KR101728920B1 - 당화당백질 측정용 전극 및 이것의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 당화당백질(gylcoprotein) 측정용 전극 및 이것의 제조방법에 대한 것으로, 전극 표면에 시스타민(Cystamine:Cys)이 결합되고, 상기 시스타민에는 보로닉산(Boronic acid: BA)이 연결되어 있는 것을 특징으로 하여, 전극 표면에 더 많은 양의 보로닉산을 결합시킬 수 있을 뿐만 아니라, 당화단백질의 양을 더욱 정확하게 측정할 수 있는 효과가 있다.

Description

당화당백질 측정용 전극 및 이것의 제조방법{Electrode for measuring gylcoprotein and Preparing method thereof}

본 발명은 당화당백질(gylcoprotein)을 측정하기 위한 전극에 대한 것으로, 상기 당화단백질과 결합 가능한 보로닉산을 전극 표면에 더 많이 결합시키고, 당화단백질의 양을 더욱 정확하게 측정할 수 있는 당화당백질 측정용 전극 및 이것의 제조방법에 대한 것이다.

당뇨병의 현재 상태를 반영하는 중요한 지표로 가장 많이 이용되고 있는 것은 혈당(blood glucose)과 당화혈색소(glycated Hemogloblin:HbA1c)이다. 특히, 당화혈색소는 검사시 공복 및 약물 종용 여부에 따른 검사상의 오류가 적고 당뇨환자이 채혈 시점 이전 혈당치의 장기적인 변이상황을 추측할 수 있어 장기간 혈장 조절 평가에 유용하며 그 특이도가 좋아 당뇨병 및 이와 연관되는 합병증을 예측하는데 좋은 지표로 여겨진다.

종래에는 당화혈색소를 전기화학적으로 측정하기 위해서, 전극 표면에 당화혈색소와 선택적으로 결합이 가능한 보로닉산(Boronic acid: BA)을 수식하였다. 보로닉산은 당류 및 당 단백질과 cis-diol interaction을 통해 특이적으로 결합하는 특성 때문에 당 단백질이나 당을 측정하는 센서에 많이 응용되고 있다. 즉, 전극 표면에 보로닉산 기를 노출시키고, 여기에 당화혈색소를 고정화한 후, 그에 다른 전기화학 신호의 변화를 통해 당화혈색소의 농도를 측정하는 것이다.

일례로, 대한민국 공개특허 2011-0002293호는 전극 표면에 덴드리머를 결합시키고 이어서 그 위에 4-포르밀-페닐보론산(4-Formyl-phenylboronic acid)을 결합시켜서 전극을 제조하였으며, 상기 4-포르밀-페닐보론산에 당화혈색소를 반응시킨 후, 당화혈색소의 양을 전기화학적인 방법으로 측정하였다. 그러나, 상기 4-포르밀-페닐보론산을 이용하더라도 측정되는 당화혈색소 반응이 미흡하였고, 또한 상기 덴드리머에 의해 전극 표면에 결합되는 4-포르밀-페닐보론산의 밀도가 적다는 단점을 가지고 있다.

상기한 바와 같은 문제점을 해결하기 위한 본 발명은 전극 표면에 더 많은 양의 보로닉산을 결합시킬 수 있고, 나아가 당화단백질의 양을 더욱 정확하게 측정하기 위한 것이다.

또한, 본 발명은 보로닉산이 결합된 전극을 간단하고 용이하게 제조하는 것이 목적이다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 전극 표면에 시스타민(Cystamine:Cys)이 결합되고, 상기 시스타민에는 보로닉산(Boronic acid: BA)이 연결되어 있는 당화당백질 측정용 전극이다.

여기서, 상기 보로닉산은 하기 화학식 1로 표시되는 3-포르밀페닐보로닉산(3-formylphenyl boronic acid:3FPBA)인 것이 바람직하다.

[화학식 1]

그리고, 상기 시스타민 하나에는 3-포르밀페닐보로닉산 2개가 연결된 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 일 구체예는 시스타민과 보로닉산이 연결된 시스타민-보로닉산 합성체가 전극 표면에 결합된 당화당백질 측정용 전극이다.

여기서, 상기 합성체는 시스타민의 디설파이드(disulfide)기에 의해 전극 표면과 결합된 것이 가능하다.

그리고, 상기 합성체는 하기 화학식 2로 표시된 Cys-FPBA₂ 일 수 있다.

[화학식 2]

또한, 상기한 본 발명의 당화당백질 측정용 전극에서, 상기 전극 표면은 금(Au)으로 이루어진 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 양상은, 시스타민과 보로닉산이 연결된 시스타민-보로닉산 합성체를 준비하는 단계; 및 상기 준비한 합성체를 전극 표면에 결합시키는 단계;를 포함하는 당화당백질 측정용 전극의 제조방법이다.

