JP2009210417A - 新規コンジュゲートおよびそれを用いたコルチゾールの分析方法、キット、ならびにそのための装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(1)コルチゾールと酸化還元酵素とが特定の構造を有するリンカーを介して連結されたコンジュゲート。(2)液体試料中のコルチゾールと、本発明のコンジュゲートとの競合反応による酵素免疫測定法を利用して液体試料中のコルチゾールを分析するコルチゾールの分析方法。(3)基板上に、コンジュゲートパッドとコルチゾールの抗体が予め固定された検出部とが形成され、コンジュゲートパッドからコルチゾールとコンジュゲートとをそれぞれ毛細管現象で検出部まで移動させ、検出部においてコルチゾールの抗体と競合反応させるキット。(4)作用極および対極からキットにて行われた競合反応の結果を電気化学的に測定するための装置。
【選択図】図1
Description
本発明のコンジュゲートにおいて、上記式(I)中におけるRは炭素数2〜20のアルキル基であることが好ましい。
本発明のキットは、検出部に、電気絶縁性の電極系基板と、電極系基板上に互いに離間して配置された作用極と対極とを含む電極系が形成され、前記コルチゾールの抗体が作用極上に予め固定されていることが、好ましい。
本発明のコンジュゲートは、コルチゾール(CORT)と酸化還元酵素とが特定の構造を有するリンカーを介して連結されたものであることを特徴とする。コルチゾールは、ストレスによって発散される副腎皮質ホルモンのうちの糖質コルチコイドの1種であり、ヒドロコルチゾンとも呼ばれる。コルチゾールは分子量が300程度のハプテンであり、このコルチゾールに標識(マーカー)を連結させたコンジュゲートを用いてコルチゾールとの競合反応を利用した酵素免疫測定法を実現する場合には、高感度な標識を用いる必要がある。本発明のコンジュゲートは、この高感度な標識として酸化還元酵素を用い、コルチゾールと酸化還元酵素とを特定の構造を有するリンカーを介して連結させたものであることを特徴とする。
本発明は、液体試料中のコルチゾールと、上述した本発明のコンジュゲートとの競合反応による酵素免疫測定法を利用して液体試料中のコルチゾールを定量分析する、コルチゾールの分析方法についても提供する。本発明のコルチゾールの分析方法によれば、上述した本発明のコンジュゲートと、液体試料中のコルチゾールとの競合反応による酵素免疫測定法を利用することで、従来のコルチゾールの酵素免疫測定法による分析方法とは異なり、試料の前処理が不要となるとともに、抗原抗体反応自体も迅速に行い得るようになるため、トータルで分オーダー(10分程度)へと短縮された、コルチゾールの即時的で特異性の高い定量分析が可能となる。
本発明はまた、液体試料中のコルチゾールと、上述した本発明のコンジュゲートとの競合反応による酵素免疫測定法を行うためのコルチゾール分析用キットについても提供する。ここで、図1は、本発明の好ましい一例のコルチゾール分析用キット1を模式的に示す図であり、図1(a)は上面図、図1(b)は斜視図である。図1に示す例の本発明のコルチゾール分析用キット1は、基板2と、基板2上に形成された、試料パッド3と、コンジュゲートパッド4と、検出部5と基本的に備え、検出部5から突出する電極系基板(後述)など、一部を除いたその全体がハウジング7にて覆われるように構成される。なお、図1(b)は、図1(a)に示すキット1からハウジング7を取り除いた状態の斜視図を示している。このような本発明のキット1は、免疫測定法、イムノクロマトグラフィ、電気化学測定を1つの試験紙上にドライケミストリーで構成することで、低廉なディスポーザブル・テストストリップを実現することができるという利点がある。
H2O2→2H++2e-+O2 (2)
上記式(2)における電子の生成量は、酸化還元酵素を含むコンジュゲート11の量に比例し、液体試料9中に含まれていたコルチゾール10の濃度には反比例することになる。このため、この電子の生成量を、コルチゾール濃度に比例した電気信号を電極測定することで、予め求めておいた検量線にプロットすることで、液体試料中のコルチゾールの濃度を算出することが可能となる。
図5は、上述した本発明のキット1と組み合わせて用いられ得る好ましい一例の本発明のコルチゾール分析用装置31の模式的な概念図である。本発明はさらに、本発明のキットが上述したように、検出部5に、電気絶縁性の電極系基板20と、電極系基板20上に互いに離間して配置された作用極22と対極23とを含む電極系21が形成され、かつ、作用極22に抗体6が予め固定されているように実現される場合に、このキット1と好適に組み合わせて用いられる分析装置についても提供する。本発明の装置31は、キット1の検出部5の作用極22および対極23をそれぞれ挿入するための挿入部32と、挿入部32に電気的に接続され、挿入部32に挿入された作用極22および対極23から、本発明のキット1にて行われた競合反応の結果を電気化学的に測定する測定部33とを備えることを特徴とする。
