で１時間攪拌しｆコ。反発後
生成した白色性ＩＲｆｆ−Ｆ別除去し、７戸液を減圧濃
縮して淡黄色粉床ｉ、ｉｇを得ｆこ。そのうら１！をク
ロロホルム１０ゴで再結晶し、白色結晶６５６〜（２，
８２ｍｒｎｏｌｅ ） ヲ（１１コ。ｌｉ’Ａ点、マ
ススペクトル、Ｎ ｂｔ ｉｔにより１的とするＮ］ｉ
ＩＡであることを確認しｆこ。
オキシトシン０．５ ｍｇ（０，５μ＋１）ｏｌｅ ）
を０．１ＭのΔａｃ１を含むＱ、 ｌ Ｍリン酸級衝Ｍ
（Ｐｌｉ ７．０ ）（以下「緩衝欣」という）ｌｆ
ｎｌ中に俗解し、Ｎ Ｍ Ｉ Ａ ｏ） ２０ ｍｙ／
ｌｄジ第４−サン浴液３５μｔ（ＮＲｌＡ ２．５ μ
Ｉｎａｌｅ ） ヲ加エテ、２５°Ｃ１５分間反応せし
めた。次いで反応液をセファデックス■Ｇ−１０（Ｌｏ
ａｎωＸ ２０ ｃｔｎ）のカラムによりゲル濾過を行
ない、未反応ＮＨＩＡを除去した。
を０．１ＭのΔａｃ１を含むＱ、 ｌ Ｍリン酸級衝Ｍ
（Ｐｌｉ ７．０ ）（以下「緩衝欣」という）ｌｆ
ｎｌ中に俗解し、Ｎ Ｍ Ｉ Ａ ｏ） ２０ ｍｙ／
ｌｄジ第４−サン浴液３５μｔ（ＮＲｌＡ ２．５ μ
Ｉｎａｌｅ ） ヲ加エテ、２５°Ｃ１５分間反応せし
めた。次いで反応液をセファデックス■Ｇ−１０（Ｌｏ
ａｎωＸ ２０ ｃｔｎ）のカラムによりゲル濾過を行
ない、未反応ＮＨＩＡを除去した。
分取液中のヨード基の定量は次の様に行なツｆｓ。スナ
ワち分取液ｏ、ｌ−に２−メルヵブ１・−１−タ） −
ルｉ Ｑ Ｑ ｎ＋ｕｏｌｅを加え、３７°Ｃ２時１４
ｊ反応ｗしめた後、未反応の２−メルカプト・エタノー
ルを４，４′−ジチオジピリジンによＬ） ＄滴定を行
なっｔコ。その結果分取液０．１ｍｉ中にＮ Ｍ Ｉ
Ａと反応した。オキシトシンが２７ｎｍｏｌｃ９Ｆｊ：
れでいることがわかっ１こ。
ワち分取液ｏ、ｌ−に２−メルヵブ１・−１−タ） −
ルｉ Ｑ Ｑ ｎ＋ｕｏｌｅを加え、３７°Ｃ２時１４
ｊ反応ｗしめた後、未反応の２−メルカプト・エタノー
ルを４，４′−ジチオジピリジンによＬ） ＄滴定を行
なっｔコ。その結果分取液０．１ｍｉ中にＮ Ｍ Ｉ
Ａと反応した。オキシトシンが２７ｎｍｏｌｃ９Ｆｊ：
れでいることがわかっ１こ。
Ｌ記分取１１Ｋ ０． ］、 ｍｌ ＋、β−Ｇａｌ
（７） ５ ｔａｇ／、、（１２，２Ｍ硫安溶液８０μ
！、（β−Ｇａｌ Ｑ、７４ ｎ１ｎｏｆ ）を緩衝液
で１．４−に希釈した溶液中に１丙下し、２８°Ｃで１
８時間反応せしめた。次いで反応ン佼をセファローズ”
６ Ｂ （２，４ｃｍ！２ｊＸ ８５ｃｌｎ）のカラト
によりゲル濾過を行なっＴこ。β−（）ａ１０弓）子星
にはＩｌｌ相当する画分を分取し、β−（ＪａＪの酵素
活性、オキシトシン特異抗体に対する結合率を以下の様
に〔７て測定した。
（７） ５ ｔａｇ／、、（１２，２Ｍ硫安溶液８０μ
！、（β−Ｇａｌ Ｑ、７４ ｎ１ｎｏｆ ）を緩衝液
で１．４−に希釈した溶液中に１丙下し、２８°Ｃで１
８時間反応せしめた。次いで反応ン佼をセファローズ”
６ Ｂ （２，４ｃｍ！２ｊＸ ８５ｃｌｎ）のカラト
によりゲル濾過を行なっＴこ。β−（）ａ１０弓）子星
にはＩｌｌ相当する画分を分取し、β−（ＪａＪの酵素
活性、オキシトシン特異抗体に対する結合率を以下の様
に〔７て測定した。
（２） β−由１の酵素活性の測定