여기서, 상기 합성체를 준비하는 단계는, 상기 시스타민과 보로닉산을 3~5시간 동안 반응시키는 단계를 포함할 수 있다.

그리고, 상기 합성체를 준비하는 단계는, 상기 시스타민과 보로닉산을 트리에틸아민(triethylamine:TEA)의 존재 하에 반응시키는 단계를 포함하는 것도 가능하다.

또한, 상기 합성체를 준비하는 단계는, 상기 시스타민과 보로닉산을 40~60℃의 온도로 반응시키는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.

상기한 본 발명은 전극 표면에 시스타민이 결합되고, 상기 시스타민에는 보로닉산이 연결되어 있는 것을 특징으로 하여, 전극 표면에 더 많은 양의 보로닉산을 결합시킬 수 있을 뿐만 아니라, 이를 통하여 당화단백질의 양을 더욱 정확하게 측정할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 시스타민과 보로닉산이 연결된 시스타민-보로닉산 합성체를 준비한 후 여기에 전극을 침지하는 1단계의 전극 침지 과정만으로 보로닉산이 결합된 전극을 간단하고 용이하게 제조할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 당화단백질 측정용 전극의 제조과정 및 이를 통한 당화단백질의 측정방법을 설명하기 위한 모식도이고,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 Bottom-up방식(●, red line)과 conjugation방식(▲, blue line)으로 제조된 전극에서의 전기화학 신호 값이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 시스타민과 보로닉산의 반응시간을 달리하여 합성한 Cys-FPBA₂ 전극에서의 전기화학 신호 값이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 시스타민과 보로닉산의 반응시 첨가해 주는 촉매의 종류에 따른 Cys-FPBA₂ 전극에서의 전기화학 신호 값이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 시스타민과 보로닉산의 반응 온도를 달리하여 합성한 Cys-FPBA₂ 전극에서의 전기화학 신호 값이다. 여기서, Cys-FPBA₂_25(●, red line)는 25℃로 반응시킨 것이고, Cys-FPBA₂_50(▲, blue line)은 50℃로 반응시킨 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 시스타민-보로닉산 합성체가 결합된 전극(▲, blue line)과 비교예로써 시스타민이 결합된 전극(●, red line)에서의, 당산화효소(GOX) 고정화 실험 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 전극에 대한, HbA1c sample 농도에 따른 전기화학 신호 및 COV값이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 전극에 대한, %HbA1c 농도에 따른 전기화학 신호 및 COV값이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 전극에 대한, reference sample내의 %HbA1c농도에 따른 전기화학 신호 및 COV값이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "구성한다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명은 당화당백질 측정용 전극에 대한 것으로, 탄수화물 사슬의 시스-디올 그룹을 가지는 당화단백질, 예를 들어 당화혈색소(Glycated Hemoglobin, HbA1c) 또는 당화알부민 등의 존재 여부 또는 그 양을 측정할 수 있는 전극에 대한 것이다.

상기 전극으로는 도체성 전극인 금(Au)전극, 백금(Pt)전극, 또는 반도체성 전극으로 탄소 전극 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 금 전극을 사용한다.

본 발명의 전극은 상기와 같이 탄수화물 사슬의 시스-디올 그룹을 가지는 당화단백질과 결합하기 위하여, 상기 시스-디올 그룹과 시스-디올 작용(cis-diol interaction)에 의하여 결합할 수 있는 보로닉산(Boronic acid: BA)을 그 외곽에 가지고, 특별히 상기 보로닉산을 전극 표면에 결합시키기 위하여 상기 전극과 보로닉산 사이에 시스타민(Cystamine:Cys)이 존재하는 것을 특징으로 한다. 여기서, 상기 보로닉산은 특별히 제한되지 않으나, 상기 화학식 1로 표시되는 3-포르밀페닐보로닉산(3-formylphenyl boronic acid:3FPBA)인 것이 바람직하다.

즉, 본 발명은 전극 표면에 시스타민이 결합되고, 상기 시스타민에는 보로닉산이 연결되어 있는 당화당백질 측정용 전극이다. 상기 시스타민은 디설파이드(disulfide)기를 가지는 바, 금속 등으로 이루어진 전극 표면에 결합 가능하고, 양 말단에 아민기를 가지고 있어서 알데히드기를 가진 보로닉산과도 결합할 수 있다. 그래서, 상기 시스타민 하나는 2개의 보로닉산(3-포르밀페닐보로닉산)을 수식할 수 있는 효과가 있다.