コルチゾール(CORT)との化学結合によるグルコースオキシダーゼ(GOD)の酵素活性の低下を抑えるために、アジポジヒドラジド(ADH)を介してGODとCORTを結合させ、リンカー分子が上記式(II)で表される構造を有し、酸化還元酵素がグルコースオキシダーゼであるCORT−GODコンジュゲートを作成した。
まず、予めプレートに抗コルチゾール抗体が固相化されているSalivary Cortisol Enzyme Immunoassay Kit(Salimetrics LLC製)に、上述のようにして作成した10mM リン酸緩衝液中のCORT−GODコンジュゲートを、1.06mg/mL、0.53mg/mL、0.21mg/mL、0.106mg/mL、0.053mg/mL、0.021mg/mL、0.0106mg/mLの濃度に調製して、それぞれ25mLずつ滴下し、37℃で1時間インキュベートした後、抗コルチゾール抗体と抗原抗体反応させた。反応後、プレートを洗浄した後に、GOD酵素活性溶液を300mL滴下し、490nmで吸光度の測定を行った。なお、コントロール条件としては、抗体未固相化プレートを用いた。
上述のようにして作成した10mM リン酸緩衝液中のCORT−GODコンジュゲート4.5mLに0.5mLの2−メルカプトエタノールと5mLのSample Bufferとを混ぜ、95℃の恒温槽で3分間ボイルしたものをSDS−PAGEのサンプルを調製した。コントロールとして市販のGOD(1mg/mL)を用い、当該GODをレーン1に、上述のように調製したSDS−PAGEのサンプルをレーン2にアプライし、泳動条件20mAでSDS−PAGE、Native−PAGEを行った。電気泳動後、ゲルを洗浄し、CBB染色液で染色を行った。
以下のようにして図1に示した例の本発明のコルチゾール分析用キット1を作成した。まず、ポリエチレン(PE)フィルム(厚み:500μm)を電極系基板20とし、その上に、電極系21として作用極22、対極23および参照極24を真空蒸着により形成した。具体的には、まず、レーザプリンタ(HP Laser Jet 4LJ Pro、ヒューレット・パッカード(株)製)を用いて、電極系基板20上の電極系21を形成する部分以外の部分にマスクを形成した。次に、電極系基板20と電極系21を形成する金属との密着性を向上するために、電極系基板20上にクロム(Cr)層を5nm真空蒸着させ、その上に、金属薄膜の導電率を向上するために、金(Au)層を40nm真空蒸着させた。さらにその上に、白金(Pt)層を40nm、銀(Ag)層を200nm真空蒸着させた。
(2)1.2mol/Lの塩酸水溶液に5分間浸漬し、作用極22の表面を洗浄後、純水で洗浄する、
(3)濃塩酸を滴下し、1分後に純水で洗浄する、
(4)10mmol/L 11−メルカプトウンデカン酸のエタノール溶液で洗浄した後、純水で洗浄する、
(5)エタノール中で5分間超音波照射する、
(6)100mg/mL N−ヒドロキシスルホスクシンイミド水溶液100mL、100mg/mL 1−エチル−3−カルボジイミドヒドロクロライド水溶液100mLを滴下し、1時間反応させる、
(7)活性化した作用極22の表面を純水で洗浄し、0.1mol/L トリス−塩酸緩衝液(pH8.0)で洗浄する、
(8)0.1mol/L トリス−塩酸緩衝液(pH8.0)を作用極22に90mL滴下し、100秒後に0.1mol/L トリス−塩酸緩衝液(pH8.0)で希釈した抗体を10mL滴下する、
(9)30分間インキュベートした後に、緩衝液で洗浄する。
Claims (11)
- コルチゾールと酸化還元酵素とが下記式(I)で表される構造を有するリンカーを介して連結された、コンジュゲート。
- 上記式(I)中におけるRが炭素数2〜20のアルキル基である、請求項1に記載のコンジュゲート。
- リンカーが下記式(II)で表される構造を有する、請求項1または2に記載のコンジュゲート。
- 酸化還元酵素が、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼおよびガラクトースオキシダーゼから選ばれるいずれかである、請求項1〜3のいずれかに記載のコンジュゲート。
- 酸化還元酵素がグルコースオキシダーゼである、請求項4に記載のコンジュゲート。
- 液体試料中のコルチゾールと、請求項1〜5のいずれかに記載のコンジュゲートとの競合反応による酵素免疫測定法を利用して液体試料中のコルチゾールを分析する、コルチゾールの分析方法。
- 液体試料が唾液から採取したものである、請求項6に記載の方法。
- 毛細管現象によって液体が移動し得るように構成された基板上に、請求項1〜5のいずれかに記載のコンジュゲートが予め含浸されたコンジュゲートパッドと、コルチゾールの抗体が予め固定された検出部とが形成され、
