CN110907654A - 一种游离雌三醇定量检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种游离雌三醇定量检测试剂盒及其制备方法，试剂盒包括试剂盒主体、密封盖、保护盖、试剂，试剂盒主体上依次设有固相载体孔、样本孔、检测抗体孔、荧光素孔、洗涤孔、读数孔，本发明试剂盒包含了完成免疫检测所需要的全部试剂成分，试剂盒里装载的固相载体的端部包被了捕获抗体，通过固相载体浸入试剂盒内的各个孔，即可以完成被测样本中目标抗原的结合以及后续检测步骤，极大降低了制造和维护的成本；本发明固相载体表面覆有具有生物相容性的多糖复合物，可减少非特异性吸附，多糖复合物可有效增强特异性的免疫信号；本发明在洗涤缓冲液中添加洗涤能力较强的SDS和Triton‑X100，提高检测的敏感性和准确性。

Description

一种游离雌三醇定量检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及体外诊断领域，具体涉及一种游离雌三醇定量检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

人体血清中的游离雌三醇主要是由胎儿肝脏和胎盘分泌的雌三醇。雌三醇前体、胆固醇及孕烯醇酮源自母体和胎盘。胎儿肾上腺将孕烯醇酮转换为脱氢表雄酮(DHEA)，之后，脱氢表雄酮又被胎儿肝脏转换为16-OH-DHEA-硫酸。随后，硫酸盐衍生物转到胎盘，在这里它被转换为雌三醇并进入母体血浆。一旦进入母体血液循环，在肝脏内结合前，它的半衰期大约为20分钟。在正常妊娠期，雌三醇含90％循环雌激素。测定游离形式的血清水平，是判断胎儿健康和胎盘功能的灵敏指标。

游离雌三醇的含量是判断胎盘功能和胎儿发育状况的重要依据，血清雌三醇的含量随着妊娠期进展而不断增加，直到分娩前才稍降，当血清雌三醇下降并同时伴有雌二醇升高时，提示胎盘功能不良，常预示早产。妊娠高血压综合征、先兆子痫、胎儿宫内生长迟缓、过期妊娠、胎儿宫内窒息、葡萄胎、胎儿先天畸形等情况，都会表现为游离雌三醇含量下降。若连续测定下降达50％，表示胎儿宫内有窘迫现象。

孕妇血清雌三醇过高，有可能是多胎妊娠、糖尿病合并妊娠及胎儿先天性肾上腺皮质功能亢进症等。在国内，游离雌三醇(fE3)检测临床上主要以放射免疫试验(RIA)；酶联免疫吸附试验(ELISA)；进口化学发光法应用为主，国外进口试剂价格非常昂贵，给患者带来很大的经济负担，不利于在基层普及。其它方法技术灵敏度较低、线性窄、特异性较差，也不利于高通量的全自动检测。因此，有待开发对游离雌三醇检测灵敏度高与可靠性并能降低检测成本的检测技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种游离雌三醇定量检测试剂盒及其制备方法，提高了检测的灵敏度和准确性。

为实现上述目的，本发明的技术方案提供一种游离雌三醇定量检测试剂盒，包括试剂盒主体、密封盖、保护盖、试剂，试剂盒主体上依次设有固相载体孔、样本孔、检测抗体孔、荧光素孔、洗涤孔、读数孔，所述固相载体孔内部为T形结构，固相载体孔上方设有保护盖，保护盖与固相载体孔通过铰接相连，固相载体孔内设有固相载体，所述样本孔内装有血清样本，所述检测抗体孔内装有生物素标记的检测抗体，所述荧光素孔内装有荧光素标记的链霉亲和素，所述洗涤孔共有8个，洗涤孔内装有洗涤缓冲液，所述读数孔的底部透明，所述密封盖完全覆盖样本孔、检测抗体孔、荧光素孔、洗涤孔、读数孔的孔口。

优选的，所述固相载体为石英针。

优选的，所述保护盖为保护铝箔。

优选的，所述固相载体的下端部涂覆有多糖复合物，多糖复合物为含质量分数0.5～2.5％壳聚糖、0.1～0.5％甘油，0.5～1.5％聚乙二醇1000的去离子水溶液。

优选的，所述洗涤缓冲液为含0.15～0.35M的NaCl、0.05～0.1％vol的曲拉通X-100、3～6g/L的十二烷基肌氨酸钠的PBS缓冲液(0.01M，pH7.4)。

