KR101061601B1 - 보론산이 수식된 전극을 이용한 당화단백질의 전기화학적 측정방법 - Google Patents

보론산이 수식된 전극을 이용한 당화단백질의 전기화학적 측정방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 보론산을 수식한 전극에 당화단백질을 고정화시키고, 발생되는 전기화학적 신호를 분석함으로써 당화단백질의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다.
특히 지금까지의 전기화학적 측정기술은 당화단백질과 결합하는 두 가지 이상의 다른 물질, 즉 당화단백질의 캡춰와 신호발생을 위한 물질 및 항체 등을 확보하여야 하는 어려움이 있었으나, 본 발명의 전극을 이용하게 되면 이러한 단백질들이 없이도 측정이 가능하다는 장점이 있으며, 기존의 항체나 캡춰 단백질과 같은 고가의 단백질을 사용하지 않기 때문에 경제적 측면에서도 유리한 효과가 있다.
보론산 염료, 당화단백질, 전기화학적 측정방법

Description

보론산이 수식된 전극을 이용한 당화단백질의 전기화학적 측정방법{Electrochemical measurement of glycated protein by using boronate associated electrode}
본 발명은 보론산을 이용한 당화단백질의 전기화학적 측정방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 보론산을 수식한 전극에 당화단백질을 고정화시키고, 발생되는 전기화학적 신호를 분석함으로써 당화단백질의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다.
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20년간 당뇨병(Diabetes Mellitus, DM)은 모든 연령대에 빈번히 발병되는 질병 중 하나로 꼽혀 왔다. 이런 당뇨병은 두 가지 형태가 있다. 제 1형 당뇨병(Type 1 DM)은 췌장 속에서 인슐린을 분비하는 세포군인 랑게르한스섬의 β 세포 파괴성 병변으로 인한 인슐린 결핍으로 발병되는 것으로 유전적인 요인이 많다. 제 2형 당뇨병(Type 2 DM)은 인슐린 저항성으로 인한 고혈당이 원인이 되는 것으로 주로 비만 및 과체중, 앉아서만 생활하는 사람들에게 발병된다. 이런 제 2형 당뇨병의 경우 그 합병증의 위험 또한 높다.
따라서, 당뇨병의 조기 진단 및 관리가 중요시되고 있다. 당뇨병의 혈당 정도를 반영하는 중요한 지표로 공복 혈장 혈당(Blood Glucose)과 당화혈색소 (Glycated Hemoglobin)가 이용되고 있다. 특히, 당화혈색소는 검사 시 공복 및 약물 복용 여부에 따른 검사 상의 오류가 적고 그 특이도가 좋아 당뇨병 및 합병증을 예측하는데 더 좋은 지표로 여겨진다[V. Wiwanitkit, "Energy consumption for the formation of hemoglobin A1c: A reappraisal and implication on the poor-control diabetes mellitus patients", Journal of Diabetes and Its Complications, vol. 20, pp.384-386, 2006.].
혈색소(hemoglobin)는 네 개의 폴리펩타이드 체인(α, β, γ, δ chain)의 집합체인 글로빈(globin)과 각 체인에 하나의 헴(heme)이 비공유 결합으로 연결되어 있는 구조로 되어있다. 혈색소는 글로빈의 종류에 따라 혈색소 A(α2β2), 혈색소 A2(α2γ2), 혈색소 F(α2δ2)로 구분되며, 혈색소 A(Hemoglobin A)가 혈색소 총량의 97%를 차지한다.