−Ｆ記分取両分を緩衝液Ａ （０，０２Ｍ リン酸緩（
Ｊ［（ｐＨ７，０＞、０．１％” ＳＡｓ （１１，９
ｉ ＮａＮａ、ｌ ｍＭ ＭｙＵ／ｖ、Ｑ、 ｌ Ｍ
ｒ％１ｒＬＣ１−を含む）により１００倍に８釈し、試
験管にこの希釈液１００μｔと４−メチルウンベリフェ
リル−β−ガラクトシドの１．０Ｘ１０’Ｍの緩衝液Ａ
溶液１００μｔを加えて３７°Ｃ１時間反応後、ＰＨ１
０，４のグリシン緩衝液４−を添加して反応を停止した
。この液の螢光測定をＦＪ起波長８６５１ｍｍ 、螢光
波長４４８ ｎｍにて行なった。
Ｊ［（ｐＨ７，０＞、０．１％” ＳＡｓ （１１，９
ｉ ＮａＮａ、ｌ ｍＭ ＭｙＵ／ｖ、Ｑ、 ｌ Ｍ
ｒ％１ｒＬＣ１−を含む）により１００倍に８釈し、試
験管にこの希釈液１００μｔと４−メチルウンベリフェ
リル−β−ガラクトシドの１．０Ｘ１０’Ｍの緩衝液Ａ
溶液１００μｔを加えて３７°Ｃ１時間反応後、ＰＨ１
０，４のグリシン緩衝液４−を添加して反応を停止した
。この液の螢光測定をＦＪ起波長８６５１ｍｍ 、螢光
波長４４８ ｎｍにて行なった。
その結果、測定に十分な酵素活性を有することが確認さ
れた。
れた。
（３） オキシトシン特異抗体に対する結合率の測定
試験管に上記（２）と同様に分取分画を１００倍に希釈
した溶液１００μｔならびにオキシトシン測定用緩衝液
（０，０５Ｍ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，５）にＥＤＴＡ
−２Ｎａ ８７２１１９、オルソフェナンスロリン５１
１Ｑ、ＮａＮｇ １ ｆを加えて１ｔになるように調整
し、さらに０．１％ヒト血清アルブミンを添加する）６
００μｔ１および１％正常ウサギ血清を含むオキシトシ
ン測定用緩衝液にて９．０００倍に希釈した抗血清１０
０μｔを加え、４°Ｃで４８時間インキュｌ＼−シジン
を行なった。次いでオキシトシン測定用緩衝液にて３０
倍に希釈した抗つサギｒ−グロブリンヤギ血渭２００μ
ｔを加えて、４℃で２４時間インキュベーションした後
、４℃でａｏｏｏｒＷｌにて３０分間遠心分離し、上清
を捨てその沈澱に緩衝液Ａを２ｔｎ１．加えて、書び４
”Ｃで３０分間遠心分離（８０００ｒｐ＋ｎ ）しで
上清を捨て、緩衝液Ａを１００μを加えて、前項と同様
基質を加えてβ−Ｇａｌの酵素活性を測定した。分取分
画の酵素活性と抗体と結合した酵素活性の比から結合率
を求めた。
した溶液１００μｔならびにオキシトシン測定用緩衝液
（０，０５Ｍ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，５）にＥＤＴＡ
−２Ｎａ ８７２１１９、オルソフェナンスロリン５１
１Ｑ、ＮａＮｇ １ ｆを加えて１ｔになるように調整
し、さらに０．１％ヒト血清アルブミンを添加する）６
００μｔ１および１％正常ウサギ血清を含むオキシトシ
ン測定用緩衝液にて９．０００倍に希釈した抗血清１０
０μｔを加え、４°Ｃで４８時間インキュｌ＼−シジン
を行なった。次いでオキシトシン測定用緩衝液にて３０
倍に希釈した抗つサギｒ−グロブリンヤギ血渭２００μ
ｔを加えて、４℃で２４時間インキュベーションした後
、４℃でａｏｏｏｒＷｌにて３０分間遠心分離し、上清
を捨てその沈澱に緩衝液Ａを２ｔｎ１．加えて、書び４