优选的，所述样本孔、检测抗体孔、荧光素孔的直径均为d1，所述洗涤孔的直径为d2，读数孔的直径为d3，固相载体孔的直径为d4，固相载体的最大直径为d5，d5＞d3＞d1＝d4＞d2。

一种游离雌三醇定量检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

(1)包被捕获抗体的固相载体：将石英针的下端在多糖复合物中浸泡1-3分钟，4℃冷冻干燥，将游离雌三醇捕获抗体用0.01M的PBS缓冲液稀释到1mg/mL，将干燥后的石英针下端部放置于游离雌三醇捕获抗体溶液中，24℃反应2小时进行标记，标记结束后用0.1M的PBS缓冲液洗涤3次，再置于封闭液中封闭8-12h，封闭液为含有1％BSA、0.1％酪蛋白、3％蔗糖的Tris-Hcl缓冲液，制得包被捕获抗体的固相载体；

(2)生物素标记的检测抗体：将游离雌三醇检测抗体用0.01M的PBS缓冲液稀释到1mg/mL，按质量比抗体：生物素＝1:3-1:8的比例添加生物素，24℃反应8-12小时进行标记，标记结束后用0.1M的PBS缓冲液透析16-24小时，换液3次，制得生物素标记的检测抗体；

(3)洗涤缓冲液：称量3.58g Na₂HPO₄·12H₂O，0.4g KCl，0.54g KH₂PO₄，加800mL双蒸水溶解，调节pH值为7.4，定溶至1000mL，制得PBS缓冲液，根据下述浓度计算并称取配制1L洗涤缓冲液所需各原料的量：0.35M的NaCl、0.1％vol的曲拉通X-100、4g/L的十二烷基肌氨酸钠，称量完毕后置于上述制备的PBS缓冲液中溶解，并混合均匀，即得洗涤缓冲液。

本发明具有有益效果：本发明石英针表面覆有具有生物相容性的多糖复合物，多糖复合物可与蛋白质分子形成氢键弱相互作用，减少非特异性吸附，多糖复合物可有效增强特异性的免疫信号，检测信号的放大是通过在多糖复合物表面形成多层荧光素-链霉亲和素分子层而实现的；本发明在洗涤缓冲液中添加洗涤能力较强的SDS和Triton-X100，同时提高洗涤液的离子强度，有效控制了分子之间的非特异性相互作用，进而实现检测结果的低背景和高信噪比，提高检测的敏感性和准确性。

附图说明

图1为本发明试剂盒结构示意图；

图2为本发明试剂盒结构另一示意图；

图3为本发明试剂盒检测不同标准品的标准曲线图。

图中：1-固相载体孔，2-保护盖，3-固相载体，4-样本孔，5-检测抗体孔，6-荧光素孔，7-第一洗涤孔，8-第二洗涤孔，9-第三洗涤孔，10-第四洗涤孔，11-第五洗涤孔，12-第六洗涤孔，13-第七洗涤孔，14-第八洗涤孔，15-读数孔，16-密封盖。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

荧光素标记链霉亲和素购自Solarbio，货号为SF068-0.1ml。

实施例1

一种游离雌三醇定量检测试剂盒，包括试剂盒主体、密封盖、保护盖、试剂，试剂盒主体上依次设有固相载体孔、样本孔、检测抗体孔、荧光素孔、洗涤孔、读数孔，所述固相载体孔内部为T形结构，固相载体孔上方设有保护盖，保护盖与固相载体孔通过铰接相连，固相载体孔内设有固相载体，所述样本孔内装有血清样本，所述检测抗体孔内装有生物素标记的检测抗体，所述荧光素孔内装有荧光素标记的链霉亲和素，所述洗涤孔共有8个，洗涤孔内装有洗涤缓冲液，所述读数孔的底部透明，所述密封盖完全覆盖样本孔、检测抗体孔、荧光素孔、洗涤孔、读数孔的孔口。

优选的，所述固相载体为石英针。

优选的，所述保护盖为保护铝箔。

优选的，所述固相载体的下端部涂覆有多糖复合物，多糖复合物为含质量分数0.5～2.5％壳聚糖、0.1～0.5％甘油，0.5～1.5％聚乙二醇1000的去离子水溶液。

