JPS62119457A - 先天性副腎皮質過形成のマススクリ−ニング用診断薬キツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １１上血皿里且１ 本発明は、新生児の先天性副腎皮質過形成のマススクリ
ーニング用診断薬キットに関する。

更に詳しくは、血液中の１７α−ヒドロキシプロゲステ
ロン（１７−ＯＨＰ）およびコルチゾールの吊を酵素Ｉ
ａ識免疫定量法（ＥＬ　ＩＳＡ　：ｅｍｚｙｍｅｌｉｎ
ｋｅｄ　ｉｌＩｌｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔ　ａｓｓａｙ
　）を用いて測定することにより、極めて多数の新生児
から先人性ｎ１腎皮質過形成患児のみを迅速かつ容易に
検出することのできるマススクリーニング用診断薬キッ
トに係る。

え夏立且韮 先天性副腎皮質過形成は、副腎皮質にＪ３けるステロイ
ド生合成の障害により、内外性器に異常を示す病態であ
って、小児に認められる副腎性器症候群の最も普遍的〈
頻度９０％以上）なものである。

元来、副腎皮質ホルモンは、共通の前駆体であるコレス
テロールから一定の生合成経路を経て生合成される（＋
）　１７α−ヒドロキシプロゲスゾロン（以下１７−　
ＯＨＰと略す、式［Ｉ］で表わされる）や］ルチゾール
（式（１１で表わされる）等のグルココルチコイド系お
よび（２）テストステロンに代表される男性ホルモンで
あるアンドロゲン系および（３）アルドステロンに代表
される鉱質コルチコイド系の３つに大別され、いずれも
脳下垂体から放出されるＡＣＴＨ（Ｉｌｌ腎皮質刺激ホ
ルモン）に支配されている。

ところが、先天性副腎皮質過形成では、先天的に副腎皮
質におけるステロイド２１−ヒドロキシラーゼ、ステロ
イド１１β−ヒドロキシラーゼ等が欠損するために、１
７−　ＯＨＰからコルチゾールへの生成が阻害され、そ
の結果ＡＣＴＨの代償的増加が起こり、アンドロゲン系
の分泌が増加する。さらにアルドステロン分泌低下があ
る。

その結果、電解質異常と副腎性男性ステロイド過剰生成
による外性器異常がひきおこされる。まず、２１−ヒド
ロキシラービ欠損症による本店の軽症のものは単純な男
性化促進を示し、高度のものは食塩喪失を合併する。１
１β−ヒドロキシラーゼ欠損を示すものは男性化促進の
他に高血圧を伴うものが多い。女児の場合には、外生殖
器異常という形で男性化がおこる。従って、これを放置
ずれば将来的に思春期早発症及び不妊の原因となる。

また、新生児期に本店の適切な診断・治療がなげれば生
命の危険におちいる場合がある。このため、該先天異常
を新生児期に早期に発見し、早期に適切な治療処置を施
さなければならない。

従来、この先天性副腎皮質過形成は次のような試薬およ
び方法により診断されてきた。

まず、　１」或いは１２５■をトレーサーとして用いる
放（ト）性同位元素免疫定吊法（Ｒ１へ法）を挙げるこ
とができる。

しかしながら、上記ＲＩＡ法は、アイソトープの取扱い
に特別の安全対策を講じなければならないため、施設の
ない所では使用できず、測定に複雑で高価な特別の装置
を必要とし、また肉眼判定ができない等の欠点を有して
いる。またラジオアイソトープを使用するため試薬は極
めて高１＋ｆｆｉである。従って毎年我国に出生する１
３０〜１ｂＯ万人という多数の新生児に対してこの方法
でマススクリーニングを実施することは困難である。

