JP2013024870A - 糖化蛋白質測定用電極及びこれの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は電極表面により多量のボロン酸を結合させることができて、さらには糖化蛋白質の量をより正確に測定するためのものであり、ボロン酸が結合した電極を簡単かつ容易に製造する。
【解決手段】本発明は、糖化蛋白質（ｇｙｌｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）測定用電極及びこれの製造方法であって、電極表面にシスタミン（Ｃｙｓｔａｍｉｎｅ：Ｃｙｓ）が結合され、前記シスタミンにはボロン酸（Ｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＢＡ）が連結されていることを特徴とし、電極表面により多量のボロン酸を結合させることができるだけではなく、糖化蛋白質の量をより正確に測定できる効果がある。
【選択図】図１

Description

本発明は、糖化蛋白質（ｇｙｌｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）を測定するための電極に関し、前記糖化蛋白質と結合可能なボロン酸を電極表面により多く結合させ、糖化蛋白質の量をより正確に測定できる糖化蛋白質測定用電極及びこれの製造方法に関する。

糖尿病の現在の状態を反映する重要な指標として最も多く利用されているのは、血糖（ｂｌｏｏｄ ｇｌｕｃｏｓｅ）と糖化ヘモグロビン（ｇｌｙｃａｔｅｄ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ：ＨｂＡ１ｃ）である。特に、糖化ヘモグロビンは、検査時空腹及び薬品推奨可否に伴う検査上の誤りが少なく、糖尿患者の採血時点以前血糖値の長期的な変移状況を推測できて、長期間血漿調節評価に有用であり、その特異度が良く糖尿病及びこれと係る合併症を予測するのに良い指標と見なされる。

従来には、糖化ヘモグロビンを電気化学的に測定するために、電極表面に糖化ヘモグロビンと選択的に結合可能なボロン酸（Ｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＢＡ）を修飾した。ボロン酸は、糖類及び糖蛋白質とシス−ジオール相互作用を介して特異的に結合する特性のため、糖蛋白質や糖を測定するセンサーに多く応用されている。即ち、電極表面にボロン酸基を露出させて、そこに糖化ヘモグロビンを固定化した後、それに他の電気化学信号の変化を介して糖化ヘモグロビンの濃度を測定するものである。

例えば、韓国公開特許２０１１−０００２２９３号は、電極表面にデンドリマーを結合させ、続いてその上に４−ホルミル−フェニルボロン酸（４−Ｆｏｒｍｙｌ−ｐｈｅｎｙｌｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を結合させて電極を製造し、前記４−ホルミル−フェニルボロン酸に糖化ヘモグロビンを反応させた後、糖化ヘモグロビンの量を電気化学的な方法で測定した。しかし、前記４−ホルミル−フェニルボロン酸を利用しても測定される糖化ヘモグロビン反応が不十分であって、また、前記デンドリマーによって電極表面に結合される４−ホルミル−フェニルボロン酸の密度が低いという短所を持っている。

前記のような問題点を解決するための本発明は、電極表面により多量のボロン酸を結合させることができて、さらには糖化蛋白質の量をより正確に測定するためのものである。

また、本発明の目的は、ボロン酸が結合した電極を簡単かつ容易に製造することである。

前記目的を達成するための本発明は、電極表面にシスタミン（Ｃｙｓｔａｍｉｎｅ：Ｃｙｓ）が結合され、前記シスタミンにはボロン酸（Ｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＢＡ）が連結されている糖化蛋白質測定用電極であることを特徴とする。

ここで、前記ボロン酸は、ホルミルフェニルボロン酸（ｆｏｒｍｙｌｐｈｅｎｙｌ ｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＦＰＢＡ）であることが好ましく、下記式（１）で表される３−ホルミルフェニルボロン酸（３−ｆｏｒｍｙｌｐｈｅｎｙｌ ｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ：３ＦＰＢＡ）であることがさらに好ましい。

そして、前記シスタミン中いずれか一つには３−ホルミルフェニルボロン酸２個が連結可能である。

本発明の一具体例は、シスタミンとボロン酸が連結されたシスタミン−ボロン酸接合体が電極表面に結合した糖化蛋白質測定用電極である。

ここで、前記接合体は、シスタミンのジスルフィド（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）基によって電極表面と結合したものであってもよい。

そして、前記接合体は、下記式（２）で表されたＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂であってもよい。

また、前記本発明の糖化蛋白質測定用電極において、前記電極表面は、金（Ａｕ）からなることが好ましい。

本発明の他の態様は、シスタミンとボロン酸が連結されたシスタミン−ボロン酸接合体を準備する段階、及び前記準備した接合体を電極表面に結合させる段階、を含む糖化蛋白質測定用電極の製造方法である。

ここで、前記接合体を準備する段階は、前記シスタミンとボロン酸を３〜５時間反応させる段階を含んでもよい。

さらに、前記接合体を準備する段階は、前記シスタミンとボロン酸をトリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ：ＴＥＡ）の存在下反応させる段階を含んでもよい。

