JP3640970B2 - 競合イムノアッセイによるステロイドの測定 - Google Patents
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Description
発明の背景
1.発明の分野
本発明は、生物体液中のステロイドの検出と測定に係わり、更に特に、競合イムノアッセイによるステロイドの検出と測定に係わる。
2.従来技術の説明
生物体液中のステロイドの検出と測定は様々な理由から重要である。例えば、内分泌異常の発生の診断を補助するために、ホルモン補充療法で必要とされるホルモン量を監視するために、又は、受胎能を調べるために、生物体液中の特定のステロイドの量を使用することが可能である。生物体液中のステロイドの存在と量の判定を競合診断アッセイによって行うことが可能である。低分子競合診断アッセイでは、結合可能な抗体部位に対する結合において被検体（analyte）と競合することが可能な標識成分が必要である。標識成分の例は、放射性トレーサー、発蛍光団／ハプテン結合体、及び、酵素／ハプテン結合体を含む。典型的には、こうした標識成分は、標識に結合された被検体又は被検体類似体から成る。典型的には標識成分を結合体（conjugate）と呼ぶ。
エストラジオール（1,3,5（10）−エストラトリエン−3,17α−ジオール）が被検体であり、その検出と測定が受胎能検査の分野で極めて重要である。エストラジオールは卵巣と胎盤とによって分泌される。卵巣及び胎盤の包膜細胞と顆粒膜細胞との中におけるアンドロゲンの芳香族化によって、エストラジオールが合成される。この芳香族化はフォリトロピン（FSH）によって促進される。エストラジオール合成は、一方では、アンドロゲン前躯体の合成に必要なルトロピン（LH）受容体の産生を促進する。
エストラジオールは、妊娠中における女性への性分化、思春期における性的発達、及び、月経周期の調節にとって重要である。月経周期は、性腺刺激ホルモン（すなわちゴナドトロピン）放出ホルモン（GnRH）、LH、FSH、及び、卵巣ステロイド（エストラジオールとプロゲステロン）の周期的放出を調節する、中枢神経系、視床下部、下垂体、卵巣、及び、子宮内膜を機能的特徴の精確な同調の結果である。エストラジオールは、ゴナドトロピンの放出の促進と阻害の両方に関与し、正のフィードバックと負のフィードバックの両方を及ぼす。卵胞期の初期においては、包膜細胞及び顆粒膜細胞からのエストラジオールの卵巣分泌は多くはない。卵胞期の途上では、エストラジオールは子宮内膜の発達を促進する（月経後の子宮内膜を修復する）。周期中期に向かって、LH産生が増大し、その結果、発達した卵胞の破裂によって卵細胞の放出が生じる。排卵後には、エストラジオール分泌が僅かに減少する。黄体期中は、エストラジオールがプロゲステロンと共に黄体から分泌され、子宮内膜の発達を更に促進する。卵細胞が受精させられない場合には、エストラジオールとプロゲステロンが更に減少する。このエストラジオールとプロゲステロンの減少が月経を開始させる。
エストラジオールの測定は、正常な性的発達（初経）、不妊症の原因（無排卵、無月経、月経困難症）、及び、月経閉止の判定に関して重要である。正常なエストラジオール濃度は、月経と初期卵胞期とにおいて最小である（25−75pg/mL）。エストラジオール濃度は、後期卵胞期において上昇して200−600pg/mLのピークに達し、その直後にLHの急増が排卵を開始させる。LHがビークに達すると、エストラジオール濃度が低下し始め、その後で、黄体期中に再び上昇する（100−300pg/mL）。受胎が起こらない場合には、更にエストラジオール濃度がその最小値に低下し、それによって月経を開始させる。受胎が生じた場合には、エストラジオール濃度が上昇し続け、第１のトリメスター（trimester）中に１−5ng/mLの濃度に達し、第２のトリメスター中に５−15ng/mLの濃度に達し、第３のトリメスター中に10−40ng/mLに達する。月経閉止期中はエストラジオール濃度は低いままである。
血清中のエストラジオール濃度を測定する方法には様々なものがある。しかし、こうした方法の多くは放射性元素を標識として使用し、幾つかの欠点を有する。こうした方法の中の幾つかが米国特許第5,342,760号（カラム１の54行からカラム３の30行）に開示されており、本明細書に参考として組み入れる。米国特許第5,342,760号は、競合イムノアッセイによるエストラジオールの測定のための有効な方法を開示し請求している。しかし、この特許で請求される方法は、限られた数の抗体に関してだけ有効であるにすぎない。
プロゲステロン（４−プレグネン−3,20−ジオン）が被検体であり、その検出と測定は、排卵の発生、受胎、妊娠中絶の危険性、又は、子宮外妊娠を判定する分野で極めて重要である。
最初に、ミトコンドリア内で、シトクロムＰ−450酵素依存性側鎖切断とヒドロキシル化とによってコレステロールがプレグネノロンに変換される。その後で、３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ酵素とイソメラーゼ酵素（３β−HSD）とが触媒する反応によって、プレグネノロンがプロゲステロンに変換される。プロゲステロンは正常に月経がある女性では卵巣の黄体によって主として産生されるが、より少ない量ではあるが、副腎皮質でも産生される。妊娠約６週間の時点で、プロゲステロンは主に胎盤によって産生されるようになる。血液循環中に、約97％から約98％のプロゲステロンがアルブミン又はコーチゾール結合タンパク質に結合する。プロゲステロンは、主として肝臓内で、プレグナンジオールとその水溶性硫酸塩、及び、グルクロニド誘導体に代謝され、尿中に排出される。
プロゲステロンの主要な機能な、着床と妊娠維持のために子宮を準備することにある。卵胞期中は、プロゲステロン濃度は低い（0.2−1.5ng/mL）ままである。LHの急激な増量と排卵の後に、破裂した卵胞内の黄体細胞がLHに反応してプロゲステロンを産生する。黄体期中は、排卵の５日後から７日後までにプロゲステロン濃度が10−20ng/mLの最大値に急激に上昇する。妊娠が生じない場合には、黄体の退行のために月経周期の最後の４日間の間にプロゲステロン濃度が低下する。
妊娠が起こる場合には、プロゲステロン濃度が、第６週目まで、黄体によって中黄体期の濃度に維持される。この時点では、胎盤がプロゲステロンの主たる供給源となり、プロゲステロン濃度は第１のトリメスターの約10−50ng/mLから第３のトリメスターの約50−280ng/mLまで上昇する。
血清プロゲステロンは、その濃度の急激な上昇が排卵後に生じるので、自然排卵又は誘発排卵の確実な指標である。無排卵を含む排卵異常は比較的頻繁に生じ、患者の約15％から約20％において不妊症の原因となっている。こうした患者では、中黄体期のプロゲステロン濃度が異常に低い。
黄体期欠損は、不妊症と自然流産とに関連した生殖障害である。この黄体期欠損は不妊女性の10％で生じると考えられている。この障害に関連した不妊症と妊娠消失は、子宮内膜の不適切な成熟と発達とに起因すると考えられている。こうした子宮内膜の欠陥は、黄体によるプロゲステロン産生が不十分であることを原因とする可能性があると考えれている。黄体期欠損の女性では、黄体期における血清プロゲステロン濃度が正常な濃度よりも低い。
妊娠期間の最初の10週間内におけるプロゲステロンの測定が、切迫流産と子宮外妊娠の患者に関する確実な予測手段であり且つ有効な診断及び治療手段であることが実証されている。検出可能な量のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（hCG）の存在下でのプロゲステロン濃度の低下（10−15ng/mL）は、妊娠年齢に無関係に、切迫流産又は子宮外妊娠を高い精度で示唆する。
典型的な生理学的濃度（ng/mL）は次の通りである。
女性：
通常周期
卵胞期 0.5
排卵期 0.5−1.5
黄体期 4.0−20.0
その他：
思春期前 0.2−0.5
閉経後 0.5
妊娠 40−200
男性：
思春期前 0.25
成人 0.25
標識成分に対する被検体の適切な親和性を有し、且つ、例えばエストラジオールやプロゲステロンのようなステロイドに関する競合イムノアッセイにおいてその抗体を有効に使用することを可能なものにする特異性を有する抗体を得ることが、困難であることが既に判明している。抗体の供給源はその数において限られており、従って、入手不可能であるか、又は、過剰に高いコストとなる。競合アッセイで有限数の抗体のいずれかを使用することは、不適切な用量反応に帰結し、従って、感度の低さ、精度の低さ、又は、感度と精度の両方の低さをもたらす。これに加えて、被検体に対する適切な親和性を示す抗体を開発することが可能である場合でさえ、こうした抗体の多くは、構造的に類似したステロイドに対する高い交差反応性という望ましくない属性を有する可能性がある。臨床的に有用であるが測定が困難である50pg/mL未満のエストラジオール濃度と1ng/mL未満のプロゲステロン濃度とを検出することが可能な競合イムノアッセイ法を提供することが望ましいだろう。
ある特定のステロイドに関する高感度のアッセイ法を開発する上で特定の抗ステロイド抗体／標識成分対が有効であるかどうかは、その用量反応曲線の情報によって評価することが可能である。ステロイドアッセイに関する用量反応曲線は、「ステロイド被検体の存在下での反応発生速度」対「ステロイド被検体の不在下での反応発生速度」の比を、ステロイド被検体の濃度の関数としてプロットした曲線である。ある特定のステロイドアッセイに関する用量反応曲線は、使用する各々の抗体／標識成分の組合せに特有であり、抗体被検体と標識成分との間の競合によって変化し得る。従って、抗ステロイド抗体／標識成分／ステロイド被検体の組合せのいずれにおいても、相対的に急勾配の用量反応曲線は、その特定の組合せが臨床的に有効なアッセイをもたらす可能性がより一層高いことを示す。
発明の要約
本発明は、競合イムノアッセイ、好ましくは競合酵素イムノアッセイによってステロイドの測定を行うための方法とキットを提供する。本発明の方法とキットは、標識に結合したステロイド類似体の使用を含む。本発明の方法とキットのよる検出に適したステロイドは、エストラジオールとプロゲステロンを含む。
本発明の方法は、
（ａ）所定のステロイドを含むと推測される試験試料と、上記ステロイドに対して特異的な抗体を結合した固相と、上記ステロイドの類似体の結合体との混合物をインキュベートし、上記固相上にステロイド／抗体複合体と結合体／抗体複合体とを形成する段階、
（ｂ）上記混合物から上記固相を分離する段階、
（ｃ）上記混合物中に存在する又は上記固相上に存在する標識の量を測定する段階、及び、
（ｄ）標識の量から上記試料中のステロイドの量を決定する段階、
を含む。
本発明のキットは、ステロイドに対して特異的な抗体を結合した固相と、そのステロイドの類似体の結合体とを含む。
本発明での使用に適したステロイド類似体を、次の構造式で表すことが可能であり、
前記式中、
R1が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R2が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R3が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R4が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R5が、アルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）、又はOHを表し、
Ｌが、標識基を表し、
但し、16位の炭素原子が、酸素原子によって16位の炭素原子に結合する２個の置換基を含まず、且つ、17位の炭素原子が、酸素原子によって17位の炭素原子に結合する２個の置換基を含まない。
本発明での使用に適した別のステロイド類似体を、次の構造式で表すことが可能であり、
前記式中、
R6が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R7が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R8が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R9が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
Ｌが、標識基を表し、
但し、16位の炭素原子が、酸素原子によって16位の炭素原子に結合する２個の置換基を含まず、且つ、17位の炭素原子が、酸素原子によって17位の炭素原子に結合する２個の置換基を含まない。
本発明での使用に適した別のステロイド類似体を、次の構造式で表すことが可能であり、
前記式中、
R10が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R11が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R12が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R13が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
Ｌが、標識基を表し、
但し、16位の炭素原子が、酸素原子によって16位の炭素原子に結合する２個の置換基を含まず、且つ、17位の炭素原子が、酸素原子によって17位の炭素原子に結合する２個の置換基を含まない。
上記式1a、1b及び1cでは、
は、特定の環又は特定の基に結合しているものとして表されている。しかし、この標識基は、結合が可能である限り、あらゆる位置で上記化合物に結合可能であることを理解されたい。こうした結合可能位置は当業者に公知である。
式1aに関する好ましい置換基は、R1のＨ、R2のOH、R3のＨ、R4のＨ、且つ、R5のOH、又は、R1のOH、R2の−Ｃ≡CH、R3のＨ、R4のＨ、且つ、R5のOHを含む。式1bに関する好ましい置換基は、R6の−CH（OH）CH3、R7のＨ、R8のＨ、且つ、R9のＨを含む。式1cに関する好ましい置換基は、R10のOH、R11のＨ、R12のＨ、且つ、R13のＨを含む。
本発明の主要な利点は、従来のアッセイ方式で使用する場合に得られる、即ち上記結合体のステロイド部分が被検体と同一の化学構造である場合に得られる、抗体の性能に比べて、所与の抗体の性能が向上可能なことである。本発明によって、その結合体のステロイド部分の置換基が異なっているか、又は、標識の位置が異なっているか、又は、結合体のステロイド部分の置換基と標識の位置の両方が異なっている場合、結合体の形で被検体の類似体を使用する競合イムノアッセイにおいて、従来は使用不可能であった抗体、即ち不適切な用量反応曲線をもたらす抗体を、有効に使用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
図１は、抗エストラジオール抗体と様々なエストロゲン−アルカリ性ホスファターゼ結合体の用量反応曲線を示すグラフである。
図２は、抗エストラジオール抗体と様々なステロイド−アルカリ性ホスファターゼ結合体の用量反応曲線を示すグラフである。
図３は、抗エストラジオール抗体と様々なエストロゲン−アルカリ性ホスファターゼ結合体の用量反応曲線を示すグラフである。
図４は、抗エストラジオール抗体と様々なエストロゲン−アルカリ性ホスファターゼ結合体の用量反応曲線を示すグラフである。
図５は、抗エストラジオール抗体と様々なエストロゲン−アルカリ性ホスファターゼ結合体の用量反応曲線を示すグラフである。
図６は、抗プロゲステロン抗体と様々なステロイド−アルカリ性ホスファターゼ結合体の用量反応曲線を示すグラフである。
詳細な説明
本発明の方法は、
（ａ）所定のステロイドを含むと推測される試験試料と、上記ステロイドに対して特異的な抗体を結合した固相と、上記ステロイドの類似体の結合体との混合物をインキュベートし、上記固相上にステロイド／抗体複合体と結合体／抗体複合体を形成する段階、
（ｂ）上記混合物から上記固相を分離する段階、
（ｃ）上記混合物中に存在する又は上記固相上に存在する標識の量を測定する段階、及び、
（ｄ）標識の量から上記試料中のステロイドの量を決定する段階、
を含む。
本発明のキットは、ステロイドに対して特異的な抗体を結合した固相と、そのステロイドの類似体の結合体を含む。
本明細書で使用する場合に、所定の被検体（即ち、ステロイド）の「類似体」は、その被検体と構造的に類似しているが、