당화혈색소(Glycated Hemoglobin)는 혈색소 A에 당이 부착하여 형성된 것으로 이는 A1a, A1b, A1c로 나뉜다. 그 중 혈색소 A1c(Hemoglobin A1c, HbA1c)가 60~80%로 가장 많으며, 이는 혈색소 β 체인의 N-말단의 발린(valine) 부위에 포도당이 비효소적인 방법으로 결합된 것이다[대한임상병리학회, "임상병리학", 완전개정 3판, 고려의학, pp.199-203, 213, 2001.; 이귀녕, 긴진규, "임상화학", 제 1판, 의학문화사, pp.153-155, 259-261, 1988.]. 적혈구의 수명이 120일인 것을 감안하여 볼 때 당화혈색소 HbA1c는 최근 1~3개월간의 평균적인 혈당 상태를 반영하며, 특히 1개월간의 혈당 변화를 가장 잘 반영한다. 따라서, HbA1c의 검사를 통한 당뇨병의 진단 및 치료 효과 관찰로의 적용 중요성 또한 강조되고 있다[성연아, "HbA1c 검사의 임상적 의의", 대한진단검사의학회지, 제 27권, 부록 2호, pp.S413-S417, 2007.]. 혈색소 총량에 대한 당화혈색소 HbA1c의 양은 퍼센타일(%)로 나타내며, 대략 HbA1c 7% 이전까지는 당뇨병이 아닌 정상 범위의 수치이고 그 이상의 수치는 당뇨병으로 판단된다. 그리하여 HbA1c 7%를 기준으로 6.9%와 7%의 명확한 차이를 구분 지을 수 있는 측정 시스템이 매우 중요하다.
% HbA1c의 측정 및 분석은 HPLC 방법과 면역검사(Immunoassay) 방법, POCT 방법 등으로 이루어진다. 이때, 사용되는 물질은 주로 보론산 기(boronate group)가 적용된 친화성 컬럼(affinity column)이나 비드(bead), 화학 염료(chemical dye)들이다. 이는 HbA1c의 당과 보론산 디올(boronic acid diol) 간의 시스-디올 작용(cis-diol interaction)에 의한 특이적인 결합 성질을 이용하 여 %HbA1c 측정에 적용되는 것이다[F. Frantzen, K. Grimsrud, D. Heggli and E. Sundrehagen, "Protein-boronic acid conjugates and their binding to low-molecular-mass cis-diols and glycated hemoglobin", Journal of Chromatography B, vol. 670, pp.37-45, 1995; W. G. John, "Haemoglobin A1c: Analysis and Standardisation", Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, vol. 41, pp.1199-1212, 2003.; S. U. Son, J. H. Seo, Y. H. Choi and S. S. Lee, "Fabrication of a disposable biochip for measuring percent hemoglobin A1c(%HbA1c)", Sensors and Actuators A, vol. 130-131, pp.267-272, 2006.].
근래 당뇨병의 자가 측정 및 관리가 가능한 간단하면서도 빠른 POCT 방법에 대한 당뇨병 환자들의 관심이 매우 증가하고 있다. %HbA1c 측정의 POCT 방법은 광학식 센싱 방법으로 많이 개발되어 왔으며, 이에 대한 연구도 활발히 진행되고 있다. 그리고 HbA1c에 특이적으로 결합을 하면서도 가격 면에서 경제적이며 간단한 시스템으로 광학식 센싱에 적용될 수 있는 보론산 기가 유도된 플루오로포어(fluorophore)나 크로모포어 염료(chromophore dye)들에 대한 연구 또한 활발히 진행되고 있다.
보론산(Boronic acid)은 비교적 잘 알려져 왔으며 그에 대한 연구가 지금까지 진행되어 왔다. 보론산의 디올과 당(Sugar)과의 시스-디올 작용이 알려지면서 당을 측정하는 연구 분야에 보론산이 이상적인 인지 물질로서 많은 연구가 진행 되어 왔다. 특히, 1990년대부터는 당이나 당단백질 (glycated protein)의 측정 및 분리를 위한 센서로의 적용 연구 또한 활발한 진행되어 왔다[H. S. Mader and O. S. Wolfbeis, "Boronic acid based probes for microdetermination of saccharides and glycosylated biomolecules", Microchimica Act, vol. 162, pp.1-34, 2008.; M. Li, N. Ni, B. Wang and Y. Zhang, "Modeling the excitation 파장 (λex) of boronic acids", Journal of Molecular Modeling, vol. 14, pp.441-449, 2008.]u.
