CN103105497A - 一种检测甲胎蛋白的电化学免疫传感器的制备方法 - Google Patents
一种检测甲胎蛋白的电化学免疫传感器的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103105497A CN103105497A CN201310047373XA CN201310047373A CN103105497A CN 103105497 A CN103105497 A CN 103105497A CN 201310047373X A CN201310047373X A CN 201310047373XA CN 201310047373 A CN201310047373 A CN 201310047373A CN 103105497 A CN103105497 A CN 103105497A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- electrode
- solution
- pedot
- electrochemical immunosensor
- preparation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开了一种检测甲胎蛋白的免疫生物传感器的制备方法，其通过将聚（3，4-乙烯二氧噻吩）、天青Ⅰ、ZnSe量子点及甲胎蛋白抗体自组装修饰到铂盘电极上得到。它利用染料分子天青Ⅰ作为电子媒介体，与聚（3，4-乙烯二氧噻吩）共同构建了抗体分子的固定载体，用ZnSe量子点来吸附在复合物薄膜表面，用于结合抗体分子与辣根过氧化物酶，将ZnSe量子点的化学放大作用与免疫传感器的特异性相结合，融合两者的优点，增强了电化学检测甲胎蛋白灵敏度和检测限。
Description
技术领域
本发明属于电化学免疫传感器技术领域，具体涉及一种检测甲胎蛋白的电化学免疫传感器的制备方法，尤其是基于ZnSe量子点及PEDOT导电化合物薄膜修饰电极用于甲胎蛋白免疫生物传感器的构建。
背景技术
甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）是胚胎发育早期的一种主要血清蛋白，在健康的成人体内，其值通常低于25 ng/ml，血清中甲胎蛋白的升高对原发性肝癌诊断具有重要的意义。目前甲胎蛋白的检测方法主要有酶联免疫分析法、放射免疫测定法、间接血酶法和琼脂双扩散法等。虽然这些方法灵敏、可靠，但存在酶不稳定，放射物质设备要求高，危害较大等缺点。
发明内容
本发明目的在于提供一种检测AFP的电化学免疫传感器的制备方法，该方法基于PEDOT及ZnSe量子点作为生物蛋白分子的固定载体，具有较宽的线性范围及较高的灵敏度。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测AFP的电化学免疫传感器的制备方法，其包括下述步骤：
1）制备水溶性ZnSe量子点；
2）制备PEDOT/AzureⅠ/ZnSe修饰电极；
3）构建电化学免疫传感器。
所述步骤1）具体可参照文献[Enustun. B. V, Turkevich. J. J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 3317-3328]进行ZnSe量子点的制备，并参照[Alexey Shavel, Nikolai Gaponik, Alexander Eychmller. J. Phys. Chem. B. 2004, 108, 5905-5908] 对ZnSe量子点进行纯化。
所述步骤2）具体为：将处理清洁的直径为3mm的铂盘电极浸入含有0.5 mol/L 3,4-乙烯二氧噻吩（EDOT）单体的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体中,在45℃温度条件下，以铂盘电极为工作电极，铂片电极为对电极，银丝作参比的+1.25 V的工作电位恒电位电聚合得到蓝色的PEDOT薄膜修饰电极，聚合电量为1.0 mC；然后将PEDOT薄膜修饰电极用去离子水洗净，晾干，取5μl质量百分比为5％的天青I（AzureⅠ）溶液滴涂于PEDOT薄膜修饰电极表面，晾干成膜，用去离子水反复冲洗用以去除非共价键合的天青Ⅰ，晾干，然后浸入ZnSe量子点溶液中浸泡12h，取出后用去离子水清洗干净，晾干备用，即为PEDOT/AzureⅠ/ZnSe修饰电极。
所述步骤3）具体为：将步骤2）所得修饰电极浸入到30 μl含1.0 mg/mL甲胎蛋白抗体（anti－AFP）的磷酸缓冲溶液中4℃孵育12h，然后用PBST溶液清洗电极用以去除与修饰电极结合不够稳定的抗体；再将修饰电极浸入到含1.0mg/L辣根过氧化物酶（HRP）的磷酸缓冲溶液中放置4小时，取出，用PBST溶液清洗干净，由此即得到电化学免疫传感器；所述PBST溶液是由0.1 mol/L的磷酸氢二钾、磷酸二氢钾配置的磷酸缓冲溶液和浓度0.05% 的Tween-20组成的混合溶液。