また、前記接合体を準備する段階は、前記シスタミンとボロン酸を４０〜６０℃の温度で反応させる段階を含むことが好ましい。

その他実施例の具体的な事項は、詳細な説明及び図面に含まれている。

前記本発明は、電極表面にシスタミンが結合され、前記シスタミンにはボロン酸が連結されていることを特徴とし、電極表面にさらに多量のボロン酸を結合させることができるだけではなく、これによって糖化蛋白質の量をより正確に測定できる効果がある。

さらに、本発明は、シスタミンとボロン酸が連結されたシスタミン−ボロン酸接合体を準備した後、ここに電極を浸漬する１段階の電極浸漬過程だけで、ボロン酸が結合した電極を簡単かつ容易に製造できる効果がある。

本発明の一実施例に係る糖化蛋白質測定用電極の製造過程及びこれによる糖化蛋白質の測定方法を説明するための模式図である。 本発明の一実施例によりＢｏｔｔｏｍ−ｕｐ方式（○、ｒｅｄ ｌｉｎｅ)とｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ方式（△、ｂｌｕｅ ｌｉｎｅ）で製造された電極における電気化学信号値である。 本発明の一実施例によりシスタミンとボロン酸の反応時間を変えて合成したＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂電極における電気化学信号値である。 本発明の一実施例によりシスタミンとボロン酸の反応時添加する触媒の種類に応じたＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂電極における電気化学信号値である。 本発明の一実施例によりシスタミンとボロン酸の反応温度を変えて合成したＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂電極における電気化学信号値である。ここで、Ｃｙｓ−ＦＰＢＡ₂＿２５（○、ｒｅｄ ｌｉｎｅ）は、２５℃で反応させたもので、Ｃｙｓ−ＦＰＢＡ₂＿５０（△、ｂｌｕｅ ｌｉｎｅ）は、５０℃で反応させたものである。 本発明の一実施例によりシスタミン−ボロン酸接合体が結合した電極（△、ｂｌｕｅ ｌｉｎｅ）と比較例としてシスタミンが結合した電極（○、ｒｅｄ ｌｉｎｅ）における、糖酸化酵素（ＧＯＸ）固定化実験結果である。 本発明の一実施例に係る電極に対する、ＨｂＡ１ｃ試料濃度に応じた電気化学信号及びＣＯＶ値である。 本発明の一実施例に係る電極に対する、％ＨｂＡ１ｃ濃度に応じた電気化学信号及びＣＯＶ値である。 本発明の一実施例に係る電極に対する、参考試料内の％ＨｂＡ１ｃ濃度に応じた電気化学信号及びＣＯＶ値である。

本発明は、多様な変換を加えることができ、種々の実施例を持つことができ、特定実施例を図面に例示して、詳細な説明で詳細に説明する。しかし、これは本発明を特定の実施形態に対して限定しようとするものではなく、本発明の思想及び技術範囲に含まれる全ての変換、均等物乃至代替物を含むものと理解されなければならない。本発明を説明するに当たり関連した公示技術に対する具体的な説明が本発明の要旨を不明瞭にすると判断される場合、その詳細な説明を省略する。

本出願で用いた用語は、単に特定の実施例を説明するために用いられたもので、本発明を限定しようとする意図はない。単数の表現は、文脈上明白に異なることを意味しない限り、複数の表現を含む。本出願において、「含む」または「構成する」等の用語は、明細書上に記載された特徴、数字、段階、動作、構成要素、部品、または、これらの組み合わせが存在することを指定しようとするものであって、一つまたはそれ以上の他の特徴や数字、段階、動作、構成要素、部品、または、これらの組み合わせ等の存在、または付加の可能性を予め排除しないものと理解されなければならない。

本発明は、糖化蛋白質測定用電極に関し、炭水化物鎖のシス−ジオールグループを持つ糖化蛋白質、例えば、糖化ヘモグロビン（Ｇｌｙｃａｔｅｄ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ、ＨｂＡ１ｃ）、または糖化アルブミン等の存在可否、またはその量を測定できる電極に関するものである。

前記電極としては、導体性電極の金（Ａｕ）電極、白金（Ｐｔ）電極、または半導体性電極として炭素電極等が用いられ、好ましくは金電極を用いる。

本発明の電極は、炭水化物鎖のシス−ジオールグループを持つ糖化蛋白質と結合するために、前記シス−ジオールグループとシス−ジオール相互作用（ｃｉｓ−ｄｉｏｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）によって結合できるボロン酸（Ｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＢＡ）をその周縁に持つことが好ましい。そして、特別に前記ボロン酸を電極表面に結合させるために、前記電極とボロン酸との間にシスタミン（Ｃｙｓｔａｍｉｎｅ：Ｃｙｓ）が存在することを特徴とする。ここで、前記ボロン酸は特に制限されず、この技術分野において広く知られた多様な形態のボロン酸を含む。例えば、前記ボロン酸は、ホルミルフェニルボロン酸（ｆｏｒｍｙｌｐｈｅｎｙｌ ｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＦＰＢＡ）であって、３−ホルミルフェニルボロン酸（３ＦＰＢＡ）であってもよく、前記式（１）で表される３−ホルミルフェニルボロン酸（３−ｆｏｒｍｙｌｐｈｅｎｙｌ ｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ：３ＦＰＢＡ）であることが好ましい。