（１）少なくとも１つの置換基の向き（例えば、β−OHに対してα−OH）、
（２）所与の置換基の同一性（例えば、−Ｈに対して−Ｃ≡CH）、又は、
（３）ステロイド骨格の環の不飽和度（例えば、ステロイドのＡ環に対してベンゼン環、シクロヘキセン環、又は、シクロヘキサン環）
の少なくとも１つにおいて被検体とは相違している化合物を意味する。
上記ステロイドの骨格を形成するシクロペンタノフェナントレン環のＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ環は、本明細書に参考として組み入れるTexbook of Biochemistry with C linical Correlations,Second Edition,Thomas M.Devlin編,John Wiley ＆ Sons,Inc.（1986）,p.402の図10.22に示されている。
被検体がエストラジオールである場合には、エストラジオール類似体の代表的な例は、
（ａ）17位のβ−OHがα−OHで置き換えられる、
（ｂ）17位のα−OHがエチニル基（−Ｃ≡CH）で置き換えられる、
（ｃ）16位のα−Ｈがα−OHで置き換えられる、又は、
（ｄ）３−ケト−４−エンを与えるようにＡ環の飽和度が変更され、10位でＡ環とＢ環の継目にメチル基が加えられ、且つ、この19位のメチル基に標識が結合される、
上記改変の少なくとも１つが加えられている化合物を非限定的に含む。
しかし、エストラジオール類似体の場合は、17位において、置換基OHと置換基Ｈを、二重結合（例えば、＝Ｏ、又は、＝Ｎ）によって17位の炭素原子に結合する任意の置換基によって置き換えることが不可能である。
被検体がプロゲステロンである場合には、プロゲステロン類似体の代表的な例は、
（ａ）20位の＝Ｏが、β−Ｈとα−OHの両方で置き換えられる、
（ｂ）17位のα−Ｈがα−OHで置き換えられる、又は、
（ｃ）３−ヒドロキシ置換トリエンを与えるようにＡ環の飽和度が変更され、Ａ環とＢ環の継目から10位のメチル基が除去され、17位のβ−COCH3がβ−Ｈで置き換えられ、且つ、17位のα−Ｈがα−OHで置き換えられる、
上記改変の少なくとも１つが加えられている化合物を非限定的に含む。
エストラジオール類似体上の17位の置換基に関しては、そのエストラジオール化合物のβ−OH置換基をα−OH置換基で置き換えることが可能である。しかし、エストラジオール類似体の17位の炭素原子は、酸素原子によって17位の炭素原子に結合する２個の置換基を含まない。例えば、17位の炭素原子は２個の−OH置換基を持たない。17位の置換基は、エストラジオール化合物の−OH置換基とは異なることが可能である。エストラジオール類似体の17位の置換基は、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）であることが可能である。こうしたアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、又はアルコキシ基は、置換されていても非置換であってもよい。しかし、17位の炭素原子に結合する置換基は、二重結合によって17位の炭素原子に結合する基ではない。言い換えれば、17位の置換基は、＝Ｏでも、＝Ｎ−でも、又は、その他の類似物でもない。エストラジオール類似体上の16位の置換基に関しては、こうした置換基は、17位に位置することが可能な置換基と同一であることが可能である。16位の置換基に関する禁則事項は、17位の置換基に関する禁則事項と同一である。上記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、及びアルコキシ基上の置換基の種類は、あまり重要ではない。しかし、こうした置換基は、被検体類似体を使用するイムノアッセイに悪影響を与えるものであってはならない。こうした置換基の代表例は、ヒドロキシル基とアルキル基を非限定的に含む。
本明細書で使用する表現「標識基」は、抗体と被検体又は被検体類似体との間の反応を検出可能にするために、抗体、被検体、又は被検体類似体に結合させられる基を意味する。標識の代表例は、酵素、放射性標識、フルオレセイン、及び、発光化合物を含む。標識は、ステロイド又はステロイド誘導体に結合することが可能であり且つ視覚手段又は装置手段によって検出可能な信号を発生することが可能なあらゆる物質である。本発明での使用に適した様々な標識としては、触媒、酵素、リポソーム、及び、シグナル発生物質（例えば、色素原、触媒、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素等）を含む他の小胞体、等が挙げられる。標識として使用するのに適した幾つかの酵素が、本明細書に参考として組み入れる米国特許第4,275,149号に開示されている。こうした酵素は、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ホスファターゼ（例えば、アルカリ性ホスファターゼ）、及び、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）を含み、これらの酵素は、酵素基質（例えば、フルオレセインジ（ガラクトピラノシド）、ニトロブルーテトラゾリウム、3,5′,5,5′−テトラニトロベンジジン、４−メトキシ−１−ナフトール、４−クロロ−１−ナフトール、４−メチルウンベリフェリルホスフェート、及び、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート）、国際公開第88100694号とEP0−254−051−A2に開示されているジオキセタンのような化学発光酵素基質、並びに、これらの誘導体及び類似体と組み合わせて使用される。標識が酵素であることが好ましく、酵素がアルカリ性ホスファターゼであることが最も好ましい。
本発明は、生物体液中のステロイドを検出し測定するための方法とキットを含む。
本明細書で使用する用語「試験試料」は、被検体を含むと推測される材料を意味する。この試験試料を、供給体から得た状態のまま直接使用することも、試料の特徴を改変するために前処理した後に使用することも可能である。試験試料を、生理的液体（例えば、血液、唾液 眼球水晶体液、脳脊髄液、汗、尿、母乳、腹水、滑液、腹膜液、羊水等）のようなあらゆる生物源から得ることが可能である。血液からの血漿の調製、粘性体液の希釈等のように、試験試料を使用前に前処理することが可能である。こうした処理の方法は、濾過、蒸留、抽出、濃縮、妨害成分の不活性化、試薬の添加等を含むことが可能である。環境アッセイ又は食品生産アッセイを行うためには、水、食品等のような生理的液体以外の液体試料を使用することが可能である。これに加えて、被検体を含むと推測される固体材料を、試験試料として使用することが可能である。場合によっては、液状媒体を形成するように又は被検体を放出させるように固体試験試料を改変することが有益な場合もある。
被検体として特に有効であることが判明しているステロイドは、エストラジオール、プロゲステロン、テストステロン、及び、これらの誘導体を非限定的に含む。
段階（ａ）で使用するのに特に適していることが判明している化合物は、エストラジオールの類似体、プロゲステロンの類似体、及び、エストラジオールの類似体である。
本発明で使用に適したステロイド類似体を次の構造式で表すことが可能であり、
前記式中、
R1が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R2が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R3が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R4が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R5が、アルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）、又はPHを表し、
Ｌが、標識基を表し、
但し、16位の炭素原子が、酸素原子によって16位の炭素原子に結合している２個の置換基を含まず、且つ、17位の炭素原子が、酸素原子によって17位の炭素原子に結合している２個の置換基を含まない。
本発明での使用に適した別のステロイド類似体を、次の構造式で表すことが可能であり、
前記式中、
R6が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R7が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R8が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R9が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
Ｌが、標識基を表し、
但し、16位の炭素原子が、酸素原子によって16位の炭素原子に結合する２個の置換基を含まず、且つ、17位の炭素原子が、酸素原子によって17位の炭素原子に結合する２個の置換基を含まない。
本発明での使用に適した別のステロイド類似体を、次の構造式で表すことが可能であり、
R10が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R11が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R12が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R13が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
Ｌが、標識基を表し、
但し、16位の炭素原子が、酸素原子によって16位の炭素原子に結合する２個の置換基を含まず、且つ、17位の炭素原子が、酸素原子によって17位の炭素原子に結合する２個の置換基を含まない。
本発明の方法とキットでの使用に適したエストラジオールの類似体の代表的な例を、次の構造式で表すことが可能である。
1,3,5,［10］−エストラトリエン−17α−エチニル−3,17β−ジオール−６−オン６−CMO（EE2）
1,3,5,［10］−エストラトリエン−3,16α,17β−トリオール−６−オン６−CMO（E3）
1,3,5,［10］−エストラトリエン−3,17α−ジオール−６−オン６−CMO（17αE2）
本発明の方法とキットでの使用に適したプロゲステロンの類似体の代表的な例を、次の構造式で表すことが可能である。
４−アンドロステン−17β−オール−3,19−ジオン 19−CMO（T2）
４−プレグネン−17α−オール−3,20−ジオン ３−CMO（17αＰ）
４−プレグネン−20α−オール−３−オン ３−CMO（20αＰ）
一般的に、エストラジオールの類似体に最も好ましい置換基は、17位のβ−OHとα−Ｃ≡CH、16位のβ−Ｈとα−Ｈ、且つ、３位の−OHであるか、又は、17位のβ−OHとα−Ｈ、16位のβ−Ｈとα−OH、且つ、３位の−OHであるか、又は、17位のβ−Ｈとα−OH、16位のβ−Ｈとα−Ｈ、且つ、３位の−OHである。プロゲステロンの類似体に最も好ましい置換基は、17位のβ−CH（OH）CH3とα−Ｈ、且つ、16位のα−Ｈとβ−Ｈであるか、又は、17位のβ−Ｃ（Ｏ）CH3とα−OH、且つ、16位のα−Ｈとβ−Ｈである。
こうした類似体を、当業者に公知の方法で調製することが可能である。上記結合体の前駆体に上記標識を結合させることによって、上記結合体を調製することが好ましい。結合体前駆体は市販されている。例えば上記の６つの代表的な例のような数多くの類似体が市販されており入手可能である。
エストラジオール、プロゲステロン、テストステロン、プレドニソン（prednisone）、及び、コーチゾンのようなステロイド被検体を、一般的なイムノアッセイ方式で検出及び測定することが可能である。しかし、説明を簡潔にするために、エストラジオールイムノアッセイ方法だけを詳細に説明することにする。しかし、天然及び合成の、プロゲステロン、テストステロン、プレドニソン、コーチゾン、及び他のステロイド類を、下記で詳細に説明する方法と実質的に同様の方法で検出及び測定することが可能であることを、当業者は理解するだろう。
エストラジオールに対して特異的である結合相手としては、モノクローナル抗体やポリクローナル抗体のようなエストラジオール特異的結合タンパク質、エストラジオールと特異的に結合するその他のエストラジオール特異的合成及び組換えタンパク質、等が挙げられる。例えば、エストラジオールのようなステロイドに特異的に結合するモノクローナル抗体やポリクローナル抗体を生産することが可能であることが、当業者に公知である。典型的には共有結合によって担体タンパク質（例えば、アルブミン）に結合したエストラジオール又はエストラジオール誘導体を含む免疫原を動物に注射すると、その動物の免疫系が、エストラジオールに特異的に結合するポリクローナル抗体を産生するだろう。マウス又はラットを使用して被検体に対するモノクローナル抗体を調製するための一般的な方法が、当業者に公知である。更に最近では、被検体特異的合成及び組換えタンパク質を調製するための方法が報告されており、この方法を、本発明で有用であるエストラジオール特異的合成及び組換えタンパク質の調製に容易に適用することが可能である。
エストラジオール特異的結合相手が結合している固相を使用して、エストラジオールを測定することが好ましい。固相の例は微小粒子である。固相に結合したステロイド結合体の量、又は、溶液中に残留するステロイド結合体の量を測定することが可能であるように、固相と試験試料を分離する。固相に結合したステロイド結合体の量、又は、溶液中に残留するステロイド結合体の量を、結合体中の標識として酵素を使用する酵素イムノアッセイによって測定することが好ましい。酵素基質と呼ぶ材料を、適切な酵素によって蛍光化合物（例えば、４−メチルウンベリフェロン）に変換することが可能である。蛍光化合物が形成される速度は、反応混合物中に存在する酵素の量を表す。酵素イムノアッセイの場合のように酵素が標識である時には、存在する酵素の量は、試験試料中に含まれるエストラジオールの量に関連している。従って、試験試料中に存在するエストラジオールの量を定量するために蛍光の測定を使用することが可能である。典型的には標準曲線と呼ばれる、エストラジオール濃度の関数として酵素活性を示すプロットによって、固相上又は溶液中のステロイド結合体の量を、試験試料中のエストラジオール濃度に相関させることが可能である。下記の表Ｉに示すようなキャリブレータ（検量物質）を使用して上記アッセイを行うことによって、標準曲線を得ることが可能である。標準曲線が有効であることを確認するために、対照を使用する。未知のエストラジオール濃度を有する試料をアッセイする場合には、測定したアッセイシグナルを標準曲線と比較し、その測定シグナルに対応するエストラジオール濃度が試料のエストラジオール濃度である。
特異的結合相手を、物理的又は化学的手段によって、好ましくは共有結合によって、固相に結合させることが可能である。この特異的結合相手は、後続の反応段階と洗浄段階においてその特異的結合相手が脱着することが実質的に無いように、固相に結合させられなければならない。選択される特異的結合相手と結合方法とに無関係に、特異的結合相手は、固相に結合させられた後に、エストラジオールやステロイド結合体に結合することが可能でなければならない。
本発明による固相は、微小粒子と、その微小粒子に化学的又は物理的に結合したエストラジオールに対して特異的である結合相手との混合物であることが可能である。本発明で使用可能な微小粒子は、ポリマー材料で作られることが好ましく、スチレン単位を有するポリマー又はアクリル酸（acrylate）単位を有するポリマーから得られる微小粒子を含むことが更に好ましい。微小粒子が実質的に球形であり、且つ、約0.1μｍから約0.25インチまでの範囲内の半径を有することが好ましい。試験試料からこうした微小粒子を分離するための好ましい方法は、ガラス繊維のような多孔性マトリックス上に微小粒子を捕獲することを含む。