量子点(quantum Dots，简称QDs)是一种半导体晶体材料的纳米颗粒，直径在10 nm 以内，较普通细胞的体积小数千倍。这种纳米尺寸的化合物具有水溶性、生物相容性等特点，在免疫生物学和临床检验学等研究中有广阔的应用前景。众所周知，纳米材料的催化性能取决于粒子的大小。小的粒径不仅有助于提高生物蛋白分子的固定能力，而且可以提供较多的活性比表面积，增加蛋白分子固定的个数。本申请合成了水溶性的ZnSe量子点，电镜结果显示其平均粒径为4.4 nm，相对于金胶纳米颗粒（16 nm）的粒径要小的多。因此，其可以代替金胶纳米颗粒作为生物蛋白分子的固定载体，从而改善生物蛋白分子的吸附能力，增加固定量。同时，在离子液体中电聚合得到的PEDOT聚合物薄膜具有疏松多孔的三维结构，便于吸附更多的量子点。因此，基于ZnSe量子点和导电聚合物PEDOT的双纳米粒子的协同作用，可以有效的增加电子传递。
本申请采用PEDOT纳米导电材料来作为生物传感器的基体，通过共价键合的方法在复合材料的表面组装导电功能材料-天青Ⅰ来共同作为电子传输体，这样既保证了抗原-抗体反应中电子的快速传递，又使得生物分子保持了有效的生物活性。更重要的是，硒化锌量子点的组装，使得标记的生物分子数目得到了增加，从而使得利用水溶性的硒化锌量子点作为信号扩增的甲胎蛋白免疫传感器，实现了对AFP的高灵敏度测定。此外，天青Ⅰ作为一种生物染料，是一种比较活泼的电子转移媒介体，在导电基质上具有良好的电化学行为。
本发明方法利用染料分子天青Ⅰ作为电子媒介体，与聚（3，4-乙烯二氧噻吩）共同构建了抗体分子的固定载体，用ZnSe量子点来吸附在复合物薄膜表面，用于结合抗体分子与辣根过氧化物酶，将ZnSe量子点的化学放大作用与免疫传感器的特异性相结合，融合两者的优点，增强了电化学检测AFP的灵敏度和检测限。
附图说明
图1是实施例1制备的电化学免疫传感器的构建示意图；
图2是实施例1制备的PEDOT及PEDOT /Azure I/ ZnSe薄膜的FESEM图；由PEDOT的电镜图片（a）可以看出制备的PEDOT为疏松多孔的三维结构，每层的厚度约10 nm，如此多孔的网状结构便于吸附更多的量子点，从而使得标记的生物分子数目增加，增强了免疫传感器的灵敏度；而由PEDOT /Azure I/ ZnSe的电镜图（b）可观察到网状结构表面覆盖大量的小颗粒，标识着在PEDOT的表面成功地修饰了大量的ZnSe量子点；
图3为按照实施例1制备的电化学免疫传感器的线形曲线。
具体实施方式
以下通过具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围并不局限于此。
实施例 1
一种检测AFP的电化学免疫传感器的制备方法，其包括下述步骤：
1）制备水溶性ZnSe量子点：
制备：参照文献[Enustun. B. V, Turkevich. J. J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 3317-3328]进行，具体为：量取125ml的二次蒸馏水充氮除氧1h，然后在搅拌条件下向水中加入0.875g(2.35 mmol) ZnClO4.6H2O与5.7 mmol的3-巯基丙酸(MPA，用作稳定剂)，用1 mol/L的NaOH溶液将反应溶液的pH值调节为6.5，继续向溶液中通氮气除氧。搅拌下，加入0.134g(0.46mmol)Al2Se3及过量硫酸进行反应（用以产生新鲜的H2Se3），在此状态下，产生了ZnSe的前驱体。然后加热回流2h，经过成核以及生长阶段，得到荧光发射波长为390nm的ZnSe量子点。
纯化：参照文献[Alexey Shavel, Nikolai Gaponik, Alexander Eychmller. J. Phys. Chem. B. 2004, 108, 5905-5908]纯化，具体为：将ZnSe量子点用3000 MW的超滤离心管于4℃离心15 min用以消除未反应完的MPA。然后用50 mmol/L、pH 7.4的PBS缓冲液洗涤三遍，取离心管的上部溶液再溶于PBS缓冲液中，用50 000 MW的超滤离心管进行第二次超滤离心，离心后将离心管下部的溶液在3000 MW的超滤离心管中经过离心浓缩，使得量子点的浓度达到0.1μmol/L，高分辨透射电镜结果表明制得的ZnSe量子点平均粒径为4.4 nm。
）制备PEDOT/Azure Ⅰ/ZnSe修饰电极：
将直径3 mm的铂盘电极依次用直径1.0、0.3和0.05μm的Al2O3粉在麂皮上抛光至镜面，每次抛光后用清水洗去表面污物，再分别用超纯水、乙醇各超声清洗3 min，氮气吹干、待用。
以BMIMBF4为电解液与支持电解质，于5ml的BMIMBF4中加入作为反应单体的EDOT 2.5mmol，搅拌均匀。先通氮气保护30min用以使溶液处于氮气氛围下。在45℃温度条件下采用三电极体系，以清洗干净的直径为3mm铂盘电极为工作电极，铂片为对比电极，银丝作参比电极，搅拌状态下，在上述电解液中于+1.25 v（vs.Ag）的工作电位恒电位电聚合，聚合电量为1.0 mC，得到表面包覆有蓝色PEDOT聚合物薄膜的修饰电极（即PEDOT修饰电极）。
将PEDOT修饰电极用去离子水冲洗干净，晾干。取5μl 质量百分比为5％的天青I水溶液滴涂于PEDOT修饰电极表面，晾干成膜，用去离子水反复冲洗，用以去除非共价键合的天青Ⅰ，晾干，然后浸入1ml的ZnSe量子点溶液（量子点浓度0.1μmol/L）中浸泡12h，取出后用去离子水清洗干净，晾干备用，即为PEDOT/AzureⅠ/ZnSe修饰电极。