即ち、本発明は、電極表面にシスタミンが結合され、前記シスタミンにはボロン酸が連結されている糖化蛋白質測定用電極である。前記シスタミン（ｃｙｓｔａｍｉｎｅ）は、中にジスルフィド（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）基を有するため、金属等からなる電極表面に結合可能で、両末端にはアミン基を有するため、アルデヒド基を有するボロン酸とも結合することができる。従って、シスタミンの一つは、前記両末端のアミン基によって２個のボロン酸（３−ホルミルフェニルボロン酸)を修飾できる効果がある。

それと共に、本発明に係る電極は、シスタミンを電極により効果的に結合させるために、電極表面に形成された表面改質層をさらに含んでもよく、これはこの技術分野において通常の知識を有する者には明らかに分かる。

従来、ボロン酸を電極表面に結合させるためには、電極表面に、まずアミンと反応できる作用基を持った３，３'−ジチオ−ビス−プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(３，３'−ｄｉｔｈｉｏ−ｂｉｓ−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ、ＤＴＳＰ)を結合させて、その上にポリ(アミドアミン)（ｐｏｌｙ（ａｍｉｄｏａｍｉｎｅ））、ポリ(アルキレンイミン)（ｐｏｌｙ（ａｌｋｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ））などのようなデンドリマーを結合させた後、さらにその上にボロン酸を結合させなければならなかった。即ち、ＢＡ／デンドリマー／ＤＴＳＰ／電極のような構造を有しなければならなかった。

しかし、本発明によると、電極表面にシスタミンを結合させて、その上にボロン酸を結合させることができるため、従来より簡単なＢＡ／シスタミン／電極の構造を有し、その製造方法においても従来より簡単かつ容易になる。

このような本発明に係る電極は、電極表面の上にシスタミンが結合され、前記シスタミンにはボロン酸が連結されていれば足りる。このような構造の電極は、まずシスタミンとボロン酸が結合したＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂接合体を準備した後、１段階の電極浸漬だけで前記接合体を電極表面に一度に結合させるコンジュゲーション（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）方式によって製造されることが好ましく、電極表面の上にシスタミンを結合させ、続いて前記シスタミンにボロン酸を順に結合させるボトムアップ（ｂｏｔｔｏｍ−ｕｐ）方式によって製造されることもできる。

本発明のように電極表面にシスタミンとボロン酸が順に結合した構造の電極は、従来技術によっては容易に考えられなかったが、それは、第一にスタミンにおいてジスルフィド基が前記シスタミンの末端に位置するのではなく、中間に位置しており、第二に後述するようにボロン酸が結合した電極を製造する一般的な方法である前記ボトムアップ方式による場合より、前記コンジュゲーション方式によって製造することがさらに好ましいからである。

これにより、本発明の一具体例は、シスタミンとボロン酸が連結されたシスタミン−ボロン酸接合体が、電極表面に結合した糖化蛋白質測定用電極であってもよい。ここで、前記接合体は、シスタミンと３−ホルミルフェニルボロン酸（３ＦＰＢＡ）が下記反応式により合成されたＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂であってもよい。

また、前記接合体は、糖化蛋白質との結合のためにボロン酸のジオール（ｄｉｏｌ）基が周縁に向かうように電極表面と結合することが好ましく、それにより、前記接合体はシスタミンのジスルフィド（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）基によって電極表面と結合することがさらに好ましい。

前記のような本発明は、電極表面にシスタミンが結合され、前記シスタミンにはボロン酸が連結されていることを特徴とし、電極表面にさらに多量のボロン酸を結合させることができるだけでなく、これを介して糖化蛋白質の量をより正確に測定できる効果がある。

本発明の他の態様は、シスタミンとボロン酸が連結されたシスタミン−ボロン酸接合体を準備する段階、及び前記準備した接合体を電極表面に結合させる段階、を含む糖化蛋白質測定用電極の製造方法である。即ち、シスタミンとボロン酸が結合したＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂接合体を先ず準備した後、前記接合体を含む溶液に電極を１回だけ浸漬させるコンジュゲーション（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）方式を介して、簡単かつ容易に糖化蛋白質測定用電極を製造することである。後述するように、このような方式によって製造された電極は、従来の一般的であるボトムアップ方式によって製造された電極より顕著に優秀な効果を持つ。

前記接合体を準備する方法は、特に制限されなく、例えば、シスタミンと３ＦＰＢＡを溶液上で室温で数時間反応させることもでき、前記溶液は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）が溶解したものが好ましい。