本発明で使用可能な他の固相は、その微小粒子に物理的又は化学的に結合したエストラジオールに対して特異的である結合相手を有する、磁気微小粒子の混合物であることが可能である。本発明で使用可能な磁気微小粒子は、酸化鉄（III）又は酸化クロムのコアとポリマー被覆とを有することが好ましい。こうした被覆は、スチレン単位を有するホモポリマーとコポリマー、カルボキシル化スチレン単位を有するホモポリマーとコポリマー、又は、アクリル酸もしくはメタクリル酸単位を有するホモポリマーもしくはコポリマーで作られることが好ましい。当業者に公知の他の固相は、反応トレイ穴の壁、チューブ、ポリマービーズ、ニトロセルロースストリップ、メンブラン等を含む。天然材料、合成材料、及び、人為的に改変された天然材料を、固相材料として使用することが可能である。こうした材料は、例えばセルロース材料（例えば、紙及びセルロース誘導体（例えば、酢酸セルロース、及び、ニトロセルロース））のような多糖類、シリカ、無機材料（例えば、不活性化アルミナ、けい藻土、MgSO4、及び、塩化ビニルのホモポリマー及びコポリマー（例えば、ポリ塩化ビニル、塩化ビニル−プロピレンコポリマー、及び、塩化ビニル−酢酸ビニルコポリマー）のような１つ以上のポリマーを含むことが可能な多孔性ポリマーマトリックス中に均一に分散した上記又は他の無機微粉砕材料）、天然布（例えば、綿）と合成布（例えば、ナイロン）、多孔性ゲル（例えば、シルカゲル、アガロース、デキストラン、ゼラチン）、並びに、ポリマーフィルム（例えば、ポリアクリルアミド）等を含む。いずれの場合にも、固相は、所期の形状を維持するのに十分な強度を持たなければならず、且つ、検出可能なシグナルの発生に干渉してはならない。この強度は支持体によって与えられることが可能である。
別の分離方法が、両方とも共通の所有者が享受し且つ本明細書に参考として組み入れる1988年１月20日付で出願された米国特許出願番号150,278（放棄）と1989年７月７日付けで出願された米国特許出願番号375,029（放棄）とに開示されている。これらの出願に対応する公開された出願は、本明細書に参考として組み入れる1992年12月10日付けで公開された国際公開第92/21980号である。これらの文献は、イオン捕獲分離を含み、この場合、アッセイで使用する特異的結合相手は、第１のポリイオン化合物と、この第１のポリイオン化合物に結合する第２のポリイオン化合物に結合している多孔性マトリックスとの両方に化学的に結合させられる。特異的結合対が形成され、第１のポリイオン化合物と第２のポリイオン化合物との間の静電的相互作用によって反応混合物から分離される。その特異的結合対の特異的結合相手が第１のポリイオン化合物に共有結合していることが好ましい。
第１のポリイオン化合物は、ポリアニオン酸（例えば、ポリアスパラギン酸、ヘパリン、カルボキシルメチルアミロース、ポリグルタミン酸、又は、ポリアクリル酸）であり、第２のポリイオン化合物は、カチオンポリマー（例えば、ポリマー第四級アンモニウム化合物（「GafQuattum」、GAF Corporation,Wayne,N.J.,07470）、ジエチルアミノエチル−デキストラン（Sigma Chemical Company,St.Louis,Mo.）、水溶性セルロース誘導体（例えば、両方ともポリマー第四級化合物である商標「Celquat Ｌ−200」及び「Celquat Ｈ−100」のセルロース誘導体（National Starch ＆ Chemical Corporation,Bridgewater,N.J.08807）、又は、MerquatTM100（Calgon Corporation）である。多孔性マトリックスをカチオンポリマーで処理して、そのマトリックスに正電荷を与える。そのカチオンポリマーを、吸収、吸着、又は、共有結合もしくはイオン結合によってマトリックスに結合させる。反応生成物の分離、正帯電マトリックスと負帯電ポリアニオン複合体との間の静電的相互作用によって実施する。
本発明での使用に適した多孔性マトリックスは、適した多孔性材料のいずれであってもよい。本明細書で使用する場合の用語「多孔性材料」は、流体がその中を通って流れ容易に通過することが可能な材料を意味する。この多孔性マトリックスに適した材料の代表的な例は、非限定的に、オレフィンポリマー（例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、及び、フッ素化オレフィンポリマー（例えば、ポリテトラフルオロエチレン））、ガラス繊維、セルロース、又は、ナイロンを含む。
多孔性マトリックスの好ましい材料は、公称厚さ0.33mmを有する「Whatman 934−AH」フィルターペーパーのような多孔性ガラス繊維材料、又は、ディスポーザブルIMxTMカートリッジ及びTestPackTM（ファイバ−マトリックス）装置（Abbott Laboratories,Abbott Park,IL,60064）を含む。こうした材料の厚さは重要ではなく、試験試料又はアッセイする被検体の特性（例えば、試験試料の流動性）に基づく選択の問題である。
上記のように、適切な酵素によって酵素基質を４−メチルウンベリフェロンのような蛍光化合物に変換することが可能である。蛍光化合物が形成される速度が、反応混合物中に存在する酵素の量を表す。こうした酵素が標識である場合には、存在する酵素の量が、試験試料中に存在するエストラジオールの量に関係付けられる。従って、酵素イムノアッセイの酵素活性によって生じる蛍光の測定を、試験試料中に存在するエストラジオールの量を定量するために使用することが可能である。当業者で公知の任意の方法で蛍光を測定することが可能である。例えば、蛍光スペクトロメーターを使用することが可能である。視覚スペクトロメーターによって、又は、高集光力の分光器を使用して写真によって、蛍光スペクトルを観察することも可能である。
好ましい実施様態では、蛍光をIMxTM自動ベンチトップアナライザー（Abbott Laboratories,Abbott Park,IL）を使用して検出することが可能である。このアナライザーは、光源として水銀アークランプを使用する蛍光光度計を含む光学アセンブリを含む。この装置は、本明細書に参考として組み入れるFiore他（Clin.Chem.,34/9:1726−1732,1988）によって説明されている。この装置では、結合体と試験試料とに接触させた抗エストラジオール抗体を含む微小粒子を捕獲するために、IMxTMディスポーザブルカートリッジ（Abbott Laboratories,Abbott Park,ILから市販され入手可能）を使用する。結合体で使用する標識がアルカリ性ホスファターゼであることが好ましい。試験試料中のエストラジオールが、微小粒子上の抗エストラジオール抗体に結合する。反応混合物から微小粒子を分離し、結合体を微小粒子に加え、入手可能な抗エストラジオール抗体に結合体が結合し、微小粒子上に存在する結合体の量を、４−メチルウンベリフェリルホスフェートが４−メチルウンベリフェロンに変換される速度から定量する。試験試料中のエストラジオールの量を、エストラジオール濃度の関数としての４−メチルウンベリフェロン形成速度の標準曲線から決定することが可能である。この標準曲線は検量線としても知られている。
一般的に、４−メチルウンベリフェロン形成速度をエストラジオール濃度に関係付ける標準曲線を、既知のエストラジオール濃度を有するキャリブレータ溶液から得る。検量線を得るために６つのキャリブレータを使用することが好ましいが、求める結果の正確さと精度に応じて、それよりも多いか少ない数のキャリブレータを使用することが可能である。次第に増加する量のエストラジオールをキャリブレータが含むことが好ましい。例えば、表Ｉは、IMxTMEstradiolアッセイのための、１組のキャリブレータの組成を示している。一般的に、検量線又はアッセイ試薬の有効性を確認するために、アッセイと組み合わせて対照を使用する。この対照の調合は、キャリブレータの調合と異なっていてもよく、特定の対照のエストラジオール濃度は、どのキャリブレータのエストラジオール濃度とも同一でなくてよい。例えば、エストラジオール濃度150pg/mL、500pg/mL及び1125pg/mLを有する対照が、表Ｉのキャリブレータに適した対照だろう。当業者は、他のキャリブレータ調合物と対照調合物を考案することが可能だろう。
こうした手順全体を通じて無菌状態を維持するために、溶媒と抗生物質と毒物を含むことが可能な系に抗菌剤を少量加えることが望ましいだろう。
下記の実施例は本発明を例示するが、添付の請求の範囲で定義する本発明の範囲を限定すると解釈されてはならない。全てのパーセンテージは、特に明示しない限り、100ミリリットル（mL）体積当たりのグラム（ｇ）重量（w/v）による。
実施例１
エストラジオールアッセイ
次の手順に従ってIMxTM装置によってIMxTMディスポーザブルカートリッジ上でエストラジオールアッセイを行った。血清試料（75μＬ）を、IMxTMEstradiol Assay緩衝液（35μＬ）、抗エストラジオール抗体で被覆したIMxTMEstradiol微小粒子（60μＬ）、及び、IMxTMBuffer（90μＬ）と混合し、反応混合物を調製した。その反応混合物を温度35℃で27.5分間インキュベートした。
IMxTMEstradiol Assay緩衝液は、５α−ジヒドロテストステロン（２μg/mL）、0.75％（w/v）サポニン、0.5Mグリシン、0.25mMクエン酸ナトリウム、及び、0.12％メチルイソチアゾリノン（w/v）（全体でpH4.5）で構成されていた。抗エストラジオール抗体で被覆したIMxTMEstradiol微小粒子（0.005−0.02％固体、w/v）を、0.1Mビス−（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（以下では、「Bis−Tris」と呼ぶ）、0.1M塩化ナトリウム、13.6％スクロース（w/v）、0.1％アジ化ナトリウム（w/v）、及び、0.2mg/mL正常ウサギIgG（全体でpH6.5）で構成されたIMxTMEstradiol Assay緩衝液中に懸濁させた。IMxTMBuffeerは、0.3M NaCl、0.1Mトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下では「Tris」と呼ぶ）、及び、0.1％アジ化ナトリウム（w/v）（全体でpH7.5）で構成された。
175μＬの反応混合物をIMxTMディスポーザブルカートリッジのファイバーマトリックスに移した。そのファイバーマトリックスをIMxTMカートリッジの吸收パッド上に置いた。微小粒子をフィルターマトリックスで捕獲し、溶液を上記吸収パッドで吸収した。その後で微小粒子をIMxTMBufferで洗浄した。ステロイド−アルカリ性ホスファターゼ結合体（60μＬ）を上記マトリックスに加え、温度35℃で12秒間インキュベートし、再びIMxTMBufferで洗浄した。その結合体（２−８μg/mLアルカリ性ホスファターゼ）を、0.1M Bis−Tris、0.5M塩化ナトリウム、１％カゼイン（w/v）、1mM塩化マグネシウム、0.1mM塩化亜鉛、及び、0.1％アジド（w/v）（全体でpH6.5）で構成された結合体緩衝液中に存在させた。様々なステロイド−アルカリ性ホスファターゼ結合体の調製を実施例４で説明する。
0.1M ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝液（pH9）中の４−メチルウンベリフェロンホスフェート（65μＬ）の1.2mM溶液を、上記マトリックスに加え、蛍光反射率によって４−メチルウンベリフェロン形成速度を測定した。その内容が既に本明細書に組み入れられているFiore他,Clin.Chem.,34/9:1726−1732,1988に説明されている通りに、光源として水銀アークランプを使用する蛍光光度計を使用して、IMxTM装置で蛍光を測定した。
IMxTMEstradiol緩衝液、IMxTMEstradiol抗エストラジオール抗体被覆微小粒子、結合体、メチルウンベリフェロンホスフェート基質、IMxTMBuffer、IMxTMディスポーザブルカートリッジ、及び、IMxTM装置を含む上記アッセイに必要なものは、Abbott Laboratories,Abbott Park,ILから市販され入手可能であり、米国特許第5,342,760号、欧州特許出願公開第288 793号、及び、Fiore他,Clin.Chem.,34/9:1726−1732,1988（これら全てを本明細書に参考として組み入れる）に説明されている。
実施例２
プロゲステロンアッセイ
実施例１のエストラジオールアッセイに使用した手順と同様の手順でIMxTM装置によってIMxTMディスポーザブルカートリッジ上でプロゲステロンアッセイを行った。血清試料（50μＬ）を、プロゲステロン試料緩衝液（80μＬ）、抗プロゲステロン抗体で被覆した微小粒子（80μＬ）、及び、IMxTMBuffer（40μＬ）と混合した。その反応混合物を温度35℃で20.8分間インキュベートした。
プロゲステロン試料緩衝液は、2.25Mグリシン,5α−ジヒドロテストステロン（0.5μg/mL）、0.2％（w/v）サポニン（EM Industries,Hawthorne,NY）、0.1M塩化ナトリウム、及び、0.1％メチルイソチアゾリノン（w/v、Rohm and Haas,Philadelphia,PA）（全体でpH2.8）で構成された。抗プロゲステロン抗体（BiosPacific,Emeryville,CA）で被覆した微小粒子（Seradyne,Indianapolis,IN）は、0.5Mモルホリノエタンスルホン酸（MES）、0.1M塩化ナトリウム、10％スクロース（w/v）、２％ウシ血清アルブミン（w/v、Intergen,Purchase,NY）、0.1mg/mLマウスIgG（Stellar Biosystems,Columbia,MDから入手したマウス血清の50％（w/v）硫酸アンモニウムカツト）、及び、0.2％アジ化ナトリウム（w/v）を含む緩衝液（全体でpH6.5）中に懸濁された0.003％（w/v）固体を含んでいた。
175μＬの反応混合物をIMxTMディスポーザブルカートリッジのファイバーマトリックスに移した。その後で微小粒子をIMxTMBufferで洗浄した。ステロイド−アルカリ性ホスファターゼ結合体（60μＬ）を上記マトリックスに加え、温度35℃で８秒間インキュベートし、再びIMxTMBufferで洗浄した。その結合体（２−15μg/mLアルカリ性ホスファターゼ）を、50mM Tris、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、0.1mM塩化亜鉛、0.5％カゼイン（w/v、Sigma Chemical Company,St.Louis,MO）、及び、0.1％アジ化ナトリウム（w/v）（全体でpH7.4）で構成される結合体緩衝液中に存在させた。
４−メチルウンベリフェロンホスフェートの添加と、４−メチルウンベリフェロン形成速度の測定を、実施例１で説明した方法で行った。
実施例３
抗体被覆微小粒子の調製
抗体で被覆した微小粒子を次のように調製した。
（ａ）マウス抗エストラジオールモノクローナル抗体（BiosPacific A3268;Bingenesis 2F−9,Sandown NH;Medix MBE 0107,San Carlos,CA）と抗プロゲステロンモノクローナル抗体（BiosPacific 087）を購入し、抗エストラジオールポリクローナル抗体（BiosPacific B4996及びMedix M17794）も購入した。
（ｂ）フロイント完全アジュバント中のウシ血清アルブミンに結合したエストラジオール６−（Ｏ−カルボキシメチル）オキシム（Sigma Chemical Company,St.Louis,MO、及び、Steraloids,Wilton,NH）を注射し、フロイント不完全アジュバントでブーストすることによって、ウサギ抗エストラジオールポリクローナル抗体を調製した。
（ｃ）（１％固体（w/v）の最終反応濃度を得るのに十分な）ラテックス微小粒子を、50mM MES緩衝液（pH4.5）と1mg/mLの抗体と混合した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDAC）を加えて0.5mg/mLの最終濃度にした。混合物を室温で30分間インキュベートした後に、0.1％Tween 20界面活性剤（v/v）と0.1M塩化ナトリウムとを含む0.1M Tris（pH7.4）で、上記微小粒子を３回洗浄した。その後で微小粒子を微小粒子保存緩衝液中に再懸濁させた。抗エストラジオール抗体被覆微小粒子保存緩衝液については実施例１で説明してあり、抗プロゲステロン抗体被覆微小粒子保存緩衝液については実施例２で説明してある。これらの微小粒子調合物を使用するアッセイを実施例５で説明する。
実施例４
ステロイド−アルカリ性ホスファターゼ結合体の調製
ステロイド−アルカリ性ホスファターゼ結合体を次のように調製した。