コンジュゲートパッドから液体試料中のコルチゾールと前記コンジュゲートとをそれぞれ毛細管現象で検出部まで移動させ、検出部においてコルチゾールの抗体と競合反応させる、コルチゾール分析用キット。 - 液体試料が唾液から採取したものである、請求項8に記載のキット。
- 検出部に、電気絶縁性の電極系基板と、電極系基板上に互いに離間して配置された作用極と対極とを含む電極系が形成され、前記コルチゾールの抗体が作用極上に予め固定されている、請求項8または9に記載のキット。
- 請求項10に記載のキットの検出部の作用極および対極をそれぞれ挿入するための挿入部と、
挿入部に電気的に接続され、挿入部に挿入された作用極および対極から前記コルチゾール分析用キットにて行われた競合反応の結果を電気化学的に測定する測定部とを備える、コルチゾール分析用装置。
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Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011002430A (ja) * | 2009-06-22 | 2011-01-06 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | コルチゾール測定方法及びコルチゾールセンサチップ |
JP2011107099A (ja) * | 2009-11-20 | 2011-06-02 | Rohm Co Ltd | 電気化学分析チップおよび電気化学分析方法 |
JP2012194037A (ja) * | 2011-03-16 | 2012-10-11 | Rohm Co Ltd | 分析チップ、分析システムおよび分析方法 |
JP2015510120A (ja) * | 2012-02-08 | 2015-04-02 | シーメンス アクチエンゲゼルシヤフトSiemens Aktiengesellschaft | ラテラルフローアッセイによる液状試料の電気化学的分析のための装置及び方法 |
KR101741944B1 (ko) * | 2016-01-12 | 2017-06-01 | 연세대학교 산학협력단 | 항원 농도 측정장치 및 항원 농도 측정방법 |
WO2021125173A1 (ja) * | 2019-12-18 | 2021-06-24 | 株式会社イムノセンス | 電気化学法ラテラルフロー式免疫検査方法とそのセンサーおよびその製造方法 |
JP2021143909A (ja) * | 2020-03-11 | 2021-09-24 | Tdk株式会社 | 分析チップ |
WO2022270586A1 (ja) * | 2021-06-23 | 2022-12-29 | パナソニックIpマネジメント株式会社 | 酵素固定電極、酵素固定電極の製造方法、標的分子の酸化還元方法、及び、標的分子の酸化還元装置 |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62119457A (ja) * | 1985-11-19 | 1987-05-30 | Sapporo Imuno Diagnostic Lab:Kk | 先天性副腎皮質過形成のマススクリ−ニング用診断薬キツト |
JPH07159401A (ja) * | 1993-12-09 | 1995-06-23 | Mieko Shimada | 唾液中のコルチゾールの酵素免疫反応による定量法 |
JPH11217400A (ja) * | 1997-10-31 | 1999-08-10 | F Hoffmann La Roche Ag | 糖蛋白質の部位特異的接合体 |
JP2000502792A (ja) * | 1995-12-29 | 2000-03-07 | ビオテッツ ベルリン―ブッフ ゲーエムベーハー | 西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて生体分子を標識する方法 |
JP2001337065A (ja) * | 2000-05-24 | 2001-12-07 | Bio Focus Ltd | 電気化学メンブレンストリップバイオセンサー |
JP2002148266A (ja) * | 2000-11-10 | 2002-05-22 | Rohto Pharmaceut Co Ltd | 検出装置及びその製造方法 |
JP2003294680A (ja) * | 2002-03-29 | 2003-10-15 | Techno Medica Co Ltd | 電気化学式バイオセンサー |
JP2006084183A (ja) * | 2004-09-14 | 2006-03-30 | Japan Science & Technology Agency | 超微小酵素電極 |
-
2008
