WO2022270586A1 - 酵素固定電極、酵素固定電極の製造方法、標的分子の酸化還元方法、及び、標的分子の酸化還元装置 - Google Patents
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Abstract
酵素固定電極は、電極と、標的分子を酸化又は還元する酸化還元酵素と、電極と酸化還元酵素との間の電子輸送を行なう電子伝達体と、を備え、電子伝達体は、鎖状の第１のリンカーを介して電極上に固定化され、酸化還元酵素は、第１のリンカーよりも長い鎖状の第２のリンカーを介して電極上に固定化されている。
Description
本開示は、酵素固定電極、酵素固定電極の製造方法、標的分子の酸化還元方法、及び、標的分子の酸化還元装置に関する。
酵素を電極に固定する手法として、化学結合により酵素を電極表面に固定化する手法と、ポリマーで酵素を包括的に固定化する手法とがある。例えば、特許文献１には、導電性部材に担体、酵素、メディエータを固定化した酵素電極が開示されている。
しかしながら、特許文献１に記載の酵素電極は、酵素から電極への電子移動を観測して電流値を計測するセンサーとしての使用はできるが、電極から酵素へ、さらには酵素から試料中の基質（以下、標的分子ともいう）へ電子を供給することができない。
そこで、本開示は、電極から酸化還元酵素へ電子を輸送し、さらに、酸化還元酵素から試料中の標的分子へ電子を輸送することができる酵素固定電極、酵素固定電極の製造方法、標的分子の酸化還元方法、及び、標的分子の酸化還元装置を提供する。
本開示の一態様に係る酵素固定電極は、電極と、標的分子を酸化又は還元する酸化還元酵素と、前記電極から受容した電子を前記酸化還元酵素へ供与する電子伝達体と、を備え、前記電子伝達体は、鎖状の第１のリンカーを介して前記電極上に固定化され、前記酸化還元酵素は、前記第１のリンカーよりも長い鎖状の第２のリンカーを介して前記電極上に固定化されている。
また、本開示の一態様に係る酵素固定電極の製造方法は、上記の酵素固定電極を製造する酵素固定電極の製造方法であって、前記電子伝達体を鎖状の前記第１のリンカーを介して前記電極上に固定化する第１固定化ステップと、前記酸化還元酵素を前記第２のリンカーを介して前記電極上に固定化する第２固定化ステップと、を含む。
また、本開示の一態様に係る標的分子の酸化還元方法は、上記の酵素固定電極の製造方法により製造された酵素固定電極を用いて標的分子を酸化又は還元する。
また、本開示の一態様に係る標的分子の酸化還元装置は、上記の酵素固定電極と、前記酵素固定電極に電圧を印加する電源と、を備え、標的分子を酸化又は還元する。
本開示によれば、電極から試料中の標的分子へ電子を輸送可能な酵素固定電極、酵素固定電極の製造方法、標的分子の酸化還元方法、及び、標的分子の酸化還元装置を提供することができる。
（本開示に至った知見）
酵素を電極に固定化した酵素固定電極は、従来からバイオセンサなどに使用されている。しかしながら、酵素固定電極は、酵素から電極への電子移動を計測するために使用されるが、電極から酵素への電子輸送、さらに、酵素から標的分子への電子輸送を実現することができない。電極から酵素への電子輸送は、酵素が複雑な立体構造を形成しているために電子を受け取りにくいことから、又は、酵素が電極に近過ぎると構造が壊れやすいことから困難である。
酵素を電極に固定化した酵素固定電極は、従来からバイオセンサなどに使用されている。しかしながら、酵素固定電極は、酵素から電極への電子移動を計測するために使用されるが、電極から酵素への電子輸送、さらに、酵素から標的分子への電子輸送を実現することができない。電極から酵素への電子輸送は、酵素が複雑な立体構造を形成しているために電子を受け取りにくいことから、又は、酵素が電極に近過ぎると構造が壊れやすいことから困難である。
酵素を電極に固定する方法には、電子伝達物質と酵素とをポリマーで包括して電極に固定する方法があるが、当該方法で製造された酵素固定電極は、基質（標的分子）との反応性が低い。なぜなら、電子伝達を介して酵素へ電子を輸送する際に、酵素固定電極の最表面に酵素が存在しない、又は、ポリマーに包括されているために酵素の自由度がないからである。
そのため、酵素が電極から電子を受容でき、さらに、試料中の基質に電子を供給できる（言い換えると、基質の反応性がよい）酵素固定電極が求められている。酵素固定電極に使用される酵素は、例えば、酸化還元酵素である。試料中の標的分子（いわゆる、標的分子）である基質を酸化又は還元するためには酸化還元酵素が必要である。電極に固定された酸化還元酵素が基質に作用するためには、電極から酸化還元酵素へ電子が輸送されることが必要である。通常、電気化学測定装置などを用いて電極から酵素へ電子を輸送する。このとき、より効率よく電子を輸送するために、メディエータなどの電子伝達物質などが用いられる。試料中に、酵素及び電子伝達物質を混入させることは好ましくないことから、これらの物質を電極に固定化した酵素固定電極の使用が求められている。