そして、前記接合体を電極表面に結合させる方法も特に制限されなく、例えば、金が蒸着された電極表面を洗浄した後、前記Ｃｙｓ−ＦＰＢＡ₂が溶解したＤＭＳＯ溶液に数時間担持するものであってもよく、前記担持の前にピラニア（Ｐｉｒａｎｈａ）溶液で汚染物質を除去することと担持後にＤＭＳＯとエタノールで洗浄することが好ましい。

また、本発明者等は、後述する実施例で記載された通り、高収率のＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂合成のための最適条件を探すために種々の条件に対する最適化実験を行い、その結果、前記接合体を準備する段階において、反応時間は３〜５時間にすることが好ましく、３〜４時間にすることがさらに好ましいが、仮に、反応時間が３時間未満の場合、Ｃｙｓ−ＦＰＢＡ₂の合成が微弱で糖酸化酵素（ＧＯＸ）による信号が弱く、反応時間が５時間を超える場合、返って、反応信号が減少するためである。そして、反応時には、トリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ：ＴＥＡ）を触媒として用いることが好ましいが、一般的なシッフ塩基合成反応で触媒として多く使われるＨＣｌより、トリエチルアミンの条件下で反応させる場合、その効果が優秀なためである。また、反応温度は４０〜６０℃にすることが好ましく、４５〜５５℃にすることがさらに好ましいが、反応温度が４０℃ 未満の場合、Ｃｙｓ−ＦＰＢＡ₂の合成が弱く(糖酸化酵素（ＧＯＸ）による信号が弱い)、反応温度が６０℃を超える場合、返って接合体が分解される恐れがある。

図１は、本発明の一実施例に係る糖化蛋白質測定用電極を利用して、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１c)を電気化学的に測定するための競合アッセイ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）の一例を示す反応模式図である。

ここに示した通り、電極表面にボロン酸を修飾した後、それぞれの測定しようとする濃度のＨｂＡ１ｃ試料と一定濃度の糖酸化酵素（ＧＯＸ）を同時に反応させると、ＨｂＡ１ｃの濃度が増加するほど相対的に高い濃度のＨｂＡ１ｃがＧＯＸが電極表面に固定化することを妨害し、それに伴う電気化学信号は減少することになる。この時、利用するＧＯＸは、糖蛋白質として何ら生化学的処理をしなくてもＢＡと反応することができ、ＨｂＡ１ｃとの競合によって電極表面に固定化されると、生物学的触媒反応により増幅された電気化学的信号を検出できるようにする特性を持つ。

本発明は、下記実施例によってよりよく理解でき、下記実施例は本発明の例示目的のためのものであり、添付された特許請求範囲によって限定される保護範囲を制限しようとするものではない。

実施例：糖化蛋白質測定用電極の製造
まず、ボロン酸自家組み立て形成層（ＢＡ ＳＡＭ）を形成させる方法として、予めシスタミン（ｃｙｓｔａｍｉｎｅ）とボロン酸（ＢＡ）の合成反応を進行した後、自家組み立て形成層（ＳＡＭ）を形成させるコンジュゲーション（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）方式と、シスタミンとＢＡを順次反応させるボトムアップ（ｂｏｔｔｏｍ−ｕｐ）方式に分けて実験を進行した。

続いて、高収率のＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂合成のための最適条件を探すために、種々の条件に対する最適化実験を行った。

実施例１：コンジュゲーション（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）方式による糖化蛋白質測定用電極の製造
先ず、チタニウムが処理されたシリコンウェハー（２０ｎｍ Ｔｉ）に純度９９．９９９％の金を２００ｎｍの厚さで抵抗性蒸着（ｒｅｓｉｓｔｉｖｅ ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）させて電極を準備した。

そして、シスタミン（５ｍＭ）と３ＦＰＢＡ（２０ｍＭ）をＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）の溶液に室温で４時間反応させてＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂を合成した。すると、シスタミンのアミノ基はシッフ塩基を媒介として、ＦＰＢＡのアルデヒド基と混合されて結合される。触媒としてトリエチルアミン（Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ：ＴＥＡ）は、塩基環境を作る前に混合された溶液に注入した。

その後、前記蒸着された金表面をピラニア（Ｐｉｒａｎｈａ）溶液に５分間担持し蒸溜水で洗浄した後、ホウ素変換された（ｂｏｒｏｎａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）自家組み立て形成層（ＳＡＭ）を生成するために、前記Ｃｙｓ−ＦＰＢＡ₂が溶解されたＤＭＳＯ溶液に２時間担持した。以後、前記電極を溶液から取り出してＤＭＳＯとエタノールで洗浄した後、蒸溜水（ＤＤＷ）で洗いおとした。最後に、電極はリン酸緩衝食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）に浸漬して保存した。

実施例２：ボトムアップ（ｂｏｔｔｏｍ ｕｐ）方式による糖化蛋白質測定用電極の製造
前記実施例１と同様な方法で電極を準備し、前記実施例１と同様に５ｍＭシスタミンと２０ｍＭ ３ＦＰＢＡを利用し、溶媒もＤＭＳＯを利用した。