종래에 보로닉산을 전극 표면에 결합시키기 위해서는 전극 표면에 먼저 아민과 반응할 수 있는 작용기를 가진 3,3'-디티오-비스-프로피온산 N-하이드록시석신이미드 에스터(3,3'-dithio-bis-propionic acid N-hydroxysuccinimide ester, DTSP)를 결합시키고, 그 위에 폴리(아미도아민)(poly(amidoamine)), 폴리(알킬렌이민) (poly(alkyleneimine))과 같은 덴드리머를 결합시킨 후, 다시 그 위에 보로닉산을 결합시켜야 했다. 즉, BA/덴드리머/DTSP/전극과 같은 구조를 가져야 했다.

그러나, 본 발명에 의하면 전극 표면에 시스타민을 결합시키고, 그 위에 바로 보로닉산을 결합시킬 수 있는바, 종래보다 간단한 BA/시스타민/전극의 구조를 가지고, 그 제조방법에 있어서도 종래보다 간단하고 용이하다.

이러한 본 발명에 따른 전극은 전극 표면 위에 시스타민이 결합되고, 상기 시스타민에는 보로닉산이 연결되어 있으면 족하다. 이러한 구조의 전극은 먼저 시스타민과 보로닉산이 결합된 Cys-FPBA₂ 합성체를 준비한 후 1단계의 전극 침지만으로 상기 합성체를 전극 표면에 한번에 결합시키는 콘쥬게이션(conjugation) 방식에 의해 제조되는 것이 바람직하며, 전극 표면 위에 시스타민을 결합시키고, 이어서 상기 시스타민에 보로닉산을 순서대로 결합시키는 바텀업(bottom-up) 방식에 의해 제조되는 것도 가능하다.

본 발명과 같이 전극 표면에 시스타민과 보로닉산이 순서대로 결합된 구조의 전극은 종래기술에 의하더라도 용이하게 생각할 수 없었는데, 이는 첫째 시스타민에서 디설파이드기가 상기 시스타민의 말단에 위치하는 것이 아니라 중간에 위치하고 있고, 둘째 후술하는 바와 같이 보로닉산이 결합된 전극을 제조하는 일반적인 방법인 상기 바텀업 방식에 의하는 경우보다, 상기 콘쥬게이션 방식에 의해 제조하는 것이 더욱 바람직하기 때문이다.

이에 따라, 본 발명의 일 구체예는 시스타민과 보로닉산이 연결된 시스타민-보로닉산 합성체가 전극 표면에 결합된 당화당백질 측정용 전극일 수 있다. 여기서, 상기 합성체는 시스타민과 3-포르밀페닐보로닉산(3FPBA)이 하기 반응식에 따라 합성된 Cys-FPBA₂ 일 수 있다.

[반응식]

또한, 상기 합성체는 당화단백질과의 결합을 위하여 보로닉산의 디올(diol)기가 외곽을 향하도록 전극 표면과 결합되는 것이 바람직하고, 이에 따라 상기 합성체는 시스타민의 디설파이드(disulfide)기에 의해 전극 표면과 결합되는 것이 더욱 바람직하다.

상기와 같은 본 발명은 전극 표면에 시스타민이 결합되고, 상기 시스타민에는 보로닉산이 연결되어 있는 것을 특징으로 하여, 전극 표면에 더 많은 양의 보로닉산을 결합시킬 수 있을 뿐만 아니라, 이를 통하여 당화단백질의 양을 더욱 정확하게 측정할 수 있는 효과가 있다.

본 발명의 다른 양상은, 시스타민과 보로닉산이 연결된 시스타민-보로닉산 합성체를 준비하는 단계; 및 상기 준비한 합성체를 전극 표면에 결합시키는 단계;를 포함하는 당화당백질 측정용 전극의 제조방법이다. 즉, 시스타민과 보로닉산이 결합된 Cys-FPBA₂ 합성체를 먼저 준비한 후, 상기 합성체를 포함하는 용액에 전극을 1번만 침지시키는 콘쥬게이션(conjugation) 방식을 통하여, 간단하고 용이하게 당화당백질 측정용 전극을 제조하는 것이다. 후술하는 바와 같이, 이러한 방식에 의해 제조된 전극은 종래의 일반적인 바텀업 방식에 의해 제조된 전극보다 현저히 우수한 효과를 가진다.

상기 합성체를 준비하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 시스타민과 3FPBA를 용액 상에서 실온으로 수시간 동안 반응시키는 것일 수 있고, 상기 용액은 DMSO(Dimethyl sulfoxide)가 용해된 것이 바람직하다.