보론산을 이용하여 광학적인 측정 방식이외에 보론산을 이용한 전기화학적인 측정은 페로센보론산을 이용하는 방식 [S. Liu, U. Wollenberger, M. Katterle, F. W. Scheller, "Ferroceneboronic acid-based amperometric biosensor for glycated hemoglobin". Sensors and Actuator B, vol. 113, pp.623-629, 2006 : J. Halㅱm다, U. Wollenberger, W. F. M. Stㆆcklein, A. Warsinke, and F. W. Scheller, " Signal amplification in immunoassays using labeling via boronic acid binding to the sugar moiety of immunoglobulin G : proof of concept for glycated hemoglobin". Analytical letters, vol. 40, pp.1434-1444, 2007] 과 전극 표면의 보론산에 당을 고정화시켜 측정하는 방식 [S. Takahasi and J-I. Anzai, " Phenylboronic acid monolayer-modified electrodes sensitive to sugars" , Langmuir, vol 21, pp.5102-5107, 2005.]이 있다. 페로센보론산을 이용하여 당단백질을 전기화학적으로 측정하는 방식은 전극 표면에 다른 물질들로 표면 개질이 이루어지고 그 위에 당단백질(glycated protein)을 고정화한 후, 페로센보론산을 다시 반응시켜 측정하는 방식으로 선택적인 고정화가 어렵고 실험과정이 복잡하다는 단점을 가진다. 또한 보론산을 전극 표면에 고정화한 경우는 대부분이 당류의 측정에만 사용되어 왔으며, 당 단백질을 측정하는 시스템에 대하여는 연구가 미미한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 보론산을 이용하여 간편하면서도 정확한 당화단백질의 전기화학적 측정방법을 개발하고자 연구, 노력한 결과 전극 표면에 특정 보론산 화합물을 수식한 전극을 제조하고, 이에 당화단백질을 반응시켜 전기화학적 신호를 측정함으로써 당화단백질의 농도를 알아낼 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 보론산을 포함하는 당화단백질 측정용 전극을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한 본 발명은 상기 전극을 이용한 당화단백질의 전기화학적 측정방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법을 통하여 당화단백질의 전기화학적 바이오센서의 개발 가능성을 제공한다.
본 발명은 전극 표면에 하기 화학식 1의 화합물이 수식되어 있는 당화단백질 측정용 전극을 그 특징으로 한다.
Figure 112009040268968-pat00001
또한 본 발명은,
상기 전극 표면에 당화혈색소 용액을 반응시키는 단계;
글루코오스 옥시다제를 산화시키는 전처리 단계;
상기 산화된 글루코오스 옥시다제를 당화혈색소 용액이 반응된 전극 표면에 반응시키는 단계; 및
전극 표면의 전기화학 신호를 측정하는 단계
를 포함하는 당화혈색소의 전기화학적 측정방법을 그 특징으로 한다.
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본 발명은 질병 진단의 중요한 지표 물질인 당화단백질의 측정을 위한 전기화학적 바이오센싱 방법에 관한 것으로서, 질병 진단에 임상적으로 적용 가능한 측정 범위(3 ~ 15% 당화단백질)를 갖는 시스템을 구축하였다.
특히 지금까지의 전기화학적 측정기술은 당화단백질과 결합하는 두 가지 이상의 다른 물질, 즉 당화단백질의 캡춰와 신호발생을 위한 물질 및 항체 등을 확보하여야 하는 어려움이 있었으나, 본 발명의 전극을 이용하게 되면 이러한 단백질들이 없이도 측정이 가능하다는 장점이 있으며, 기존의 항체나 캡춰 단백질과 같은 고가의 단백질을 사용하지 않기 때문에 경제적 측면에서도 유리한 효과가 있다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 전극 표면에 하기 화학식 1의 화합물이 수식되어 있는 당화단백질 측정용 전극을 그 특징으로 한다.