そこで、本願発明者らは、上記課題を鑑み鋭意検討した結果、電極上に電子伝達体及び酵素がそれぞれ化学結合により固定された酵素固定電極であって、導電性を有する第１のリンカーで電子伝達体が電極上に固定化され、導電性を有しない第２のリンカーで酵素が電極上に固定化された酵素固定電極を見出した。当該酵素固定電極は、第１のリンカー及び第２のリンカーは鎖状であり、第２のリンカーは、第１のリンカーよりも長く、これらのリンカーによって電極上に固定化された電子伝達体と酵素との間の距離は電子が移動できる程度に小さい（例えば、数μｍ以内）ことを特徴とする。本開示に係る酵素固定電極は、電子伝達体（例えば、メディエータ）及び酵素の両方が電極上に固定されており、電子伝達体と酵素との間の距離が電子移動可能なほど小さいため、電極から酸化還元酵素へ電子を輸送し、さらに、酸化還元酵素から試料中の基質（いわゆる、標的分子）への電子輸送を実現できる。
（本開示の一態様）
本開示の一態様の概要は、以下の通りである。
本開示の一態様の概要は、以下の通りである。
本開示の一態様に係る酵素固定電極は、電極と、標的分子を酸化又は還元する酸化還元酵素と、前記電極と前記酸化還元酵素との間の電子輸送を行なう電子伝達体と、を備え、前記電子伝達体は、鎖状の第１のリンカーを介して前記電極上に固定化され、前記酸化還元酵素は、前記第１のリンカーよりも長い鎖状の第２のリンカーを介して前記電極上に固定化されている。
これにより、酵素固定電極では、電極から電子伝達体へ供与された電子が、酸化還元酵素へ輸送されやすくなる。また、酵素固定電極では、酸化還元酵素が鎖状の第２のリンカーで電極上に固定されているため、酸化還元酵素の自由度が高くなる。さらに、酵素固定電極では、酸化還元酵素が酵素固定電極の最表面に位置しているため、酸化還元酵素によって受容された電子が、酸化還元酵素から試料中に含まれる標的分子へ輸送されやすくなる。したがって、酵素固定電極は、電極から酸化還元酵素へ電子を輸送し、さらに、酸化還元酵素から試料中の標的分子へ電子を輸送することができる。
例えば、本開示の一態様に係る酵素固定電極では、第１のリンカーは、炭素数が２以上５以下のアルキル鎖を含む。
これにより、第１のリンカーは、導電性を有することができるため、電極から供与された電子は電子伝達体へ輸送されやすくなる。
例えば、本開示の一態様に係る酵素固定電極では、第２のリンカーは、炭素数が３以上２０以下のアルキル鎖を含む。
これにより、第２のリンカーは、導電性を有しにくくなるため、電子伝達体から酸化還元酵素へ電子が輸送されやすくなる。
例えば、本開示の一態様に係る酵素固定電極では、電子伝達体の分子量は、５００以下である。
電子伝達体は、分子量が５００を超えると、酸化還元酵素の活性部位に近づけなくなり、電子を供与できなくなる。そのため、電子伝達体の分子量が５００以下であると、電子伝達体が酸化還元酵素に電子を供与することができる。
また、本開示の一態様に係る酵素固定電極の製造方法は、上記のいずれかの酵素固定電極を製造する酵素固定電極の製造方法であって、前記電子伝達体を鎖状の前記第１のリンカーを介して前記電極上に固定化する第１固定化ステップと、前記酸化還元酵素を前記第２のリンカーを介して前記電極上に固定化する第２固定化ステップと、を含む。
これにより、酵素固定電極の製造方法は、電極から酸化還元酵素へ電子を輸送し、さらに、酸化還元酵素から試料中の標的分子へ電子を輸送することができる酵素固定電極を製造することができる。
また、本開示の一態様に係る標的分子の酸化還元方法は、上記の酵素固定電極の製造方法により製造された酵素固定電極を用いて前記標的分子を酸化又は還元する。
これにより、標的分子の酸化還元方法は、酵素固定電極から標的分子へ電子が輸送されるため、標的分子を効率良く酸化又は還元することができる。
また、本開示の一態様に係る標的分子の酸化還元方法では、前記標的分子は、ジスルフィド結合を有するタンパク質である。
これにより、標的分子の酸化還元方法は、標的分子中のジスルフィド結合を還元することにより、標的分子を還元することができる。
また、本開示の一態様に係る標的分子の酸化還元装置は、上記のいずれかの酵素固定電極と、前記酵素固定電極に電圧を印加する電源と、を備え、標的分子を酸化又は還元する。
これにより、標的分子の酸化還元装置は、酵素固定電極から標的分子へ電子が輸送されるため、標的分子を効率良く酸化又は還元することができる。
なお、これらの包括的又は具体的な態様は、システム、方法、装置、集積回路、コンピュータプログラム又はコンピュータ読み取り可能なＣＤ－ＲＯＭなどの記録媒体で実現されてもよく、システム、方法、装置、集積回路、コンピュータプログラム及び記録媒体の任意な組み合わせで実現されてもよい。
