CN104391020B - 一种电化学适配体传感器、其制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种电化学适配体传感器、其制备方法及其用途，更具体而言，本发明涉及一种基于PdCuMWCNTs纳米粒子构建的电化学适配体传感器、其制备方法，以及由该方法制备的电化学适配体传感器在测定腺苷中的用途。本发明的电化学适配体传感器表现出优良的准确性、稳定性、重现性与高的灵敏度，对推广适配体传感器在疾病预防、疾病诊断和药物筛选上的实际应用具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种电化学适配体传感器、其制备方法及其用途，更具体而言，本发明涉及一种基于PdCuMWCNTs纳米粒子构建的电化学适配体传感器、其制备方法，以及由该方法制备的电化学适配体传感器在测定腺苷中的用途。
背景技术
腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量。腺苷对心血管系统和肌体的许多其它系统及组织均有生理作用。因此，建立一种简便快捷的腺苷的测定方法是十分必要的。目前测定腺苷的方法主要有高效液相色谱法，电渗毛细管电泳法和流动注射法等，但是这些方法在灵敏度、选择性、稳定性和可操作性方面存在一些局限性。
核酸适配体具有易合成、稳定性好等优点，可方便地在其特定位置用氧化还原试剂、纳米粒子、荧光、酶或生物素分子等功能团加以标记，并可长期贮存和在常温下运输，所以在分析领域中的应用受到了研究者特别的厚爱，作为一种新型的分子识别元件，它的出现使抗原抗体的反应发生了革命性的变化，大大弥补了现有抗体的不足，也为传统免疫传感器发展开辟了一条新的道路。因此近年来基于核酸适配体构建的电化学传感器的研究受到了极大关注。
石墨烯具有极好的结晶性和非凡的电子学、热力学和力学性能，因此是人们广泛关注的焦点。在石墨烯的研究和应用中，为了充分发挥其优良性质，必须对石墨烯进行功能化。也就是在保持石墨烯材料优势的基础上，进一步对材料进行性能改性和优化，合成了生物相容性优异的金掺杂的石墨烯，从而达到更好固定修饰材料的目的。
本发明将金掺杂的石墨烯和硫堇溶液滴涂到玻碳电极表面用于固定捕获探针，PdCuMWCNTs用于固载腺苷适配体，利用腺苷和其适配体链的特异性识别制备了检测腺苷的电化学适配体传感器。以硫堇(TH)作为电子媒介体，通过葡萄糖氧化酶(GOX)和辣根过氧化物酶(HRP)双酶实现双重信号的放大。测试结果显示，上述方法制备的电化学适配体传感器的灵敏度、选择性和稳定性高，基于上述发现，发明人完成了本发明。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种电化学适配体传感器，所述电化学适配体传感器包括：工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰金掺杂的石墨烯、硫堇、捕获探针、PdCuMWCNTs/HRP/GOX/腺苷适配体溶液、不同浓度的腺苷。
本发明的再一个目的在于提供一种电化学适配体传感器的制备方法，所述方法制备的传感器灵敏度高、重现性好、操作简便。
本发明的另一目的是提供所述电化学适配体传感器在测定腺苷中的用途。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的。
本发明的电化学适配体传感器包括：工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰金掺杂的石墨烯、硫堇、捕获探针、PdCuMWCNTs/HRP/GOX/腺苷适配体溶液、不同浓度的腺苷。所述工作电极与参比电极、对电极组成电化学适配体传感器来检测腺苷。所述参比电极为饱和甘汞电极，对电极为铂丝电极。所述的捕获探针为5’-CCCAGGTTCTCT-(CH2)6-NH2-3’ (SSDNA1)，腺苷适配体为3’-SH-TGGAAGGAGGCGTTATGAGGGGGTCCAAGAGA-5’ (SSDNA2)。