（ａ）当該結合体に使用するステロイド誘導体10μｇと、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド10μｇを、ジメチルホルムアミド（無水）100μＬ中に溶解した。EDAC 40μｇをその溶液に加えた。ウシ腸アルカリ性ホスファターゼと共にエストラジオール類似体とプロゲステロン類似体を使用して様々な結合体を生産するために使用するステロイドを表IIに示す。
（ｂ）段階（ａ）の混合物のアリコートを、ステロイド：酵素のモル比が10:1（テストステロンの場合には20:1）であるように、炭酸緩衝液（pH8）中のアルカリ性ホスファターゼ（Boehringer Mannheim,Germanyから入手可能）に加えた。その結果得たステロイド−アルカリ性ホスファターゼ結合体を、G25 Sephadexカラム上の未結合ステロイドや他の低分子量材料から分離した。分離した結合体のアリコートを抜き出し、このアリコートを希釈して、エストラジオール結合体緩衝液又はプロゲステロン結合体緩衝液中で約１μg/mLから約20μg/mLまでの濃度に希釈した。実施例１は、エストラジオールアッセイとIMxTM装置を使用するアッセイとで使用する結合体を説明する。実施例２は、プロゲステロンアッセイとIMxTM装置を使用するアッセイとで使用する結合体を説明する。
実施例５
抗エストラジオール抗体／ステロイド結合体マトリック ス
マウスモノクローナル抗体とウサギポリクローナル抗体の両方を含む幾つかの抗エストラジオール抗体を、実施例１で説明したアッセイ法において様々なステロイドアルカリ性ホスファターゼ結合体に関する速度比の値を得るために試験した。これに加えて、実施例２で説明したアッセイ法で３つのステロイド−アルカリ性ホスファターゼ結合体を使用して抗プロゲステロン抗体を試験した。その結果を表IIIに示す。
用量反応を、速度比の値を測定することによって評価した。本明細書で使用する場合の用語「速度比の値」は、「被検体を含まない場合に観察されるアッセイシグナルの値」（この実施例では、表III、キャリブレータＡ）で「特定の被検体濃度で観察されるアッセイシグナルの値」（この例では、表III、キャリブレータＦ）を割ることによって得られる商を意味する。Abbott IMxTM装置は、１秒間当たりの毎秒蛍光カウント（cps/s）を単位としてアッセイシグナルを測定する。速度比の値は無次元数であり、異なったアッセイからのデータを正規化し、それによって、異なったアッセイ又はアッセイフォーマットの直接的な比較を可能にする。便宜上、速度比の値を、キャリブレータＦからのシグナルとキャリブレータＡからのシグナルとから計算した。エストラジオールアッセイでは、キャリブレータＦは3000pg/mLエストラジオールの濃度であり、プロゲステロンアッセイでは、キャリブレータＦは、40ng/mLプロゲステロンの濃度である。キャリブレータＡは被検体を含まない。
700以上の異なった抗体／ステロイド結合体の組合せのスクリーンからのキャリブレータF/キャリブレータＡ比に関する速度比の値の代表的なサンプリングを、表IIIに示す。８つのステロイド結合体と、極めて低い速度比の値を有する代表的ないくつかのマウスモノクローナル抗体及びウサギポリクローナル抗体を示している。一例として、ポリクローナル抗体Rabbit 438の場合には、試験した８つのステロイド結合体に関する最小の速度比の値が、エチニルエストラジオール（EE2）結合体で得られ、この場合、速度比の値は0.20だった。試験した700値の抗体／ステロイド結合体組合せの場合に、エストラジオールアッセイにおいてエストラジオール結合体もエストロン結合体も最良の用量反応を生じさせなかった。この実施例では、エストラジオール（E2）とエストロン（E1）の具体例は、比較例である。これらは、エストラジオールアッセイの類似体を構成しない。
実施例６
ポリクローナルRabbit 583抗体とエストラジオール結 合体及びエストラジオール類似体結合体との用量反応曲 線
図１から図６に示すように、特定のステロイドアッセイにおける速度比の値のパターンは、使用する抗体／ステロイド結合体の組合せの各々に特有である。速度比の値は、「特定の被検体濃度で観察されるアッセイシグナル」の「被検体が存在しない場合に観察されるアッセイシグナル」に対する比である。速度比の値を、任意の所期被検体濃度で測定することが可能である。この実施例では、エストラジオールキャリブレータＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦ（表Ｉ）を、臨床的に有用なエストラジオール濃度範囲に亙って速度比の値を測定するために使用した。所定の抗体／ステロイド結合体の組合せにおける速度比の値を、被検体濃度の関数としてプロットし、用量反応曲線を得る。選択した抗エストラジオール抗体／結合体組合せの用量反応曲線を、IMxTMEstradiolアッセイのダイナミックレンジ（０−3000pg/mL）全体に亙って調べた。図１は、Rabbit 583からの抗エストラジオールポリクローナル抗体と様々なエストロゲン結合体とに関して観察される、様々な用量反応曲線を示す。
いずれかの特定のキャリブレータ（例えばキャリブレータＦ）における低い速度比の値が、急勾配の用量反応曲線に関連付けられることが理解できるだろう。本明細書で使用する場合に表現「急勾配の用量反応曲線」は、低濃度における被検体の小さな濃度変化（即ち、その曲線の横軸）が、大きな速度比の値の変化（即ち、その曲線の縦軸）を生じさせることを意味する。この点を更に明確に述べると、図１において、17αE2の用量反応曲線がE1とE3の用量反応曲線よりも急勾配であり、E1とE3の用量反応曲線がE2とEE2の用量反応曲線よりも急勾配である。ポリクローナル抗体Rabbit 583の場合には、17αE2結合体が最も急勾配の用量反応曲線を生じさせ、同様に、最も低いキャリブレータF/キャリブレータＡ速度比の値（0.03）を生じさせた。表IIIと図１を参照されたい。用量反応曲線が相対的に急勾配であることは、キャリブレータＦの速度比の値の大きさに逆に関係付けられる（表IIIと実施例５を参照されたい）。
低被検体濃度領域内のより急勾配の用量反応曲線は、その領域内の被検体濃度をより正確に推測することを可能にする。従って、低被検体濃度領域内において特定の抗体／ステロイド組合せがより急勾配の用量反応曲線を有することは、その組合せが、比較的低いステロイド濃度をより正確に測定することが可能なイムノアッセイを実現し、したがって、臨床的により適切なアッセイを可能にすることを示している。低ステロイド濃度における濃度の小さな差異を正確に測定することは、受胎能を診断するために使用するステロイドアッセイの主要な臨床的有用性の１つであると考えられる。
実施例７
ポリクローナルRabbit 2522抗体とステロイド類似体結 合体との用量反応曲線
図２は、Rabbit 2522からの抗エストラジオールポリクローナル抗体と様々なステロイド類似体の結合体とにおいて観察される様々な用量反応曲線を示す。この抗体の場合には、芳香Ａ環を含む結合体ハプテン以外の結合体ハプテンの場合に、最小の速度比の値が観察された。プロゲステロン類似体17αＰの用量反応曲線は、テストステロンT2の用量反応曲線よりも急勾配であり、テストステロンT2の用量反応曲線はエストロゲン17αE2、EE2及びE2の用量反応曲線よりも急勾配である。
実施例８
ポリクローナルRabbit 438抗体とエストラジオール結 合体及びエストラジオール類似体結合体との用量反応曲 線
図３は、Rebbit 438からの抗エストラジオールポリクローナル抗体とエストラジオール結合体又は様々なエストラジオール類似体の結合体とにおいて観察される様々な用量反応曲線を示す。この抗体の場合には、エチニルエストラジオール結合体ハプテン（EE2）において、最も急勾配の用量反応曲線が観察された。
実施例９
ポリクローナルRabbit 581抗体とエストラジオール結 合体及びエストラジオール類似体結合体との用量反応曲 線
図４は、Rabbit 581からの抗エストラジオールポリクローナル抗体とエストラジオール結合体又は様々なエストラジオール類似体結合体とにおいて観察される様々な用量反応曲線を示す。この抗体の場合には、17α−エストラジオール結合体ハプテン（17αE2）において、最も急勾配の用量反応曲線が観察された。
実施例10
マウスモノクローナルA3268抗体とエストラジオール結 合体及びエストラジオール類似体結合体との用量反応曲 線
図５は、BiosPacificから入手した抗エストラジオールマウスモノクローナル抗体A3268とエストラジオール結合体又は様々なエストラジオール類似体の結合体とにおいて観察される様々な用量反応曲線を示す。この抗体の場合には、エストリオール結合体ハプテン（E3）において、最も急勾配の用量反応曲線が観察された。
実施例11
マウスモノクローナル087抗体とステロイド類似体結合 体との用量反応曲線
抗プロゲステロン抗体／結合体組合せにおける用量反応曲線を、０−40ng/mLの範囲に亙って調べた（プロゲステロンキャリブレータＡからキャリブレータＦまで）。図６は、BiosPacificからの抗プロゲステロンマウスモノクローナル抗体087と、ステロイド類似体17α−ヒドロキシプロゲステロン（17αＰ）結合体とテストステロン（T2）結合体とにおいて観察される様々な用量反応曲線を示す。この抗体の場合には、構造的により類似したプロゲステロン類似体である17α−ヒドロキシプロゲステロンに比較して、用量反応曲線の著しい改善がテストステロン結合体で観察された。プロゲステロンアッセイにおけるキャリブレータＡからキャリブレータＦは次の通りである。キャリブレータＡ＝プロゲステロン 0ng/mL、キャリブレータＢ＝プロゲステロン 1.0ng/mL、キャリブレータＣ＝プロゲステロン 4.0ng/mL、キャリブレータＤ＝プロゲステロン 10ng/mL、キャリブレータＥ＝プロゲステロン 20ng/mL、及び、キャリブレータＦ＝プロゲステロン 40ng/mL。
本発明の範囲と思想から逸脱することなく、本発明の様々な改変と変更が当業者に明らかになるだろう。本発明は、本明細書で説明した実施様態に不当に限定されるべきでないということを理解されたい。
1.発明の分野
本発明は、生物体液中のステロイドの検出と測定に係わり、更に特に、競合イムノアッセイによるステロイドの検出と測定に係わる。
2.従来技術の説明
生物体液中のステロイドの検出と測定は様々な理由から重要である。例えば、内分泌異常の発生の診断を補助するために、ホルモン補充療法で必要とされるホルモン量を監視するために、又は、受胎能を調べるために、生物体液中の特定のステロイドの量を使用することが可能である。生物体液中のステロイドの存在と量の判定を競合診断アッセイによって行うことが可能である。低分子競合診断アッセイでは、結合可能な抗体部位に対する結合において被検体（analyte）と競合することが可能な標識成分が必要である。標識成分の例は、放射性トレーサー、発蛍光団／ハプテン結合体、及び、酵素／ハプテン結合体を含む。典型的には、こうした標識成分は、標識に結合された被検体又は被検体類似体から成る。典型的には標識成分を結合体（conjugate）と呼ぶ。
エストラジオール（1,3,5（10）−エストラトリエン−3,17α−ジオール）が被検体であり、その検出と測定が受胎能検査の分野で極めて重要である。エストラジオールは卵巣と胎盤とによって分泌される。卵巣及び胎盤の包膜細胞と顆粒膜細胞との中におけるアンドロゲンの芳香族化によって、エストラジオールが合成される。この芳香族化はフォリトロピン（FSH）によって促進される。エストラジオール合成は、一方では、アンドロゲン前躯体の合成に必要なルトロピン（LH）受容体の産生を促進する。
エストラジオールは、妊娠中における女性への性分化、思春期における性的発達、及び、月経周期の調節にとって重要である。月経周期は、性腺刺激ホルモン（すなわちゴナドトロピン）放出ホルモン（GnRH）、LH、FSH、及び、卵巣ステロイド（エストラジオールとプロゲステロン）の周期的放出を調節する、中枢神経系、視床下部、下垂体、卵巣、及び、子宮内膜を機能的特徴の精確な同調の結果である。エストラジオールは、ゴナドトロピンの放出の促進と阻害の両方に関与し、正のフィードバックと負のフィードバックの両方を及ぼす。卵胞期の初期においては、包膜細胞及び顆粒膜細胞からのエストラジオールの卵巣分泌は多くはない。卵胞期の途上では、エストラジオールは子宮内膜の発達を促進する（月経後の子宮内膜を修復する）。周期中期に向かって、LH産生が増大し、その結果、発達した卵胞の破裂によって卵細胞の放出が生じる。排卵後には、エストラジオール分泌が僅かに減少する。黄体期中は、エストラジオールがプロゲステロンと共に黄体から分泌され、子宮内膜の発達を更に促進する。卵細胞が受精させられない場合には、エストラジオールとプロゲステロンが更に減少する。このエストラジオールとプロゲステロンの減少が月経を開始させる。
エストラジオールの測定は、正常な性的発達（初経）、不妊症の原因（無排卵、無月経、月経困難症）、及び、月経閉止の判定に関して重要である。正常なエストラジオール濃度は、月経と初期卵胞期とにおいて最小である（25−75pg/mL）。エストラジオール濃度は、後期卵胞期において上昇して200−600pg/mLのピークに達し、その直後にLHの急増が排卵を開始させる。LHがビークに達すると、エストラジオール濃度が低下し始め、その後で、黄体期中に再び上昇する（100−300pg/mL）。受胎が起こらない場合には、更にエストラジオール濃度がその最小値に低下し、それによって月経を開始させる。受胎が生じた場合には、エストラジオール濃度が上昇し続け、第１のトリメスター（trimester）中に１−5ng/mLの濃度に達し、第２のトリメスター中に５−15ng/mLの濃度に達し、第３のトリメスター中に10−40ng/mLに達する。月経閉止期中はエストラジオール濃度は低いままである。
血清中のエストラジオール濃度を測定する方法には様々なものがある。しかし、こうした方法の多くは放射性元素を標識として使用し、幾つかの欠点を有する。こうした方法の中の幾つかが米国特許第5,342,760号（カラム１の54行からカラム３の30行）に開示されており、本明細書に参考として組み入れる。米国特許第5,342,760号は、競合イムノアッセイによるエストラジオールの測定のための有効な方法を開示し請求している。しかし、この特許で請求される方法は、限られた数の抗体に関してだけ有効であるにすぎない。
プロゲステロン（４−プレグネン−3,20−ジオン）が被検体であり、その検出と測定は、排卵の発生、受胎、妊娠中絶の危険性、又は、子宮外妊娠を判定する分野で極めて重要である。
最初に、ミトコンドリア内で、シトクロムＰ−450酵素依存性側鎖切断とヒドロキシル化とによってコレステロールがプレグネノロンに変換される。その後で、３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ酵素とイソメラーゼ酵素（３β−HSD）とが触媒する反応によって、プレグネノロンがプロゲステロンに変換される。プロゲステロンは正常に月経がある女性では卵巣の黄体によって主として産生されるが、より少ない量ではあるが、副腎皮質でも産生される。妊娠約６週間の時点で、プロゲステロンは主に胎盤によって産生されるようになる。血液循環中に、約97％から約98％のプロゲステロンがアルブミン又はコーチゾール結合タンパク質に結合する。プロゲステロンは、主として肝臓内で、プレグナンジオールとその水溶性硫酸塩、及び、グルクロニド誘導体に代謝され、尿中に排出される。
プロゲステロンの主要な機能な、着床と妊娠維持のために子宮を準備することにある。卵胞期中は、プロゲステロン濃度は低い（0.2−1.5ng/mL）ままである。LHの急激な増量と排卵の後に、破裂した卵胞内の黄体細胞がLHに反応してプロゲステロンを産生する。黄体期中は、排卵の５日後から７日後までにプロゲステロン濃度が10−20ng/mLの最大値に急激に上昇する。妊娠が生じない場合には、黄体の退行のために月経周期の最後の４日間の間にプロゲステロン濃度が低下する。
妊娠が起こる場合には、プロゲステロン濃度が、第６週目まで、黄体によって中黄体期の濃度に維持される。この時点では、胎盤がプロゲステロンの主たる供給源となり、プロゲステロン濃度は第１のトリメスターの約10−50ng/mLから第３のトリメスターの約50−280ng/mLまで上昇する。
血清プロゲステロンは、その濃度の急激な上昇が排卵後に生じるので、自然排卵又は誘発排卵の確実な指標である。無排卵を含む排卵異常は比較的頻繁に生じ、患者の約15％から約20％において不妊症の原因となっている。こうした患者では、中黄体期のプロゲステロン濃度が異常に低い。