以下、実施の形態について、図面を参照しながら具体的に説明する。
なお、以下で説明する実施の形態は、いずれも包括的又は具体的な例を示すものである。以下の実施の形態で示される数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置位置及び接続形態、ステップ、ステップの順序などは、一例であり、請求の範囲を限定する主旨ではない。また、以下の実施の形態における構成要素のうち、最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。また、各図は、必ずしも厳密に図示したものではない。各図において、実質的に同一の構成については同一の符号を付し、重複する説明は省略又は簡略化される場合がある。
また、各図において、それぞれ互いに直交するＸ軸方向、Ｙ軸方向、及びＺ軸方向を適宜用いて説明する。特に、Ｚ軸方向のプラス側を上側、マイナス側を下側として説明する場合がある。
また、本開示において、平行及び垂直などの要素間の関係性を示す用語、及び、矩形などの要素の形状を示す用語、並びに、数値は、厳格な意味のみを表すのではなく、実質的に同等な範囲、例えば数％程度の差異をも含むことを意味する。
また、本開示の図面において、破線は、表面から見えないもの及び領域の境界を表す。
（実施の形態）
以下、実施の形態について、図１から図６を参照しながら具体的に説明する。
以下、実施の形態について、図１から図６を参照しながら具体的に説明する。
［標的分子酸化還元装置］
［１．概要］
まず、図１を参照しながら、実施の形態における標的分子酸化還元装置の概要について説明する。図１は、本実施の形態に係る酵素固定電極を備える標的分子酸化還元装置の構成の一例を示す図である。
［１．概要］
まず、図１を参照しながら、実施の形態における標的分子酸化還元装置の概要について説明する。図１は、本実施の形態に係る酵素固定電極を備える標的分子酸化還元装置の構成の一例を示す図である。
標的分子酸化還元装置１００は、電極（いわゆる、酵素固定電極）に電圧が印加されることにより、電極と酸化還元酵素との間の電子輸送を行う。例えば、標的分子酸化還元装置１００は、電極から電極の表面に固定化された電子伝達体に電子を輸送し、さらに、電子伝達体から電極の最表面に位置する酸化還元酵素に電子を輸送する。これにより、酵素固定電極と試料中の標的分子との間で電子授受が起こるため、標的分子が酸化又は還元される。例えば、標的分子酸化還元装置１００は、標的分子を含む試料（例えば、サンプル溶液）を非流動状態で、電極に電圧を印加することで、電極に固定化された酸化還元酵素と試料中の標的分子との間で電子授受が行われ、標的分子が酸化又は還元される。そして、液体を非流動状態から流動状態に切り替えることにより、酸化又は還元された標的分子を液体中に拡散させる。このように、液体の流動状態の切り替えを繰り返すことで、液体全体で、標的分子を効率良く酸化又は還元することができる。
なお、液体が非流動状態であるとは、例えば、液体が撹拌又は振盪されておらず（つまり、剪断力、又は、振動などの外力を受けておらず）、液面にゆらぎなどの動きが見られない状態をいう。
［２．構成］
続いて、実施の形態における標的分子酸化還元装置１００の構成について図１から図３を参照しながら説明する。
続いて、実施の形態における標的分子酸化還元装置１００の構成について図１から図３を参照しながら説明する。
図１に示されるように、標的分子酸化還元装置１００は、標的分子を含む試料９を撹拌して流動状態にする撹拌部４０と、標的分子との間で電子授受を行うことにより標的分子を酸化又は還元する酸化還元酵素が固定された酵素固定電極（カソード電極１）と、酵素固定電極に電圧を印加する電源２０と、電源２０及び撹拌部４０を制御する制御部３０と、を備える。なお、酵素固定電極には、電子伝達体及び酸化還元酵素が固定されている。
電圧印加部１０は、例えば、カソード電極１（作用極ともいう）、参照極２、対極３、セル４、蓋部５、端子６ａ、６ｂ、６ｃ、及び、リード７ａ、７ｂ、７ｃを備える三電極式セルである。なお、電圧印加部１０は、例えば、作用極（カソード電極１）及び対極３を備える二電極式セルであってもよい。
カソード電極１及び対極３は、導電性物質から構成される。導電性物質としては、例えば、炭素材料、導電性ポリマー材料、半導体、又は、金属などであってもよい。
まず、カソード電極１について、図２及び図３を参照しながら説明する。図２は、図１のＩＩ－ＩＩ線における断面図である。図３は、電極上に固定された電子伝達体及び酸化還元酵素を模式的に示す図である。
カソード電極１は、酵素固定電極である。カソード電極１は、例えば、ガラス基板１１と、ガラス基板１１上に蒸着されたチタン蒸着層１２と、チタン蒸着層１２に形成されたカソード基板１３と、カソード基板１３に固定された電子伝達体及び酸化還元酵素を含む反応層１４とを有する。