”Ｃで３０分間遠心分離（８０００ｒｐ＋ｎ ）しで
上清を捨て、緩衝液Ａを１００μを加えて、前項と同様
基質を加えてβ−Ｇａｌの酵素活性を測定した。分取分
画の酵素活性と抗体と結合した酵素活性の比から結合率
を求めた。
その結果この分取分画は３０％の結合率を示し、β−Ｇ
ａｌ標識オキシトシンであることが確認された。
ａｌ標識オキシトシンであることが確認された。
実施例３ ５ＰＤＰを化学結合剤としたβ−Ｇａｚ標識
オキシトシンの製造 オキシトシン０．５＃ｖ（０，５μｍｏｌｅ ）を実施
例２と同様の緩衝液１−に溶解し、これにＩＪＩＪＪＰ
ＩＱ〜をエタノール１−に溶解した液７８ ｔｔｌ （
ｌ：ＩＰＤＰ ２，５μｔｎｏｌｅニ相当）を加え、２
８℃で３０分間反応後、セファデックス■Ｇ−１０（１
，０ｃｒｎＯＸ２０ｃｒｎ）カラムによりゲル口過し、
未反応Ｓ ＰＤＰを除去した。
オキシトシンの製造 オキシトシン０．５＃ｖ（０，５μｍｏｌｅ ）を実施
例２と同様の緩衝液１−に溶解し、これにＩＪＩＪＪＰ
ＩＱ〜をエタノール１−に溶解した液７８ ｔｔｌ （
ｌ：ＩＰＤＰ ２，５μｔｎｏｌｅニ相当）を加え、２
８℃で３０分間反応後、セファデックス■Ｇ−１０（１
，０ｃｒｎＯＸ２０ｃｒｎ）カラムによりゲル口過し、
未反応Ｓ ＰＤＰを除去した。
このゲル口過による分取液中に含まれる反応したオキシ
トシンの２−ピリジルジチオ基の定量を行なった。分取
液１ｒｎＩ！に２−メルカプトエタノールの５壓−緩衝
液溶液２−（１２８ｎｒｎｏｌｅ）を加え２０°Ｃで１
５分間反応後遊離したピリジン−２−チオン量を３４８
０ｒｌｌの吸収より測定しＴこ。その結果１ゴ中に２−
ピリジルジチオ基は６０．２ ｎｍｏｌｅ含まれていた
。
トシンの２−ピリジルジチオ基の定量を行なった。分取
液１ｒｎＩ！に２−メルカプトエタノールの５壓−緩衝
液溶液２−（１２８ｎｒｎｏｌｅ）を加え２０°Ｃで１
５分間反応後遊離したピリジン−２−チオン量を３４８
０ｒｌｌの吸収より測定しＴこ。その結果１ゴ中に２−
ピリジルジチオ基は６０．２ ｎｍｏｌｅ含まれていた
。
β−Ｇａｌ （１） ５ Ｑ／ｍｌ ２．２ Ｍ 、硫
安溶液８０μｔ（β−Ｇａｌ ｏ、 ７４ ｎｍｏｌｅ
ニ相当）を１ｄ（７）緩衝液で希釈した溶液中に、−
Ｆ配分取液０．５−□を滴下し、２３℃で２００時間反
応しめた。
安溶液８０μｔ（β−Ｇａｌ ｏ、 ７４ ｎｍｏｌｅ
ニ相当）を１ｄ（７）緩衝液で希釈した溶液中に、−
Ｆ配分取液０．５−□を滴下し、２３℃で２００時間反
応しめた。
反応後反応液をセファローズ■６Ｂ（２，４ｃＴｎに３
Ｘ ８５ ｃｍ ）カラムによりゲル濾過を行ない、
β−Ｇａｌの分子量にほぼ相当する分子量画分を分取し
、β−Ｇａｌの酵素活性、オキシトシン特異抗体に対す
る結合率を実施例２と同様の方法により測定した。
Ｘ ８５ ｃｍ ）カラムによりゲル濾過を行ない、
β−Ｇａｌの分子量にほぼ相当する分子量画分を分取し
、β−Ｇａｌの酵素活性、オキシトシン特異抗体に対す
る結合率を実施例２と同様の方法により測定した。
その結果、測定に十分な酵素活性を有することが確認さ
れ、結合率も３５％を示し、β−Ｇａｌ標識オキシトシ
ンであることが確認された。
れ、結合率も３５％を示し、β−Ｇａｌ標識オキシトシ
ンであることが確認された。