本发明的电化学适配体传感器的制备方法包括以下步骤：
a、制备PdCuMWCNTs/HRP/GOX/腺苷适配体溶液；
b、制备电化学适配体传感器工作电极；
c、制作电化学适配体传感器工作曲线。
其中，步骤a的制备PdCuMWCNTs/HRP/GOX/腺苷适配体溶液，具体包括以下步骤：
① 将PdCl2，CuSO4·5H2O和L-谷氨酸混合于烧瓶中（质量之比为1:1.6:4），加入40 mL乙二醇（EG），然后在不断搅拌下逐滴加入8 wt% KOH/EG调整溶液pH大约为11，此过程溶液由绿色变为深蓝色；
② 将纯净的多壁碳纳米管（与CuSO4·5H2O的质量之比为3:2）加入到上述混合液中，超声2 h，得到均匀的悬浮液；
③ 将所得到的混合溶液转移到50 mL 高压釜中，在160 ℃下加热6 h，然后冷却至室温，离心洗涤数次后，将固体于40 ℃真空干燥8 h，即可得到PdCuMWCNTs黑色固体粉末；
④ 分别配制1 mg/mL的上述PdCuMWCNTs、HRP和GOX溶液；用Tris-HCl配制5 mmol/L SSDNA2；然后取等体积的SSDNA2 (5 mmol/L)，PdCuMWCNTs (1 mg/mL)，HRP(1 mg/mL)和GOX(1 mg/mL)混合后放在4 ℃下震荡24 h，得到PdCuMWCNTs/HRP/GOX/腺苷适配体溶液。
步骤b的制备电化学适配体传感器工作电极的方法，具体包括以下步骤：
① 将玻碳电极表面进行抛光处理使其表面光洁；
② 配制浓度为2 mg/mL的金掺杂的石墨烯溶液，然后将金掺杂的石墨烯溶液滴到电极上，室温晾干；
③ 将0.5 mg/mL的硫堇溶液滴到电极表面，室温晾干；
④ 用Tris-HCl配制5 mmol/L SSDNA1，然后将其滴到电极表面，将电极在4 ℃放置2 h；
⑤ 将孵化好的PdCuMWCNTs/HRP/GOX/腺苷适配体溶液修饰到电极上，在4 ℃放置4 h；
⑥ 再滴上一系列不同浓度的腺苷溶液，在4 ℃保存晾干，即得到电化学适配体传感器的工作电极。
步骤c的制作电化学适配体传感器工作曲线，步骤如下：
① 将参比电极—饱和甘汞电极、对电极—铂丝电极和上述制备的工作电极正确连接在电化学工作站上；
② 含有浓度为1 mmol/L葡萄糖的pH 8.0的PBS缓冲溶液作为底液，通过方波伏安法(SWV)检测工作电极的电流；根据电流响应的差值(不加腺苷溶液和加入腺苷溶液)与腺苷标准溶液浓度的关系，绘制工作曲线。
本发明的另一方面提供上述方法制备的电化学适配体传感器在测定腺苷中的用途。
本发明的有益成果：
（1）本发明的发明人首次将PdCuMWCNTs引入到腺苷的电化学适配体传感器的制备当中。利用其优异的生物相容性和高的催化性能，使所制作的传感器有更高的灵敏度和更宽的检测范围。
（2）在本发明的制备方法中，以硫堇作为电子媒介体，通过加入双酶GOX和HRP实现双重信号的放大，进一步提高了传感器的灵敏度。
（3）该传感器集成了适配体和电化学传感器两方面的优势，既具有电化学传感器的高灵敏度、快响应、简单操作、低成本，又具有适配体的高选择性和特异性。因此本发明的电化学适配体传感器表现出了优良的准确性、稳定性、重现性与高的灵敏度，对推广适配体传感器在疾病预防、疾病诊断和药物筛选上的实际应用具有重要的意义。
附图说明
下面结合附图说明和具体实施例对本发明做进一步详细描述。
图1为本发明的电极层层修饰在5 mmol/L铁氰化钾溶液中的循环伏安图。
图中标记：a-裸玻碳电极的循环伏安图；b-修饰金掺杂的石墨烯和硫堇溶液之后的循环伏安图；c-修饰捕获探针SSDNA1之后的循环伏安图；d-修饰PdCuMWCNTs/HRP/GOX/腺苷适配体溶液之后的循环伏安图；e-修饰腺苷后的电化学适配体传感器的循环伏安图。