即ち、前記金電極に先ずシスタミンを反応させて電極表面にアミン基が露出するようにした後、アミン基と反応できるアルデヒド基が結合した３ＦＰＢＡを反応させてシッフ塩基による結合ができるようにした。

実験例１：コンジュゲーション方式とボトムアップ方式による電極の電気化学信号測定
前記実施例１と２の電極において、ＢＡ ＳＡＭの修飾の可否は、合わせて２５μｇ／ｍｌの糖酸化酵素（ＧＯＸ）をＢＡ−ＳＡＭ／Ａｕ／Ｓｉ電極に反応させて、ＧＯＸの糖鎖とＢＡのシス−ジオール相互作用に結合されて現れるＧＯＸ酵素増幅反応を介した電気化学信号の大きさを利用して追跡した。この時使った電子伝達物質は、０．１ｍＭ フェロセン（Ｆｃ）溶液で、ＧＯＸの基質である１０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅが添加されたものを利用した。電気化学的測定方式は、循環電圧電流法（ｃｙｃｌｉｃ ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ）を利用し、走査速度は５ｍｖ／ｓにした。

図２は、本発明の一実施例によるボトムアップ方式（○、ｒｅｄ ｌｉｎｅ）とコンジュゲーション方式（△、ｂｌｕｅ ｌｉｎｅ）で製造された電極における電気化学信号（ｃｙｃｌｉｃ ｖｏｌｔａｍｍｏｇｒａｍ、ＣＶ）値である。図２から分かるようにコンジュゲーション方式のＢＡ ＳＡＭでは基質がないバックグランド信号に比べて約２μＡ信号が増加したことを見ることができた。これは、金電極表面上のＢＡとシス−ジオール相互作用によって固定化されたＧＯＸによるもので、金電極表面にＢＡが修飾されていることが確認された。しかし、ボトムアップ方式は、約０．３μＡ増加したことからコンジュゲーション方式に比べてほとんどＢＡが修飾されていないと考えられる。

これによって、ＢＡ ＳＡＭの形成方式はボトムアップ方式より、先に合成反応を進行して得たＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂を利用して、ＳＡＭを形成させるコンジュゲーション方式が大きく効果的であることが分かり、以後の全ての実験は、コンジュゲーション方法を通して得たＢＡ−ＳＡＭ／Ａｕ／Ｓｉ電極を利用して行った。

実施例３：Ｃｙｓ−ＦＰＢＡ₂の合成反応時間に応じた電極製造及び電気化学信号測定
最適なＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂合成反応時間を決めるために、２時間から８時間まで合成反応を進行して、反応時間に応じたＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂合成程度を比較した。実施例１と同様にＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂の合成は、ＤＭＳＯ上の５ｍＭ シスタミンと２０ｍＭ ３ＦＰＢＡで行い、反応時間に応じたＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂の合成収率によるＢＡ ＳＡＭの修飾程度は前記実験例１（ＢＡ ＳＡＭ修飾方式試験）と同様にＧＯＸ固定化実験を介して確認し、合成時間に応じた電気化学的実験結果は図３に示した。

図３に示されたように、４時間までは反応時間が増加するほどＧＯＸによる信号も大きくなることを見ることができる。しかし、４時間過ぎになると、徐々に反応収率が減少することから、最適な反応時間として４時間を選択した。これに伴い、今後のＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂は、５ｍＭ シスタミンと２０ｍＭ ３ＦＰＢＡをＤＭＳＯ上で４時間合成して用いる。

実施例４：Ｃｙｓ−ＦＰＢＡ₂の合成時用いる触媒に応じた電極製造及び電気化学信号測定
感度のよいＨｂＡ１ｃ測定が可能になるためには、合成されるＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂の合成収率を最大に高めなければならない。より効率的かつ高収率でＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂を合成するために触媒を用いた。前記実施例１を基に、添加する触媒としてはＨＣｌ、トリエチルアミン（ＴＥＡ）を選択し、対照群としては触媒も添加しないもの、の三つを互いに比較した。既に本発明者等がシッフ塩基合成反応で用いた触媒を参考にして、ＨＣｌの場合、０．３５％ １００μｌを３ｍｌのＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂接合体に添加し、ＴＥＡは１．１μｌを添加した。

図４は、触媒に応じた電気化学信号を示したもので、ＣＶ（ｃｙｃｌｉｃ ｖｏｌｔａｍｍｏｇｒａｍ）上の電圧４００ｍＶにおける電流値から基質がないバックグランド信号を差し引いた電流値を示した。図４から分かるように、ＴＥＡを添加した場合、添加しなかった場合とＨＣｌを添加した場合よりＧＯＸによる信号が高いことがわかる。このことから、合成反応時ＴＥＡを添加することが、Ｃｙｓ−ＦＰＢＡ₂の合成をより容易にすることが分かり、以後Ｃｙｓ−ＦＰＢＡ₂合成はＴＥＡ １．１μｌを添加して進行した。