黄体期欠損は、不妊症と自然流産とに関連した生殖障害である。この黄体期欠損は不妊女性の10％で生じると考えられている。この障害に関連した不妊症と妊娠消失は、子宮内膜の不適切な成熟と発達とに起因すると考えられている。こうした子宮内膜の欠陥は、黄体によるプロゲステロン産生が不十分であることを原因とする可能性があると考えれている。黄体期欠損の女性では、黄体期における血清プロゲステロン濃度が正常な濃度よりも低い。
妊娠期間の最初の10週間内におけるプロゲステロンの測定が、切迫流産と子宮外妊娠の患者に関する確実な予測手段であり且つ有効な診断及び治療手段であることが実証されている。検出可能な量のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（hCG）の存在下でのプロゲステロン濃度の低下（10−15ng/mL）は、妊娠年齢に無関係に、切迫流産又は子宮外妊娠を高い精度で示唆する。
典型的な生理学的濃度（ng/mL）は次の通りである。
女性：
通常周期
卵胞期 0.5
排卵期 0.5−1.5
黄体期 4.0−20.0
その他：
思春期前 0.2−0.5
閉経後 0.5
妊娠 40−200
男性：
思春期前 0.25
成人 0.25
標識成分に対する被検体の適切な親和性を有し、且つ、例えばエストラジオールやプロゲステロンのようなステロイドに関する競合イムノアッセイにおいてその抗体を有効に使用することを可能なものにする特異性を有する抗体を得ることが、困難であることが既に判明している。抗体の供給源はその数において限られており、従って、入手不可能であるか、又は、過剰に高いコストとなる。競合アッセイで有限数の抗体のいずれかを使用することは、不適切な用量反応に帰結し、従って、感度の低さ、精度の低さ、又は、感度と精度の両方の低さをもたらす。これに加えて、被検体に対する適切な親和性を示す抗体を開発することが可能である場合でさえ、こうした抗体の多くは、構造的に類似したステロイドに対する高い交差反応性という望ましくない属性を有する可能性がある。臨床的に有用であるが測定が困難である50pg/mL未満のエストラジオール濃度と1ng/mL未満のプロゲステロン濃度とを検出することが可能な競合イムノアッセイ法を提供することが望ましいだろう。
ある特定のステロイドに関する高感度のアッセイ法を開発する上で特定の抗ステロイド抗体／標識成分対が有効であるかどうかは、その用量反応曲線の情報によって評価することが可能である。ステロイドアッセイに関する用量反応曲線は、「ステロイド被検体の存在下での反応発生速度」対「ステロイド被検体の不在下での反応発生速度」の比を、ステロイド被検体の濃度の関数としてプロットした曲線である。ある特定のステロイドアッセイに関する用量反応曲線は、使用する各々の抗体／標識成分の組合せに特有であり、抗体被検体と標識成分との間の競合によって変化し得る。従って、抗ステロイド抗体／標識成分／ステロイド被検体の組合せのいずれにおいても、相対的に急勾配の用量反応曲線は、その特定の組合せが臨床的に有効なアッセイをもたらす可能性がより一層高いことを示す。
発明の要約
本発明は、競合イムノアッセイ、好ましくは競合酵素イムノアッセイによってステロイドの測定を行うための方法とキットを提供する。本発明の方法とキットは、標識に結合したステロイド類似体の使用を含む。本発明の方法とキットのよる検出に適したステロイドは、エストラジオールとプロゲステロンを含む。
本発明の方法は、
（ａ）所定のステロイドを含むと推測される試験試料と、上記ステロイドに対して特異的な抗体を結合した固相と、上記ステロイドの類似体の結合体との混合物をインキュベートし、上記固相上にステロイド／抗体複合体と結合体／抗体複合体とを形成する段階、
（ｂ）上記混合物から上記固相を分離する段階、
（ｃ）上記混合物中に存在する又は上記固相上に存在する標識の量を測定する段階、及び、
（ｄ）標識の量から上記試料中のステロイドの量を決定する段階、
を含む。
本発明のキットは、ステロイドに対して特異的な抗体を結合した固相と、そのステロイドの類似体の結合体とを含む。
本発明での使用に適したステロイド類似体を、次の構造式で表すことが可能であり、
R1が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R2が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R3が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R4が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R5が、アルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）、又はOHを表し、
Ｌが、標識基を表し、
但し、16位の炭素原子が、酸素原子によって16位の炭素原子に結合する２個の置換基を含まず、且つ、17位の炭素原子が、酸素原子によって17位の炭素原子に結合する２個の置換基を含まない。
本発明での使用に適した別のステロイド類似体を、次の構造式で表すことが可能であり、
R6が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R7が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R8が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R9が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
Ｌが、標識基を表し、
但し、16位の炭素原子が、酸素原子によって16位の炭素原子に結合する２個の置換基を含まず、且つ、17位の炭素原子が、酸素原子によって17位の炭素原子に結合する２個の置換基を含まない。
本発明での使用に適した別のステロイド類似体を、次の構造式で表すことが可能であり、
R10が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R11が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R12が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R13が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
Ｌが、標識基を表し、
但し、16位の炭素原子が、酸素原子によって16位の炭素原子に結合する２個の置換基を含まず、且つ、17位の炭素原子が、酸素原子によって17位の炭素原子に結合する２個の置換基を含まない。
上記式1a、1b及び1cでは、
式1aに関する好ましい置換基は、R1のＨ、R2のOH、R3のＨ、R4のＨ、且つ、R5のOH、又は、R1のOH、R2の−Ｃ≡CH、R3のＨ、R4のＨ、且つ、R5のOHを含む。式1bに関する好ましい置換基は、R6の−CH（OH）CH3、R7のＨ、R8のＨ、且つ、R9のＨを含む。式1cに関する好ましい置換基は、R10のOH、R11のＨ、R12のＨ、且つ、R13のＨを含む。
本発明の主要な利点は、従来のアッセイ方式で使用する場合に得られる、即ち上記結合体のステロイド部分が被検体と同一の化学構造である場合に得られる、抗体の性能に比べて、所与の抗体の性能が向上可能なことである。本発明によって、その結合体のステロイド部分の置換基が異なっているか、又は、標識の位置が異なっているか、又は、結合体のステロイド部分の置換基と標識の位置の両方が異なっている場合、結合体の形で被検体の類似体を使用する競合イムノアッセイにおいて、従来は使用不可能であった抗体、即ち不適切な用量反応曲線をもたらす抗体を、有効に使用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
図１は、抗エストラジオール抗体と様々なエストロゲン−アルカリ性ホスファターゼ結合体の用量反応曲線を示すグラフである。
図２は、抗エストラジオール抗体と様々なステロイド−アルカリ性ホスファターゼ結合体の用量反応曲線を示すグラフである。
図３は、抗エストラジオール抗体と様々なエストロゲン−アルカリ性ホスファターゼ結合体の用量反応曲線を示すグラフである。
図４は、抗エストラジオール抗体と様々なエストロゲン−アルカリ性ホスファターゼ結合体の用量反応曲線を示すグラフである。
図５は、抗エストラジオール抗体と様々なエストロゲン−アルカリ性ホスファターゼ結合体の用量反応曲線を示すグラフである。
図６は、抗プロゲステロン抗体と様々なステロイド−アルカリ性ホスファターゼ結合体の用量反応曲線を示すグラフである。
詳細な説明
本発明の方法は、
（ａ）所定のステロイドを含むと推測される試験試料と、上記ステロイドに対して特異的な抗体を結合した固相と、上記ステロイドの類似体の結合体との混合物をインキュベートし、上記固相上にステロイド／抗体複合体と結合体／抗体複合体を形成する段階、
（ｂ）上記混合物から上記固相を分離する段階、
（ｃ）上記混合物中に存在する又は上記固相上に存在する標識の量を測定する段階、及び、
（ｄ）標識の量から上記試料中のステロイドの量を決定する段階、
を含む。
本発明のキットは、ステロイドに対して特異的な抗体を結合した固相と、そのステロイドの類似体の結合体を含む。
本明細書で使用する場合に、所定の被検体（即ち、ステロイド）の「類似体」は、その被検体と構造的に類似しているが、
（１）少なくとも１つの置換基の向き（例えば、β−OHに対してα−OH）、
（２）所与の置換基の同一性（例えば、−Ｈに対して−Ｃ≡CH）、又は、
（３）ステロイド骨格の環の不飽和度（例えば、ステロイドのＡ環に対してベンゼン環、シクロヘキセン環、又は、シクロヘキサン環）
の少なくとも１つにおいて被検体とは相違している化合物を意味する。
上記ステロイドの骨格を形成するシクロペンタノフェナントレン環のＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ環は、本明細書に参考として組み入れるTexbook of Biochemistry with C linical Correlations,Second Edition,Thomas M.Devlin編,John Wiley ＆ Sons,Inc.（1986）,p.402の図10.22に示されている。
被検体がエストラジオールである場合には、エストラジオール類似体の代表的な例は、
（ａ）17位のβ−OHがα−OHで置き換えられる、
（ｂ）17位のα−OHがエチニル基（−Ｃ≡CH）で置き換えられる、
（ｃ）16位のα−Ｈがα−OHで置き換えられる、又は、
（ｄ）３−ケト−４−エンを与えるようにＡ環の飽和度が変更され、10位でＡ環とＢ環の継目にメチル基が加えられ、且つ、この19位のメチル基に標識が結合される、
上記改変の少なくとも１つが加えられている化合物を非限定的に含む。
しかし、エストラジオール類似体の場合は、17位において、置換基OHと置換基Ｈを、二重結合（例えば、＝Ｏ、又は、＝Ｎ）によって17位の炭素原子に結合する任意の置換基によって置き換えることが不可能である。
被検体がプロゲステロンである場合には、プロゲステロン類似体の代表的な例は、
（ａ）20位の＝Ｏが、β−Ｈとα−OHの両方で置き換えられる、
（ｂ）17位のα−Ｈがα−OHで置き換えられる、又は、
（ｃ）３−ヒドロキシ置換トリエンを与えるようにＡ環の飽和度が変更され、Ａ環とＢ環の継目から10位のメチル基が除去され、17位のβ−COCH3がβ−Ｈで置き換えられ、且つ、17位のα−Ｈがα−OHで置き換えられる、
上記改変の少なくとも１つが加えられている化合物を非限定的に含む。
エストラジオール類似体上の17位の置換基に関しては、そのエストラジオール化合物のβ−OH置換基をα−OH置換基で置き換えることが可能である。しかし、エストラジオール類似体の17位の炭素原子は、酸素原子によって17位の炭素原子に結合する２個の置換基を含まない。例えば、17位の炭素原子は２個の−OH置換基を持たない。17位の置換基は、エストラジオール化合物の−OH置換基とは異なることが可能である。エストラジオール類似体の17位の置換基は、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）であることが可能である。こうしたアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、又はアルコキシ基は、置換されていても非置換であってもよい。しかし、17位の炭素原子に結合する置換基は、二重結合によって17位の炭素原子に結合する基ではない。言い換えれば、17位の置換基は、＝Ｏでも、＝Ｎ−でも、又は、その他の類似物でもない。エストラジオール類似体上の16位の置換基に関しては、こうした置換基は、17位に位置することが可能な置換基と同一であることが可能である。16位の置換基に関する禁則事項は、17位の置換基に関する禁則事項と同一である。上記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、及びアルコキシ基上の置換基の種類は、あまり重要ではない。しかし、こうした置換基は、被検体類似体を使用するイムノアッセイに悪影響を与えるものであってはならない。こうした置換基の代表例は、ヒドロキシル基とアルキル基を非限定的に含む。
本明細書で使用する表現「標識基」は、抗体と被検体又は被検体類似体との間の反応を検出可能にするために、抗体、被検体、又は被検体類似体に結合させられる基を意味する。標識の代表例は、酵素、放射性標識、フルオレセイン、及び、発光化合物を含む。標識は、ステロイド又はステロイド誘導体に結合することが可能であり且つ視覚手段又は装置手段によって検出可能な信号を発生することが可能なあらゆる物質である。本発明での使用に適した様々な標識としては、触媒、酵素、リポソーム、及び、シグナル発生物質（例えば、色素原、触媒、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素等）を含む他の小胞体、等が挙げられる。標識として使用するのに適した幾つかの酵素が、本明細書に参考として組み入れる米国特許第4,275,149号に開示されている。こうした酵素は、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ホスファターゼ（例えば、アルカリ性ホスファターゼ）、及び、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）を含み、これらの酵素は、酵素基質（例えば、フルオレセインジ（ガラクトピラノシド）、ニトロブルーテトラゾリウム、3,5′,5,5′−テトラニトロベンジジン、４−メトキシ−１−ナフトール、４−クロロ−１−ナフトール、４−メチルウンベリフェリルホスフェート、及び、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート）、国際公開第88100694号とEP0−254−051−A2に開示されているジオキセタンのような化学発光酵素基質、並びに、これらの誘導体及び類似体と組み合わせて使用される。標識が酵素であることが好ましく、酵素がアルカリ性ホスファターゼであることが最も好ましい。
本発明は、生物体液中のステロイドを検出し測定するための方法とキットを含む。
本明細書で使用する用語「試験試料」は、被検体を含むと推測される材料を意味する。この試験試料を、供給体から得た状態のまま直接使用することも、試料の特徴を改変するために前処理した後に使用することも可能である。試験試料を、生理的液体（例えば、血液、唾液 眼球水晶体液、脳脊髄液、汗、尿、母乳、腹水、滑液、腹膜液、羊水等）のようなあらゆる生物源から得ることが可能である。血液からの血漿の調製、粘性体液の希釈等のように、試験試料を使用前に前処理することが可能である。こうした処理の方法は、濾過、蒸留、抽出、濃縮、妨害成分の不活性化、試薬の添加等を含むことが可能である。環境アッセイ又は食品生産アッセイを行うためには、水、食品等のような生理的液体以外の液体試料を使用することが可能である。これに加えて、被検体を含むと推測される固体材料を、試験試料として使用することが可能である。場合によっては、液状媒体を形成するように又は被検体を放出させるように固体試験試料を改変することが有益な場合もある。
被検体として特に有効であることが判明しているステロイドは、エストラジオール、プロゲステロン、テストステロン、及び、これらの誘導体を非限定的に含む。