그리고, 상기 합성체를 전극 표면에 결합시키는 방법 역시 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 금이 증착된 전극 표면을 세척한 뒤 상기 Cys-FPBA₂가 용해된 DMSO 용액에 수시간 동안 담지하는 것일 수 있고, 상기 담지 전에 피라나(Piranha) 용액으로 오염물질을 제거하는 것과 담지 후에 DMSO와 에탄올로 세척하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명자들은 후술하는 실시예에서 기재된 바와 같이, 높은 수율의 Cys-FPBA₂ 합성을 위한 최적 조건을 찾기 위해 여러 가지 조건에 대한 최적화 실험을 진행하였고, 그 결과 상기 합성체를 준비하는 단계에서, 반응시간은 3~5시간으로 하는 것이 바람직한데, 만약, 반응시간이 3시간 미만인 경우 Cys-FPBA₂의 합성이 미약하여 당산화효소(GOX)에 의한 신호가 약하고, 반응시간이 5시간을 초과하는 경우 오히려 반응 신호가 감소하였기 때문이다. 그리고, 반응시에는 트리에틸아민(triethylamine:TEA)을 촉매로 사용하는 것이 바람직한데, 일반적인 schiff base 합성 반응에서 촉매로 많이 사용하는 HCl 보다, 트리에틸아민의 조건 하에서 반응시키는 경우 그 효과가 우수하기 때문이다. 또한, 반응온도는 40~60℃로 하는 것이 바람직한데, 반응온도가 40℃ 미만인 경우 Cys-FPBA₂의 합성이 미약(당산화효소(GOX)에 의한 신호가 약함)하고, 반응온도가 60℃를 초과하는 경우 오히려 합성체가 분해될 수 있기 때문이다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 당화단백질 측정용 전극을 이용하여, 당화혈색소(HbA1c)를 전기화학적으로 측정하기 위한 경쟁적 어쎄이(competition assay)의 일례를 나타내는 반응 모식도이다.

여기에 나타난 바와 같이, 전극 표면에 보로닉산을 수식한 후 각각의 측정하고자 하는 농도의 HbA1c 시료와 일정한 농도의 당산화효소(GOX)를 동시에 반응시키게 되면 HbA1c의 농도가 증가할 수록 상대적으로 높은 농도의 HbA1c가 GOX가 전극 표면에 고정화하는 것을 방해하여 그에 따른 전기화학 신호는 감소하게 된다. 이때 이용하는 GOX는 당단백질로서 아무런 생화학적 처리를 하지 않고도 BA와 반응할 수 있으며, HbA1c와의 competition에 의하여 전극표면에 고정화되면 생물학적 촉매반응으로 인해 증폭된 전기화학적 신호를 검출할 수 있도록 하는 특성을 지닌다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 : 당화당백질 측정용 전극의 제조

우선, 보로닉산 자가조립형성층(BA SAM)을 형성시키는 방법으로, 미리 시스타민(cytamine)과 보로닉산(BA)의 합성반응을 진행한 후 자가조립형성층(SAM)을 형성시키는 콘쥬게이션(conjugation) 방식과, cystamine과 BA를 순차적으로 반응시키는 바텀업(bottom-up)방식으로 나누어 실험을 진행하였다.

이어서, 높은 수율의 Cys-FPBA₂ 합성을 위한 최적 조건을 찾기 위해 여러 가지 조건에 대한 최적화 실험을 진행하였다.

실시예 1 : 콘쥬게이션 ( conjugation ) 방식에 의한 당화당백질 측정용 전극의 제조

먼저, 티타늄이 처리된 실리콘 웨이퍼(20nm Ti)에 순도 99.999%의 금을 200nm의 두께로 저항성 증착(resistive evaporation)시켜서 전극을 준비하였다.

그리고, cystamine(5mM)과 3FPBA(20mM)를 DMSO(Dimethyl sulfoxide)의 용액(solution) 상에 실온으로 4시간 동안 반응시켜 Cys-FPBA₂를 합성하였다. 그러면, cystamine의 아미노기는 Schiff's base를 매개로 하여 FPBA의 알데히드기와 혼합되어 결합된다. 촉매로써 트리에틸아민(Triethylamine:TEA)은 염기환경을 조성하기 전에 혼합된 용액에 주입하였다.

그런 다음, 상기 증착된 금 표면을 피라나(Piranha) 용액에 5분 동안 담지하고 증류수로 세척한 뒤, 붕소변환된(boronate-modified) 자가조립형성층(SAM)을 생성하기 위하여 상기 Cys-FPBA₂가 용해된 DMSO 용액에 2시간 동안 담지하였다. 이후, 상기 전극을 용액에서 꺼내어 DMSO와 에탄올로 세척한 뒤, 증류수(DDW)로 헹구었다. 마지막으로 전극은 인산완충식염수(Phosphate Buffered Saline : PBS)에 담구어 저장하였다.