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Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62119457A (ja) * | 1985-11-19 | 1987-05-30 | Sapporo Imuno Diagnostic Lab:Kk | 先天性副腎皮質過形成のマススクリ−ニング用診断薬キツト |
JPH07159401A (ja) * | 1993-12-09 | 1995-06-23 | Mieko Shimada | 唾液中のコルチゾールの酵素免疫反応による定量法 |
JP2000502792A (ja) * | 1995-12-29 | 2000-03-07 | ビオテッツ ベルリン―ブッフ ゲーエムベーハー | 西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて生体分子を標識する方法 |
JPH11217400A (ja) * | 1997-10-31 | 1999-08-10 | F Hoffmann La Roche Ag | 糖蛋白質の部位特異的接合体 |
JP2001337065A (ja) * | 2000-05-24 | 2001-12-07 | Bio Focus Ltd | 電気化学メンブレンストリップバイオセンサー |
JP2002148266A (ja) * | 2000-11-10 | 2002-05-22 | Rohto Pharmaceut Co Ltd | 検出装置及びその製造方法 |
JP2003294680A (ja) * | 2002-03-29 | 2003-10-15 | Techno Medica Co Ltd | 電気化学式バイオセンサー |
JP2006084183A (ja) * | 2004-09-14 | 2006-03-30 | Japan Science & Technology Agency | 超微小酵素電極 |
Cited By (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011002430A (ja) * | 2009-06-22 | 2011-01-06 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | コルチゾール測定方法及びコルチゾールセンサチップ |
JP2011107099A (ja) * | 2009-11-20 | 2011-06-02 | Rohm Co Ltd | 電気化学分析チップおよび電気化学分析方法 |
JP2012194037A (ja) * | 2011-03-16 | 2012-10-11 | Rohm Co Ltd | 分析チップ、分析システムおよび分析方法 |
JP2015510120A (ja) * | 2012-02-08 | 2015-04-02 | シーメンス アクチエンゲゼルシヤフトSiemens Aktiengesellschaft | ラテラルフローアッセイによる液状試料の電気化学的分析のための装置及び方法 |
US10359388B2 (en) | 2012-02-08 | 2019-07-23 | Siemens Aktiengesellschaft | Arrangement and method for the electrochemical analysis of liquid samples by means of lateral flow assays |
US10514353B2 (en) | 2012-02-08 | 2019-12-24 | Siemens Aktiengesellschaft | Arrangement and method for the electrochemical analysis of liquid samples by means of lateral flow assays |
KR101741944B1 (ko) * | 2016-01-12 | 2017-06-01 | 연세대학교 산학협력단 | 항원 농도 측정장치 및 항원 농도 측정방법 |
WO2021125173A1 (ja) * | 2019-12-18 | 2021-06-24 | 株式会社イムノセンス | 電気化学法ラテラルフロー式免疫検査方法とそのセンサーおよびその製造方法 |
JP2021143909A (ja) * | 2020-03-11 | 2021-09-24 | Tdk株式会社 | 分析チップ |
JP7207663B2 (ja) | 2020-03-11 | 2023-01-18 | Tdk株式会社 | 分析チップ |
WO2022270586A1 (ja) * | 2021-06-23 | 2022-12-29 | パナソニックIpマネジメント株式会社 | 酵素固定電極、酵素固定電極の製造方法、標的分子の酸化還元方法、及び、標的分子の酸化還元装置 |
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