実施例４ オキシトシン測定用検量線の作成オキシトシ
ン標準溶液はオキシトシン測定用１ｍ 衝故に０．１％
ヒト血清アルブミンヲ加えた溶液にオキシトシンを溶解
して８〜１．０００μ口旧１・／−の濃度溶液を準備し
た。
ン標準溶液はオキシトシン測定用１ｍ 衝故に０．１％
ヒト血清アルブミンヲ加えた溶液にオキシトシンを溶解
して８〜１．０００μ口旧１・／−の濃度溶液を準備し
た。
試験管にオキシトシン標準溶液２００μｔならびに実施
例２の第３項で調整した希釈抗血清１００μｔおＪび血
漿４００μｔを加え４°Ｃで４８時間ブレインキュベー
ションを行なった。血漿は健常人男子の血液をヘパリン
化ジオキシドシン分解酵素阻害剤を入れた冷却試験管に
採取し、よく混和した後冷却遠心を行ない、血漿を分離
し５６℃で３０分間の非動化後、再度遠沈し上清を一２
０℃で凍結保存したものを用いた。
例２の第３項で調整した希釈抗血清１００μｔおＪび血
漿４００μｔを加え４°Ｃで４８時間ブレインキュベー
ションを行なった。血漿は健常人男子の血液をヘパリン
化ジオキシドシン分解酵素阻害剤を入れた冷却試験管に
採取し、よく混和した後冷却遠心を行ない、血漿を分離
し５６℃で３０分間の非動化後、再度遠沈し上清を一２
０℃で凍結保存したものを用いた。
ブレインキュベーション後、実施例２で得られたβ−Ｇ
ａｌ標識オキシトシン１００μｔを添加して４ ”Ｃで
１８時間インキュベーションを行ない、第２抗体（抗つ
サギγ−グロブリンヤギ血清）の３０倍希釈液２００μ
ｔを加えて、さらに４℃で２４時間インキュベージタン
を行なった。その後４°Ｃで３０分間遠心分ｌｌｔ （
８０００ｒｐｒｎ ） （、、上清を捨−ｃ、さらに緩
衝ｇＡ２−を加えて、上記と同様の遠心分離操作を行な
い、上清を捨てた後沈澱のβ−Ｇａｌの酵素活性を測定
また。
ａｌ標識オキシトシン１００μｔを添加して４ ”Ｃで
１８時間インキュベーションを行ない、第２抗体（抗つ
サギγ−グロブリンヤギ血清）の３０倍希釈液２００μ
ｔを加えて、さらに４℃で２４時間インキュベージタン
を行なった。その後４°Ｃで３０分間遠心分ｌｌｔ （
８０００ｒｐｒｎ ） （、、上清を捨−ｃ、さらに緩
衝ｇＡ２−を加えて、上記と同様の遠心分離操作を行な
い、上清を捨てた後沈澱のβ−Ｇａｌの酵素活性を測定
また。
β−〇ａｌの酵素活性測定は実施例２の第２項と同様の
方法で行なった。この測定の結果実施例２で得られたＮ
ＨＩＡを化学結合剤としたβ−Ｇａｌ標識オキシトシン
を用いた場合の検量線を図−１に示す。
方法で行なった。この測定の結果実施例２で得られたＮ
ＨＩＡを化学結合剤としたβ−Ｇａｌ標識オキシトシン
を用いた場合の検量線を図−１に示す。
実施例２で得られたβ−Ｇａｌ標識オキシトシンに替え
て、実施例８で得られたＳ ＰＤＰを化学結合剤とした
β−Ｇａｌオキシトシンを用いた場合にも同様の結果を
得たつその検量線を図−２に示す。
て、実施例８で得られたＳ ＰＤＰを化学結合剤とした
β−Ｇａｌオキシトシンを用いた場合にも同様の結果を
得たつその検量線を図−２に示す。
いずれの化学結合剤を用いた場合ともオキシトシン標準
溶液１６μｕｎ＋ｔ／＠／の測定が可能であり、この串
は４００μｌの血漿を用いた場合は８μｕｎ＋ｔ／ｍｌ
