CN103499627B - 一种检测卡那霉素残留的适配体传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测卡那霉素残留的适配体传感器的制备方法，其特征在于：石墨烯-聚苯胺复合物、硫堇和纳米金胶的制备，电极表面依次滴涂硫堇、石墨烯-聚苯胺复合物和纳米金胶后，自组装卡那霉素适配体。由于硫堇、纳米金等材料增加电极表面电子传导能力和稳定性，石墨烯-聚苯胺复合膜提供了更多的氨基和羧基，使电极表面具备更好地定向固定抗生素适配体的能力。具大量氨基的纳米复合膜与纳米金胶形成金氨体系具有较高稳定性和高度有序性，为卡那霉素适配体的固定提供了良好生物界面，保持了卡那霉素的生物活性且提高了卡那霉素适配体的有效固定量。经上述步骤制备的适配体传感器，灵敏度、稳定性和特异性较好，再生能力好，回收率符合要求。
Description
技术领域
本发明提供一种检测卡那霉素残留的适配体传感器的制备方法，属于生物传感器技术领域。
背景技术
抗生素作为一种治疗疾病的药物，目前已经被广泛应用在乳牛的疾病治疗。无论是通过肌肉注射还是口服，进入奶牛体内的抗生素都是可以以乳牛新陈代谢排出体外，并且奶牛产的牛乳就是乳牛把抗生素类物质排泄出体外的一种比较重要途径。因此牛奶中的抗生素残留在来源方面的问题，一般专家调查认为，泌乳期乳牛的用药不当或者安全时间不注意问题都会成为牛奶中的抗生素残留的重要的两个因素，特别是使用乳房灌注法治疗乳腺炎时，易造成牛乳中抗生素残留。目前，在牛饲料中添加化学添加剂已经十分普遍，其中抗生素会占据一定的比例，它的主要是用来预防奶牛疾病，所以这样牛奶抗生素残留的重要原因。此外，一些不法交奶户在高温季节为防止乳的酸败，往往向牛乳中掺杂各种抗生素，这也是乳中抗生素残留的一个来源。卡那霉素（kanamycin）：一种由卡那链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)产生的氨基糖苷类抗生素，含三个组分：卡那霉素A、B和C，卡那霉素A为主要组分。卡那霉素是一种蛋白质生物合成抑制剂，通过与30S核糖体结合从而致使mRNA密码误读。若细菌中产生一种破坏卡那霉素的酶，则可变为抗性株。卡那霉素抗性的质粒经常被作为选择基因或标记基因用于分子克隆中。卡那霉素的主要毒副作用体现为对于脑神经、听觉以及肾脏的损害，因此，针对该类药物在食品中的残留，许多国家和机构都规定了明确的最大残留限量（MRL s）。由于养殖过程中经常存在着违法使用或者不合理使用的现象，牛奶中卡那霉素的过量残留，已经成为国内外普遍关注的食品安全问题之一。
抗生素残留的检测方法：抗生素残留的检测方法多种多样，每种方法都有各自特点，适应在不同条件下检测，在选用各种方法是我们应当根据简便易用、精确可靠的原则。常用的抗生素残留检测方法有气相色谱法（GC）、光谱法、高效液相色谱法（HPLC）、薄层色谱法（TLC）、适配体分析法等。这些分析方法虽然具有高选择性，但是其操作繁琐、耗时长、成本高，并且需对样品进行预浓缩和衍生处理，所以很难得到广泛应用。因此,人们会更加急切的需要快速、可靠、经济和适合于现场应用的快速检测方法。于是,快速、可信、廉价、敏感的适配体生物传感器应运而生。与传统的分析方法相比,适配体生物传感器具有待测的样品不用经过预先处理、分析速度快、操作系统简单、准确度高、专一性强、成本低、响应快等优点。
发明的目的在于提供一种能克服上述缺陷以及操作简单、灵敏度高、选择性好的检测卡那霉素残留的适配体传感器的制备方法。
其技术方案为：一种检测卡那霉素残留的适配体传感器的制备方法，其特征在于：适配体传感器的敏感界面组成包括由硫堇、石墨烯-聚苯胺复合膜和纳米金胶(AuNPs)，进而固定卡那霉素适配体。