优选的，所述洗涤缓冲液为含0.15～0.35M的NaCl、0.05～0.1％vol的曲拉通X-100、3～6g/L的十二烷基肌氨酸钠的PBS缓冲液(0.01M，pH7.4)。

优选的，所述样本孔、检测抗体孔、荧光素孔的直径均为d1，所述洗涤孔的直径为d2，读数孔的直径为d3，固相载体孔的直径为d4，固相载体的最大直径为d5，d5＞d3＞d1＝d4＞d2。

本发明试剂盒包含了完成免疫检测所需要的全部试剂成分，试剂盒里装载的固相载体的端部包被了捕获抗体，通过固相载体浸入试剂盒内的各个孔，即可以完成被测样本中目标抗原的结合以及后续检测步骤，极大降低了制造和维护的成本。

实施例2

一种检测血液中游离雌三醇的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

(1)包被捕获抗体的固相载体：将石英针的下端在多糖复合物中浸泡1-3分钟，4℃冷冻干燥，将游离雌三醇捕获抗体用0.01M的PBS缓冲液稀释到1mg/mL，将干燥后的石英针下端部放置于游离雌三醇捕获抗体溶液中，24℃反应2小时进行标记，标记结束后用0.1M的PBS缓冲液洗涤3次，再置于封闭液中封闭8-12h，封闭液为含有1％BSA、0.1％酪蛋白、3％蔗糖的Tris-Hcl缓冲液，制得包被捕获抗体的固相载体；

(2)生物素标记的检测抗体：将游离雌三醇检测抗体用0.01M的PBS缓冲液稀释到1mg/mL，按质量比抗体：生物素＝1:3-1:8的比例添加生物素，24℃反应8-12小时进行标记，标记结束后用0.1M的PBS缓冲液透析16-24小时，换液3次，制得生物素标记的检测抗体；

(3)洗涤缓冲液：称量3.58g Na₂HPO₄·12H₂O，0.4g KCl，0.54g KH₂PO₄，加800mL双蒸水溶解，调节pH值为7.4，定溶至1000mL，制得PBS缓冲液，根据下述浓度计算并称取配制1L洗涤缓冲液所需各原料的量：0.35M的NaCl、0.1％vol的曲拉通X-100、4g/L的十二烷基肌氨酸钠，称量完毕后置于上述制备的PBS缓冲液中溶解并混合均匀，即得洗涤缓冲液。

实施例3

一、试剂盒的使用方法

将包被捕获抗体的固相载体放入样本孔中，10-60s后取出在第一洗涤孔、第二洗涤孔、第三洗涤孔依次震荡清洗，清洗后放入检测抗体孔中，10-60s后取出在第四洗涤孔、第五洗涤孔依次震荡清洗，清洗后放入荧光素标记链霉亲和素中10-60s后取出在第六洗涤孔、第七洗涤孔、第八洗涤孔依次震荡清洗，晾干后放入读数孔中，即可采用荧光分析检测仪检测。

本发明样本中的目标抗原首先与固相载体表面的捕获抗体结合，该固相载体随后依次浸入含有生物素标记的检测抗体中以及荧光素标记链霉亲和素中进行结合反应，固相载体表面涂敷了具有生物相容性的多糖复合物，可有效抵抗非特异性结合，信号的放大是通过在惰性的多糖基质表面形成层层叠叠的Cy5-SA分子层而实现的。这种循环标记反应可不断重复而进一步放大信号。

二、检测结果分析

1.线性：本试剂盒以标准品浓度值为X轴，以标准品信号值为Y轴，建立定标曲线，根据待测样本的信号值强度回算相应的浓度值，如图2所示，线性方程为y＝30.855x-0.7833，R2＝0.9956，最低检测限为0.02ng/mL。

取浓度为2ng/ml的游离雌三醇标准品进行10次试验，利用线性方程y＝30.855x-0.7833，计算检测浓度值；检测结果如表1所示，测定的平均值分别为2.042ng/ml，标准偏差为0.123，批内变异系数为6％。

表1

	游离雌三醇标准品(2ng/ml)
		第一次	1.88
第二次	2.11
		第三次	2.09
第四次	1.95
		第五次	2.29
第六次	1.89
		第七次	2.06
第八次	2.11
		第九次	1.98
第十次	2.06
		平均值	2.042
标准偏差	0.123
		批内变异系数	6％