从图1中可以看出，与裸玻碳电极的循环伏安图(图1a)相比，当电极表面修饰上金掺杂的石墨烯和硫堇溶液后，氧化峰电流值明显增加(图1b)，说明金掺杂的石墨烯和硫堇具有很好的电子传输能力；当电极表面继续修饰上SSDNA1之后(图1c)，峰电流明显降低，说明SSDNA1阻碍了电子的传递；当PdCuMWCNTs/HRP/GOX/腺苷适配体溶液修饰到电极的表面时，峰电流继续减小(图1d)，这是因为腺苷适配体SSDNA2的存在阻碍了电子的传递。当200 nmol/L的腺苷修饰到电极上时，峰电流增大(图1e)，这是由于腺苷与其适配体链的特异性结合使腺苷适配体从电极上脱落，从而导致电子传递能力增强。由此说明电极的层层修饰是成功的。
具体实施方式
本发明使用的SSDNA1和SSDNA2均购自上海生工生物工程有限公司，氯化钯、L-谷氨酸均购自百灵威公司，硫酸铜购自阿拉丁试剂有限公司，乙二醇购自天津市福宁精细化工有限公司，氢氧化钾购于国药集团化学试剂有限公司，磷酸二氢钾、磷酸氢二钠均购于天津市广成化学试剂有限公司，除了玻碳电极用超纯水清洗外，整个实验过程用的均是二次水。
CHI760D电化学工作站购自上海辰华仪器有限公司。
实施例1 制备电化学适配体传感器
（1）制备PdCuMWCNTs/HRP/GOX/腺苷适配体溶液
① 将3.8 mL PdCl2 (3.3 mg/mL)溶液，20 mg CuSO4·5H2O，50 mg L-谷氨酸混合于烧瓶中，加入40 mL乙二醇（EG），然后在不断搅拌下逐滴加入8 wt% KOH/EG调整溶液pH大约为11，此过程溶液由绿色变为深蓝色；
② 将30 mg纯净的多壁碳纳米管加入到上述混合液中，超声2 h，得到均匀悬浮液；
③ 将所得到的混合溶液转移到50 mL高压釜中，在160 ℃下加热6 h，然后冷却至室温，离心洗涤数次后，将固体于40 ℃真空干燥8 h，即可得到PdCuMWCNTs黑色固体粉末；
④ 分别配制1 mg/mL的上述PdCuMWCNTs、HRP和GOX溶液；用Tris-HCl配制5 mmol/L SSDNA2；然后分别取100 mL的SSDNA2 (5 mmol/L)，PdCuMWCNTs (1 mg/mL)，HRP(1 mg/mL)和GOX(1 mg/mL)混合后放在4 ℃下震荡24 h，得到PdCuMWCNTs/HRP/GOX/腺苷适配体溶液。
（2）制备电化学适配体传感器工作电极
① 将直径为4 mm的玻碳电极用1.0、0.3、0.05 mm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于0.05 mol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2~0.6 V扫描，使峰电位差小于110 mV，用超纯水清洗电极表面，吹干；
② 配制浓度为2 mg/mL的金掺杂的石墨烯溶液，然后取6 μL的金掺杂的石墨烯溶液滴到电极上，室温晾干；
③ 将6 mL 0.5 mg/mL的硫堇溶液滴到电极表面，室温晾干；
④ 用Tris-HCl配制5 mmol/L SSDNA1，然后取6 μL修饰到电极表面，将电极在4 ℃放置2 h；
⑤ 将6 μL孵化好的PdCuMWCNTs/HRP/GOX/腺苷适配体溶液修饰到电极上，在4 ℃放置4 h；
⑥ 再滴上一系列6 μL不同浓度的腺苷溶液，在4 ℃保存晾干，即得到电化学适配体传感器的工作电极。
（3）制作电化学适配体传感器工作曲线
打开电化学工作站，将参比电极—饱和甘汞电极、对电极—铂丝电极和上述制备的工作电极正确连接在电化学工作站上；
含有浓度为1 mmol/L葡萄糖的pH 8.0的PBS缓冲溶液作为底液，通过方波伏安法(SWV)检测工作电极的电流；根据电流响应的差值(不加腺苷溶液和加入腺苷溶液)与腺苷标准溶液浓度的关系，绘制工作曲线。
实施例2 腺苷的检测
按照实施例1所述的步骤制备电化学适配体传感器，采用该电化学适配体传感器检测表1所示的腺苷，其检测技术指标见表1。
表1 腺苷的检测技术指标
| 检测物 | 线性范围 (nmol/L) | 线性相关系数 | 检测限 (nmol/L) |
| 腺苷 | 10~400 | 0.998 | 3.2 |
由表1检测技术指标结果可知，本发明制备的电化学适配体传感器用于腺苷的检测，其线性范围宽，检测限低，方法灵敏度高。
实施例3 人血清中腺苷的检测