の測定が可能であることを示す。
溶液１６μｕｎ＋ｔ／＠／の測定が可能であり、この串
は４００μｌの血漿を用いた場合は８μｕｎ＋ｔ／ｍｌ
の測定が可能であることを示す。
参考例Ｉ ＭＢＳを化学結合剤としたβ−Ｇａｌ標識
オキシトシンによるオキシ］・シンの定量 オキシ１−シン０５η（０，５μｍｏ！ｅ）を実施例２
と同様の緩衝液１ ｍｌに溶解しＭＢＳの５ｊｎｆ ／
７！テトラヒドロフラン溶液３８μｔ（０，６μ＋ｕ
ｏｌｅ ）を加えて、３０°Ｃで８０分間反応を行なつ
ｆ４゜未反応ＭＢＢの除去には反応後の液をセフアデツ
クス”Ｇ −１０（１，Ｏｃｒｎ’Ｘ２０ｃｎｒ ）の
カラムを用いるゲル濾過法を行なった。
オキシトシンによるオキシ］・シンの定量 オキシ１−シン０５η（０，５μｍｏ！ｅ）を実施例２
と同様の緩衝液１ ｍｌに溶解しＭＢＳの５ｊｎｆ ／
７！テトラヒドロフラン溶液３８μｔ（０，６μ＋ｕ
ｏｌｅ ）を加えて、３０°Ｃで８０分間反応を行なつ
ｆ４゜未反応ＭＢＢの除去には反応後の液をセフアデツ
クス”Ｇ −１０（１，Ｏｃｒｎ’Ｘ２０ｃｎｒ ）の
カラムを用いるゲル濾過法を行なった。
精製［７た溶液中のＭ Ｂ ８と反応したオキシトシン
の定置は実施例３０条件と同様過剰の２の２−メルカプ
トエタノール量を４．４′−ジチオジピリジンにより求
めて行なった。
の定置は実施例３０条件と同様過剰の２の２−メルカプ
トエタノール量を４．４′−ジチオジピリジンにより求
めて行なった。
ｐ−ｔｉａＪト（ｙ）反応はβ−（ｙ＋ＩＩ Ｑ、７５
ｎｍｏｌｅに対しでΔＩＢＳと反応しｆこ万キシドシ
ンを５５ ｎ＋ｎｏｌｅ 、 ２８ｎ ＋ｎｏｌｅ
、 ５，６ｎ＋ｎｏｌｅ 、 ０．５５ ｎｍｏｌｅと
なる嵐を用いて実施例２と同様の方法でβ−（ｊ、ｈｌ
ａ識オキシトシンを合成し確認した。
ｎｍｏｌｅに対しでΔＩＢＳと反応しｆこ万キシドシ
ンを５５ ｎ＋ｎｏｌｅ 、 ２８ｎ ＋ｎｏｌｅ
、 ５，６ｎ＋ｎｏｌｅ 、 ０．５５ ｎｍｏｌｅと
なる嵐を用いて実施例２と同様の方法でβ−（ｊ、ｈｌ
ａ識オキシトシンを合成し確認した。
上記で得られたＡｔ １３ Ｈを化学結合剤として用い
１こ（１−ｕａｌ標蟲オキシトシンを用いて、実施例４
の方法でオキシトシンの定量を行なっｆこ。８！量線を
図３に示す。
１こ（１−ｕａｌ標蟲オキシトシンを用いて、実施例４
の方法でオキシトシンの定量を行なっｆこ。８！量線を
図３に示す。
未反応ＭＢδの除去法としで、ケル濾過法に替えて、反
応１．；故を凍結乾燥した後ア±トンで未反応ＭＢ８を
洗浄除去するアセトン洗浄法を行なっ１こ場合にもほぼ
同様の恢琶線が得られ、まｆこＭＢＳと反応しｒ： ＞
オキシトシンの使用斌を変えても同様の結果であった。
応１．；故を凍結乾燥した後ア±トンで未反応ＭＢ８を
洗浄除去するアセトン洗浄法を行なっ１こ場合にもほぼ
同様の恢琶線が得られ、まｆこＭＢＳと反応しｒ： ＞
オキシトシンの使用斌を変えても同様の結果であった。
いずれの場合にも、１０００μｕｎｉｔ／−でもわずか
な結合阻否をボずのみであっ１こ。
な結合阻否をボずのみであっ１こ。
標識副キットシンによるオキシトシン
の定量
ｂｌ、 ＩＳ Ｓの代ｔ） ニＣｉＬ Ｍ Ｏ） ０．
５ ’Ｑ／ｍｌ！、 ’） オキ？ン浴股を月」いた以
外は参考例１と同様の方法にでＣＩＬＭと反応し１゛こ