2.稳定性：试剂盒自成品生产之日起于37℃放置10天(有效期为18个月)；成品剩余效期内，则按37℃放置10天有效期为18个月推算37℃放置的时间进行检测，结果符合各项目规定的要求。

3.特异性检测

1)在所示浓度检测以下内源性物质，检测结果如下表2，没有发现显著的干扰性。

表2

干扰物	添加最高浓度
		甘油三酯	1000mg/dl
血红蛋白	50mg/dl
		胆红素	50mg/dl

2)在所示浓度检测以下交叉物质，检测结果如表3所示，没有发现显著的干扰性。

表3

本试剂盒检测结果准确度高、线性关系良好、稳定性好、特异性强，可作为辅助判断胎盘功能和胎儿发育状况的重要工具。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种游离雌三醇定量检测试剂盒，其特征在于，包括试剂盒主体、密封盖、保护盖、试剂，试剂盒主体上依次设有固相载体孔、样本孔、检测抗体孔、荧光素孔、洗涤孔、读数孔，所述固相载体孔内部为T形结构，固相载体孔上方设有保护盖，保护盖与固相载体孔通过铰接相连，固相载体孔内设有固相载体，所述样本孔内装有血清样本，所述检测抗体孔内装有生物素标记的检测抗体，所述荧光素孔内装有荧光素标记的链霉亲和素，所述洗涤孔共有8个，洗涤孔内装有洗涤缓冲液，所述读数孔的底部透明，所述密封盖完全覆盖样本孔、检测抗体孔、荧光素孔、洗涤孔、读数孔的孔口。

2.如权利要求1所述的一种游离雌三醇定量检测试剂盒，其特征在于，所述固相载体为石英针。

3.如权利要求1所述的一种游离雌三醇定量检测试剂盒，其特征在于，所述保护盖为保护铝箔。

4.如权利要求1所述的一种游离雌三醇定量检测试剂盒，其特征在于，所述固相载体的下端部涂覆有多糖复合物，多糖复合物为含质量分数0.5～2.5％壳聚糖、0.1～0.5％甘油，0.5～1.5％聚乙二醇1000的去离子水溶液。

5.如权利要求1所述的一种游离雌三醇定量检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤缓冲液为含0.15～0.35M的NaCl、0.05～0.1％vol的曲拉通X-100、3～6g/L的十二烷基肌氨酸钠的PBS缓冲液(0.01M，pH7.4)。

6.如权利要求1所述的一种游离雌三醇定量检测试剂盒，其特征在于，所述样本孔、检测抗体孔、荧光素孔的直径均为d1，所述洗涤孔的直径为d2，读数孔的直径为d3，固相载体孔的直径为d4，固相载体的最大直径为d5，d5＞d3＞d1＝d4＞d2。

7.一种游离雌三醇定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)包被捕获抗体的固相载体：将石英针的下端在多糖复合物中浸泡1-3分钟，4℃冷冻干燥，将游离雌三醇捕获抗体用0.01M的PBS缓冲液稀释到1mg/mL，将干燥后的石英针下端部放置于游离雌三醇捕获抗体溶液中，24℃反应2小时进行标记，标记结束后用0.1M的PBS缓冲液洗涤3次，再置于封闭液中封闭8-12h，封闭液为含有1％BSA、0.1％酪蛋白、3％蔗糖的Tris-Hcl缓冲液，制得包被捕获抗体的固相载体；

(2)生物素标记的检测抗体：将游离雌三醇检测抗体用0.01M的PBS缓冲液稀释到1mg/mL，按质量比抗体：生物素＝1:3-1:8的比例添加生物素，24℃反应8-12小时进行标记，标记结束后用0.1M的PBS缓冲液透析16-24小时，换液3次，制得生物素标记的检测抗体；

(3)洗涤缓冲液：称量3.58g Na₂HPO₄·12H₂O，0.4g KCl，0.54g KH₂PO₄，加800mL双蒸水溶解，调节pH值为7.4，定溶至1000mL，制得PBS缓冲液，根据下述浓度计算并称取配制1L洗涤缓冲液所需各原料的量：0.35M的NaCl、0.1％vol的曲拉通X-100、4g/L的十二烷基肌氨酸钠，称量完毕后置于上述制备的PBS缓冲液中溶解，并混合均匀，即得洗涤缓冲液。

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