それ故、ラジオアイソトープを使用しない測定法の開発
が強く望まれてきた。この目的のため、荒用らにより酵
素免疫測定法（ＥＩＡ法）が開発された。該ＥＩＡ法は
、濾紙血液に、抗１７−　ＯＨＰ−３−〇Ｍ○−ＢＳＡ
家兎血消を第１抗体とし、山羊抗家兎ＩｇＧ血清−Ｉｇ
Ｇフラクシ」ンをポリアセタールビーズに吸着さけたも
のを第２抗体固相化ビーズとして用いて反応ざ往、新生
児濾紙血液中の１７−　ＯＨＰを測定する方法である。

しかしながら、上記ＥＩＡ法は、１検休ごとに試験管中
で操作を行う必要があり、また蛍光色素を標識化合物と
して用いるため、蛍光色素を励起し、観察するための特
別な装置が必要となる。従って大量の検体を処理するに
は必ずしも適した方法とは言えない。また現在前られる
抗１７−０ＨＰ抗体（市販および自家作成抗体とも）は
、その特異性が充分でなく、水溶性ステロイド（例えば
、１７−０１＋プロゲステロン硫酸塩）と交着するため
、上記直接法によるＥＩＡ法の他に、濾紙血液をジ工チ
ルエーテル等の有機溶媒で抽出して用いることによって
ノイズを軽減する抽出法によるＥＩＡ法も開発されてい
る。しかし、大間の有ｎｒａ媒を使用する上記方法は、
有機溶媒の廃棄処理問題および測定者の健庫に及ぼす問
題等の新たな問題を生じることとなった。

更に、新生児に対して水痘のマススクリーニングを行な
う際、未熟児、ストレス、低出生体重児合併症をもった
満１［１産児などで１７−　ＯＨプロゲステロン値が直
接法および抽出法によるＥＩＡ法を用いても高くなり、
木症患児と区別できない場合のあることが明らかとなっ
た。

１が　１　べ−１１ 以上詳しく説明したように、従来の先天性副腎皮質過形
成マススクリーニングの試薬および方法は各々解決すべ
き固有の欠点を有している。

そこで本発明の目的も、多数の新生児の中から先天性副
腎皮質過形成患児のみを安全、迅速、容易且つ特異的に
検出しうるマススクリーニング用の試薬を提供すること
にある。

口１゛　を　°ｌするための一 本発明者は、上記した問題を解決すべく種々研究、検討
した結果、濾紙血液中の１７−ＯＨＰ−ＩＰおよびコル
チゾールの両方の値を酵素標識免疫定量法（以下ＥＬＩ
ＳＡと略す）を用いて測定することによって上記問題を
解決できることを発見し、かかる新知見に基いて本発明
を完成さヒたものであ−る。

即ち、本発明の先天性副腎皮質過形成のマススクリーニ
ング用診断薬キットは、 （ａ）　　抗１７−０ＨＰ−ＢＳＡ家兎面清からなル１
７−０ＨＰ測定用第１抗体； （ｂ）　　抗コルチゾール−ＢＳＡ家兎血清からなるコ
ルチゾール測定用第１抗 （Ｃ）　　マイクロタイタープレートの穴の内壁面上に
同相化された山羊抗家兎ＩｇＧ血清−１０Ｇフラクシヨ
ンからなる共通第２抗体＝（ｄ）　　酵素標識１７−Ｏ
ＨＰ；（ ｅ）　　酵素標識コルチゾール；（ ｆ）　　酵素反応基質； （（Ｊ）　　酵素反応停止液； からなることを特徴とする。

本発明で１７−　０ｆ−Ｉ　Ｐ測定用第１抗体として使
用される抗１７−　Ｏ　Ｈ　Ｐ　−　［３　ＳＡ家兎血
清は常法により１７−ＯＨＰ−ＩＰ−８３△を家兎に免
疫して作製できる。また、この抗体はＨｅｄｉｃｉｎｓ
ｋ社及び他の会社からも市販されている。

本発明でコルチゾール測定用第１抗 用される抗コルチゾール−ＢＳΔ家兎血清は常法により
コルチゾール−ＢＳＡを家兎に免疫して作製できる。ま
た、本発明で共通第２抗体として使用される山羊抗家兎
Ｉ（ＩＧ血清−ＩｇＧフラクションはＨｉｌｓｅ社から
市販されている。