実施例５：Ｃｙｓ−ＦＰＢＡ₂の合成反応温度に応じた電極製造及び電気化学信号測定
一方、Ｃｙｓ−ＦＰＢＡ₂の合成収率を最大に高めるために、前記実施例１を基に、Ｃｙｓ−ＦＰＢＡ₂も常温条件である２５℃と５０℃で合成を進行して、それぞれの温度で合成したＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂を適用してその結果を比較した。

図５は、それぞれの温度で合成して形成したＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂ ＳＡＭに固定化されたＧＯＸに応じた電気化学信号を示す。図５から分かるように、２５℃で合成したＢＡ ＳＡＭでより５０℃で合成したＢＡ ＳＡＭに固定化されたＧＯＸによる信号が１μＡほど（ｘ２）より大きいことが分かる。このことから５０℃で合成したＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂でのＧＯＸが固定化された量がより多く、これは５０℃で合成したＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂が効率がずっと良いことが分かる。従って、Ｃｙｓ−ＦＰＢＡ₂合成のための温度は、５０℃にして実験を進行した。

実験例２：Ｃｙｓ−ＦＰＢＡ₂ ＳＡＭ／Ａｕ形成確認
前記実施例１〜５と実験例１から得た最適なＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂合成条件は、ＤＭＳＯを溶媒として５ｍＭ シスタミンと２０ｍＭ ３−ホルミルフェニルボロン酸を５０℃で４時間反応させ、触媒としてＴＥＡ １．１μｌを添加した。

このように合成されたＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂ ＳＡＭ／Ａｕ表面が意図した通り修飾されたか確認するために、ＢＡが合成されなかったシスタミンと比較実験を行った。前記ＢＡ修飾を確認した実験と同様にＢＡが合成されなかったシスタミンとＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂が固定化された金電極に２５μｇ／ｍｌ ＧＯＸを反応させてＧＯＸの固定化様子を比較した。

ＢＡが修飾された場合は、ＢＡとシス−ジオール相互作用によってＧＯＸが電極表面に固定化されてＧＯＸによる電気化学信号が検出され、ＢＡがスムーズに修飾されなかったシスタミンの場合には、ＧＯＸが固定化できる作用基が存在しないために固定化にならないと予想した。

実際の実験結果、図６から分かるように、Ｃｙｓ−ＦＰＢＡ₂の場合、バックグランド対比約２．２μＡが増加したが、シスタミンの場合には０．５μＡ増加した。これは、Ｃｙｓ−ＦＰＢＡ₂電極の場合には、ＧＯＸと電極表面とＢＡ群との間のシス−ジオール相互作用による特異的結合によって固定化されたことであり、シスタミンの場合は、ＧＯＸとシスタミンのアミン基との間の非特異的結合（静電気力による結合であり、その結合は弱くて溶液ｐＨによって可変的であるためバイオセンシングに利用できない)によるものである。このことから、本発明に係るＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂が十分合成されて電極表面にＢＡ基が修飾されることが確認できた。このように確認した最適条件のＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂を利用して、金電極表面にＢＡ ＳＡＭを形成させて、ＨｂＡ１ｃ測定のための競合アッセイを行った。

実験例３：電気化学方式の％ＨｂＡ１ｃ測定
前記実施例及び実験例から確認された条件によって合成されたＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂を利用して、電極表面にＢＡ ＳＡＭを形成した後、ＨｂＡ１ｃの％濃度に応じた電気化学式測定を進行した。ＨｂＡ１ｃの電気化学的測定のために、天然ＧＯＸと競合アッセイを行った。

実験は、ＨｂＡ１ｃだけからなる緩衝液上試料（実験例３−１）と、ＢＳＡを含んだ％ＨｂＡ１ｃ（実験例３−２）、そして参考試料（実験例３−３）を利用して、競合アッセイを行った。

実験例３−１：ＨｂＡ１ｃ試料（ＰＢＳ緩衝液中）に対する％ＨｂＡ１ｃ測定
本発明に係る競合アッセイが、％ＨｂＡ１ｃを測定するのに適合するか判断するために、まず精製されたＨｂＡ１ｃだけを利用してＨｂＡ１ｃの濃度に応じた電気化学信号を検出した。用いられたＨｂＡ１ｃ試料の濃度は、一般人の全ヘモグロビンの平均濃度である１５０ｍｇ／ｍｌを７５００倍に希釈した２０μｇ／ｍｌをＨｂ １００％として、各々０％から１５％までの濃度（０．５μｇ／ｍｌ〜３μｇ／ｍｌ）で試料を希釈してＨｂＡ１ｃの濃度に応じた信号を測定した。