オキシトシン’：” ｊ’Ｊ 、ＪＪ肖ｃｔ！Ｉｔと同
様本反応Ｇ １１． Ｍの除去をゲル濾過ｌムに、Ｌり
行ない、β−１ｊａｌとの反届ならびに精製ケ行なっｆ
こ。
５ ’Ｑ／ｍｌ！、 ’） オキ？ン浴股を月」いた以
外は参考例１と同様の方法にでＣＩＬＭと反応し１゛こ
オキシトシン’：” ｊ’Ｊ 、ＪＪ肖ｃｔ！Ｉｔと同
様本反応Ｇ １１． Ｍの除去をゲル濾過ｌムに、Ｌり
行ない、β−１ｊａｌとの反届ならびに精製ケ行なっｆ
こ。
実弛例４と１１用様の方法によｔ）ＯｎＭｉを化学結合
剤こしたβ−（ｊａｌ標識オキントシンケ用いて到キン
トシー／の疋ｒを行なっ１こ。検量線−１？図４に示す
。
剤こしたβ−（ｊａｌ標識オキントシンケ用いて到キン
トシー／の疋ｒを行なっ１こ。検量線−１？図４に示す
。
本反応Ｃ１１Ｊ〜ｊ、の除去性として、ケルｉ濾過法に
（６Ｆえでアービトンｌ先浄法を行なった場合にもほぼ
同様の検量線かイりられ、またＣｌ１Ｍ反応オキシトシ
ンの使用量を貧化させた場合も同様であつ１こ。
（６Ｆえでアービトンｌ先浄法を行なった場合にもほぼ
同様の検量線かイりられ、またＣｌ１Ｍ反応オキシトシ
ンの使用量を貧化させた場合も同様であつ１こ。
いずれの場合にも、１０００μｍ１旧ｔ／ゴでもわすか
な結合阻害を４＼すのみで５＞っ１こ。
な結合阻害を４＼すのみで５＞っ１こ。
第１図は、ＮｆｌＩＡを化学結合剤としたβ−Ｇａｌ標
識オキシトシンを用いた場合のヒト血清存在下のオキシ
トシンの検量線を表わす。縦軸は結合率（％）を、横軸
はオキシトシン濃度（μＵ／−１対数目盛）を表わす。 第２〜第４図は、各々５ＰＤＰ 、 Ｍｎ２ 、 Ｃｆ
１Ｍを化学結合剤としたβ−Ｇａｌ標識オキシトシンを
用いた場合のヒト血清存在下のオキシトシンの検量線を
表わす。縦軸、横軸は第１図と同様である。 １０１００１０００ＡＡｕ／ｎ１１
識オキシトシンを用いた場合のヒト血清存在下のオキシ
トシンの検量線を表わす。縦軸は結合率（％）を、横軸
はオキシトシン濃度（μＵ／−１対数目盛）を表わす。 第２〜第４図は、各々５ＰＤＰ 、 Ｍｎ２ 、 Ｃｆ
１Ｍを化学結合剤としたβ−Ｇａｌ標識オキシトシンを
用いた場合のヒト血清存在下のオキシトシンの検量線を
表わす。縦軸、横軸は第１図と同様である。 １０１００１０００ＡＡｕ／ｎ１１
Claims (8)
- （１）一般式 で表わされる化学結合剤とオキシトシンを反応させた後
β−Ｄ−ガラクトシターセと結合させることを！待機と
するβ−Ｄ−ガラクトシターゼ標識標識オキシトンシン
造法。 - （２）蛋白のＩＨ基と反応してスルフィド結合を形成し
得る官能基がハロゲン原子である特許請求の範囲第１項
に記載の製造法。 - （３）ハロゲン原子がヨード原子である特許請求の範囲
第２項に記載の製造法。 - （４）蛋白のＳＨ基と反応してジスルフィド結合を形成
し得る官能基が一般式−Ｓ、−Ｚ（Ｚは隣りの硫黄原子
と共に活性ジスルフィド基を形成し得る基を表わす）で
表わされる活性ジスルフィド基であるＷｔ＋請求の範囲
第１項に記載の製造法。 - （５）ｚか２−ピリジルチオ基、４−ピリジルチオ基ま
１こは３−カルホキシー４−ニトロフェニルチオ基であ
る特許請求の範囲第４項に記載の製造法。 - （６） カルボキシル基の反応性＝＞Ｘ体が活性エス