[화학식 1]
Figure 112009040268968-pat00002
상기 4-포르밀-페닐보론산(4-Formyl-phenylboronic acid)은 탄수화물 사슬의 시스-디올 그룹과 시스-디올 작용(cis-diol interaction)에 의하여 결합할 수 있 다. 즉, 4-포르밀-페닐보론산은 당화단백질과 하기 화학식 2와 같이 결합한다.
Figure 112009040268968-pat00003
따라서 상기 4-포르밀-페닐보론산이 전극에 수식되어 당화단백질과 결합하며, 결합되는 당화단백질의 양을 분석하여 병 진단의 중요한 지표 물질인 당화단백질을 측정할 수 있게 된다.
상기 4-포르밀-페닐보론산을 전극에 수식하기 위하여 먼저 덴드리머를 전극에 수식한다. 상기 덴드리머로는 폴리(아미도아민)(poly(amidoamine)), 폴리(알킬렌이민) (poly(alkyleneimine))이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 폴리(아미도아민)을 사용하며, 상기 덴드리머는 G2.0 이상의 세대로 확장된 것을 사용한다.
상기 덴드리머가 전극에 수식되기 위하여 먼저 전극 표면에 아민-반응성 자 가-조립층(self-assembled monolayer, SAM)을 생성시켜 아민과 반응할 수 있는 반응기를 생성시키는 것이 바람직하다. 상기 아민-반응성 자가-조립층을 생성시키기 위하여 3,3'-디티오-비스-프로피온산 N-하이드록시석신이미드 에스터(3,3'-dithio-bis-propionic acid N-hydroxysuccinimide ester, DTSP)에 전극을 담지할 수 있다. 전극에 아민-반응성 자가-조립층이 생성된 뒤 덴드리머에 담지하여 덴드리머를 수식한 후, 최종적으로 4-포르밀-페닐보론산 용액에 전극을 담지하여 4-포르밀-페닐보론산이 수식된 당화단백질을 측정용 전극을 제조할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 전극으로는 도체성 전극인 금(Au)전극, 백금(Pt)전극, 또는 반도체성 전극으로 탄소 전극 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 금 전극을 사용한다.
본 발명에서 측정 가능한 당화단백질은 상기 4-포르밀-페닐보론산과 결합할 수 있는 당화혈색소(Glycated Hemoglobin, HbA1c) 또는 당화알부민일 수 있다.
본 발명은 기판, 상기 전극 및 전기화학적 신호의 측정 장치를 포함하는 것을 하는 전기화학적 바이오 센서를 권리범위로 포함한다.
또한 본 발명은 상기 전극 표면에 당화혈색소 용액을 반응시키는 단계, 글루코오스 옥시다제를 산화시키는 전처리 단계, 상기 산화된 글루코오스 옥시다제를 당화혈색소 용액이 반응된 전극 표면에 반응시키는 단계 및 전극 표면의 전기화학 신호를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 당화혈색소의 전기화학적 측정방법을 그 특징으로 한다.
먼저 상기 4-포르밀-페닐보론산이 수식된 전극에 농도를 측정하고자 하는 당화혈색소를 반응시켜 전극 표면에 고정화시킨다. 이후 신호발생물질로 글루코오스 옥시다제를 선택하는데, 글루코오스 옥시다제의 생체전기촉매반응(Bioelectrocatalysis)은 전기적신호를 생성시켜 안정적으로 당화혈색소의 농도 측정을 가능하게 한다.
먼저, 상기 글루코오스 옥시다제를 산화시켜 하이드록시기를 알데하이드기가 노출되도록 한다. 이는 전극 표면에 수식된 덴드리머의 아민기와 상기 글루코오스 옥시다제가 반응을 일으켜 고정화되도록 하기 위함이다. 상기 글루코오스 옥시다제의 산화를 위하여 소디움 과아이오딘산염(sodium periodate)이 사용될 수 있다.