カソード基板１３としては、例えば、金、グラッシーカーボン、又は、ＩＴＯ（Ｉｎｄｉｕｍ Ｔｉｎ Ｏｘｉｄｅ）などの導電性基板を用いてもよい。カソード基板１３の厚みは特に限定されない。
カソード基板１３に固定化される電子伝達体は、電極と電極上固定された酸化還元酵素との間の電子授受を可能とする物質であれば特に限定されない。例えば、ビオローゲン、キノン、又は、インドフェノールなどが挙げられる。電子伝達体は、鎖状の第１のリンカーでカソード基板１３上に固定化されている。第１のリンカーは、例えば、炭素数が２以上５以下のアルキル鎖を含む。第１のリンカーは、末端にはチオール基を有する。第１のリンカーと電極（具体的には、カソード基板１３）とが化学結合することで、電子伝達体が電極の表面に固定化される。
電極へ固定化される電子伝達体、及び、酸化還元酵素については、以下の（１）～（４）の特徴を有するとよい。（１）電子伝達体と電極とを繋ぐ第１のリンカーは、導電性を有し、かつ、（２）酸化還元酵素と電極とを繋ぐ第２のリンカーは、第１のリンカーと類似した構造であるが導電性を有しない。また、（３）電子伝達体と電極との間の距離よりも、酸化還元酵素と電極との間の距離が大きい。（４）電子伝達体と酸化還元酵素との距離は、電子移動が可能な距離（例えば、数μｍ以内）である。これにより、電極から電子伝達体へ移動した電子が、酸化還元酵素へ移動しやすくなる。また、電極の最表面に酸化還元酵素が配置され、鎖状の第２のリンカーで電極に固定化されているため、酸化還元酵素の自由度が高まり、標的分子に作用しやすくなる。
なお、電子伝達体と酸化還元酵素との組み合わせによって、上記の好ましい範囲内で、第１のリンカー及び第２のリンカーの炭素数を変更してもよい。
なお、第２のリンカーが導電性を有しないとは、わずかに電気を伝導するが第１のリンカーに比べて十分に導電性が低く、実質的に非導電性と同視できる程度の場合を含む。
また、電極の表面（いわゆる、カソード基板１３）に固定化される酸化還元酵素は、標的分子を酸化又は還元する酵素である。酸化還元酵素は、第１のリンカーよりも長い鎖状の第２のリンカーでカソード基板１３上に固定化されている。第２のリンカーは、例えば、炭素数が３以上２０以下のアルキル鎖を含む。中でも、第２のリンカーは、炭素数が６以上１４以下のアルキル鎖を含んでもよい。
参照極２は、試料９中の成分とは反応せず、一定の電位を維持する電極であり、電源２０によりカソード電極１と参照極２との間の電位差を一定に制御するために使用される。参照極２は、例えば、銀／塩化銀電極である。対極３は、例えば、白金電極である。
電源２０は、制御部３０から出力された制御信号に従って、電圧印加部１０のカソード電極１と対極３との間に電圧を印加し、カソード電極１と参照極２との間の電位を所定の値に制御する。
制御部３０は、電源２０の電圧印加及び撹拌部４０のモータ（不図示）の動きを制御するための情報処理を行う。制御部３０は、例えば、プロセッサ、マイクロコンピュータ又は専用回路によって実現される。
撹拌部４０は、制御部３０から出力された制御信号に従って、モータの動作を制御することにより、電圧印加部１０の中にセットされた撹拌子８の回転速度及び回転時間を制御する。
［３．酵素固定電極の製造方法］
続いて、酵素固定電極の製造方法について図４及び図５を参照しながら説明する。図４は、酵素固定電極の製造方法の一例を示すフローチャートである。図５は、図４の各フローを模式的に示す図である。図５の（ａ）は、第１固定化工程を示し、図５の（ｂ）は、第２固定化工程を示す。なお、酵素固定電極は、カソード電極１である。
続いて、酵素固定電極の製造方法について図４及び図５を参照しながら説明する。図４は、酵素固定電極の製造方法の一例を示すフローチャートである。図５は、図４の各フローを模式的に示す図である。図５の（ａ）は、第１固定化工程を示し、図５の（ｂ）は、第２固定化工程を示す。なお、酵素固定電極は、カソード電極１である。
酵素固定電極の製造方法は、第１固定化ステップ（Ｓ１）と、酸化還元酵素を第２のリンカーを介して電極上に固定化する第２固定化工程（Ｓ２）とを含む。
第１固定化ステップ（Ｓ１）では、電子伝達体を鎖状の第１のリンカーを介して電極上に固定化する。まず、第１のリンカーと結合した電子伝達体（例えば、電子メディエータ）と、第２のリンカーとを含む溶液を準備し、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）の形成と同様にして、電子伝達体と結合した第１のリンカーと、第２のリンカーとを電極上に固定化する。例えば、電子伝達体と結合した第１のリンカー、及び、第２のリンカーを、それぞれエタノール：アセトニトリル＝１：１の溶液に混合し、この混合溶液に電極を１時間以上浸漬して静置する。なお、図５の（ａ）に示されるように、電子伝達体は、第１のリンカーを有している。第１のリンカーは、末端にチオール基を有する。第１のリンカーと電極とが化学結合することで、電子伝達体が第１のリンカーを介して電極に固定化される。なお、第１のリンカーは、電子が電極から電子伝達体まで移動できる長さのアルキル鎖である。第１のリンカーは、例えば、炭素数が２以上５以下のアルキル鎖である。