所述的一种检测卡那霉素残留的适配体传感器的制备方法，其特征在于：金电极(d=3mm)的清洗，适配体传感器敏感界面的构建及过程表征(制备石墨烯-聚苯胺纳米复合物，利用硫堇、石墨烯-聚苯胺和纳米金胶的协同作用共同修饰电极)，适配体传感器工作曲线的建立，适配体传感器性能的检测，适配体传感器对实际样品的检测。
所述的一种检测卡那霉素残留的适配体传感器的制备方法，其特征在于：实验条件的优化，主要包括适配体浓度、测试底液的pH以及测试时间和温度；所制备的适配体传感器的工作曲线为：y = 0.0327x + 0.2585 （R2 = 0.9954）；适配体传感器性能检测包括重现性、稳定性、再生性、特异性以及适配体传感器对牛奶样品回收率的测定。
其制备原理为：适配体检测抗原是近年来发展起来的新技术，将一个适配体末端交联到固相载体上作为捕获分子，去捕获待测标本中的靶物质，另一个适配体的5′端标有相应的指示剂，如荧光素、生物素、放射性同位素或胶体金等标记转化为检测分子，当检测分子与相应的待测标本结合后就会产生信号，以达到检测的目的。本发明采用以硫堇、石墨烯-聚苯胺复合物和纳米金胶对金电极进行修饰。由于硫堇、纳米金等材料增加电极表面电子传导能力和稳定性，石墨烯-聚苯胺复合膜提供了更多的氨基和羧基，使电极表面具备更好地定向固定抗生素适配体的能力。具大量氨基的纳米复合膜与纳米金胶形成的金氨体系具有较高的稳定性和高度有序性，为卡那霉素适配体在电极表面的固定提供了良好的生物界面，保持了卡那霉素的生物活性且提高了传感器表面卡那霉素适配体的有效固定量，进而增大了检测精度。经上述步骤制备的适配体传感器，比较简单，且灵敏度、稳定性和特异性较好，再生能力好，回收率符合要求。
为达到以上目的，采取以下技术方案实现：一种检测卡那霉素残留的适配体传感器的制备方法，其特征在于：(1) 适配体传感器制备前裸金电极的清洗、活化和性能测试，如果测试循环伏安曲线中的峰电位差在120mV以下，氧化峰和还原峰对称，则所述金电极可使用，否则要重新返回清洗步骤中，直到符合要求。(2) 清洗好的裸金电极表面滴涂分散均匀的硫堇，继而修饰石墨烯-聚苯胺，在修饰上纳米金胶，然后固定卡那霉素适配体，最后用牛血清白蛋白(BSA)封闭非特异性结合位点。适配体传感器制备结束后，放入冰箱里4℃保存备用。
为达到以上目的，采取以下技术方案实现：一种检测卡那霉素残留的适配体传感器的制备方法，其特征在于：(1) 将上述制备好的适配体传感器在工作底液中以不同的扫速做循环伏安方法扫描，可以得到峰值和扫速的关系，得到是受扩散控制的。(2) 配置一系列的卡那霉素标准液，进行循环伏安扫描，得到抑制率，进一步得出上述制备的适配体传感器的工作曲线、检测范围和检测限；(3) 配置一系列经常混合使用的抗生素溶液，以检测所制备适配体传感器的选择性； 通过循环伏安扫描多段验证上述适配体传感器的稳定性，通过解离和再次特异性结合检测其再生性能；(5) 对实际牛奶样品进行分析得出该适配体传感器的回收率。
本发明采用简单的原位聚合法合成聚苯胺均匀包裹石墨烯的纳米复合材料和纳米金胶来促进电化学反应中电子的传递，提高电极上的响应电流，改善电极表面的微环境，因而可以作为载体材料，用以制备响应信号强和灵敏度高的适配体传感器；具有大量氨基的纳米复合膜与纳米金胶形成的金氨体系具有较高的稳定性和高度有序性，增大了适配体传感器的电流响应并提高了传感器表面适配体的有效固定，从而增大了检测精度。
所述适配体传感器的制备工艺如下：在金电极（GE）上滴加6 μL的硫堇（TH），在室温条件下放置两个小时，得TH/GE。接着在THAu电极上滴加6 μL 2 mg/mL的石墨烯-聚苯胺复合物(Gr-PANI)，于室温下放置2h。接着电极自然晾干后，再滴加6 μL纳米金(AuNPs)溶液，在室温条件下放置两个小时自然晾干。然后在前述电极上滴加6 uL的5μM的适配体，在室温条件下放置两个小时自然晾干。接着在适配体晾干的基础上滴加6 μL 0.5% BSA溶液，室温下静置2h，以封闭非特异性结合位点，取出置于室温下晾干，适配体传感器制作完成，保存在4°C条件下备用。