）构建电化学免疫传感器：
将PEDOT/AzureⅠ/ZnSe修饰电极浸入到30 μl含1.0 mg/mL甲胎蛋白抗体的磷酸缓冲溶液中4℃孵育12h以使抗体分子结合在修饰电极表面，然后用PBST溶液清洗修饰电极用以移走电极表面物理吸附的抗体；再将修饰电极浸入到30μl含1.0mg/L HRP的磷酸缓冲溶液中放置4小时，取出，用PBST溶液清洗干净，由此即得到电化学免疫传感器；所述PBST溶液是由0.1 mol/L的磷酸氢二钾、磷酸二氢钾配置的磷酸缓冲溶液和浓度0.05% 的Tween-20组成的混合溶液。
一）电化学免疫传感器检测AFP：
将制备好的电化学免疫传感器浸入到30 μL含有不同浓度AFP的样品溶液中于37 ℃孵育20 min，用PBST溶液清洗电极表面后，与铂片对电极、甘汞参比电极组成三电极系统，在5ml 含有2.0 mmol/L H2O2的pH 7.4 磷酸缓冲液中进行循环伏安电化学检测。整个检测过程保持在氮气氛围中，扫描电位区间为-0.6～0.3V（vs.SCE，Saturated Calomel Electrode）。根据响应电流与AFP浓度的对数之间的线性关系，绘制工作曲线。得到“响应电流－AFP浓度”的线性曲线为I=2.5286logC-0.2386，线性相关系数为0.9868（结果见图3）。AFP在5×10-5 ng/ml～250 ng/ml范围内，响应电流与AFP浓度的对数保持良好的线性关系，检测限为10-6 ng/ml。
二）电化学免疫传感器的稳定性与重现性：
将电化学免疫传感器浸入到30 μL含有5 ng/ml AFP的标准溶液中于37 ℃免疫反应20 min，然后用PBST溶液清洗电极表面后，与铂片对电极，甘汞参比电极，组成三电极系统，在5ml 含有2.0 mmol/L H2O2的pH 7.4 磷酸缓冲溶液中进行循环伏安电化学检测。整个检测过程保持在氮气氛围中，扫描电位区间为-0.6～0.3V（vs.SCE）。每隔三天对相同浓度的标准样品进行测试，60天后，传感器的电流响应保持在96.2％。
同时制备6个电化学免疫传感器，浸入到同一份含有5ng/ml AFP的标准品中于37 ℃免疫反应20 min，测试响应电流，其相对标准偏差（RSD）在4.7％以内。
将电化学免疫传感器浸泡在piranha溶液（由浓硫酸与30％过氧化氢按体积比3：1混和而得）中5min即可除去电极表面的生物分子和有机物质，实现对免疫修饰电极的再生。重复上述的电极修饰过程即可得到全新的AFP传感器。对于连续再生5次的传感器，其相对标准偏差（RSD）为5.6％。
三）电化学免疫传感器在检测实际血清样品中AFP浓度的应用：
将电化学免疫传感器置于6份实际血清样品中免疫反应20 min后，按上述实验方法测量其电流值。然后通过线性方程求出样品中的AFP浓度，并和医院临床诊断中所使用的化学发光酶联免疫法得到的结果进行比较，结果见表1。由表1可看出，采用本发明方法制备的免疫传感器所得的检测结果和传统临床检测结果基本相一致。因此，表明该免疫传感器可满足临床对AFP检测的需求。
Claims (3)
1.一种检测甲胎蛋白的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
1）制备水溶性ZnSe量子点；
2）制备PEDOT/AzureⅠ/ZnSe修饰电极；
3）构建电化学免疫传感器。
2.如权利要求1所述检测甲胎蛋白的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤2）具体为：将处理清洁的铂盘电极浸入含有0.5 mol/L 3,4-乙烯二氧噻吩单体的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体中,在45℃温度条件下，以铂盘电极为工作电极，银丝为参比的+1.25 V的工作电位恒电位电聚合得到PEDOT薄膜修饰电极，聚合电量为1.0 mC；然后将PEDOT薄膜修饰电极用去离子水洗净，晾干，取5μl浓度5％的天青I溶液滴涂于PEDOT薄膜修饰电极表面，晾干成膜，用去离子水反复冲洗用以去除非共价键合的天青Ⅰ，晾干，然后浸入ZnSe量子点溶液中浸泡12h，取出后用去离子水清洗干净，晾干备用，即为PEDOT/AzureⅠ/ZnSe修饰电极。
3.如权利要求1所述检测甲胎蛋白的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤3）具体为：将步骤2）所得修饰电极浸入到30 μl含1.0 mg/mL甲胎蛋白抗体的磷酸缓冲溶液中4℃孵育12h，然后用PBST溶液清洗电极用以去除与修饰电极结合不够稳定的抗体；再将修饰电极浸入到含1.0mg/L辣根过氧化物酶的磷酸缓冲溶液中放置4小时，取出，用PBST溶液清洗干净，由此即得到电化学免疫传感器；所述PBST溶液是由0.1 mol/L的磷酸氢二钾、磷酸二氢钾配置的磷酸缓冲溶液和浓度0.05% 的Tween-20组成的混合溶液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310047373XA CN103105497A (zh) | 2013-02-06 | 2013-02-06 | 一种检测甲胎蛋白的电化学免疫传感器的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310047373XA CN103105497A (zh) | 2013-02-06 | 2013-02-06 | 一种检测甲胎蛋白的电化学免疫传感器的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103105497A true CN103105497A (zh) | 2013-05-15 |