また、酸化還元酵素を電極に固定化するための第２のリンカーは、炭素数が３以上のアルキル鎖であるが、電子が電極から直接酸化還元酵素に移動できないようにするため、炭素数が６以上のアルキル鎖であるとよい。また、第２のリンカーは、炭素数が２０以下のアルキル鎖であるが、第１のリンカーに結合した電子伝達体から酸化還元酵素への電子の移動をしやすくするために、炭素数が１４以下のアルキル鎖であるとよい。つまり、第２のリンカーは、炭素数が３以上２０以下であるが、より好ましくは、例えば、第２のリンカーは、炭素数が６以上１４以下のアルキル鎖であってもよい。また、第２のリンカーは、一方の末端にカルボキシル基又はアミノ基を有し、他方の末端にはチオール基を有する。なお、分子量が５００以下の化合物を電子伝達体として用いる場合、第２のリンカーは、炭素数が１５未満のアルキル鎖であるとよい。例えば、第２のリンカーのアルキル鎖の長さは、第１のリンカーのアルキル鎖の長さ、及び、第１のリンカーに結合する電子伝達体のサイズ（分子量）によって適宜決定されてもよい。
続いて、第２固定化ステップ（Ｓ２）では、酸化還元酵素を第２のリンカーを介して電極上に固定化する。より具体的には、図５の（ｂ）に示されるように、電極上に固定化された第２のリンカーと酸化還元酵素とを結合させる。このとき、例えば、酸化還元酵素のアミノ基と第２のリンカーのカルボキシル基とがアミンカップリング反応により結合される。これにより、酸化還元酵素が第２のリンカーを介して電極上に固定化される。
［４．標的分子の酸化還元方法］
続いて、標的分子の酸化還元方法について図２及び図６を参照しながら説明する。図６は、標的分子の酸化還元方法を説明するための図である。
続いて、標的分子の酸化還元方法について図２及び図６を参照しながら説明する。図６は、標的分子の酸化還元方法を説明するための図である。
標的分子の酸化還元方法は、カソード電極１として酵素固定電極と、対極３としてアノード電極と、参照極２とを備える三電極方式の電圧印加部１０を用いて、試料９に含まれる標的分子を酸化又は還元する。アノード電極の表面積は、例えば、カソード電極１よりも十分大きい。
試料９は、標的分子を含む水溶液である。試料９に印加する電圧は、参照極２に対するカソード電極１の電位が電子伝達体（電子メディエータ）の酸化電位となるように制御されてもよい。
以下、実施例にて本開示の酵素固定電極を用いた標的分子の酸化還元方法について具体的に説明するが、本開示は以下の実施例のみに何ら限定されるものではない。
実施例１及び比較例１～３では、何も固定化していない電極を使用した場合、及び、電子伝達体及び酸化還元酵素の少なくともいずれかを電極に固定化した酵素固定電極を使用した場合の標的分子の還元率（例えば、残存率及び分解率）について検証した。
実施例１、比較例４及び５では、第１のリンカー及び第２のリンカーの炭素数が好ましい範囲内である場合、及び、第１のリンカー又は第２のリンカーの炭素数が好ましい範囲外である場合の標的分子の還元率について検証した。
［実施例１］
（標的分子を含む試料の調製）
標的分子は、β－ラクトグロブリンを使用した。標的分子を含む試料（以下、試料という）は、β-ラクトグロブリンをｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解して３．３ミリグラム／ミリリットルに調製した。
（標的分子を含む試料の調製）
標的分子は、β－ラクトグロブリンを使用した。標的分子を含む試料（以下、試料という）は、β-ラクトグロブリンをｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解して３．３ミリグラム／ミリリットルに調製した。
（酵素固定電極を用いた標的分子の還元）
三電極方式の電圧印加セル（例えば、図１の電圧印加部１０）及びポテンショスタット（例えば、図１の電源２０）を用いて、試料に、低温で、８時間、所定の電圧を印加した。三極のうちカソード電極１には酵素固定電極を用い、参照極２にはＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用い、対極３に白金（Ｐｔ）電極を用いた。標的分子を含む試料に印加した所定の電圧は、参照極２に対するカソード電極１の電位が電子メディエータの還元電位となるようにポテンショスタットにより制御した。酵素固定電極は、第１のリンカーとして炭素数４のアルキル鎖を用いて電子伝達体（例えば、メチルビオローゲン）を電極に固定化し、第２のリンカーとして炭素数１０のアルキル鎖を用いて酸化還元酵素（例えば、チオレドキシン還元酵素とチオレドキシンの複合体）を電極に固定化した。