이후, 상기 산화된 글루코오스 옥시다제를 당화혈색소가 고정화된 전극에 반응시킨다. 상기 산화된 글루코오스 옥시다제는 당화혈색소가 고정되지 않는 덴드리머의 아민기와 반응함으로써 결합되어 채워지게 된다.
상기 당화혈색소 및 글루코오스 옥시다제가 고정화된 전극으로부터의 전기화학적 신호를 검출하는 데 있어서는 순환 전압전류법(Cyclic voltammetry)이 이용된다. 순환 전압전류법은 전기화학적인 신호 검출 방법으로서 널리 사용되는 것으로, 분광학적 방법 등과 같은 다른 방법에 비하여 시스템이 간단하여 저렴한 가격으로 센서 및 시스템을 제작할 수 있어서 유리하다. 순환 전압전류법을 통해 상기 전극으로부터의 전기화학적 신호를 검출하기 위하여, 상기 전극을 작업 전극으로 이용하고, 은/염화은 기준 전극, 그리고 백금선 전극을 보조 전극으로 하는 삼전극계를 구성하여 신호 검출을 행한다. 순환 전압전류법을 수행하는 데 있어서, 측정을 위한 탐지 물질로는 전기활성을 갖는 수용성의 많은 물질들이 유용하다. 일반적으로, 첨가되는 전기화학적 활성종으로서 페로센 유도체, 페리시안 화합물 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 페로센 메탄올을 사용하고, 전해질 용액 내에 수밀리몰 이하의 농도가 되도록 조제하여 사용한다. 상기 당화혈색소 및 글루코오스 옥시다제가 고정화된 전극에서 순환 전압전류법을 수행하여 검출된 전기화학적 신호로부터 얻어지는 전압전류의 파형의 변화 또는 최대 전류값의 변화를 측정하여 신호를 정량 수치화한다.
결국 본 발명은 당화혈색소의 농도가 높아 전극 표면에 많이 고정화 될수록 신호발생물질인 글루코오스 옥시다제가 고정화될 수 있는 부분이 적어지기 때문에 유효 전극 면적이 감소하는 원리를 이용한 것이다.
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특히, 본 발명에서의 목적하는 질환의 진단을 하기 위해서는 3 ~ 15 %의 당화혈색소를 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 따른 당화단백질의 전기화학적 측정방법은 고가의 항체나 단백질을 사용하지 않고, 또한 복잡한 측정 시스템을 이용하지 않고도 보론산이 수식된 전극을 이용하여 전기화학적 신호의 측정을 통해 간단하고 빠른 당화단백질의 바이오센싱이 가능하다.
이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
참조예 : 실험 재료 및 방법
인간 당화혈색소(HbA1c) 및 인간 탈당화(deglycated)된 혈색소(HbA0)는 Exocell사로 부터 구매하여 사용하였다.
또한 4-포르밀-페닐보론산(4-Formyl-phenylboronic acid, FPBA), 페로센메탄올, 4세대 확장된 폴리(아미도아민) 덴드리머(poly(amidoamine) generation G 4.0 dendrimer), 소디움 과아이오딘산염(sodium periodate) 및 소디움 시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride)는 Aldrich 사에서 구매하였으며, GOX(Glucose oxidase, EC 1.1.3.4. from Aspergillus niger), 3,3'-디티오-비스-프로피온산 N- 하이드록시석신이미드 에스터(3,3'-dithio-bis-propionic acid N-hydroxysuccinimide ester, DTSP), 포타슘 페리시아나이드(Potassium ferricyanide), β-D-글루코오스, 디메틸설폭사이드(DMSO) 및 소디움 비카보네이트(sodium bicarbonate)는 Sigma 사에서 구입하였으며, 무수 소디움 카보네이트는 DC chemical, D-프럭토오즈(Fructose)는 Yakuri사에서 구입하였다.