실시예 2 : 바텀업 ( bottom up ) 방식에 의한 당화당백질 측정용 전극의 제조

상기 실시예 1에서와 같은 방법으로 전극을 준비하였고, 상기 실시예 1에서와 같이 5 mM 시스타민과 20 mM 3FPBA를 이용하였고, 용매도 DMSO를 이용하였다.

즉, 상기 금 전극에 먼저 시스타민을 반응시켜 전극 표면에 아민기가 노출되도록 한 후, 아민기와 반응할 수 있는 알데하이드기가 결합된 3FPBA를 반응시켜서 schiff' base에 의한 결합이 이루어지도록 하였다.

실험예 1 : 콘쥬게이션 방식과 바텀업 방식에 의한 전극의 전기화학 신호 측정

상기 실시예 1과 2의 전극에서, BA SAM의 수식여부는 모두 25μg/ml의 당산화효소(GOX)를 BA-SAM/Au/Si 전극에 반응시켜 GOX의 당쇄와 BA의 cis-diol interaction으로 결합되어 나타나는 GOX 효소 증폭반응을 통한 전기화학신호의 크기를 이용하여 추적하였다. 이때 사용한 전자 전달 물질은 0.1 mM ferrocene(Fc)용액으로 GOX의 기질인 10 mM glucose가 첨가된 것을 이용하였다. 전기화학적 측정방식은 순환 전압전류법(cyclic voltammetry)을 이용하였고 scan rate는 5 mv/s으로 하였다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 Bottom-up방식(●, red line)과 conjugation방식(▲, blue line)으로 제조된 전극에서의 전기화학신호(cyclic voltammogram; CV) 값이다. 도 2에서 보이는 것처럼 conjugation 방식의 BA SAM에서는 기질이 없는 background 신호에 비해서 약 2 μA 신호가 증가한 것을 볼 수 있었다. 이는 금 전극 표면 위의 BA와 cis-diol interaction에 의해 고정화된 GOX에 의한 것으로 금 전극 표면에 BA가 수식되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 bottom-up 방식은 약 0.3 μA증가한 것으로 보아 conjugation 방식에 비해 거의 BA가 수식이 되지 않은 것으로 보인다.

이를 통해 BA SAM의 형성 방식은 bottom-up 방식보다, 먼저 합성 반응을 진행하여 얻은 Cys-FPBA₂ 를 이용하여 SAM을 형성 시키는 conjugation 방식이 크게 효과적인 것을 알 수 있었고, 이후의 모든 실험은 conjugation방법을 통해 얻은 BA-SAM/Au/Si 전극을 이용하여 수행하였다.

실시예 3 : Cys - FPBA ₂ 의 합성 반응시간에 따른 전극 제조 및 전기화학 신호 측정

최적의 Cys-FPBA₂ 합성 반응시간을 결정하기 위하여 2시간부터 8시간까지 합성 반응을 진행하여 반응 시간에 따른 Cys-FPBA₂ 합성 정도를 비교하였다. 실시예 1에서와 같이 Cys-FPBA₂의 합성은 DMSO상의 5 mM cystamine 과 20 mM 3FPBA으로 수행하였고, 반응시간에 따른 Cys-FPBA₂의 합성 수율에 의한 BA SAM의 수식정도는 상기 실험예 1(BA SAM 수식방식 test)과 마찬가지로 GOX 고정화 실험을 통해 확인하였으며, 합성시간에 따른 전기화학적 실험 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 보이는 것과 같이, 4시간 까지는 반응시간이 증가할 수록 GOX에 의한 신호 또한 커지는 것을 볼 수 있다. 하지만 4시간이 지나가게 되면 서서히 반응 수율이 감소하는 것을 보아 최적의 반응 시간으로 4시간을 선택하였다. 이에 따라 앞으로의 Cys-FPBA₂ 는 5 mM cystamine 과 20 mM 3FPBA를 DMSO상에서 4시간 동안 합성하여 사용하였다.

실시예 4 : Cys - FPBA ₂ 의 합성시 사용하는 촉매에 따른 전극 제조 및 전기화학 신호 측정

민감한 HbA1c측정이 가능하기 위해서는 합성되는 Cys-FPBA₂의 합성 수율을 최대로 높여야 한다. 보다 효율적이고 높은 수율로 Cys-FPBA₂를 합성하기 위해 촉매를 사용하였다. 상기 실시예 1을 바탕으로, 첨가해 주는 촉매로는 HCl, triethylamine(TEA)를 선택하였고, control군으로 어떤 촉매도 첨가하지 않은 것, 3가지를 서로 비교하였다. 기존에 본 발명자들이 schiff base 합성 반응에서 사용한 촉매들을 참고로 하여, HCl의 경우 0.35% 100μl를 3ml의 Cys-FPBA₂ conjugates에 첨가하였고 TEA는 1.1 μl를 첨가하였다.