図７は、本発明の一実施例に係る電極に対する、ＨｂＡ１ｃ試料濃度に応じた電気化学信号及びＣＯＶ値である。図７から分かるように、ＨｂＡ１ｃの濃度が増加するほど電気化学信号は減ることが分かる。ＨｂＡ１ｃの濃度が増加すると、電極表面上に固定化されるＨｂＡ１ｃの量が増加するため、信号が出せるＧＯＸの結合が空間的に制限されて、相対的に結合する量が減少することになる。従って、ＨｂＡ１ｃの濃度が増加するほどＧＯＸによる電気化学的信号は減少することになる。図７のようにＨｂＡ１ｃの診断範囲である２．５〜１５％で徐々に信号が減少し、このことからＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂ ＳＡＭを利用してＨｂＡ１ｃ濃度測定が可能な電気化学的測定方式が有効であることが確認された。

さらに、再現性を検証するために、３回の独立的な繰り返し実験を介して、ＨｂＡ１ｃの測定範囲中、低濃度２．５％ （０．５μｇ／ｍｌ）、中濃度７％ （１．４μｇ／ｍｌ）、高濃度１５％ （３μｇ／ｍｌ）を選択して、ＣＯＶ（変動係数）を求めた。ＨｂＡ１ｃだけを利用した標準溶液サンプルのＣＯＶは、２．５％（０．５μｇ／ｍｌ）で９％、７％（１．４μｇ／ｍｌ）の場合１７％、高濃度１５％（３μｇ／ｍｌ）は２９％であり、高濃度でＣＯＶが相対的に高いことが分かった。これは、本測定システムの特性上、高濃度で信号値（電流）が小さくなるため、相対的にＣＶ値が高まるものと考えられる。本サンプル実験を介して、ＢＡ ＳＡＭを基にした競合アッセイが、ＨｂＡ１ｃの測定に有用であることが確認された。

実験例３−２：％ＨｂＡ１ｃ試料（ＰＢＳ緩衝液中ＢＳＡ）に対する％ＨｂＡ１ｃ測定
前記実験例３−１のＨｂＡ１ｃ試料は、それぞれの％ＨｂＡ１ｃに該当するＨｂＡ１ｃだけからなる試料であるため、ＧＯＸと混合した電極に反応させる試料の全蛋白質濃度は、全て異なることになる。最終的に目的とする％ＨｂＡ１ｃは、糖化されているヘモグロビン（Ｈｂ）のＨｂＡ１ｃと糖化されていなかったＨｂＡ０からなる全Ｈｂ試料におけるＨｂＡ１ｃを測定することである。

ＨｂＡ０とＨｂＡ１ｃからなる全Ｈｂで実験を進行する前に、ＨｂＡ０の代わりに糖化蛋白質でないＢＳＡとＨｂＡ１ｃからなる％ＨｂＡ１ｃに応じた信号を測定した。同様に全蛋白質（１００％ Ｈｂと仮定)は、２０μｇ／ｍｌとして２．５％から１５％のＨｂＡ１ｃ試料を準備して、ＧＯＸと競合アッセイを行った。

図８は、本発明の一実施例に係る電極に対する、％ＨｂＡ１ｃ濃度に応じた電気化学信号及びＣＯＶ値である。図８の左側グラフから分かるように、ＨｂＡ１ｃの濃度が増加するほど電気化学信号は減少することが分かる。右側の表は、ＨｂＡ１ｃ標準溶液試料を利用して実験と同様に３回の繰り返し実験から得られたＣＯＶ値を示す。ＨｂＡ１ｃだけを含む実験例３−１の実験結果よりＣＯＶ値が全体的に低くなっていることが分かるが、これはＨｂＡ１ｃだけを利用した試料の場合、全蛋白質量が全て一定ではないが、ＢＳＡで全蛋白質量を一定に合わせると、全体的な蛋白質試料条件がより均一になるため、再現性がさらに良くなるためと考えられる。

さらに、本実験を介して、競合アッセイが全Ｈｂを利用した実験に適用可能であることが確認でき、競合アッセイのためのＨｂ試料とＧＯＸ試料との間の比率が適切であることも確認できた。競合アッセイを行うに当たり、二つの試料との間の濃度比率が大変重要な要素になるが、これはＧＯＸの比率が相対的に高過ぎたり低過ぎると、電気化学的信号は大き過ぎたり小さすぎるため、ＨｂＡ１ｃによる信号を精度よく区分し切れなくなるためである。

実験例３−３：％ＨｂＡ１ｃ試料（参考試料）に対する％ＨｂＡ１ｃ測定
血液内％ＨｂＡ１ｃを測定するために、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社から購入したＨｂＡ１ｃ参考試料（Ｌｙｐｈｏｃｈｅｋ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ｌｉｎｅａｒｉｔｙ ｓｅｔ）を利用して実験を進行した。用いられた試料は、それぞれのＨｂＡ１ｃレベルに応じた凍結乾燥された全血に近い参考試料である。Ｌｉｎｅａｒｉｔｙ ｓｅｔに含まれた４個の試料には、全ヘモグロビン数値が表記されていないため、競合アッセイを行う前にＲｏｃｈｅ社のレフロトロン（Ｒｅｆｌｏｔｒｏｎ）を利用して各サンプルの全ヘモグロビンとグルコースの量を測定した。測定結果、各サンプルの全Ｈｂ量が異なり、サンプル毎に相当量のグルコースが含まれていることが確認された。血液内のグルコースはＨｂＡ１ｃ同様にＢＡと反応できるため、％ＨｂＡ１ｃ濃度の測定に妨げとなる。正確なＨｂＡ１ｃの測定のために、試料内のグルコースを取り除いた後、希薄して各々試料の全Ｈｂを２０μｇ／ｍｌに合わせて実験を進行した。