附图说明
图1 纳米金复合物的SEM表征图
图2 适配体传感器组装过程的电流特性表征
图3 适配体传感器特异性分析
图4 适配体传感器的标准曲线。
具体实施方式
实施例：(1) 硫堇溶液的制备：用分析天平秤取硫堇粉末250mg，然后置于烧杯中，加入超纯水搅拌溶解。将溶解好的溶液转移至50mL容量瓶中，定容，得到5mg/mL的硫堇溶液。（2）石墨烯-聚苯胺复合膜的制备：首先，氧化石墨烯（GR）的制备由改性Hummers方法。简言之，氧化石墨烯粉末使用含有硝酸钠和高锰酸钾的硫酸溶液，然后过氧化氢被缓慢加入到混合物中。当没有气体产生时，在该混合物中加入过量的超纯水。将反应混合物过滤，并用盐酸水溶液和超纯水洗涤。将滤液溶解在超纯水中，并通过透析去除杂质。最后将滤液离心30分钟，以除去残留的石墨，然后得到氧化石墨烯。石墨烯-聚苯胺复合物材料的制备程序类似如下：0.3mol/L的聚苯胺溶解在1mol/L的盐酸溶液中，通过超声波处理1小时。然后，10ml 0.075mol/L的过硫酸铵和1mol的盐酸溶液在剧烈搅拌下加入到混合物中。苯胺的聚合反应发生在此约5分钟后，同时该混合物颜色变为绿色。在室温下（RT）下搅拌过夜后，将所得混合物用100ml超纯水稀释，并通过过滤收集。(2) 纳米金胶的制备采用柠檬酸三钠热还原氯金酸(HAuCl4)的方法。所有的玻璃器皿均用王水浸泡过夜，再用12mol/L的氢氧化钠水溶液浸泡2h，洗涤干净备用。将98mL去离子水和2mL 50mM氯金酸溶液混合，快速搅拌下加热至亚沸状态(即产生回流)时，迅速加入10mL 38.8mM的柠檬酸三钠溶液，混合物加热至沸腾后，继续搅拌20min(此间溶液由淡黄色转为无色，然后变灰黑色，最后成酒红色)，除去热源后继续搅拌至室温下慢慢冷却。将冷却后的金胶溶液置于干净的棕色玻璃瓶中于4°C冰箱中避光保存备用，数月有效。(3) 金电极的清洗：金电极修饰前，首先浸入热的“piranha”溶液 (H2SO4:30% H2O2 = 3:1)中浸泡15min，用水清洗干净，接下来用0.3μm、30nm的Al2O3浆在麂皮上抛光至镜面，抛光后用去离子水洗去除表面污物，再移入超声水浴中清洗，每次5min，重复二次，然后依次用6mol/L的HNO3、无水乙醇和去离子水超声清洗，氮气环境下干燥。(4) 金电极的活化：彻底清洗后，电极在0.5mol/L H2SO4溶液中用循环伏安法活化，扫描范围1.0V～-1.0V，反复扫描直至达到稳定的循环伏安图为止。(5) 预处理好的金电极的测试：在含有1×10-3 mol/L K3Fe(CN)6的0.20 mol/L KNO3溶液中跑循环伏安曲线，以测试所述金电极的性能，扫描速度50mV/S，扫描范围为-0.1V～0.6V；当所述循环伏安曲线中的峰电位差在80mV以下，并尽可能接近64mV，所述金电极可使用，否则要重新返回步骤(3)中，处理所述金电极，直到符合要求。(6) 取6μL分散均匀的硫堇（TH）滴涂在电极表面，常温下2h，然后用pH7.5的磷酸盐缓冲液冲洗表面，氮气吹干。在金电极（GE）上滴加6 μL的硫堇（TH），在室温条件下放置两个小时，得TH/GE。(7)接着在TH/GE电极上滴加6 μL 2 mg/mL的石墨烯-聚苯胺复合物(Gr-PANI)，于室温下放置2h。(8)接着电极自然晾干后，再滴加6 μL纳米金(AuNPs)溶液，在室温条件下放置两个小时自然晾干。(9)然后在前述电极上滴加6 uL的5μM的适配体，在室温条件下放置两个小时自然晾干。