CN114563453A - 一种以pedot/lyh为载体的酶生物传感器的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以PEDOT/LYH为载体的酶生物传感器，包括一玻碳电极，玻碳电极的检测端表面电沉积有层状氢氧化钇，层状氢氧化钇表面电沉积一层聚3,4‑乙烯二氧噻吩，随后在聚3,4‑乙烯二氧噻吩/层状氢氧化钇上吸附固定辣根过氧化氢酶；其制备方法包括以下步骤：首先将玻碳电极浸入硝酸钇溶液，通过电沉积制备层状氢氧化钇，再将层状氢氧化钇修饰电极浸入3,4‑乙烯二氧噻吩溶液中，通过电沉积在层状氢氧化钇表面得到一层聚3,4‑乙烯二氧噻吩，洗涤吹干后滴加辣根过氧化氢酶溶液得到酶生物传感器。本发明具有制备过程简单、条件易控、酶的生物活性高、重复性及稳定性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及酶传感器和电化学技术领域，尤其涉及一种以PEDOT/LYH为载体的酶生物传感器的制备方法和应用。
背景技术
过氧化氢(H2O2)不仅被广泛应用于医药、化工、环境卫生等领域，而且还在人体中发挥着重要的生物学作用。但浓度过大的过氧化氢会对人体和生态环境产生诸多不良影响。因此，有必要探索一种具有高灵敏度和低检测限的过氧化氢快速测定方法。相较于传统的过氧化氢检测方法，如色谱法、比色法、化学发光法和分光光度法等。基于酶电极的生物传感器法，因选择性好、响应速度快、灵敏度高等特点，受到广泛关注。但目前所报道的众多酶固定化载体材料的前期制备过程较为繁琐，在某些条件下无法实现酶生物传感器的快速制备及应用。
在特定的条件下，通过电沉积硝酸钇溶液得到的层状氢氧化钇(LYH)会呈现出由片层结构组成的纳米花状形貌，这种特殊的形貌既能够增加酶的吸附量，又能为底物提供接触固定化酶的便利条件。但因其导电性较差，不利于修饰电极表面的电子传递，将层状氢氧化钇用作电极修饰及酶固定化载体材料未见报道。聚3,4-乙烯二氧噻吩(PEDOT)是一种具有极高导电性的导电聚合物，能够简单快速地沉积到电极表面，且可以通过控制聚合条件控制PEDOT膜的厚度，以增强电极的催化功能，因此被广泛的应用在生物传感器上。将PEDOT与LYH结合作为酶固定化载体，能够有效解决上述问题。
本发明通过简单的电沉积法，将辣根过氧化氢酶固定在PEDOT/LYH载体上制备了酶生物传感器，层状氢氧化钇的纳米花状形貌为酶的大量吸附提供了大的比表面积，同时为过氧化氢接触固定化酶提供了便利条件；聚3,4-乙烯二氧噻吩的引入有效改善了酶生物传感器的导电性；层状氢氧化钇与聚3,4-乙烯二氧噻吩之间的协同作用，为酶的固定化提供了众多的活性位点，能够有效提高酶生物传感器的电催化性能。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的之一是提供一种以PEDOT/LYH为载体的酶生物传感器，所述酶生物传感器包括一玻碳电极，其特征在于：所述玻碳电极的检测端表面电沉积有层状氢氧化钇，层状氢氧化钇表面电沉积一层聚3,4-乙烯二氧噻吩，随后在聚3,4-乙烯二氧噻吩/层状氢氧化钇上固定辣根过氧化氢酶；所述玻碳电极记作GCE，所述层状氢氧化钇记作LYH，所述聚3,4-乙烯二氧噻吩记作PEDOT，所述辣根过氧化氢酶记作HRP。
本发明的目的之二是提供的一种以PEDOT/LYH为载体的酶生物传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)GCE的预处理