テル体である特ｖ−＋：請求の範囲＠１項に記載の製造
法。 - （７） 活性エステル体がＮ−ヒドロキシサクシンイ
ミドエステルまたはｐ−ニトロフェノール乙 エステルである特許請求の範囲第÷項に記載の製造法。 - （８）一般式 Ｘ−Ａ−４ でｉわされる化学結合剤がＮ−サクシンイミシルヨード
アセテートまたはへ−サクシンイミジル８−（２−ピリ
ジルジチオ）プロピオネートである特許請求の範囲第１
項に記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8715783A JPS59211861A (ja) | 1983-05-17 | 1983-05-17 | オキシトシン測定用酵素標識オキシトシンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8715783A JPS59211861A (ja) | 1983-05-17 | 1983-05-17 | オキシトシン測定用酵素標識オキシトシンの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59211861A true JPS59211861A (ja) | 1984-11-30 |
Family
ID=13907150
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8715783A Pending JPS59211861A (ja) | 1983-05-17 | 1983-05-17 | オキシトシン測定用酵素標識オキシトシンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59211861A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016140063A1 (ja) * | 2015-03-04 | 2016-09-09 | 栄研化学株式会社 | オキシトシンの高感度測定法 |
| WO2020241812A1 (ja) * | 2019-05-31 | 2020-12-03 | 株式会社スカイシーファーマ | 抗オキシトシンモノクローナル抗体及び該抗体を含むキット |
-
1983
- 1983-05-17 JP JP8715783A patent/JPS59211861A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016140063A1 (ja) * | 2015-03-04 | 2016-09-09 | 栄研化学株式会社 | オキシトシンの高感度測定法 |
| JPWO2016140063A1 (ja) * | 2015-03-04 | 2017-12-14 | 栄研化学株式会社 | オキシトシンの高感度測定法 |
| WO2020241812A1 (ja) * | 2019-05-31 | 2020-12-03 | 株式会社スカイシーファーマ | 抗オキシトシンモノクローナル抗体及び該抗体を含むキット |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4896959B2 (ja) | ドキソルビシン免疫測定法 | |