Family
ID=48313505
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310047373XA Pending CN103105497A (zh) | 2013-02-06 | 2013-02-06 | 一种检测甲胎蛋白的电化学免疫传感器的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103105497A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106117356A (zh) * | 2016-06-30 | 2016-11-16 | 天津大学 | 一种金纳米粒子偶联辣根过氧化物酶和甲胎蛋白标记抗体的制备方法 |
| CN114563453A (zh) * | 2022-03-03 | 2022-05-31 | 桂林理工大学 | 一种以pedot/lyh为载体的酶生物传感器的制备方法和应用 |
-
2013
- 2013-02-06 CN CN201310047373XA patent/CN103105497A/zh active Pending
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 刘珂珂: "离子液体中3,4-乙烯二氧噻吩的电聚合及在电子器件上的应用研究", 《南京大学博士学位论文》 * |
| 刘珂珂等: "基于PEDOT/nanoAu的高稳定的多巴胺传感器", 《第十四次全国电化学会议论文汇编》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106117356A (zh) * | 2016-06-30 | 2016-11-16 | 天津大学 | 一种金纳米粒子偶联辣根过氧化物酶和甲胎蛋白标记抗体的制备方法 |
| CN114563453A (zh) * | 2022-03-03 | 2022-05-31 | 桂林理工大学 | 一种以pedot/lyh为载体的酶生物传感器的制备方法和应用 |
| CN114563453B (zh) * | 2022-03-03 | 2024-02-06 | 桂林理工大学 | 一种以pedot/lyh为载体的酶生物传感器的制备方法和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Qiu et al. | A label-free amperometric immunosensor based on biocompatible conductive redox chitosan-ferrocene/gold nanoparticles matrix | |
| Li et al. | Label-free photoelectrochemical immunosensor for neutrophil gelatinase-associated lipocalin based on the use of nanobodies | |
| Wang et al. | Photoelectrochemical sensitive detection of insulin based on CdS/polydopamine co-sensitized WO3 nanorod and signal amplification of carbon nanotubes@ polydopamine | |
| Wang et al. | Dual amplification strategy for the fabrication of highly sensitive interleukin-6 amperometric immunosensor based on poly-dopamine | |
| Feng et al. | Recent advances of carbon nanotubes‐based electrochemical immunosensors for the detection of protein cancer biomarkers | |
| Chen et al. | Surface‐Imprinting Sensor Based on Carbon Nanotubes/Graphene Composite for Determination of Bovine Serum Albumin | |