또한 전극의 표면 특성을 측정하고자 하는 XPS(X-ray photoelectron spectrometry)는 K-Alpha X-ray 광전자 스펙트로메터(Thermo Electron 사)를 사용하여 수행하였다. 또한 전기화학적 신호의 측정은 랩탑 컴퓨터에 연결된 CH instruments 사의 전기화학적 분석기 모델 630B를 사용하였다.
제조예 1 : 당화단백질 측정용 전극의 제조
티타늄이 처리된 실리콘 웨이퍼(20nm Ti)에 순도 99.999%의 금을 200nm의 두께로 저항성 증착(resistive evaporation)시킨다. 상기 증착된 금 표면을 피라나(Piranha) 용액에 5분동안 담지하고 증류수로 세척한 뒤 아민-반응성 자가증막(SAM)을 생성하기 위하여 5mM DTSP가 용해된 DMSO 용액에 2시간 동안 담지하였다. 이후 전극을 용액에서 꺼내어 DMSO와 에탄올로 세척한 뒤, 폴리(아미도아민) 덴드리머 G 4.0 에탄올 용액에 1시간 동안 반응시켰다. 그리고, 덴드리머와 반응한 전극을 에탄올로 세척한 뒤 1mM FPBA 에탄올 용액과 1시간 동안 반응시켰다. 이때 상기 FPBA 에탄올 용액에 트리에틸아민을 첨가하여 염기성 조건에서 반응이 진행되도록 하였고, 0.1N NaOH 수용액에 12mM의 소디움 시아노보로하이드라이드 를 첨가하여 FPBA의 결합 반응 과정에서 생성되는 시프(Schiff) 염기의 양을 감소시켰다. 최종적으로 FPBA와 반응한 전극을 비카보네이트 버퍼(0.1M, pH 9.0)에 담지한 후 꺼내어 당화단백질 측정용 전극을 제조하였다. 상기 제조과정을 도 1에 도식화하여 나타내었다.
실험예 1 : XPS에 의한 당화단백질 측정용 전극 표면의 특성 확인
FPBA와 반응시키지 아니한 전극과 상기 제조예 1에서 제조된 FPBA가 수식된 전극의 표면 특성을 확인하기 위하여 XPS를 수행하였고, 그 결과를 도 2 및 3에 각각 나타내었다.
두 전극의 S(2p) 스펙트라는 161.9 및 163.1 eV에서의 두 피크의 결합으로 나타나고 있으며 이는 DTSP의 티올과 디설파이드 그룹에 의한 것에 해당한다. C(1s) 및 N(1s) 스펙트라에서 피크 높이의 차이는 보론산으로 개질된 것에 기인한 것이다. C(1s) 스펙트라에서 C-C결합은 285.2eV, C=O 및 C=N 결합은 286.3eV, 그리고 아미드 결합(-NH-CO-)은 288.41eV에서의 피크가 나타나며, 상기 세 개의 피크가 중첩되어 있다. 특히 FPBA가 수식된 전극의 경우 286.3eV(C=N)에서의 피크 넓이가 21714.14 counts/s 로 나타나 FPBA가 수식되지 아니한 전극에서의 20030.4 counts/s 에 비하여 증가한 것을 확인할 수 있었고, 원자 함량(atom percentage)도 35.50%에서 37.04%로 증가하였다. 또한 N(1s) 스펙트라에서는 400.2 eV에서 NH2 결합이 나타났고, FPBA가 수식된 전극의 경우 FPBA가 수식되지 아 니한 전극에 비해 피크 넓이는 18452.73 counts/s에서 15101.46 counts/s로, 원자 함량(atom percentage)은 19.29%에서 15.19%로 감소함을 확인할 수 있었다. 상기 C(1s) 및 N(1s) 스펙트라에서의 변화는 덴드리머의 아민기(NH2)가 FPBA의 알데하이드기와의 반응을 통하여 이민(-NH=CH-)기로 전환되기 때문이라 보여진다.