配制腺苷的浓度依次为10，20，30，40，50，100，200，300，400 nmol/L，根据实施例1绘制得到工作曲线，用于人血清中腺苷的检测。取新鲜血清样品，离心分离后取上清液，用于测定人血清中腺苷的含量。然后向人血清中加入一定浓度的腺苷标准溶液，进行加标回收实验，通过测定得到的回收值与加入量的比值计算出样品中腺苷的平均回收率，检测结果见表2。
表2 人血清中腺苷的检测结果
上表中n为平行测定的次数。
由表2检测结果可知，结果的相对标准偏差（RSD）为3.0%，平均回收率为105%，说明本发明的制备方法得到的电化学适配体传感器具有较高的准确度和精密度。
Claims (2)
1.一种电化学适配体传感器的制备方法，所述电化学适配体传感器包括：工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰金掺杂的石墨烯、硫堇、捕获探针、PdCuMWCNTs/HRP/GOX/腺苷适配体和不同浓度的腺苷溶液，所述参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为铂丝电极，所述的捕获探针SSDNA1为5￠-CCCAGGTTCTCT-(CH2)6-NH2-3￠，腺苷适配体SSDNA2为3￠-SH-TGGAAGGAGGCGTTATGAGGGGGTCCAAGAGA-5￠；
其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
a、制备PdCuMWCNTs/HRP/GOX/腺苷适配体溶液；
b、制备电化学适配体传感器工作电极；
c、制作电化学适配体传感器工作曲线；
其中，步骤a制备PdCuMWCNTs/HRP/GOX/腺苷适配体溶液的具体步骤如下：
① 将质量比为1:1.6:4的PdCl2，CuSO4·5H2O和L-谷氨酸混合于烧瓶中，加入40 mL乙二醇EG，然后在不断搅拌下逐滴加入8 wt% KOH/EG调整溶液pH大约为11，此过程溶液由绿色变为深蓝色；
② 将纯净的多壁碳纳米管加入到上述混合液中，其中，所述多壁碳纳米管与CuSO4·5H2O的质量之比为3:2，超声2 h，得到均匀的悬浮液；
③ 将所得到的混合溶液转移到50 mL高压釜中，在160 ℃下加热6 h，然后冷却至室温，离心洗涤数次后，将固体于40 ℃真空干燥8 h，即可得到PdCuMWCNTs黑色固体粉末；
④ 分别配制1 mg/mL的上述PdCuMWCNTs、HRP和GOX溶液；用Tris-HCl配制5 mmol/L腺苷适配体SSDNA2；然后取等体积的5 mmol/L SSDNA2，1 mg/mL PdCuMWCNTs，1 mg/mL HRP和1 mg/mL GOX混合后放在4 ℃下震荡24 h，得到PdCuMWCNTs/HRP/GOX/腺苷适配体溶液；
步骤b制备电化学适配体传感器工作电极的具体步骤如下：
① 将玻碳电极表面进行抛光处理使其表面光洁；
② 配制浓度为2 mg/mL的金掺杂的石墨烯溶液，然后将所述金掺杂的石墨烯溶液滴到电极上，室温晾干；
③ 将0.5 mg/mL的硫堇溶液滴到电极表面，室温晾干；
④ 用Tris-HCl配制5 mmol/L捕获探针SSDNA1，然后将其滴到电极表面，将电极在4 ℃放置2 h；
⑤ 将孵化好的SSDNA2/PdCuMWCNTs/HRP/GOX修饰到电极上，在4 ℃放置4 h；
⑥ 再滴上一系列不同浓度的腺苷溶液，在4 ℃保存晾干，即得到电化学适配体传感器的工作电极；
步骤c制作电化学适配体传感器工作曲线的具体步骤如下：
① 将作为参比电极的饱和甘汞电极、作为对电极的铂丝电极和上述制备的工作电极正确连接在电化学工作站上；
② 含有浓度为1 mmol/L葡萄糖的pH 8.0的PBS缓冲溶液作为底液，通过方波伏安法SWV检测工作电极的电流；根据不加腺苷溶液和加入腺苷溶液电流响应的差值与腺苷标准溶液浓度的关系，绘制工作曲线。
2. 如权利要求1所述制备方法制备的电化学适配体传感器在测定腺苷中的用途。
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