本発明の試薬キットで使用する酵素標識１７−０１−Ｉ
　Ｐおよび酵素標識コルチゾールは、１７−ＯＨＰ−（
Ｐ若しくはコルチゾールを標識酵素と反応させることに
よって調整することができる。標識酵素にはアルカリ性
ホフファターゼ（ＡＰ）や西洋ワ勺ビバーオキシダーゼ
（）−ＩＲＰ）を用いることができ、特に）４ＲＰが好
ましい。

具体的には１７−　Ｏ　Ｈ　Ｐ−１−Ｉ　Ｒ　Ｐ結合体
およびコルチゾール−Ｈ　Ｒ　Ｐ結合体は飛出らがＣｈ
ｅｎ＋。

Ｐｈａｒｍ　、Ｂｕｌｌ，　、　３１　：　２７２４，
　１９８３に報告した方法に準じて、混合酸無水物法で
調整できる。

山羊抗家兎ＩｇＧ血清−１９Ｇフラクションのマイクロ
タイタープレートへの固相化は例えば、次のようにして
行なわれる。抗家兎ＩｇＧ山羊血２１ＩｇＧフラクシ１
ンを９６穴（ウェル）のマイクロタイタープレートに１
００μ吏分注し、空温で２日問放置後、０．０５　Ｍリ
ン酸緩衝液（Ｐｕｓ）で洗浄し、さらにＰＢＳに０．１
％ＢＳＡ添加溶液３００μ髪を分注し、１日間放置後、
ＰＢＳ−ＢＳＡを除去して乾燥させ、使用時まで４℃で
保存する。

本発明の試薬キットを用いて、マススクリーニングを行
うには、上記共通第２抗体を固相化したマイクロタイタ
ープレートの各ウェルに血液検体が含浸された濾紙ディ
スクを入れ、希釈した上記１７−　Ｏ　Ｈ　Ｐ抗体オヨ
ヒ希釈下り，　タ記１７−　Ｏ　ｉｎ　Ｐ　−ＨＲＰ結
合体を加え′Ｃ室温で２〜２４時間インキュベートする
。その後、各ウェルを生理食塩水で洗浄し、酵素反応基
質を加えて、２５℃で３０〜６０分間インキュベートし
た侵、酵素反応停止薬を加えて反応を停止する。しかる
後、マイクロエライザ自動読み取り機等を用いて比色定
損を行う。かくして、血液中の１７−　ＯＨＰの量を定
量的に測定することができる。

次いでコルチゾールの定量を行う。］ルルチールの定■
を行うには、共通第２抗体を固相化した新たなマイクロ
プレート中に血液検体が含浸された濾紙ディスクを入れ
、希釈したコルチゾール抗体およびコルチゾール−ＨＲ
Ｐ結合体を加えて、以下の手順は１７−０　）Ｉ　Ｐの
場合と全く同様にして比色定量する。

本発明の試薬キットで用いることのできる酵素反応基質
としてはｐ−ニトロフェニルリン酸（標識酵素としてＡ
Ｐを用いた場合）や、Ｈ２Ｏ２Ｊ３よびこれにより酸化
されるＯ−フェニレンジアミンく標識酵素としてＨＲＰ
を用いた場合）を挙げることができる。

また、酵素反応停止薬としては、Ｎａ　ＯＨ（ｔｌ質と
して上記ｐ−ニトロフ１ニルリン酸を使用した場合）或
いはＨ２８Ｏ４（Ｉ質にトｈｏ２および０−フェニレン
ジアミンを使用した場合）を用いることができる。ＨＲ
１１標識抗体を使用する本発明の好ましい態様では、基
質としてＨ２０２およびＯ−フェニレンジアミンを用い
、１７−０ＨＰの場合には３０分間、コルチゾールの場
合には６０分間インギュベートして反応させ、３Ｎ−１
−１２８０４で反応を停止して、４９０１−で比色定量
する。