| Wang et al. | Ultrasensitive detection of carcinoembryonic antigen by a simple label-free immunosensor | |
| Wang et al. | A supersandwich multienzyme–DNA label based electrochemical immunosensor | |
| CN107085022B (zh) | 3-硝基酪氨酸的分子印迹电化学传感器的制备及应用 | |
| CN104132981B (zh) | 一种Cu2S标记的雌激素免疫传感器的制备方法及应用 | |
| Haji-Hashemi et al. | Sensitive electrochemical immunosensor for citrus bacterial canker disease detection using fast Fourier transformation square-wave voltammetry method | |
| Sun et al. | Reagentless and label-free voltammetric immunosensor for carcinoembryonic antigen based on polyaniline nanowires grown on porous conducting polymer composite | |
| CN106525943A (zh) | 一种表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法及其应用 | |
| Song et al. | Dual amplification strategy for the fabrication of highly sensitive amperometric immunosensor based on nanocomposite functionalized interface | |
| Li et al. | Graphene‐Based Nanohybrids for Advanced Electrochemical Sensing | |
| Mishyn et al. | The holy grail of pyrene-based surface ligands on the sensitivity of graphene-based field effect transistors | |
| Wang et al. | Graphene-Prussian blue/gold nanoparticles based electrochemical immunoassay of carcinoembryonic antigen | |
| Erkmen et al. | Layer-by-layer modification strategies for electrochemical detection of biomarkers | |
| Liu et al. | Highly sensitive, reagentless amperometric immunosensor based on a novel redox-active organic–inorganic composite film | |
| Zinggeler et al. | Printed antifouling electrodes for biosensing applications | |
| CN104391020B (zh) | 一种电化学适配体传感器、其制备方法及其用途 | |
| Zhan et al. | Microliter sample insulin detection using a screen-printed electrode modified by nickel hydroxide | |
| Park et al. | Label-free detection of antibody− antigen interactions on (R)-lipo-diaza-18-crown-6 self-assembled monolayer modified gold electrodes | |
| CN103913571A (zh) | 一种阵列断裂电极的免疫检测方法 | |
| Li et al. | Development and modeling of an ultrasensitive label-free electrochemical immunosensor for okadaic acid based on polythionine-modified three-dimensional gold nanoelectrode ensembles |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130515 |