図９は、本発明の一実施例に係る電極に対する、参考試料内の％ＨｂＡ１ｃ濃度に応じた電気化学信号及びＣＯＶ値である。即ち、グルコースを取り除き適宜希釈した４個のＨｂＡ１ｃレベルの参考試料を利用した競合アッセイの結果である。提供されたサンプル・データ・シートには、それぞれのＨｂＡ１ｃレベルに応じた試料を商用化されたＨｂＡ１ｃ測定機器を介して得られたＨｂＡ１ｃの％濃度値が示されている。本実験では、Ｒｏｃｈｅ／Ｈｉｔａｃｈｉ Ｃｏｂａｓ ｃ ｓｙｓｔｅｍｓを利用して測定したＩＦＣＣ値のＨｂＡ１ｃ％濃度を試料毎の％ＨｂＡ１ｃ値として選択して実験を進行した。図９の右側のデータシートによると、試料１は、１．７％、２は４．４％、３は１７％のＨｂＡ１ｃが含まれていることが分かった。

図９に示された通り、陽性対照としてＨｂが含まれないＧＯＸ／ＢＳＡ試料をＨｂＡ１ｃ ０％として、レベル４まで合わせて５個の試料に対する実験結果である。図９の左側のグラフから分かるように、％ＨｂＡ１ｃ濃度が増加するほど競合アッセイによる電気化学信号は減少することが分かる。これは、本研究によって開発された競合アッセイが、グルコースを取り除いた血液において％ＨｂＡ１ｃの測定が可能であることを証明するものである。ＣＯＶ値も６％台であり、他の試料と比較した際に再現性も相対的に高いことが分かる。

一方、前記では本発明を特定の好ましい実施例に関連して図示して説明したが、以下の特許請求範囲によって用意される本発明の技術的特徴や分野を逸脱しない限度内で本発明が多様に改造及び変化できることは、当業界において通常の知識を有する者にとっては明らかである。

Claims (12)

1. 電極表面にシスタミン（Ｃｙｓ）が結合され、前記シスタミンにはボロン酸（Ｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＢＡ）が連結されていることを特徴とする、糖化蛋白質測定用電極。
2. 前記ボロン酸は、ホルミルフェニルボロン酸（ＦＰＢＡ）であることを特徴とする、請求項１に記載の糖化蛋白質測定用電極。
3. 前記ボロン酸は、下記式（１）で表される３−ホルミルフェニルボロン酸（３ＦＰＢＡ）であることを特徴とする、請求項１に記載の糖化蛋白質測定用電極。
   
4. 前記シスタミン一つに３−ホルミルフェニルボロン酸２個が連結されていることを特徴とする、請求項１に記載の糖化蛋白質測定用電極。
5. シスタミンとボロン酸が連結されたシスタミン−ボロン酸接合体が電極表面に結合していることを特徴とする、糖化蛋白質測定用電極。
6. 前記接合体は、シスタミンのジスルフィド基によって電極表面と結合していることを特徴とする、請求項５に記載の糖化蛋白質測定用電極。
7. 前記接合体は、下記式（２）で表されたＣｙｓ−ＦＰＢＡ₂であることを特徴とする、請求項５に記載の糖化蛋白質測定用電極。
   
8. 前記電極表面は、金（Ａｕ）からなることを特徴とする、請求項１乃至７のうちいずれか一項に記載の糖化蛋白質測定用電極。
9. シスタミンとボロン酸が連結されたシスタミン−ボロン酸接合体を準備する段階と、前記準備した接合体を電極表面に結合させる段階とを含むことを特徴とする、糖化蛋白質測定用電極の製造方法。
10. 前記接合体を準備する段階は、
    前記シスタミンとボロン酸を３〜５時間反応させる段階を含むことを特徴とする、請求項９に記載の糖化蛋白質測定用電極の製造方法。
11. 前記接合体を準備する段階は、
    前記シスタミンとボロン酸をトリエチルアミン（ＴＥＡ）の存在下で反応させる段階を含むことを特徴とする、請求項９に記載の糖化蛋白質測定用電極の製造方法。
12. 前記接合体を準備する段階は、
    前記シスタミンとボロン酸を４０〜６０℃の温度で反応させる段階を含むことを特徴とする、請求項９に記載の糖化蛋白質測定用電極の製造方法。