그리고, O(1s) 스펙트라에서는 FPBA가 수식된 전극의 경우 533.31eV에서 새로운 피크(B-O)가 나타남을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 제조예에 의한 방법에 의하여 전극에 FPBA가 안정적으로 수식되었다는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2 : 순환 전압전류법에 의한 당화단백질 측정용 전극 표면의 특성 확인
상기 제조예 1에서 제조된 FPBA가 수식된 전극과 FPBA와 반응시키지 아니한 전극의 표면 특성을 순환 전압전류법에 의하여 확인하고자 하기와 같이 실험하였다.
제조된 FPBA가 수식된 전극과 FPBA와 반응시키지 아니한 전극을 각각 증류수로 세척하고, pH 9의 PBS(phosphate-buffered saline)에 50mM D-프럭토오즈가 용해된 혼합용액에 3시간 동안 담지하였다. 이후 Fe(CN)6 3-/4- 0.1mM 를 포함하는 pH 7 및 9인 각각의 PBS에서 50mV/s의 주사 속도(potential sweep rate)로 순환 전압전류 측정을 수행하였고 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4를 살펴보면 FPBA와 반응시키지 아니한 전극은 pH 7에서와 pH 9에서의 각각 최대 전류가 250 mV에서 2.6 및 2.5 ㎂이고, 전체적인 볼타모그램(Voltammogram)이 비슷하게 나타남을 확인할 수 있었다. 그러나 FPBA가 수식된 전극의 경우 pH가 7에서 9로 변하면서 최대 전류가 3.0에서 0.7 ㎂로 감소한 것을 확인하였다. 이러한 최대 전류의 감소는 Fe(CN)6 3-/4- 이온과 알칼리 조건하에서 당이 결합한 뒤 전극 표면에 생성된 음전하와의 정전기 반발(electrostatic repulsion)에 기인한 것으로, 상기 정전기 반발이 전자의 이동을 방해하여 pH 9 조건에서 최대 전류가 감소하고, 볼타모그램에서 피크가 나타나지 않게 된다(도 5 참고). 결국, 상기 순환 전압전류법에 의하여 보론산이 전극에 안정적으로 수식되고, 목적 물질인 당과 결합이 잘 이루어진다고 결론 내릴 수 있었다.
실시예 1 : 글루코오스 옥시다제의 후발 충진에 따른 당화혈색소 측정
먼저 HbA0를 이용하여 당화혈색소 HbA1c를 희석하여 2.5%, 5%, 6%, 9%, 12% 및 15%의 농도로 당화혈색소 HbA0/HbA1c 샘플을 제조한다. 모든 샘플은 헤모글로빈 농도가 150 mgHB/ml로 조절된다. 상기 HbA0/HbA1c 샘플을 pH9.0의 비카보네이트 버퍼에 넣은 뒤, 상기 버퍼에 제조예 1의 전극을 1시간 동안 담지하였다.
한편 글루코오스 옥시다제 1mg 및 소디움 과아이오딘산염(sodium periodate)을 PBS에 녹이고 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 산화된 글루코오스 옥시다제를 정제하고 Centricon® 을 사용하여 분자량이 30,000 이상이 되도록 한외 여과(ultrafiltration)한 뒤, PBS에 넣어 1 mg/ml의 산화 글루코오스 옥시다제 PBS 용액을 얻었다.
비카보네이트 버퍼에 담지된 전극을 꺼내어 PBS 및 비카보네이트 버퍼로 세척한 뒤, 상기 1 mg/ml의 산화 클루코오스 옥시다제 PBS 용액에 30분간 담지하였다. 상기 글루코오스 옥시다제의 후발 충진에 의한 당화혈색소 측정 방법을 도 6에 도식화하여 나타내었다.