三電極方式の電圧印加セル（例えば、図１の電圧印加部１０）及びポテンショスタット（例えば、図１の電源２０）を用いて、試料に、低温で、８時間、所定の電圧を印加した。三極のうちカソード電極１には酵素固定電極を用い、参照極２にはＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用い、対極３に白金（Ｐｔ）電極を用いた。標的分子を含む試料に印加した所定の電圧は、参照極２に対するカソード電極１の電位が電子メディエータの還元電位となるようにポテンショスタットにより制御した。酵素固定電極は、第１のリンカーとして炭素数４のアルキル鎖を用いて電子伝達体（例えば、メチルビオローゲン）を電極に固定化し、第２のリンカーとして炭素数１０のアルキル鎖を用いて酸化還元酵素（例えば、チオレドキシン還元酵素とチオレドキシンの複合体）を電極に固定化した。
（標的分子の還元状態の確認）
標的分子であるβ－ラクトグロブリンが還元されたことを確認するため、電圧印加後の試料を消化酵素と３７℃で１時間反応させた後に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。次いで、電気泳動後のゲルを染色し、画像解析によりアレルゲン性タンパク質のバンドの濃さを数値化した。なお、対照サンプルとして、電圧を印加する前のβ－ラクトグロブリンもＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、この数値を標的分子の残存率１００％として、比例計算により実施例１の標的分子の残存率を算出した。電気泳動像を図７に示す。図７は、実施例１、比較例１、比較例２、及び、比較例３のＳＤＳ－ＰＡＧＥ後の電気泳動像を示す図である。図７の（ａ）は、対照サンプルの電気泳動像である。図７の（ｆ）は、分子量マーカーの電気泳動像である。図７の（ｅ）は実施例１の電気泳動像であり、破線で囲まれた位置に標的分子のバンドが見られた。実施例１では、残存率は７０％であることが確認された。
標的分子であるβ－ラクトグロブリンが還元されたことを確認するため、電圧印加後の試料を消化酵素と３７℃で１時間反応させた後に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。次いで、電気泳動後のゲルを染色し、画像解析によりアレルゲン性タンパク質のバンドの濃さを数値化した。なお、対照サンプルとして、電圧を印加する前のβ－ラクトグロブリンもＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、この数値を標的分子の残存率１００％として、比例計算により実施例１の標的分子の残存率を算出した。電気泳動像を図７に示す。図７は、実施例１、比較例１、比較例２、及び、比較例３のＳＤＳ－ＰＡＧＥ後の電気泳動像を示す図である。図７の（ａ）は、対照サンプルの電気泳動像である。図７の（ｆ）は、分子量マーカーの電気泳動像である。図７の（ｅ）は実施例１の電気泳動像であり、破線で囲まれた位置に標的分子のバンドが見られた。実施例１では、残存率は７０％であることが確認された。
分解率の算出結果を図８に示す。図８は、実施例１、比較例１、比較例２、及び、比較例３の標的分子の分解率を示すグラフである。実施例１では、標的分子の分解率は３０％であることが確認された。
［比較例１］
カソード電極１として金電極（電極に何も固定化されていない金電極）を用いた点以外は、実施例１と同様に行った。電気泳動像を図７に示す。図７の（ｂ）は、比較例１の電気泳動像であり、破線で囲まれた領域に標的分子のバンドが見られた。比較例１では、残存率は、９９％であることが確認された。
カソード電極１として金電極（電極に何も固定化されていない金電極）を用いた点以外は、実施例１と同様に行った。電気泳動像を図７に示す。図７の（ｂ）は、比較例１の電気泳動像であり、破線で囲まれた領域に標的分子のバンドが見られた。比較例１では、残存率は、９９％であることが確認された。
また、分解率の算出結果を図８に示す。比較例１では、標的分子の分解率は１％であることが確認された。
［比較例２］
カソード電極１として電極に電子伝達体のみを固定した金電極を用いた点以外は、実施例１と同様に行った。電気泳動像を図７に示す。図７の（ｃ）は、比較例２の電気泳動像であり、破線で囲まれた領域に標的分子のバンドが見られた。比較例２では、残存率は、９９％であることが確認された。