将GCE依次用0.05μm的氧化铝粉配成的浆液和麂皮打磨至表面呈光滑镜面，依次用超纯水、乙醇洗涤，N2吹干，得到预处理后的GCE；
(2)LYH/GCE的制备
将一定量的Y(NO3)3·6H2O溶于超纯水中配制成浓度为0.01～0.5mol/L的硝酸钇溶液；将步骤(1)中预处理后的GCE作为工作电极，与对电极、参比电极组成三电极体系，插入硝酸钇溶液中，电沉积得到层状氢氧化钇修饰电极，依次用超纯水、乙醇洗涤，N2吹干，记作LYH/GCE；
(3)PEDOT/LYH/GCE的制备
将一定量的EDOT溶于超纯水中配制成浓度为0.0005～0.5mol/L的3,4-乙烯二氧噻吩溶液；将步骤(2)中制备的LYH/GCE作为工作电极，与对电极、参比电极组成三电极体系，插入3,4-乙烯二氧噻吩溶液中，电沉积得到聚3,4-乙烯二氧噻吩/层状氢氧化钇修饰电极，依次用超纯水、乙醇洗涤，N2吹干，记作PEDOT/LYH/GCE；
(4)HRP/PEDOT/LYH/GCE的制备
将一定量的辣根过氧化氢酶分散于超纯水中，配制成浓度为0.5～5mg/mL的HRP溶液；在步骤(3)制得的PEDOT/LYH/GCE上滴加5μL配置好的HRP溶液，静置12h，通过物理吸附作用将HRP固定在PEDOT/LYH/GCE上，得到辣根过氧化氢酶/聚3,4-乙烯二氧噻吩/层状氢氧化钇修饰电极，记作HRP/PEDOT/LYH/GCE，该修饰电极即为酶生物传感器。
步骤(2)(3)中，所述对电极为铂片；参比电极为Ag/AgCl电极。
步骤(2)中，电沉积的温度优选为30～65℃，沉积电压优选为-1.00～-1.50V，电沉积的时间优选为30～600s；该步骤所得LYH呈现出由片层结构组成的纳米花状形貌，具有较大的比表面积。
步骤(3)中，电沉积的温度为25℃，沉积电压为1.8V，电沉积的时间优选为30～600s；该步骤所得PEDOT均匀的包覆在LYH片层结构表面及纳米花上，对LYH的形貌没有影响。
本发明的目的之三是提供一种以PEDOT/LYH为载体的酶生物传感器的应用。
一种以PEDOT/LYH为载体的酶生物传感器在检测过氧化氢中的应用，检测时的具体操作方法：以含1mM对苯二酚的0.1M(pH＝6.8)PB缓冲溶液为支持电解质，以HRP/PEDOT/LYH/GCE为工作电极，采用电化学工作站，通过计时电流法测定其对于过氧化氢的响应效果。
与现有技术相比，主要优点在于：本发明利用具有大比表面积的纳米花状层状氢氧化钇与具有极高导电性的聚3,4-乙烯二氧噻吩之间的协同作用，为酶的固定化提供了众多的活性位点；HRP/PEDOT/LYH/GCE相较于HRP/LYH/GCE和HRP/PEDOT/GCE具有更高的响应效果；该酶生物传感器的酶固定载体制备方法简单、条件易控。
附图说明：
图1为本发明实施例1制备的PEDOT/LYH/CGE的SEM图；
图2为本发明实施例1、对比例1、对比例2中HRP/PEDOT/LYH/CGE和HRP/LYH/GCE、HRP/PEDOT/GCE分别在含1.0mM对苯二酚的0.1M PB(pH＝6.8)缓冲液中，对5.0mM过氧化氢的循环伏安曲线；
图3为本发明实施例1、对比例1、对比例2中HRP/PEDOT/LYH/CGE和HRP/LYH/GCE、HRP/PEDOT/GCE分别在含1.0mM对苯二酚的0.1M PB(pH＝6.8)缓冲液中，对不同浓度过氧化氢的安培响应曲线；
图4为本发明实施例1、对比例1、对比例2中HRP/PEDOT/LYH/CGE和HRP/LYH/GCE、HRP/PEDOT/GCE分别在含1.0mM对苯二酚的0.1M PB(pH＝6.8)缓冲液中，对不同浓度过氧化氢安培响应曲线的校正曲线。