段階（ａ）で使用するのに特に適していることが判明している化合物は、エストラジオールの類似体、プロゲステロンの類似体、及び、エストラジオールの類似体である。
本発明で使用に適したステロイド類似体を次の構造式で表すことが可能であり、
R1が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R2が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R3が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R4が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R5が、アルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）、又はPHを表し、
Ｌが、標識基を表し、
但し、16位の炭素原子が、酸素原子によって16位の炭素原子に結合している２個の置換基を含まず、且つ、17位の炭素原子が、酸素原子によって17位の炭素原子に結合している２個の置換基を含まない。
本発明での使用に適した別のステロイド類似体を、次の構造式で表すことが可能であり、
R6が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R7が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R8が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R9が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
Ｌが、標識基を表し、
但し、16位の炭素原子が、酸素原子によって16位の炭素原子に結合する２個の置換基を含まず、且つ、17位の炭素原子が、酸素原子によって17位の炭素原子に結合する２個の置換基を含まない。
本発明での使用に適した別のステロイド類似体を、次の構造式で表すことが可能であり、
R11が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R12が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
R13が、OH、Ｈ、アルキル基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルキル基）、アルケニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルケニル基）、アルキニル基（好ましくは２個から３個までの炭素原子を有するアルキニル基）、及びアルコキシ基（好ましくは１個から３個までの炭素原子を有するアルコキシ基）から成る群から選択される基を表し、
Ｌが、標識基を表し、
但し、16位の炭素原子が、酸素原子によって16位の炭素原子に結合する２個の置換基を含まず、且つ、17位の炭素原子が、酸素原子によって17位の炭素原子に結合する２個の置換基を含まない。
本発明の方法とキットでの使用に適したエストラジオールの類似体の代表的な例を、次の構造式で表すことが可能である。
1,3,5,［10］−エストラトリエン−17α−エチニル−3,17β−ジオール−６−オン６−CMO（EE2）
４−アンドロステン−17β−オール−3,19−ジオン 19−CMO（T2）
こうした類似体を、当業者に公知の方法で調製することが可能である。上記結合体の前駆体に上記標識を結合させることによって、上記結合体を調製することが好ましい。結合体前駆体は市販されている。例えば上記の６つの代表的な例のような数多くの類似体が市販されており入手可能である。
エストラジオール、プロゲステロン、テストステロン、プレドニソン（prednisone）、及び、コーチゾンのようなステロイド被検体を、一般的なイムノアッセイ方式で検出及び測定することが可能である。しかし、説明を簡潔にするために、エストラジオールイムノアッセイ方法だけを詳細に説明することにする。しかし、天然及び合成の、プロゲステロン、テストステロン、プレドニソン、コーチゾン、及び他のステロイド類を、下記で詳細に説明する方法と実質的に同様の方法で検出及び測定することが可能であることを、当業者は理解するだろう。
エストラジオールに対して特異的である結合相手としては、モノクローナル抗体やポリクローナル抗体のようなエストラジオール特異的結合タンパク質、エストラジオールと特異的に結合するその他のエストラジオール特異的合成及び組換えタンパク質、等が挙げられる。例えば、エストラジオールのようなステロイドに特異的に結合するモノクローナル抗体やポリクローナル抗体を生産することが可能であることが、当業者に公知である。典型的には共有結合によって担体タンパク質（例えば、アルブミン）に結合したエストラジオール又はエストラジオール誘導体を含む免疫原を動物に注射すると、その動物の免疫系が、エストラジオールに特異的に結合するポリクローナル抗体を産生するだろう。マウス又はラットを使用して被検体に対するモノクローナル抗体を調製するための一般的な方法が、当業者に公知である。更に最近では、被検体特異的合成及び組換えタンパク質を調製するための方法が報告されており、この方法を、本発明で有用であるエストラジオール特異的合成及び組換えタンパク質の調製に容易に適用することが可能である。
エストラジオール特異的結合相手が結合している固相を使用して、エストラジオールを測定することが好ましい。固相の例は微小粒子である。固相に結合したステロイド結合体の量、又は、溶液中に残留するステロイド結合体の量を測定することが可能であるように、固相と試験試料を分離する。固相に結合したステロイド結合体の量、又は、溶液中に残留するステロイド結合体の量を、結合体中の標識として酵素を使用する酵素イムノアッセイによって測定することが好ましい。酵素基質と呼ぶ材料を、適切な酵素によって蛍光化合物（例えば、４−メチルウンベリフェロン）に変換することが可能である。蛍光化合物が形成される速度は、反応混合物中に存在する酵素の量を表す。酵素イムノアッセイの場合のように酵素が標識である時には、存在する酵素の量は、試験試料中に含まれるエストラジオールの量に関連している。従って、試験試料中に存在するエストラジオールの量を定量するために蛍光の測定を使用することが可能である。典型的には標準曲線と呼ばれる、エストラジオール濃度の関数として酵素活性を示すプロットによって、固相上又は溶液中のステロイド結合体の量を、試験試料中のエストラジオール濃度に相関させることが可能である。下記の表Ｉに示すようなキャリブレータ（検量物質）を使用して上記アッセイを行うことによって、標準曲線を得ることが可能である。標準曲線が有効であることを確認するために、対照を使用する。未知のエストラジオール濃度を有する試料をアッセイする場合には、測定したアッセイシグナルを標準曲線と比較し、その測定シグナルに対応するエストラジオール濃度が試料のエストラジオール濃度である。
特異的結合相手を、物理的又は化学的手段によって、好ましくは共有結合によって、固相に結合させることが可能である。この特異的結合相手は、後続の反応段階と洗浄段階においてその特異的結合相手が脱着することが実質的に無いように、固相に結合させられなければならない。選択される特異的結合相手と結合方法とに無関係に、特異的結合相手は、固相に結合させられた後に、エストラジオールやステロイド結合体に結合することが可能でなければならない。
本発明による固相は、微小粒子と、その微小粒子に化学的又は物理的に結合したエストラジオールに対して特異的である結合相手との混合物であることが可能である。本発明で使用可能な微小粒子は、ポリマー材料で作られることが好ましく、スチレン単位を有するポリマー又はアクリル酸（acrylate）単位を有するポリマーから得られる微小粒子を含むことが更に好ましい。微小粒子が実質的に球形であり、且つ、約0.1μｍから約0.25インチまでの範囲内の半径を有することが好ましい。試験試料からこうした微小粒子を分離するための好ましい方法は、ガラス繊維のような多孔性マトリックス上に微小粒子を捕獲することを含む。
本発明で使用可能な他の固相は、その微小粒子に物理的又は化学的に結合したエストラジオールに対して特異的である結合相手を有する、磁気微小粒子の混合物であることが可能である。本発明で使用可能な磁気微小粒子は、酸化鉄（III）又は酸化クロムのコアとポリマー被覆とを有することが好ましい。こうした被覆は、スチレン単位を有するホモポリマーとコポリマー、カルボキシル化スチレン単位を有するホモポリマーとコポリマー、又は、アクリル酸もしくはメタクリル酸単位を有するホモポリマーもしくはコポリマーで作られることが好ましい。当業者に公知の他の固相は、反応トレイ穴の壁、チューブ、ポリマービーズ、ニトロセルロースストリップ、メンブラン等を含む。天然材料、合成材料、及び、人為的に改変された天然材料を、固相材料として使用することが可能である。こうした材料は、例えばセルロース材料（例えば、紙及びセルロース誘導体（例えば、酢酸セルロース、及び、ニトロセルロース））のような多糖類、シリカ、無機材料（例えば、不活性化アルミナ、けい藻土、MgSO4、及び、塩化ビニルのホモポリマー及びコポリマー（例えば、ポリ塩化ビニル、塩化ビニル−プロピレンコポリマー、及び、塩化ビニル−酢酸ビニルコポリマー）のような１つ以上のポリマーを含むことが可能な多孔性ポリマーマトリックス中に均一に分散した上記又は他の無機微粉砕材料）、天然布（例えば、綿）と合成布（例えば、ナイロン）、多孔性ゲル（例えば、シルカゲル、アガロース、デキストラン、ゼラチン）、並びに、ポリマーフィルム（例えば、ポリアクリルアミド）等を含む。いずれの場合にも、固相は、所期の形状を維持するのに十分な強度を持たなければならず、且つ、検出可能なシグナルの発生に干渉してはならない。この強度は支持体によって与えられることが可能である。
別の分離方法が、両方とも共通の所有者が享受し且つ本明細書に参考として組み入れる1988年１月20日付で出願された米国特許出願番号150,278（放棄）と1989年７月７日付けで出願された米国特許出願番号375,029（放棄）とに開示されている。これらの出願に対応する公開された出願は、本明細書に参考として組み入れる1992年12月10日付けで公開された国際公開第92/21980号である。これらの文献は、イオン捕獲分離を含み、この場合、アッセイで使用する特異的結合相手は、第１のポリイオン化合物と、この第１のポリイオン化合物に結合する第２のポリイオン化合物に結合している多孔性マトリックスとの両方に化学的に結合させられる。特異的結合対が形成され、第１のポリイオン化合物と第２のポリイオン化合物との間の静電的相互作用によって反応混合物から分離される。その特異的結合対の特異的結合相手が第１のポリイオン化合物に共有結合していることが好ましい。
第１のポリイオン化合物は、ポリアニオン酸（例えば、ポリアスパラギン酸、ヘパリン、カルボキシルメチルアミロース、ポリグルタミン酸、又は、ポリアクリル酸）であり、第２のポリイオン化合物は、カチオンポリマー（例えば、ポリマー第四級アンモニウム化合物（「GafQuattum」、GAF Corporation,Wayne,N.J.,07470）、ジエチルアミノエチル−デキストラン（Sigma Chemical Company,St.Louis,Mo.）、水溶性セルロース誘導体（例えば、両方ともポリマー第四級化合物である商標「Celquat Ｌ−200」及び「Celquat Ｈ−100」のセルロース誘導体（National Starch ＆ Chemical Corporation,Bridgewater,N.J.08807）、又は、MerquatTM100（Calgon Corporation）である。多孔性マトリックスをカチオンポリマーで処理して、そのマトリックスに正電荷を与える。そのカチオンポリマーを、吸収、吸着、又は、共有結合もしくはイオン結合によってマトリックスに結合させる。反応生成物の分離、正帯電マトリックスと負帯電ポリアニオン複合体との間の静電的相互作用によって実施する。
本発明での使用に適した多孔性マトリックスは、適した多孔性材料のいずれであってもよい。本明細書で使用する場合の用語「多孔性材料」は、流体がその中を通って流れ容易に通過することが可能な材料を意味する。この多孔性マトリックスに適した材料の代表的な例は、非限定的に、オレフィンポリマー（例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、及び、フッ素化オレフィンポリマー（例えば、ポリテトラフルオロエチレン））、ガラス繊維、セルロース、又は、ナイロンを含む。
多孔性マトリックスの好ましい材料は、公称厚さ0.33mmを有する「Whatman 934−AH」フィルターペーパーのような多孔性ガラス繊維材料、又は、ディスポーザブルIMxTMカートリッジ及びTestPackTM（ファイバ−マトリックス）装置（Abbott Laboratories,Abbott Park,IL,60064）を含む。こうした材料の厚さは重要ではなく、試験試料又はアッセイする被検体の特性（例えば、試験試料の流動性）に基づく選択の問題である。
上記のように、適切な酵素によって酵素基質を４−メチルウンベリフェロンのような蛍光化合物に変換することが可能である。蛍光化合物が形成される速度が、反応混合物中に存在する酵素の量を表す。こうした酵素が標識である場合には、存在する酵素の量が、試験試料中に存在するエストラジオールの量に関係付けられる。従って、酵素イムノアッセイの酵素活性によって生じる蛍光の測定を、試験試料中に存在するエストラジオールの量を定量するために使用することが可能である。当業者で公知の任意の方法で蛍光を測定することが可能である。例えば、蛍光スペクトロメーターを使用することが可能である。視覚スペクトロメーターによって、又は、高集光力の分光器を使用して写真によって、蛍光スペクトルを観察することも可能である。
好ましい実施様態では、蛍光をIMxTM自動ベンチトップアナライザー（Abbott Laboratories,Abbott Park,IL）を使用して検出することが可能である。このアナライザーは、光源として水銀アークランプを使用する蛍光光度計を含む光学アセンブリを含む。この装置は、本明細書に参考として組み入れるFiore他（Clin.Chem.,34/9:1726−1732,1988）によって説明されている。この装置では、結合体と試験試料とに接触させた抗エストラジオール抗体を含む微小粒子を捕獲するために、IMxTMディスポーザブルカートリッジ（Abbott Laboratories,Abbott Park,ILから市販され入手可能）を使用する。結合体で使用する標識がアルカリ性ホスファターゼであることが好ましい。試験試料中のエストラジオールが、微小粒子上の抗エストラジオール抗体に結合する。反応混合物から微小粒子を分離し、結合体を微小粒子に加え、入手可能な抗エストラジオール抗体に結合体が結合し、微小粒子上に存在する結合体の量を、４−メチルウンベリフェリルホスフェートが４−メチルウンベリフェロンに変換される速度から定量する。試験試料中のエストラジオールの量を、エストラジオール濃度の関数としての４−メチルウンベリフェロン形成速度の標準曲線から決定することが可能である。この標準曲線は検量線としても知られている。
一般的に、４−メチルウンベリフェロン形成速度をエストラジオール濃度に関係付ける標準曲線を、既知のエストラジオール濃度を有するキャリブレータ溶液から得る。検量線を得るために６つのキャリブレータを使用することが好ましいが、求める結果の正確さと精度に応じて、それよりも多いか少ない数のキャリブレータを使用することが可能である。次第に増加する量のエストラジオールをキャリブレータが含むことが好ましい。例えば、表Ｉは、IMxTMEstradiolアッセイのための、１組のキャリブレータの組成を示している。一般的に、検量線又はアッセイ試薬の有効性を確認するために、アッセイと組み合わせて対照を使用する。この対照の調合は、キャリブレータの調合と異なっていてもよく、特定の対照のエストラジオール濃度は、どのキャリブレータのエストラジオール濃度とも同一でなくてよい。例えば、エストラジオール濃度150pg/mL、500pg/mL及び1125pg/mLを有する対照が、表Ｉのキャリブレータに適した対照だろう。当業者は、他のキャリブレータ調合物と対照調合物を考案することが可能だろう。