カソード電極１として電極に電子伝達体のみを固定した金電極を用いた点以外は、実施例１と同様に行った。電気泳動像を図７に示す。図７の（ｃ）は、比較例２の電気泳動像であり、破線で囲まれた領域に標的分子のバンドが見られた。比較例２では、残存率は、９９％であることが確認された。
また、分解率の算出結果を図８に示す。比較例２では、標的分子の分解率は１％であることが確認された。
［比較例３］
カソード電極１として電極に酸化還元酵素のみを固定した金電極を用いた点以外は、実施例１と同様に行った。電気泳動像を図７に示す。図７の（ｄ）は、比較例３の電気泳動像であり、破線で囲まれた領域に標的分子のバンドが見られた。比較例３では、残存率は、９６％であることが確認された。
カソード電極１として電極に酸化還元酵素のみを固定した金電極を用いた点以外は、実施例１と同様に行った。電気泳動像を図７に示す。図７の（ｄ）は、比較例３の電気泳動像であり、破線で囲まれた領域に標的分子のバンドが見られた。比較例３では、残存率は、９６％であることが確認された。
また、分解率の算出結果を図８に示す。比較例３では、標的分子の分解率は４％であることが確認された。
（結果）
実施例１、比較例１～３の結果から、金電極（比較例１）と、金電極に電子伝達体のみを固定化した電極（比較例２）は、分解率が１％であり、金電極に酸化還元酵素のみを固定化した電極（比較例３）は、分解率が４％であった。これらの結果は、誤差の範囲であると考えられるため、電子伝達体及び酸化還元酵素の片方のみを電極に固定しても、標的分子の還元率を向上させないことが確認された。一方、電子伝達体及び酸化還元酵素が電極に固定化された酵素固定電極を使用すると（実施例１）、標的分子の分解率が３０％と有意な結果が得られた。したがって、本開示に係る酵素固定電極を使用すると、試料中の標的分子を還元することができることが確認された。
実施例１、比較例１～３の結果から、金電極（比較例１）と、金電極に電子伝達体のみを固定化した電極（比較例２）は、分解率が１％であり、金電極に酸化還元酵素のみを固定化した電極（比較例３）は、分解率が４％であった。これらの結果は、誤差の範囲であると考えられるため、電子伝達体及び酸化還元酵素の片方のみを電極に固定しても、標的分子の還元率を向上させないことが確認された。一方、電子伝達体及び酸化還元酵素が電極に固定化された酵素固定電極を使用すると（実施例１）、標的分子の分解率が３０％と有意な結果が得られた。したがって、本開示に係る酵素固定電極を使用すると、試料中の標的分子を還元することができることが確認された。
［比較例４］
カソード電極１として炭素数１５のアルキル鎖を第２のリンカーに使用した酵素固定電極を用いた点以外、実施例１と同様に行った。実施例１と同様に、対照サンプルとして、電圧を印加する前のβ－ラクトグロブリンもＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、この数値を標的分子の残存率１００％として、比例計算により比較例４の標的分子の残存率を算出した。電気泳動像を図９に示す。図９は、実施例１、比較例４、及び、比較例５のＳＤＳ－ＰＡＧＥ後の電気泳動像を示す図である。図９の（ａ）は、対照サンプルの電気泳動像である。図９の（ｅ）は、分子量マーカーの電気泳動像である。図９の（ｂ）は比較例４の電気泳動像であり、破線で囲まれた位置に標的分子のバンドが見られた。実施例４では、残存率は９９％であることが確認された。
カソード電極１として炭素数１５のアルキル鎖を第２のリンカーに使用した酵素固定電極を用いた点以外、実施例１と同様に行った。実施例１と同様に、対照サンプルとして、電圧を印加する前のβ－ラクトグロブリンもＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、この数値を標的分子の残存率１００％として、比例計算により比較例４の標的分子の残存率を算出した。電気泳動像を図９に示す。図９は、実施例１、比較例４、及び、比較例５のＳＤＳ－ＰＡＧＥ後の電気泳動像を示す図である。図９の（ａ）は、対照サンプルの電気泳動像である。図９の（ｅ）は、分子量マーカーの電気泳動像である。図９の（ｂ）は比較例４の電気泳動像であり、破線で囲まれた位置に標的分子のバンドが見られた。実施例４では、残存率は９９％であることが確認された。
分解率の算出結果を図１０に示す。図１０は、実施例１、比較例４、及び、比較例５の標的分子の分解率を示すグラフである。比較例４では、標的分子の分解率は１％であることが確認された。
なお、図９の（ｃ）は、実施例１の電気泳動像であり、残存率は、７２％であり、分解率は、２８％であった。
［比較例５］
カソード電極１として炭素数８のアルキル鎖を第２のリンカーに使用した酵素固定電極を用いた点以外、実施例１と同様に行った。電気泳動像を図９に示す。図９の（ｄ）は、比較例５の電気泳動像であり、破線で囲まれた領域に標的分子のバンドが見られた。比較例５では、残存率は、８１％であることが確認された。