도 4는 촉매에 따른 전기화학 신호를 나타낸 것으로 CV(cyclic voltammogram)상의 전압 400 mV에서의 current 값에서 기질이 없는 background신호를 뺀 전류값을 나타내었다. 도 4에서 볼 수 있듯이, TEA를 첨가한 경우 첨가하지 않은 경우와 HCl을 첨가한 경우보다 GOX에 의한 신호가 더 높은 것을 볼 수 있었다. 이를 통해, 합성 반응 시 TEA를 첨가해주는 것이 Cys-FPBA₂ 의 합성을 더 용이하게 해주는 것을 알 수 있었고, 이후Cys-FPBA₂ 합성은 TEA 1.1 μl을 첨가하여 진행하였다.

실시예 5 : Cys - FPBA ₂ 의 합성 반응온도에 따른 전극 제조 및 전기화학 신호 측정

한편, Cys-FPBA₂의 합성 수율을 최대로 높이기 위하여, 상기 실시예 1을 바탕으로, Cys-FPBA₂ 역시 상온 조건인 25℃와 50 ℃에서 합성을 진행하고 각각의 온도에서 합성한 Cys-FPBA₂를 적용하여 그 결과를 비교하였다.

도 5는 각각의 온도에서 합성하여 형성한 Cys-FPBA₂ SAM에 고정화된 GOX에 따른 전기화학신호를 보여준다. 도 5에서 보이는 것처럼, 25℃에서 합성한 BA SAM에서 보다 50℃에서 합성한 BA SAM에 고정화된 GOX에 의한 신호가 1 μA가량 (x2) 더 큰 것을 볼 수 있었다. 이를 통해 50℃에서 합성한 Cys-FPBA₂에서의 GOX가 고정화된 양이 더 많은 것을 볼 수 있었고, 이는 50℃에서 합성한 Cys-FPBA₂가 효율이 훨씬 좋은 것을 보여준다. 따라서 Cys-FPBA₂ 합성을 위한 온도는 50℃로 하여 실험을 진행하였다.

실험예 2 : Cys - FPBA ₂ SAM / Au 형성 확인

상기 실시예 1~5와 실험예 1을 통하여 얻은 최적의 Cys-FPBA₂ 합성 조건은 DMSO를 용매로 하여 5 mM cystamine과 20 mM 3-formylphenyl boronic acid를 50 ℃에서 4시간 반응시키며 촉매로 TEA 1.1 μl첨가한 것이다.

이렇게 합성된 Cys-FPBA₂ SAM/Au 표면이 의도한 대로 수식이 되었는지 확인하기 위하여 BA가 합성되지 않은 cystamine과 비교 실험을 수행하였다. 앞서 BA수식을 확인한 실험들과 동일하게 BA가 합성되지 않은 cytamine과 Cys-FPBA₂가 고정화된 금 전극에 25 μg/ml GOX를 반응시켜 GOX의 고정화 양상을 비교하였다.

BA가 수식이 된 경우는 BA와 cis-diol interaction에 의하여 GOX가 전극 표면에 고정화되어 GOX에 의한 전기화학 신호가 검출 될 것이고, BA가 원활히 수식되지 않은 cystamine의 경우에는 GOX가 고정화될 수 있는 작용기가 존재하지 않기 때문에 고정화가 되지 않을 것으로 예상하였다.

실제 실험 결과, 도 6에서 보이는 것처럼 Cys-FPBA₂의 경우 background 대비 약 2.2 μA가 증가하였으나, cystamine의 경우에서는 0.5 μA가 증가하였다. 이는 Cys-FPBA₂ 전극의 경우에는 GOX와 전극 표면의BA group간의 cis-diol interaction에 의한 특이적 결합에 의해 고정화된 것이며, cystamine의 경우는 GOX와 cystamine의 아민기간의 비특이적 결합(정전기력에 의한 결합이며, 약하고 용액 pH에 의하여 가변적이기 때문에 바이오센싱에 이용할 수 없음)에 의한 것이다. 이를 통해 본 발명에 따른 Cys-FPBA₂가 제대로 합성이 이루어져 전극 표면에 BA기가 수식이 됨을 확인할 수 있었다. 이렇게 확인한 최적 조건의 Cys-FPBA₂ 를 이용하여 금 전극 표면에 BA SAM을 형성 시켜 HbA1c측정을 위한 competition assay를 수행하였다.