下記の実施例は本発明を例示するが、添付の請求の範囲で定義する本発明の範囲を限定すると解釈されてはならない。全てのパーセンテージは、特に明示しない限り、100ミリリットル（mL）体積当たりのグラム（ｇ）重量（w/v）による。
実施例１
エストラジオールアッセイ
次の手順に従ってIMxTM装置によってIMxTMディスポーザブルカートリッジ上でエストラジオールアッセイを行った。血清試料（75μＬ）を、IMxTMEstradiol Assay緩衝液（35μＬ）、抗エストラジオール抗体で被覆したIMxTMEstradiol微小粒子（60μＬ）、及び、IMxTMBuffer（90μＬ）と混合し、反応混合物を調製した。その反応混合物を温度35℃で27.5分間インキュベートした。
IMxTMEstradiol Assay緩衝液は、５α−ジヒドロテストステロン（２μg/mL）、0.75％（w/v）サポニン、0.5Mグリシン、0.25mMクエン酸ナトリウム、及び、0.12％メチルイソチアゾリノン（w/v）（全体でpH4.5）で構成されていた。抗エストラジオール抗体で被覆したIMxTMEstradiol微小粒子（0.005−0.02％固体、w/v）を、0.1Mビス−（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（以下では、「Bis−Tris」と呼ぶ）、0.1M塩化ナトリウム、13.6％スクロース（w/v）、0.1％アジ化ナトリウム（w/v）、及び、0.2mg/mL正常ウサギIgG（全体でpH6.5）で構成されたIMxTMEstradiol Assay緩衝液中に懸濁させた。IMxTMBuffeerは、0.3M NaCl、0.1Mトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下では「Tris」と呼ぶ）、及び、0.1％アジ化ナトリウム（w/v）（全体でpH7.5）で構成された。
175μＬの反応混合物をIMxTMディスポーザブルカートリッジのファイバーマトリックスに移した。そのファイバーマトリックスをIMxTMカートリッジの吸收パッド上に置いた。微小粒子をフィルターマトリックスで捕獲し、溶液を上記吸収パッドで吸収した。その後で微小粒子をIMxTMBufferで洗浄した。ステロイド−アルカリ性ホスファターゼ結合体（60μＬ）を上記マトリックスに加え、温度35℃で12秒間インキュベートし、再びIMxTMBufferで洗浄した。その結合体（２−８μg/mLアルカリ性ホスファターゼ）を、0.1M Bis−Tris、0.5M塩化ナトリウム、１％カゼイン（w/v）、1mM塩化マグネシウム、0.1mM塩化亜鉛、及び、0.1％アジド（w/v）（全体でpH6.5）で構成された結合体緩衝液中に存在させた。様々なステロイド−アルカリ性ホスファターゼ結合体の調製を実施例４で説明する。
0.1M ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝液（pH9）中の４−メチルウンベリフェロンホスフェート（65μＬ）の1.2mM溶液を、上記マトリックスに加え、蛍光反射率によって４−メチルウンベリフェロン形成速度を測定した。その内容が既に本明細書に組み入れられているFiore他,Clin.Chem.,34/9:1726−1732,1988に説明されている通りに、光源として水銀アークランプを使用する蛍光光度計を使用して、IMxTM装置で蛍光を測定した。
IMxTMEstradiol緩衝液、IMxTMEstradiol抗エストラジオール抗体被覆微小粒子、結合体、メチルウンベリフェロンホスフェート基質、IMxTMBuffer、IMxTMディスポーザブルカートリッジ、及び、IMxTM装置を含む上記アッセイに必要なものは、Abbott Laboratories,Abbott Park,ILから市販され入手可能であり、米国特許第5,342,760号、欧州特許出願公開第288 793号、及び、Fiore他,Clin.Chem.,34/9:1726−1732,1988（これら全てを本明細書に参考として組み入れる）に説明されている。
実施例２
プロゲステロンアッセイ
実施例１のエストラジオールアッセイに使用した手順と同様の手順でIMxTM装置によってIMxTMディスポーザブルカートリッジ上でプロゲステロンアッセイを行った。血清試料（50μＬ）を、プロゲステロン試料緩衝液（80μＬ）、抗プロゲステロン抗体で被覆した微小粒子（80μＬ）、及び、IMxTMBuffer（40μＬ）と混合した。その反応混合物を温度35℃で20.8分間インキュベートした。
プロゲステロン試料緩衝液は、2.25Mグリシン,5α−ジヒドロテストステロン（0.5μg/mL）、0.2％（w/v）サポニン（EM Industries,Hawthorne,NY）、0.1M塩化ナトリウム、及び、0.1％メチルイソチアゾリノン（w/v、Rohm and Haas,Philadelphia,PA）（全体でpH2.8）で構成された。抗プロゲステロン抗体（BiosPacific,Emeryville,CA）で被覆した微小粒子（Seradyne,Indianapolis,IN）は、0.5Mモルホリノエタンスルホン酸（MES）、0.1M塩化ナトリウム、10％スクロース（w/v）、２％ウシ血清アルブミン（w/v、Intergen,Purchase,NY）、0.1mg/mLマウスIgG（Stellar Biosystems,Columbia,MDから入手したマウス血清の50％（w/v）硫酸アンモニウムカツト）、及び、0.2％アジ化ナトリウム（w/v）を含む緩衝液（全体でpH6.5）中に懸濁された0.003％（w/v）固体を含んでいた。
175μＬの反応混合物をIMxTMディスポーザブルカートリッジのファイバーマトリックスに移した。その後で微小粒子をIMxTMBufferで洗浄した。ステロイド−アルカリ性ホスファターゼ結合体（60μＬ）を上記マトリックスに加え、温度35℃で８秒間インキュベートし、再びIMxTMBufferで洗浄した。その結合体（２−15μg/mLアルカリ性ホスファターゼ）を、50mM Tris、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、0.1mM塩化亜鉛、0.5％カゼイン（w/v、Sigma Chemical Company,St.Louis,MO）、及び、0.1％アジ化ナトリウム（w/v）（全体でpH7.4）で構成される結合体緩衝液中に存在させた。
４−メチルウンベリフェロンホスフェートの添加と、４−メチルウンベリフェロン形成速度の測定を、実施例１で説明した方法で行った。
実施例３
抗体被覆微小粒子の調製
抗体で被覆した微小粒子を次のように調製した。
（ａ）マウス抗エストラジオールモノクローナル抗体（BiosPacific A3268;Bingenesis 2F−9,Sandown NH;Medix MBE 0107,San Carlos,CA）と抗プロゲステロンモノクローナル抗体（BiosPacific 087）を購入し、抗エストラジオールポリクローナル抗体（BiosPacific B4996及びMedix M17794）も購入した。
（ｂ）フロイント完全アジュバント中のウシ血清アルブミンに結合したエストラジオール６−（Ｏ−カルボキシメチル）オキシム（Sigma Chemical Company,St.Louis,MO、及び、Steraloids,Wilton,NH）を注射し、フロイント不完全アジュバントでブーストすることによって、ウサギ抗エストラジオールポリクローナル抗体を調製した。
（ｃ）（１％固体（w/v）の最終反応濃度を得るのに十分な）ラテックス微小粒子を、50mM MES緩衝液（pH4.5）と1mg/mLの抗体と混合した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDAC）を加えて0.5mg/mLの最終濃度にした。混合物を室温で30分間インキュベートした後に、0.1％Tween 20界面活性剤（v/v）と0.1M塩化ナトリウムとを含む0.1M Tris（pH7.4）で、上記微小粒子を３回洗浄した。その後で微小粒子を微小粒子保存緩衝液中に再懸濁させた。抗エストラジオール抗体被覆微小粒子保存緩衝液については実施例１で説明してあり、抗プロゲステロン抗体被覆微小粒子保存緩衝液については実施例２で説明してある。これらの微小粒子調合物を使用するアッセイを実施例５で説明する。
実施例４
ステロイド−アルカリ性ホスファターゼ結合体の調製
ステロイド−アルカリ性ホスファターゼ結合体を次のように調製した。
（ａ）当該結合体に使用するステロイド誘導体10μｇと、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド10μｇを、ジメチルホルムアミド（無水）100μＬ中に溶解した。EDAC 40μｇをその溶液に加えた。ウシ腸アルカリ性ホスファターゼと共にエストラジオール類似体とプロゲステロン類似体を使用して様々な結合体を生産するために使用するステロイドを表IIに示す。
（ｂ）段階（ａ）の混合物のアリコートを、ステロイド：酵素のモル比が10:1（テストステロンの場合には20:1）であるように、炭酸緩衝液（pH8）中のアルカリ性ホスファターゼ（Boehringer Mannheim,Germanyから入手可能）に加えた。その結果得たステロイド−アルカリ性ホスファターゼ結合体を、G25 Sephadexカラム上の未結合ステロイドや他の低分子量材料から分離した。分離した結合体のアリコートを抜き出し、このアリコートを希釈して、エストラジオール結合体緩衝液又はプロゲステロン結合体緩衝液中で約１μg/mLから約20μg/mLまでの濃度に希釈した。実施例１は、エストラジオールアッセイとIMxTM装置を使用するアッセイとで使用する結合体を説明する。実施例２は、プロゲステロンアッセイとIMxTM装置を使用するアッセイとで使用する結合体を説明する。
抗エストラジオール抗体／ステロイド結合体マトリック ス
マウスモノクローナル抗体とウサギポリクローナル抗体の両方を含む幾つかの抗エストラジオール抗体を、実施例１で説明したアッセイ法において様々なステロイドアルカリ性ホスファターゼ結合体に関する速度比の値を得るために試験した。これに加えて、実施例２で説明したアッセイ法で３つのステロイド−アルカリ性ホスファターゼ結合体を使用して抗プロゲステロン抗体を試験した。その結果を表IIIに示す。
用量反応を、速度比の値を測定することによって評価した。本明細書で使用する場合の用語「速度比の値」は、「被検体を含まない場合に観察されるアッセイシグナルの値」（この実施例では、表III、キャリブレータＡ）で「特定の被検体濃度で観察されるアッセイシグナルの値」（この例では、表III、キャリブレータＦ）を割ることによって得られる商を意味する。Abbott IMxTM装置は、１秒間当たりの毎秒蛍光カウント（cps/s）を単位としてアッセイシグナルを測定する。速度比の値は無次元数であり、異なったアッセイからのデータを正規化し、それによって、異なったアッセイ又はアッセイフォーマットの直接的な比較を可能にする。便宜上、速度比の値を、キャリブレータＦからのシグナルとキャリブレータＡからのシグナルとから計算した。エストラジオールアッセイでは、キャリブレータＦは3000pg/mLエストラジオールの濃度であり、プロゲステロンアッセイでは、キャリブレータＦは、40ng/mLプロゲステロンの濃度である。キャリブレータＡは被検体を含まない。
700以上の異なった抗体／ステロイド結合体の組合せのスクリーンからのキャリブレータF/キャリブレータＡ比に関する速度比の値の代表的なサンプリングを、表IIIに示す。８つのステロイド結合体と、極めて低い速度比の値を有する代表的ないくつかのマウスモノクローナル抗体及びウサギポリクローナル抗体を示している。一例として、ポリクローナル抗体Rabbit 438の場合には、試験した８つのステロイド結合体に関する最小の速度比の値が、エチニルエストラジオール（EE2）結合体で得られ、この場合、速度比の値は0.20だった。試験した700値の抗体／ステロイド結合体組合せの場合に、エストラジオールアッセイにおいてエストラジオール結合体もエストロン結合体も最良の用量反応を生じさせなかった。この実施例では、エストラジオール（E2）とエストロン（E1）の具体例は、比較例である。これらは、エストラジオールアッセイの類似体を構成しない。
ポリクローナルRabbit 583抗体とエストラジオール結 合体及びエストラジオール類似体結合体との用量反応曲 線
図１から図６に示すように、特定のステロイドアッセイにおける速度比の値のパターンは、使用する抗体／ステロイド結合体の組合せの各々に特有である。速度比の値は、「特定の被検体濃度で観察されるアッセイシグナル」の「被検体が存在しない場合に観察されるアッセイシグナル」に対する比である。速度比の値を、任意の所期被検体濃度で測定することが可能である。この実施例では、エストラジオールキャリブレータＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦ（表Ｉ）を、臨床的に有用なエストラジオール濃度範囲に亙って速度比の値を測定するために使用した。所定の抗体／ステロイド結合体の組合せにおける速度比の値を、被検体濃度の関数としてプロットし、用量反応曲線を得る。選択した抗エストラジオール抗体／結合体組合せの用量反応曲線を、IMxTMEstradiolアッセイのダイナミックレンジ（０−3000pg/mL）全体に亙って調べた。図１は、Rabbit 583からの抗エストラジオールポリクローナル抗体と様々なエストロゲン結合体とに関して観察される、様々な用量反応曲線を示す。
いずれかの特定のキャリブレータ（例えばキャリブレータＦ）における低い速度比の値が、急勾配の用量反応曲線に関連付けられることが理解できるだろう。本明細書で使用する場合に表現「急勾配の用量反応曲線」は、低濃度における被検体の小さな濃度変化（即ち、その曲線の横軸）が、大きな速度比の値の変化（即ち、その曲線の縦軸）を生じさせることを意味する。この点を更に明確に述べると、図１において、17αE2の用量反応曲線がE1とE3の用量反応曲線よりも急勾配であり、E1とE3の用量反応曲線がE2とEE2の用量反応曲線よりも急勾配である。ポリクローナル抗体Rabbit 583の場合には、17αE2結合体が最も急勾配の用量反応曲線を生じさせ、同様に、最も低いキャリブレータF/キャリブレータＡ速度比の値（0.03）を生じさせた。表IIIと図１を参照されたい。用量反応曲線が相対的に急勾配であることは、キャリブレータＦの速度比の値の大きさに逆に関係付けられる（表IIIと実施例５を参照されたい）。
低被検体濃度領域内のより急勾配の用量反応曲線は、その領域内の被検体濃度をより正確に推測することを可能にする。従って、低被検体濃度領域内において特定の抗体／ステロイド組合せがより急勾配の用量反応曲線を有することは、その組合せが、比較的低いステロイド濃度をより正確に測定することが可能なイムノアッセイを実現し、したがって、臨床的により適切なアッセイを可能にすることを示している。低ステロイド濃度における濃度の小さな差異を正確に測定することは、受胎能を診断するために使用するステロイドアッセイの主要な臨床的有用性の１つであると考えられる。
実施例７
ポリクローナルRabbit 2522抗体とステロイド類似体結 合体との用量反応曲線
図２は、Rabbit 2522からの抗エストラジオールポリクローナル抗体と様々なステロイド類似体の結合体とにおいて観察される様々な用量反応曲線を示す。この抗体の場合には、芳香Ａ環を含む結合体ハプテン以外の結合体ハプテンの場合に、最小の速度比の値が観察された。プロゲステロン類似体17αＰの用量反応曲線は、テストステロンT2の用量反応曲線よりも急勾配であり、テストステロンT2の用量反応曲線はエストロゲン17αE2、EE2及びE2の用量反応曲線よりも急勾配である。
実施例８
ポリクローナルRabbit 438抗体とエストラジオール結 合体及びエストラジオール類似体結合体との用量反応曲 線
図３は、Rebbit 438からの抗エストラジオールポリクローナル抗体とエストラジオール結合体又は様々なエストラジオール類似体の結合体とにおいて観察される様々な用量反応曲線を示す。この抗体の場合には、エチニルエストラジオール結合体ハプテン（EE2）において、最も急勾配の用量反応曲線が観察された。
実施例９
ポリクローナルRabbit 581抗体とエストラジオール結 合体及びエストラジオール類似体結合体との用量反応曲 線
図４は、Rabbit 581からの抗エストラジオールポリクローナル抗体とエストラジオール結合体又は様々なエストラジオール類似体結合体とにおいて観察される様々な用量反応曲線を示す。この抗体の場合には、17α−エストラジオール結合体ハプテン（17αE2）において、最も急勾配の用量反応曲線が観察された。