１−」 本発明のキットによれば、従来のＥＩＡ法に比べで、全
過程を通し、試験管等の副容器を必要とせず、安価なマ
イクロタイタープレート（９６穴）を用い一度に多ｍの
検体を分析しうる利点を有する。また、操作も橿めて簡
単であり、経汎性にすぐれている。従来の第２抗体同相
化ビーズを用いるＥｌＡ法では、その酵素活性の測定に
蛍光及び化学発光法が用いられており、高価な測定機器
を必要とづるが、本発明のキットを用いれば、巾なる比
色法なので安価な測定機器で行うことができる。。

また、抽出法によるＥＴＡ法のように有償溶媒を使用し
ないので、多量の検体を分析しても測定筒の１ｌｌＩＦ
１１・を害することもなく安全である。上記各種の利点
は、既述したＲｆＡ法の欠点をも同時に解決することが
できるしのぐある。

更に、従来の１７−　ＯＨＰ値のみを測定するマススク
リーニング法では、先天性の１腎皮質過形成児と、未熟
児、ストレス等によるｇ１７−０８１１児との区別をで
きない場合があったが、本発明の試薬キラ１〜を用いて
、１７−０ＨＰ値のみでなくコルチゾール値も同時に測
定することによって本問題を解決することができる。即
ち、先天性副腎皮質過形成児は１７−０ＨＰ値が非常に
高いのにコルチゾール値がこれに対応した高い値を示さ
く１い。一方、低出生体重児は、１７−ＯＨＰ−ＩＰ値
が高い場合にはコルチゾール値もこれに対応して高くな
る。従って１７−０ＨＰ／Ｄルヂゾールを算出すること
によって両者を区別することが可能となる。

以下、実施例をあげて本発明を更に詳細に説明する。し
かし、下記の実施例は本発明の範囲を限定するものでは
ない。

（ａ）１７−ＯＨＰ抗体：　１７−ＯＨ１７−０ＨＰ−
３０八を家兎に免疫して調製した。得られる抗１７−Ｏ
ＨＰ１７−０ＨＰ−３０家兎血清を使用時１０万倍に希
釈する。

（ｂ）　　フルヂゾール抗体ニコルデシールー６ＣＭＯ
−ＢＳ八を家兎に免疫して調製した。（）ノられる抗コ
ルデシールー６ＣＭＯ−ＢＳＡ家兎血清を使用時４万（
８に希釈する。

（Ｃ）　　共通第２抗体：抗家兎１！ＩＧ山羊血清ｒａ
　Ｇ７５クシ、＋ン（６，ｃｚ９Ａｂ　／ｄＰ１３ｓ）
０．１ｍｌを各つＪル（９６穴／プレート）に分注し、
２５℃で２日間放置した。その後、０．０５Ｍ　　ＰＢ
Ｓで各ウェルを３回洗浄し、０．１％ＢＳＡＪ”５，１
：ヒ０．０５　Ｍ　　ＰＢＳかうなルＦ１ＭＯ９３ｄを
各ウェルに分注し、４℃で１日間放置した。０．１％Ｂ
Ｓ△およびｏ、ｏｓＭ　　ＰＢＳを除去し乾燥させ、４
℃で保存した。

（ｄ）１７−ＯＨＰ−ＨＲＰ結合体：１７１７−０ｆ−
ＩＰ−３０と西洋ワザビベルオギシダーゼを混合酸無水
物法で調製した。

（ｅ）　　コルデシ−ルー１−Ｉ　ＲＰ結合体ニコルデ
シ−ルー３０Ｍ０と西洋ワサビベルオキシダーピを混合
酸無水物法で調製した。

け）酵素反応基質：　　０．０３％Ｈ２０２および１７
−ＯＨＰ測測定対して０．０２５％フェニレンジアミン
を、そして、コルチゾール測定に対しては０．０５％フ
ェニレンジアミンの０．１％クエン酸緩衝液（ｐＨ４，
５）を使用時笠間混合してその０．１５ａｔを使用した
。