담지된 전극을 꺼내어 PBS로 세척한 후, 0.1mM 페로센메탄올 및 10mM 글루코오스가 포함된 PBS 용액에서 5mV/s의 주사 속도(potential sweep rate)로 순환 전압전류 측정을 수행하였고 그 결과를 도 7에 나타내었다. 또한 볼타모그램에서 안정적인 전류를 나타내는 400mV에서의 전류값을 측정하여 당화혈색소의 농도별로 표시한 그래프를 도 8에 나타내었다.
상기 도 8의 그래프는 당화혈색소의 농도가 높아질수록 신호발생물질인 글루코오스 옥시다제가 고정화된 부분이 적어져서 낮은 전류가 흐르게 됨을 보여주고 있다. 상기 그래프를 통해 질병 진단에 임상적으로 적용 가능한 측정 범위인 3 ~ 15% 범위 당화혈색소의 경우 전류값의 측정을 통하여 당화혈색소의 농도를 알아낼 수 있음을 확인하였다.
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도 1은 본 발명의 당화단백질 측정용 전극을 제조하는 과정을 도식화한 것이다.
도 2는 FPBA와 반응시키지 아니한 전극의 XPS 스펙트라를 나타낸 것이다.
도 3은 FPBA가 수식된 전극의 XPS 스펙트라를 나타낸 것이다.
도 4는 실험예 2의 순환 전압전류법에서의 볼타모그램(Voltammogram)을 나타낸 것이다. Dend는 FPBA와 반응시키지 아니한 전극, Dend-FPBA는 FPBA가 수식된 전극을 의미한다.
도 5는 실험예 2의 순환 전압전류법에서 Fe(CN)6 3-/4- 이온과 알칼리 조건하에서 당이 결합한 뒤 전극 표면에 생성된 음전하와의 정전기 반발(electrostatic repulsion)을 도식화한 것이다.
도 6은 본 발명의 산화된 글루코오스 옥시다제의 후발 충진에 의한 당화혈색소 측정 방법을 도식화한 것이다.
도 7은 실시예 1의 글루코오스 옥시다제의 후발 충진시 볼타모그램을 나타낸 것이다.
도 8은 실시예 1의 글루코오스 옥시다제의 후발 충진시 당화혈색소의 농도에 따른 400mV에서의 전류를 나타낸 그래프이다.
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Claims (13)

  1. 전극 표면에 하기 화학식 1의 화합물이 수식되어 있는 당화단백질 측정용 전극 표면에 전극 표면에 당화단백질 용액을 반응시키는 단계;
    글루코오스 옥시다제를 산화시키는 전처리 단계;
    상기 산화된 글루코오스 옥시다제를 당화단백질 용액이 반응된 전극 표면에 반응시키는 단계; 및
    전극 표면의 전기화학 신호를 측정하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 당화단백질의 전기화학적 측정방법:
    [화학식 1]
    Figure 112011044484718-pat00004
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 전기화학 신호의 측정은 전압전류의 파형의 변화 또는 최대 전류값의 변화를 측정하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 측정방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 당화단백질은 당화혈색소(Glycated Hemoglobin, HbA1c) 또는 당화알부민인 것을 특징으로 하는 측정방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 측정방법은 당뇨병 진단에 사용되는 것을 특징으로 하는 측정방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 당화단백질 측정용 전극은 전극표면에 덴드리머가 수식되고, 그 위에 상기 화학식 1의 화합물이 수식된 것을 특징으로 하는 측정방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 덴드리머는 폴리(아미도아민)(poly(amidoamine)), 또는 폴리(알킬렌이민)(poly(alkyleneimine))인 것을 특징으로 하는 측정방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 전극에 아민반응기를 생성시킨 뒤 덴드리머가 결합되어 수식된 것을 특징으로 하는 측정방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 전극은 금 전극인 것을 특징으로 하는 측정방법.
  9. 제 3 항에 있어서, 상기 당화혈색소는 3 ~ 15 퍼센타일(%)의 당화혈색소인 것을 특징으로 하는 측정방법.
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