実施例10
マウスモノクローナルA3268抗体とエストラジオール結 合体及びエストラジオール類似体結合体との用量反応曲 線
図５は、BiosPacificから入手した抗エストラジオールマウスモノクローナル抗体A3268とエストラジオール結合体又は様々なエストラジオール類似体の結合体とにおいて観察される様々な用量反応曲線を示す。この抗体の場合には、エストリオール結合体ハプテン（E3）において、最も急勾配の用量反応曲線が観察された。
実施例11
マウスモノクローナル087抗体とステロイド類似体結合 体との用量反応曲線
抗プロゲステロン抗体／結合体組合せにおける用量反応曲線を、０−40ng/mLの範囲に亙って調べた（プロゲステロンキャリブレータＡからキャリブレータＦまで）。図６は、BiosPacificからの抗プロゲステロンマウスモノクローナル抗体087と、ステロイド類似体17α−ヒドロキシプロゲステロン（17αＰ）結合体とテストステロン（T2）結合体とにおいて観察される様々な用量反応曲線を示す。この抗体の場合には、構造的により類似したプロゲステロン類似体である17α−ヒドロキシプロゲステロンに比較して、用量反応曲線の著しい改善がテストステロン結合体で観察された。プロゲステロンアッセイにおけるキャリブレータＡからキャリブレータＦは次の通りである。キャリブレータＡ＝プロゲステロン 0ng/mL、キャリブレータＢ＝プロゲステロン 1.0ng/mL、キャリブレータＣ＝プロゲステロン 4.0ng/mL、キャリブレータＤ＝プロゲステロン 10ng/mL、キャリブレータＥ＝プロゲステロン 20ng/mL、及び、キャリブレータＦ＝プロゲステロン 40ng/mL。
本発明の範囲と思想から逸脱することなく、本発明の様々な改変と変更が当業者に明らかになるだろう。本発明は、本明細書で説明した実施様態に不当に限定されるべきでないということを理解されたい。
Claims (27)
- 試験試料中のエストラジオールの量を測定するための方法であって、
（ａ）エストラジオールを含むと推測される試験試料と、エストラジオールに対して特異的な抗体を結合した固相と、エストラジオール類似体の結合体との混合物をインキュベートし、前記固相上にエストラジオール／抗体複合体と結合体／抗体複合体とを形成する段階、
（ｂ）前記混合物から前記固相を分離する段階、
（ｃ）前記混合物中に存在する又は前記固相上に存在する標識の量を測定する段階、及び、
（ｄ）標識の量から前記試料中のエストラジオールの量を決定する段階、
を含み、前記エストラジオール類似体の結合体が下記式 1a:
［式中、R 1 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、ア ルキニル基及びアルコキシ基から成る群から選択される 基を表し、
R 2 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、アルキニル 基及びアルコキシ基から成る群から選択される基を表 し、
R 3 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、アルキニル 基及びアルコキシ基から成る群から選択される基を表 し、
R 4 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、アルキニル 基及びアルコキシ基から成る群から選択される基を表 し、
R 5 は、アルコキシ基又はOHを表し、
Ｌは、標識基を表し、
但し、16位の炭素原子が、酸素原子によって16位の炭素 原子に結合する２個の置換基を含まず、且つ、17位の炭 素原子が、酸素原子によって17位の炭素原子に結合する ２個の置換基を含まない。］
を有する前記方法。 - 前記エストラジオール類似体が式：
を有する請求項１に記載の方法。 - 前記エストラジオール類似体が式：
を有する請求項１に記載の方法。 - 前記エストラジオール類似体が式：
を有する請求項１に記載の方法。 - エストラジオールに対して特異的である抗体を結合した固相とエストラジオール類似体の結合体とを含む、エストラジオールについて競合イムノアッセイを行うためのキットであって、前記エストラジオール類 似体の結合体が式1a:
［式中、R 1 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、ア ルキニル基及びアルコキシ基から成る群から選択される 基を表し、
R 2 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、アルキニル 基及びアルコキシ基から成る群から選択される基を表 し、
R 3 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、アルキニル 基及びアルコキシ基から成る群から選択される基を表 し、
R 4 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、アルキニル 基及びアルコキシ基から成る群から選択される基を表 し、
R 5 は、アルコキシ基又はOHを表し、
Ｌは、標識基を表し、
但し、16位の炭素原子が、酸素原子によって16位の炭素 原子に結合する２個の置換基を含まず、且つ、17位の炭 素原子が、酸素原子によって17位の炭素原子に結合する ２個の置換基を含まない。］
を有する前記キット。 - 前記エストラジオール類似体が式：
を有する請求項５に記載のキット。 - 前記エストラジオール類似体が式：
を有する請求項５に記載のキット。 - 前記エストラジオール類似体が式：
を有する請求項５に記載のキット。 - 下記式1a:
［式中、R 1 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、ア ルキニル基及びアルコキシ基から成る群から選択される 基を表し、
R 2 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、アルキニル 基及びアルコキシ基から成る群から選択される基を表 し、
R 3 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、アルキニル 基及びアルコキシ基から成る群から選択される基を表 し、
R 4 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、アルキニル 基及びアルコキシ基から成る群から選択される基を表 し、
R 5 は、アルコキシ基又はOHを表し、
Ｌは、標識基を表し、
但し、16位の炭素原子が、酸素原子によって16位の炭素 原子に結合する２個の置換基を含まず、且つ、17位の炭 素原子が、酸素原子によって17位の炭素原子に結合する ２個の置換基を含まない。］を有するエストラジオール 類似体の結合体。 - 前記エストラジオール類似体が式：
を有する請求項９に記載の結合体。 - 前記エストラジオール類似体が式：
を有する請求項９に記載の結合体。 - 前記エストラジオール類似体が式：
を有する請求項９に記載の結合体。 - 試験試料中のプロゲステロンの量を測定するための方法であって、
（ａ）プロゲステロンを含むと推測される試験試料と、プロゲステロンに対して特異的な抗体を結合した固相と、プロゲステロン類似体の結合体との混合物をインキュベートし、前記固相上にプロゲステロン／抗体複合体と結合体／抗体複合体とを形成する段階、
（ｂ）前記混合物から前記固相を分離する段階、
（ｃ）前記混合物中に存在する又は前記固相上に存在する標識の量を測定する段階、及び、
（ｄ）標識の量から前記試料中のプロゲステロンの量を決定する段階、
を含み、前記プロゲステロン類似体の結合体が下記式1 b:
［式中、R 6 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、ア ルキニル基及びアルコキシ基から成る群から選択される 基を表し、
R 7 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、アルキニル 基及びアルコキシ基から成る群から選択される基を表 し、
R 8 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、アルキニル 基及びアルコキシ基から成る群から選択される基を表 し、
R 9 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、アルキニル 基及びアルコキシ基から成る群から選択される基を表 し、
Ｌは、標識基を表し、
但し、16位の炭素原子が、酸素原子によって16位の炭素 原子に結合する２個の置換基を含まず、且つ、17位の炭 素原子が、酸素原子によって17位の炭素原子に結合する ２個の置換基を含まない。］
を有する前記方法。 - 前記プロゲステロン類似体が式：
を有する請求項13に記載の方法。 - 前記プロゲステロン類似体が式：
を有する請求項13に記載の方法。 - 試験試料中のプロゲステロンの量を測定するための方法であって、
（ａ）プロゲステロンを含むと推測される試験試料と、プロゲステロンに対して特異的な抗体を結合した固相と、プロゲステロン類似体の結合体との混合物をインキュベートし、前記固相上にプロゲステロン／抗体複合体と結合体／抗体複合体とを形成する段階、
（ｂ）前記混合物から前記固相を分離する段階、
（ｃ）前記混合物中に存在する又は前記固相上に存在する標識の量を測定する段階、及び、
（ｄ）標識の量から前記試料中のプロゲステロンの量を決定する段階、
を含み、前記プロゲステロン類似体の結合体が下記式1 c:
［式中、R 10 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、 アルキニル基及びアルコキシ基から成る群から選択され る基を表し、
R 11 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、アルキニ ル基及びアルコキシ基から成る群から選択される基を表 し、
R 12 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、アルキニ ル基及びアルコキシ基から成る群から選択される基を表 し、
R 13 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、アルキニ ル基及びアルコキシ基から成る群から選択される基を表 し、
Ｌは、標識基を表し、
但し、16位の炭素原子が、酸素原子によって16位の炭素 原子に結合する２個の置換基を含まず、且つ、17位の炭 素原子が、酸素原子によって17位の炭素原子に結合する ２個の置換基を含まない。］
を有する前記方法。 - 前記プロゲステロン類似体が式：
を有する請求項16に記載の方法。 - プロゲステロンに対して特異的である抗体を結合した固相とプロゲステロン類似体の結合体とを含む、プロゲステロンについて競合イムノアッセイを行うためのキットであって、前記プロゲステロン類似体の 結合体が式1b:
［式中、R 6 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、ア ルキニル基及びアルコキシ基から成る群から選択される 基を表し、
R 7 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、アルキニル 基及びアルコキシ基から成る群から選択される基を表 し、
R 8 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、アルキニル 基及びアルコキシ基から成る群から選択される基を表 し、
R 9 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、アルキニル 基及びアルコキシ基から成る群から選択される基を表 し、
Ｌは、標識基を表し、
但し、16位の炭素原子が、酸素原子によって16位の炭素 原子に結合する２個の置換基を含まず、且つ、17位の炭 素原子が、酸素原子によって17位の炭素原子に結合する ２個の置換基を含まない。］
を有する前記キット。 - 前記プロゲステロン類似体が式：
を有する請求項18に記載のキット。 - 前記プロゲステロン類似体が式：
を有する請求項18に記載のキット。 - プロゲステロンに対して特異的である抗体を結合した固相とプロゲステロン類似体の結合体とを含む、プロゲステロンについて競合イムノアッセイを行うためのキットであって、前記プロゲステロン類似体の 結合体が式1c:
［式中、R 10 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、 アルキニル基及びアルコキシ基から成る群から選択され る基を表し、
R 11 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、アルキニ ル基及びアルコキシ基から成る群から選択される基を表 し、
R 3 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、アルキニル 基及びアルコキシ基から成る群から選択される基を表 し、
R 13 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、アルキニ ル基及びアルコキシ基から成る群から選択される基を表 し、
Ｌは、標識基を表し、
但し、16位の炭素原子が、酸素原子によって16位の炭素 原子に結合する２個の置換基を含まず、且つ、17位の炭 素原子が、酸素原子によって17位の炭素原子に結合する ２個の置換基を含まない。］
を有する前記キット。 - 前記プロゲステロン類似体が式：
を有する請求項21に記載のキット。 - 下記式1b:
［式中、R 6 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、ア ルキニル基及びアルコキシ基から成る群から選択される 基を表し、
R 7 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、アルキニル 基及びアルコキシ基から成る群から選択される基を表 し、
R 8 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、アルキニル 基及びアルコキシ基から成る群から選択される基を表 し、
R 9 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、アルキニル 基及びアルコキシ基から成る群から選択される基を表 し、
Ｌは、標識基を表し、
但し、16位の炭素原子が、酸素原子によって16位の炭素 原子に結合する２個の置換基を含まず、且つ、17位の炭 素原子が、酸素原子によって17位の炭素原子に結合する ２個の置換基を含まない。］を有するプロゲステロン類 似体の結合体。 - 前記プロゲステロン類似体が式：
を有する請求項23に記載の結合体。 - 前記プロゲステロン類似体が式：
を有する請求項23に記載の結合体。 - 下記式1c:
［式中、R 10 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、 アルキニル基及びアルコキシ基から成る群から選択され る基を表し、
R 11 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、アルキニ ル基及びアルコキシ基から成る群から選択される基を表 し、
R 12 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、アルキニ ル基及びアルコキシ基から成る群から選択される基を表 し、
R 13 は、OH、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、アルキニ ル基及びアルコキシ基から成る群から選択される基を表 し、
Ｌは、標識基を表し、
但し、16位の炭素原子が、酸素原子によって16位の炭素 原子に結合する２個の置換基を含まず、且つ、17位の炭 素原子が、酸素原子によって17位の炭素原子に結合する ２個の置換基を含まない。］を有するプロゲステロン類 似体の結合体。 - 前記プロゲステロン類似体が式：
を有する請求項26に記載の結合体。
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