실험예 3 : 전기화학방식의 % HbA1c 측정

상기 실시예 및 실험예를 통해 확인된 조건에 의해 합성된 Cys-FPBA₂를 이용하여 전극 표면에 BA SAM을 형성한 후 HbA1c의 %농도에 따른 전기화학식 측정을 진행하였다. HbA1c의 전기화학적 측정을 위해 native GOX와 competition assay를 수행하였다.

실험은 HbA1c만으로 이루어진 buffer 상 sample(실험예 3-1)과, BSA를 포함한 %HbA1c(실험예 3-2), 그리고 reference sample(실험예 3-3)을 이용하여 competition assay를 수행하였다

실험예 3-1 : HbA1c sample ( in PBS buffer )에 대한 % HbA1c 측정

본 발명에 따른 competition assay가 %HbA1c를 측정하는데 적합한지 판단하기 위해 우선 정제된 HbA1c만을 이용하여 HbA1c의 농도에 따른 전기화학신호를 검출하였다. 사용한 HbA1c sample의 농도는 일반사람의 total hemoglobin의 평균농도인 150 mg/ml을 7500 배 희석한 20 μg/ml를 Hb 100%로 하여 각각 0%부터 15%까지의 농도(0.5 μg/ml~3 μg/ml)로 sample을 희석하여 HbA1c의 농도에 따른 신호를 측정하였다.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 전극에 대한, HbA1c sample 농도에 따른 전기화학 신호 및 COV값이다. 도 7에서 보이는 것처럼 HbA1c의 농도가 증가할 수록 전기화학 신호는 줄어드는 것을 볼 수 있었다. HbA1c의 농도가 증가하게 되면 전극 표면 위에 고정화되는 HbA1c의 양이 증가하게 되므로 신호를 낼 수 있는 GOX의 결합이 공간적으로 제한되어 상대적으로 결합하는 양이 줄어들게 된다. 따라서 HbA1c의 농도가 증가할수록 GOX에 의한 전기화학적 신호는 감소하게 된다. 도 7에서와 같이 HbA1c의 진단범위인 2.5~15%에서 점점 신호가 감소하였고 이를 통해 Cys-FPBA₂ SAM을 이용하여 HbA1c 농도측정이 가능한 전기화학적 측정방식이 작동함을 확인하였다.

또한, 재현성을 검증하기 위하여 3번의 독립적인 반복실험을 통해 HbA1c의 측정 범위 중 낮은 농도 2.5% (0.5 μg/ml), 중간 농도 7% (1.4 μg/ml), 높은 농도 15% (3 μg/ml)를 선택해 COV(coefficient of variation)를 구하였다. HbA1c만을 이용한 표준용액 샘플의 COV는 2.5% (0.5 μg/ml)에서 9%, 7% (1.4 μg/ml)의 경우 17%, 높은 농도 15% (3 μg/ml)는 29%로 높은 농도에서 COV가 상대적으로 높은 것을 볼 수 있다. 이는 본 측정 시스템의 특성상 높은 농도에서 신호값 (current)이 작아지기 때문에 상대적으로 CV값이 높아지는 것으로 볼 수 있다. 본 샘플 실험을 통해 BA SAM기반의 competition assay가 HbA1c의 측정에 유용한 것을 확인할 수 있었다.

실험예 3-2 : % HbA1c sample ( with BSA in PBS buffer )에 대한 % HbA1c 측정

상기 실험예 3-1의 HbA1c sample은 각각의 %HbA1c에 해당하는 HbA1c만으로 이루어진 sample이기 때문에 GOX와 mix한 전극에 반응시키는 sample의 total protein농도는 모두 다르게 된다. 최종적으로 목적하는 %HbA1c는 당화되어 있는 hemoglobin(Hb)인 HbA1c와 당화되어있지 않은 HbA0로 이루어진 total Hb sample에서의 HbA1c를 측정하는 것이다.

HbA0와 HbA1c로 이루어진 total Hb에서 실험을 진행하기 이전에 HbA0를 대신하여 당화단백질이 아닌 BSA와 HbA1c로 이루어진 %HbA1c에 따른 신호를 측정하였다. 마찬가지로 total protein(100% Hb로 가정)은 20 μg/ml로 하여 2.5%부터 15%의 HbA1c sample을 준비하여 GOX와 competition assay를 수행하였다.