(10)接着在适配体晾干的基础上滴加6 μL 0.5% BSA溶液，室温下静置2h，以封闭非特异性结合位点，取出置于室温下晾干，适配体传感器制作完成，保存在4°C条件下备用。 (11) 从适配体浓度、测试底液pH、测试时间和温度四方面对所制备的适配体传感器的实验条件进行优化，抗体浓度的范围为0-20μg/mL，pH的范围为6.0-8.5，测试时间时间的范围为0-120min。测试温度的范围为0-60℃。(11) 配置0.01-200ng/mL的卡那霉素标准溶液，将上述制备好的适配体传感器分别浸入不同浓度的卡那霉素标准溶液，在常温下孵育60min，检测反应前后电流变化得到其工作曲线。(12) 将适配体在土霉素（QT）、妥布霉素（TOB）、庆大霉素（CN）、四环素（TE）和链霉素（SM）等干扰物10ng/ml存在的情况下对10 ng/mL的卡那霉素（KM）标准液进行测试，以检测其选择性；选5根于相同条件下制备好的适配体传感器检测其重现性；连续7天依次检测相同浓度的适配体溶液以检测其稳定性；将适配体与卡那霉素结合后的传感器用甘氨酸-HCl缓冲液(pH2.8)解离卡那霉素5min后再次免疫，检测其再生能力。(13)将牛奶稀释到合适倍数，加入不同浓度的卡那霉素后测试。对卡那霉素的添加后检测率在97.2–104.9%之间。
此种适配体传感器检测卡那霉素残留的检测方法操作工艺简单，检测时间较短，检测卡那霉素浓度范围广，灵敏度高，稳定性好，再生能力高以及对实际样品分析有较好的回收率和重现性，符合我国抗生素残留快速检测技术发展和国际化要求。
Claims (2)
1.一种检测卡那霉素残留的适配体传感器的制备方法，其特征在于，适配体传感器的制备方法如下：
在金电极上滴加6 μL的硫堇，在室温条件下放置两个小时，得硫堇修饰的金电极，接着在硫堇修饰的金电极表面滴加6μL 2 mg/mL的石墨烯-聚苯胺复合物，于室温下放置2h，接着电极自然晾干后，再滴加6μL纳米金溶液，在室温条件下放置两个小时自然晾干，然后在前述电极上滴加6μL的5μM的卡那霉素适配体，在室温条件下放置两个小时自然晾干，接着在卡那霉素适配体晾干的基础上滴加6 μL 0.5% BSA溶液，室温下静置2h，以封闭非特异性结合位点，取出置于室温下晾干，适配体传感器制作完成，保存在4°C条件下备用。
2. 如权利要求1所述的一种检测卡那霉素抗生素残留的适配体传感器的制备方法，其特征在于，石墨烯-聚苯胺纳米复合物的制备方法如下：
（1）氧化石墨烯的制备：氧化石墨粉末被缓慢地加入到含有硝酸钠和高锰酸钾的硫酸溶液以及过氧化氢的混合物中，当没有气体产生时，在该混合物中加入过量的超纯水，将反应混合物过滤，并用HCl水溶液和超纯水洗涤，将滤液溶解在超纯水中，并通过过滤除去杂质，最后，将滤液离心30分钟，以除去残留的石墨，然后得到氧化石墨烯；
(2) 石墨烯-聚苯胺纳米复合物制备如下：0.3 mol/L的苯胺溶解在1 mol/L盐酸溶液中，氧化石墨烯被添加到上述混合液中超声处理1小时，然后，10 ml包含0.075 mol/L的过硫酸铵和1 mol/L的HCl溶液在剧烈搅拌下迅速加入到混合物中，苯胺的聚合反应开始后约5分钟，同时该混合物的颜色变为绿色，在室温下搅拌过夜后，将所得混合物用100ml超纯水稀释，并通过过滤收集，将所得的石墨烯-聚苯胺复合材料添加到含有0.1毫升肼的50ml超纯水中95℃下加热1小时，然后对复合材料进行过滤，重复用超纯水洗涤，以除去过量的肼，最后，所得到的复合材料被分散在10毫升的含有0.06克过硫酸铵的1 mol/L盐酸中，室温下搅拌过夜，通过过滤收集析出的聚合物，并用超纯水、乙醇和己烷重复洗涤，通过过滤收集所得的石墨烯-聚苯胺纳米复合材料。
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