（ｇ）　　停止液：３Ｎ硫酸を使用した。

測定手順：以下の手順で１７−　ＯＨＰおよびコルチゾ
ールを測定した。

なお測定にはＩｍｍｕｎｏ　Ｒｅａｄｅｒ　ＮＪ２０Ｇ
　　（Ｉｎｔｅｒｍｅｄ社）を使用した。

（１）　　１７−０ＨＰの測定 抗原抗体反応 （２）］ルヂゾールの測定 抗原抗体反応 旌−呈 （ｉ）　　測定感度：３ｍディスク１枚で１７−０ＨＩ
）は（１，５ｎｏ／ｄ　（血液）、コルチゾールは１０
ｎｇ／ｌｉｔ＜血液）まで測定可能であった。

（ｉｉ）再現性：１７−０ＨＰ、コルチゾールとも測定
内変動係数は７．７〜１０．６％、測定量変動係数は８
．２〜１３．０％と良好な再現性を示した。

（ｉｉｉ　）第２抗体固相化ビーズを用いる蛍光法ＥＩ
Ａとの相関：１７−０ＨＰはｒ＝　０．９６４、コルチ
ゾールはｒ＝ｏ、９５９ど、共に良好な相関を示し、本
発明の試薬キットが十分測定に使用しつることが証明さ
れた。

（ｉｖ）正常児、低出生体重児、先天性ＷＩＩ腎皮質過
形成児の識別： 正常児１４９２例、抵出生体ｍ児９１例、先天性副腎皮
質過形成疑陽性児１４例および先天性副腎皮質過形成確
定児６例に対して、本発明の試薬キットを用いて１７−
　ＯＨＰおよびコルチゾールの吊を測定した結果を以下
の第１表に示す。

第１表から明らかなように、１７−　ＯＨＰとコルチゾ
ールの比（１７−ＯＨＰ／コルチゾール）は先天性副腎
皮質過形成確定例の群が際立って高くなっており、他の
群と明確に区別をすることができた。

１川」ど１里 以上詳しく説明したように、本発明の先天性副腎皮質過
形成のマススクリーニング用診断薬キットを使用するこ
とによって、多数の新生児から先天性副腎皮質過形成患
児のみを安全、迅速且つ容易に検出することが可能とな
った。特に本発明では９６穴のマイクロタイタープレー
トに第２抗体を固定させて一度に多くの検体を測定でき
る。これは毎年我国において出生する１３０〜１５０万
人という多数の新生児に対して本庁のマススクリーニン
グを行うためには極めて優れたキットであるといえる。

（外５名）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）抗１７−ＯＨＰ−ＢＳＡ家兎血清からなる
   １７−ＯＨＰ測定用第１抗体； （ｂ）抗コルチゾール−ＢＳＡ家兎血清からなるコルチ
   ゾール測定用第１抗体； （ｃ）マイクロタイタープレートの穴の内壁面上に固相
   化された山羊抗家兎ＩｇＧ血清− ＩｇＧフラクションからなる共通第２抗体；（ｄ）酵素
   標識１７−ＯＨＰ； （ｅ）酵素標識コルチゾール； （ｆ）酵素反応基質； （ｇ）酵素反応停止液； からなる先天性副腎皮質過形成のマススクリーニング用
   診断薬キット。
2. （２）酵素標識１７−ＯＨＰが１７−ＯＨＰ−ＨＲＰ結
   合体である特許請求の範囲第１項記載のキット。
3. （３）酵素標識コルチゾールがコルチゾール−ＨＲＰ結
   合体である特許請求の範囲第１項または第２項記載のキ
   ット。
4. （４）酵素反応基質がＨ＿２Ｏ＿２およびｏ−フェニレ
   ンジアミンである特許請求の範囲第１項〜第３項のいず
   れか１項に記載のキット。
5. （５）酵素反応停止液が希硫酸である特許請求の範囲第
   １項〜第４項のいずれか１項に記載のキット。