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 전극에 대한, %HbA1c 농도에 따른 전기화학 신호 및 COV값이다. 도 8의 왼쪽 그래프에서 보이는 것처럼 HbA1c의 농도가 증가할수록 전기화학 신호는 감소하는 것을 볼 수 있다. 오른쪽의 표는 HbA1c 표준용액 sample을 이용하여 실험했던 것과 마찬가지로 3번 반복실험을 통한 COV값을 나타낸 것이다. HbA1c 만을 포함하는 실험예 3-1의 실험 결과보다 COV값이 전체적으로 낮아진 것을 볼 수 있는데 이는 HbA1c만을 이용한 sample의 경우, total protein양이 모두 일정하지 않지만 BSA로 total protein양을 일정하게 맞춰주게 되면 전체적인 protein sample 조건이 보다 균일해지기 때문에 재현성이 더 좋아지기 때문인 것으로 보여진다.

또한, 본 실험을 통하여 competition assay가 total Hb를 이용한 실험에 적용이 가능함을 확인할 수 있었고, competition assay를 위한 Hb sample과 GOX sample간의 비율이 적절한 것 역시 확인할 수 있었다. Competition assay를 수행함에 있어 두 sample간의 농도 비율이 매우 중요한 요소가 되는데 이는 GOX의 비율이 상대적으로 너무 높거나 낮으면 전기화학적 신호는 너무 크거나 작아서 HbA1c에 의한 신호를 정밀하게 구분해 내지 못하게 되기 때문이다.

실험예 3-3 : % HbA1c sample ( reference sample )에 대한 % HbA1c 측정

혈액 내 %HbA1c를 측정하기 위하여 Bio-Rad 社에서 구매한 HbA1c reference sample (Lyphochek Hemoglobin Linearity set)을 이용하여 실험을 진행하였다. 사용된 sample은 각각의 HbA1c level에 따른 lyophilized 된whole blood에 가까운 reference sample이다. Linearity set에 포함된 4개의 sample에는 total hemoglobin 수치가 표기되어 있지 않기 때문에 competition assay의 수행에 앞서 Roche社의 Reflotron을 이용하여 각 샘플의 total hemoglobin과 glucose의 양을 측정하였다. 측정 결과 각 샘플의 total Hb양이 상이했고 각 샘플마다 상당한 양의 glucose가 포함되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 혈액 내의 glucose는HbA1c와 마찬가지로 BA와 반응할 수 있기 때문에 %HbA1c농도를 측정하는데 있어 방해역할을 하게 된다. 정확한 HbA1c의 측정을 위하여 sample내의 glucose를 제거한 후 희석을 통해 각각 sample의 total Hb를 20 μg/ml로 맞추어 실험을 진행하였다.

도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 전극에 대한, reference sample내의 %HbA1c농도에 따른 전기화학 신호 및 COV값이다. 즉, glucose를 제거하고 적절히 희석한 4개의 HbA1c level의 reference sample을 이용한 competition assay의 결과이다. 제 공된 sample data sheet에는 각각의 HbA1c level에 따른 sample을 상용화된 HbA1c측정 기기들을 통해 얻은 HbA1c의 %농도값이 나타나 있다. 본 실험에서는 Roche/Hitachi Cobas c systems 을 이용하여 측정한 IFCC값의 HbA1c% 농도를 sample마다의 %HbA1c값으로 선택하여 실험을 진행하였다. 도 9의 오른쪽 Data sheet에 따르면 sample 1번은 1.7%, 2번은 4.4%, 3번은 17%의HbA1c가 포함되어 있는 것을 알 수 있었다.

도 9에 나타난 바와 같이, Positive control로 Hb가 포함되지 않은 GOX/BSA sample을 HbA1c 0%로 하여 level 4까지 총 5개의 sample에 대한 실험 결과이다. 도 9의 왼쪽 그래프에서 볼 수 있는 것과 같이 %HbA1c 농도가 증가할수록 competition assay에 의한 전기화학 신호는 감소하는 것을 볼 수 있었다. 이는 본 연구를 통해 개발한 competition assay가 glucose를 제거한 혈액에서 %HbA1c의 측정이 가능함을 증명한다. COV값 역시 6%대로 다른 sample들과 비교하였을 때 재현성 또한 상대적으로 높은 것을 볼 수 있었다.

한편, 상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.

Claims (11)

1. 전극 표면에 시스타민(Cystamine:Cys)이 결합되고, 상기 시스타민에는 보로닉산(Boronic acid: BA)이 연결되어 있는 당화당백질 측정용 전극.
   
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4. 시스타민과 보로닉산이 연결된 시스타민-보로닉산 합성체가 전극 표면에 결합된 당화당백질 측정용 전극.
   
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8. 시스타민과 보로닉산이 연결된 시스타민-보로닉산 합성체를 준비하는 단계; 및
   상기 준비한 합성체를 전극 표면에 결합시키는 단계;를 포함하는 당화당백질 측정용 전극의 제조방법.
   
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