具体实施方式
为进一步理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但并不以任何方式限制本发明。
实施例1：
(1)GCE的预处理
将GCE依次用0.05μm的氧化铝粉配成的浆液和麂皮打磨至表面呈光滑镜面，依次用超纯水、乙醇洗涤，N2吹干，得到预处理后的GCE；
(2)LYH/GCE的制备
将一定量的Y(NO3)3·6H2O溶于超纯水中配制成浓度为0.05mol/L的硝酸钇溶液；将步骤(1)中预处理后的GCE作为工作电极，与对电极、参比电极组成三电极体系，插入硝酸钇溶液中，设置电沉积的温度为35℃，沉积电压为-1.00V，电沉积的时间为120s，电沉积得到层状氢氧化钇修饰电极，依次用超纯水、乙醇洗涤，N2吹干，记作LYH/GCE；
(3)PEDOT/LYH/GCE的制备
将一定量的EDOT溶于超纯水中配制成浓度为0.01mol/L的3,4-乙烯二氧噻吩溶液；将步骤(2)中制备的LYH/GCE作为工作电极，与对电极、参比电极组成三电极体系，插入3,4-乙烯二氧噻吩溶液中，设置电沉积的温度为25℃，沉积电压为1.8V，电沉积的时间为150s，电沉积得到聚3,4-乙烯二氧噻吩/层状氢氧化钇修饰电极，依次用超纯水、乙醇洗涤，N2吹干，记作PEDOT/LYH/GCE；
(4)HRP/PEDOT/LYH/GCE的制备
将一定量的辣根过氧化氢酶分散于超纯水中，配制成浓度为0.5mg/mL的HRP溶液；在步骤(3)制得的PEDOT/LYH/GCE上滴加5μL配置好的HRP溶液，静置12h，通过物理吸附作用将HRP固定在PEDOT/LYH/GCE上，得到辣根过氧化氢酶/聚3,4-乙烯二氧噻吩/层状氢氧化钇修饰电极，记作HRP/PEDOT/LYH/GCE。
实施例2：
(1)GCE的预处理
按照实施例1中步骤(1)中的方法和条件制备；
(2)LYH/GCE的制备
按照实施例1中步骤(2)中的方法和条件制备；
(3)PEDOT/LYH/GCE的制备
将一定量的EDOT溶于超纯水中配制成浓度为0.01mol/L的3,4-乙烯二氧噻吩溶液；将步骤(2)中制备的LYH/GCE作为工作电极，与对电极、参比电极组成三电极体系，插入3,4-乙烯二氧噻吩溶液中，设置电沉积的温度为25℃，沉积电压为1.8V，电沉积的时间为300s，电沉积得到聚3,4-乙烯二氧噻吩/层状氢氧化钇修饰电极，依次用超纯水、乙醇洗涤，N2吹干，记作PEDOT/LYH/GCE；
(4)HRP/PEDOT/LYH/GCE的制备
按照实施例1中步骤(4)中的方法和条件制备。
对比例1：
(1)GCE的预处理
按照实施例1中步骤(1)中的方法和条件制备；
(2)LYH/GCE的制备
按照实施例1中步骤(2)中的方法和条件制备；
(3)HRP/LYH/GCE的制备
将一定量的辣根过氧化氢酶分散于超纯水中，配制成浓度为0.5mg/mL的HRP溶液；在步骤(2)制得的LYH/GCE上滴加5μL配置好的HRP溶液，静置12h，通过物理吸附作用将HRP固定在LYH/GCE上，得到辣根过氧化氢酶/层状氢氧化钇修饰电极，记作HRP/LYH/GCE。
对比例2：
(1)GCE的预处理
按照实施例1中步骤(1)中的方法和条件制备；
(2)PEDOT/GCE的制备