カソード電極１として炭素数８のアルキル鎖を第２のリンカーに使用した酵素固定電極を用いた点以外、実施例１と同様に行った。電気泳動像を図９に示す。図９の（ｄ）は、比較例５の電気泳動像であり、破線で囲まれた領域に標的分子のバンドが見られた。比較例５では、残存率は、８１％であることが確認された。
また、分解率の算出結果を図１０に示す。比較例５では、標的分子の分解率は１９％であることが確認された。
（結果）
実施例１、比較例４及び比較例５の結果から、電子伝達体及び酸化還元酵素を固定化するためのリンカーの炭素数が好ましい範囲外である場合（比較例４及び比較例５）、標的分子の還元率を向上させないことが確認された。電子伝達体と酸化還元酵素との距離が電子移動可能な範囲を超えたため、電極から酸化還元酵素へ電子輸送が行われなかったと考えられる。
実施例１、比較例４及び比較例５の結果から、電子伝達体及び酸化還元酵素を固定化するためのリンカーの炭素数が好ましい範囲外である場合（比較例４及び比較例５）、標的分子の還元率を向上させないことが確認された。電子伝達体と酸化還元酵素との距離が電子移動可能な範囲を超えたため、電極から酸化還元酵素へ電子輸送が行われなかったと考えられる。
一方、電子伝達体及び酸化還元酵素を固定化するためのリンカーの炭素数が好ましい範囲内である場合（実施例１）、標的分子の還元率は効率良く分解されることが確認された。電子伝達体と酸化還元酵素との距離が電子移動可能な範囲にあるため、電極から酸化還元酵素への電子輸送が行われたと考えられる。そのため、標的分子の分解率が２８％と有意な結果が得られた。したがって、本開示に係る酵素固定電極を使用すると、試料中の標的分子を還元することができることが確認された。
以上、本開示に係る酵素固定電極、酵素固定電極の製造方法、及び、標的分子の酸化還元方法について、実施の形態に基づいて説明したが、本開示は、これらの実施の形態に限定されるものではない。本開示の主旨を逸脱しない限り、当業者が思いつく各種変形を実施の形態に施したものや、実施の形態における一部の構成要素を組み合わせて構築される別の形態も、本開示の範囲に含まれる。
本開示によれば、電極から電極に固定された酸化還元酵素へ、さらに、酸化還元酵素から試料中の標的部分へ電子が輸送され、標的分子を効率良く酸化還元することができる酵素固定電極及び当該電極を用いた標的分子の酸化還元方法を実施する装置を提供できる。
１ カソード電極
２ 参照極
３ 対極
４ セル
５ 蓋部
６ａ 端子
６ｂ 端子
６ｃ 端子
７ａ リード
７ｂ リード
７ｃ リード
８ 撹拌子
９ 試料
１０ 電圧印加部
１１ ガラス基板
１２ チタン蒸着層
１３ カソード基板
１４ 反応層
２０ 電源
３０ 制御部
４０ 撹拌部
１００ 標的分子酸化還元装置
２ 参照極
３ 対極
４ セル
５ 蓋部
６ａ 端子
６ｂ 端子
６ｃ 端子
７ａ リード
７ｂ リード
７ｃ リード
８ 撹拌子
９ 試料
１０ 電圧印加部
１１ ガラス基板
１２ チタン蒸着層
１３ カソード基板
１４ 反応層
２０ 電源
３０ 制御部
４０ 撹拌部
１００ 標的分子酸化還元装置
Claims (8)
- 電極と、
標的分子を酸化又は還元する酸化還元酵素と、
前記電極と前記酸化還元酵素との間の電子輸送を行なう電子伝達体と、
を備え、
前記電子伝達体は、鎖状の第１のリンカーを介して前記電極上に固定化され、
前記酸化還元酵素は、前記第１のリンカーよりも長い鎖状の第２のリンカーを介して前記電極上に固定化されている、
酵素固定電極。 - 前記第１のリンカーは、炭素数が２以上５以下のアルキル鎖を含む、
請求項１に記載の酵素固定電極。 - 前記第２のリンカーは、炭素数が３以上２０以下のアルキル鎖を含む、
請求項１又は２に記載の酵素固定電極。 - 前記電子伝達体の分子量は、５００以下である、
請求項１～３のいずれか１項に記載の酵素固定電極。 - 請求項１～４のいずれか１項に記載の酵素固定電極を製造する酵素固定電極の製造方法であって、
前記電子伝達体を鎖状の前記第１のリンカーを介して前記電極上に固定化する第１固定化ステップと、
前記酸化還元酵素を前記第２のリンカーを介して前記電極上に固定化する第２固定化ステップと、
を含む、
酵素固定電極の製造方法。 - 請求項５に記載の酵素固定電極の製造方法により製造された酵素固定電極を用いて標的分子を酸化または還元する、
標的分子の酸化還元方法。 - 前記標的分子は、ジスルフィド結合を有するタンパク質である、
請求項６に記載の標的分子の酸化還元方法。 - 請求項１～４のいずれか１項に記載の酵素固定電極と、
前記酵素固定電極に電圧を印加する電源と、
を備え、
標的分子を酸化又は還元する、
標的分子の酸化還元装置。
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