| JPH07505714A (ja) | 流体試料中のチロキシンを検出・定量するための試薬および方法 | |
| JPS5836308B2 (ja) | 抗体の製造方法 | |
| EP0119767B1 (en) | Method of measuring ligands | |
| TANIMORI et al. | Enzyme immunoassay of neocarzinostatin using β-galactosidase as label | |
| Fujiwara et al. | Enzyme immunoassay for the quantification of mitomycin C using β-galactosidase as a label | |
| US7781570B2 (en) | Site-specific aminoglycoside derivatives for use in immunodiagnostic assays | |
| JPS63292061A (ja) | 完全無傷なプラコラーゲンペプチド（３型）およびプロコラーゲン（３型）の選択的な免疫学的測定法 | |
| JP2517561B2 (ja) | カテコ−ルエストロゲンのイムノアツセイキツド | |
| JPS59211861A (ja) | オキシトシン測定用酵素標識オキシトシンの製造法 | |
| JPS6210070A (ja) | ヒスタミン誘導体、免疫原接合体およびそれに対してレイズされた抗体 | |
| JP2968910B2 (ja) | １α，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３に対する抗体及びその用途 | |
| JP4663831B2 (ja) | モノクローナル抗体、細胞株及びｎ１，ｎ１２−ジアセチルスペルミンの測定法 | |
| JPS58149700A (ja) | ペルオキシダ−ゼ含有複合体，その製造法および試薬 | |
| CA2088974A1 (en) | Ddi immunoassays, derivatives, conjugates and antibodies | |
| JP3479453B2 (ja) | 尿中テガフールの測定法 | |
| Melick et al. | Assay of parathyroid hormone in disturbances of calcium metabolism | |
| JP3257568B2 (ja) | ヒトｎｏｓに結合する抗体およびヒトｎｏｓの免疫測定法 | |
| CN110724190A (zh) | 柚皮素抗原及其制备方法与应用 | |
| JPS6078919A (ja) | １７α―ヒドロキシプロゲステロンの測定用抗原 | |
| JPS60122372A (ja) | アクラルピシン定量用試薬 | |
| JPH0435710B2 (ja) | ||
| JPH0317300B2 (ja) | ||
| JP2003522537A (ja) | テルビナフィンに対する特異的モノクローナル抗体 | |
| JPH03144366A (ja) | 免疫測定法 |