将一定量的EDOT溶于超纯水中配制成浓度为0.01mol/L的3,4-乙烯二氧噻吩溶液；将步骤(1)中预处理后的GCE作为工作电极，与对电极、参比电极组成三电极体系，插入3,4-乙烯二氧噻吩溶液中，设置电沉积的温度为25℃，沉积电压为1.8V，电沉积的时间为300s，电沉积得到聚3,4-乙烯二氧噻吩修饰电极，依次用超纯水、乙醇洗涤，N2吹干，记作PEDOT/GCE；
(3)HRP/PEDOT/GCE的制备
将一定量的辣根过氧化氢酶分散于超纯水中，配制成浓度为0.5mg/mL的HRP溶液；在步骤(2)制得的PEDOT/GCE上滴加5μL配置好的HRP溶液，静置12h，通过物理吸附作用将HRP固定在PEDOT/GCE上，得到辣根过氧化氢酶/聚3,4-乙烯二氧噻吩修饰电极，记作HRP/PEDOT/GCE。
图1为本发明实施例1制备的PEDOT/LYH/CGE的SEM图。从图中可以看到，PEDOT/LYH呈现出纳米花结构，说明PEDOT均匀包覆在LYH表面，且未对LYH形貌造成影响。
图2为本发明实施例1、对比例1、对比例2中HRP/PEDOT/LYH/CGE和HRP/LYH/GCE、HRP/PEDOT/GCE分别在含1.0mM对苯二酚的0.1M PB(pH＝6.8)缓冲液中，对5.0mM过氧化氢的循环伏安曲线。可以看到，HRP/PEDOT/LYH/CGE对过氧化氢表现出最大的还原峰电流，相较于HRP/LYH/GCE和HRP/PEDOT/GCE具有更高的响应效果，这是由于具有极高导电性的PEDOT和具有大比表面积的LYH之间的协同作用，为HRP提供了更多的活性位点，且提高了材料的导电性，进而提高了电催化性能。
图3为本发明实施例1、对比例1、对比例2中HRP/PEDOT/LYH/CGE和HRP/LYH/GCE、HRP/PEDOT/GCE分别在含1.0mM对苯二酚的0.1M PB(pH＝6.8)缓冲液中，对不同浓度过氧化氢的安培响应曲线。可以看到，随过氧化氢浓度增加，电流也随之增大。总的来讲，与HRP/LYH/GCE和HRP/PEDOT/GCE相比，HRP/PEDOT/LYH/CGE在相同的过氧化氢浓度下表现出更大的还原电流阶梯增长。
图4为本发明实施例1、对比例1、对比例2中HRP/PEDOT/LYH/CGE和HRP/LYH/GCE、HRP/PEDOT/GCE分别在含1.0mM对苯二酚的0.1M PB(pH＝6.8)缓冲液中，对不同浓度过氧化氢安培响应曲线的校正曲线。HRP/LYH/GCE相对应的线性方程为I(μA)＝-0.0034C(μM)-0.086(R2＝0.999)；HRP/AuNPs/GCE相对应的线性方程为I(μA)＝-0.0111C(μM)-1.847(R2＝0.993)；HRP/AuNPs/LYH/GCE相对应的线性方程为I(μA)＝-0.0142C(μM)-3.434(R2＝0.998)。从校正曲线斜率可以看出，相较于HRP/LYH/GCE和HRP/AuNPs/GCE，HRP/AuNPs/LYH/GCE的灵敏度最高，为15.6μA mM-1。
Claims (7)
1.一种以PEDOT/LYH为载体的酶生物传感器，所述酶生物传感器包括一玻碳电极，其特征在于：所述玻碳电极的检测端表面电沉积有层状氢氧化钇，层状氢氧化钇表面电沉积一层聚3,4-乙烯二氧噻吩，随后在聚3,4-乙烯二氧噻吩/层状氢氧化钇上吸附固定辣根过氧化氢酶；所述玻碳电极记作GCE，所述层状氢氧化钇记作LYH，所述聚3,4-乙烯二氧噻吩记作PEDOT，所述辣根过氧化氢酶记作HRP。
2.一种如权利要求1所述的以PEDOT/LYH为载体的酶生物传感器的制备方法，包括以下具体步骤：
(1)GCE的预处理
将GCE依次用0.05μm的氧化铝粉配成的浆液和麂皮打磨至表面呈光滑镜面，依次用超纯水、乙醇洗涤，N2吹干，得到预处理后的GCE；
(2)LYH/GCE的制备
将一定量的Y(NO3)3·6H2O溶于超纯水中配制成浓度为0.01～0.5mol/L的硝酸钇溶液；将步骤(1)中预处理后的GCE作为工作电极，与对电极、参比电极组成三电极体系，插入硝酸钇溶液中，电沉积得到层状氢氧化钇修饰电极，依次用超纯水、乙醇洗涤，N2吹干，记作LYH/GCE；
(3)PEDOT/LYH/GCE的制备
将一定量的EDOT溶于超纯水中配制成浓度为0.0005～0.5mol/L的3,4-乙烯二氧噻吩溶液；将步骤(2)中制备的LYH/GCE作为工作电极，与对电极、参比电极组成三电极体系，插入3,4-乙烯二氧噻吩溶液中，电沉积得到聚3,4-乙烯二氧噻吩/层状氢氧化钇修饰电极，依次用超纯水、乙醇洗涤，N2吹干，记作PEDOT/LYH/GCE；
(4)HRP/PEDOT/LYH/GCE的制备
将一定量的辣根过氧化氢酶分散于超纯水中，配制成浓度为0.5～5mg/mL的HRP溶液；在步骤(3)制得的PEDOT/LYH/GCE上滴加5μL配置好的HRP溶液，静置12h，通过物理吸附作用将HRP固定在PEDOT/LYH/GCE上，得到辣根过氧化氢酶/聚3,4-乙烯二氧噻吩/层状氢氧化钇修饰电极，记作HRP/PEDOT/LYH/GCE，该修饰电极即为酶生物传感器。
3.如权利要求2所述的一种以PEDOT/LYH为载体的酶生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)(3)中，所述对电极为铂片；参比电极为Ag/AgCl电极。
4.如权利要求2所述的一种以PEDOT/LYH为载体的酶生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，电沉积的温度为30～65℃，沉积电压为-1.00～-1.50V，电沉积的时间为30～600s；该步骤所得LYH呈现出由片层结构组成的纳米花状形貌，具有较大的比表面积。
5.如权利要求2所述的一种以PEDOT/LYH为载体的酶生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，电沉积的温度为25℃，沉积电压为1.8V，电沉积的时间为30～600s；该步骤所得PEDOT均匀的包覆在LYH片层结构表面及纳米花上，对LYH的形貌没有影响。
6.一种权利要求2所述方法制备的以PEDOT/LYH为载体的酶生物传感器在检测过氧化氢中的应用。
7.一种权利要求2所述方法制备的以PEDOT/LYH为载体的酶生物传感器在检测过氧化氢中的应用，其特征在于，检测时的具体操作方法为：以含1mM对苯二酚的0.1M(pH＝6.8)PB缓冲溶液为支持电解质，以HRP/PEDOT/LYH/GCE为工作电极，采用电化学工作站，通过计时电流法检测其对于过氧化氢的响应效果。
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| CN115266862A (zh) * | 2022-07-22 | 2022-11-01 | 闽江学院 | 激光直写石墨烯/PB/PEDOT/Au复合电极及其制备方法和应用 |
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-
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