DE60024481T2

DE60024481T2 - Geschützte alkylierungsreagenzien in einem verfahren zur quantifizierung von homocystein

Info

Publication number: DE60024481T2
Application number: DE60024481T
Authority: DE
Inventors: Steve De Keczer; Ping Yen LIU; Dariush Davalian; Nurith Kurn; F. Edwin ULLMAN
Original assignee: Dade Behring Marburg GmbH
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH
Priority date: 1999-09-09
Filing date: 2000-08-15
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2020-08-16
Also published as: EP1224467B1; US6783947B1; JP4684511B2; JP2003508790A; WO2001018548A3; US20040198703A1; EP1224467A2; DE60024481D1; WO2001018548A2

Description

EINLEITUNG UND ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Bei Alpha-Haloketonen handelt es sich um Alkylierungsagentien, die in einer Vielfalt von Zusammenhängen geeignet sind, einschließlich der Verbindung verschiedener Moleküle an andere sulfhydrylhaltige Moleküle. Die α-Haloketone besitzen jedoch Eigenschaften, die deren Einsatz in Tests und Reaktionen, in welchen die Komponenten eines Kits zur Verwendung in solchen Verfahren zusammen und/oder über einen gewissen Zeitraum gelagert werden müssen, problematisch und unpraktisch machen. Zum Beispiel reagieren die α-Haloketone spontan mit Wasser, Alkali und organischen Basen und können deshalb nicht für längere Zeiträume in wäßrigen Lösungen gelagert werden, insbesondere in Gegenwart von Proteinen mit einem physiologischen pH-Wert.
α-Haloketone werden oft deshalb nicht verwendet, weil sie im allgemeinen zu reaktiv sind, eine Quervernetzung des Proteins verursachen und ansonsten hydrolytisch instabil sind. Gäbe es diese Probleme nicht, würde deren höhere Reaktivität die Verwendung von niedrigeren Konzentrationen des Arzneimittelderivates ermöglichen. Einige der α-Haloketone sind ebenfalls nicht ausreichend löslich zur Verwendung in solchen Zusammenhängen. Daher werden die α-Haloketone trotz ihrer potentiellen Nützlichkeit in einer Reihe von diagnostischen und synthetischen Applikationen oft als zu instabil erachtet, um in solchen Applikationen eingesetzt zu werden.
Auf ähnliche Weise werden Proteine oft an andere Proteine gebunden, indem eine Alkylierungsgruppe an ein Protein und eine Sulfhydrylgruppe an die andere befestigt wird. Es ist jedoch oft schwierig, auf diese Weise eine quantitative Verbindung zu erhalten, ohne hohe Konzentrationen eines Proteinglieds und/oder beider Proteinglieder einzusetzen und/oder mehrere oder einzelne Alkylierungsagentien an eines der Proteine zu befestigen. Weiterhin darf das Protein, an dem Alkylierungsagentien befestigt sind, entweder keine Sulfhydrylgruppe enthalten oder seine Sulfhydrylgruppen müssen geschützt sein, um eine Polymerisation zu vermeiden. Das Problem könnte wiederum umgangen werden, indem ein reaktiveres α-Haloketon verwendet würde, wenn es nicht so schwierig wäre, ein Protein herzustellen und aufzubewahren, das ein hochreaktives Alkylierungsagens enthält.
Das US-Patent Nr. 5,714,361 beschreibt Verfahren zur Herstellung von Haloenolphosphaten, die als Selbstmordhemmer von Phosphaten oder Phosphodiesteraseenzymen dienen können. Es werden dort Zusammensetzungen bereitgestellt, die mit einem Enzym reagieren, wodurch das Enzym derart modifiziert wird, daß das Enzym seine Aktivität permanent verliert, so daß die Zusammensetzung Selbstmord begeht, d.h. ihren Nutzen verliert.
In WO97/36616 wird ein Antitumoragens offenbart, umfassend einen makromolekularen Trägeranteil, einen aktiven Alkylierungsanteil, der ein Stickstoffsenf ist sowie einen stabilisierenden Anteil, der den aktiven Alkylierungsanteil mit dem Trägeranteil koppelt. Das Alkylierungsreagens wird durch Polypeptid(e) stabilisiert. Um das Alkylierungsagens zu aktivieren, wird ein Enzym in Kontakt mit dem stabilisierten Alkylierungsreagens gebracht, worauf das (die) Polypeptid(e) sich von dem Senf löst (lösen), wobei das Alkylierungsreagens zurück gelassen wird. Es gibt dort zwar hergestellte Haloalkylamine oder Sulfonsäurealkylamine, jedoch keine Haloketone, insbesondere keine α-Haloketone.
Im US-Patent Nr. 5,478,729 wird ein Immunoassay für Homocystein offenbart, der sich mit der Reaktion zwischen BABA (Bromacetylbenzoesäure) und Homocystein befaßt, welche ein modifiziertes Homocystein erzeugt, das von einem Antikörper erkannt werden kann.
Die vorliegende Erfindung stellt neuartige Lösungen für die vorgenannten Probleme bereit, wodurch sich diese Klasse an Alkylierungsagentien für verschiedene, unter anderem diagnostische und synthetische, Hilfsmittel als praktisch erweist. Die vorliegende Erfindung offenbart Verfahren zur Herstellung und Verwenden von geschützten Haloketonen, die in einer Vielfalt an Applikationen geeignet sind – beispielsweise in Tests und Konjugationsreaktionen.
Als ein Beispiel für letzteres werden bestimmte G6PDH-Arzneimittelkonjugate durch zunächst die Verknüpfung der Enzyme mit einer α-Halosäure hergestellt, um ein α-Haloamid zu bilden und danach durch Verknüpfung dieses Konjugats mit einem Sulfhydryl-markierten Arzneimittel. Das Verfahren ist besonders dann geeignet, wenn das Arzneimittel eine freie Aminogruppe aufweist, die Auswirkungen auf die Verknüpfung mittels eines aktiven Esters des Arzneimittels hätte.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Bei der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Haloketon um ein α-Haloketon. Bevorzugt enthalten α-Haloketone α-Bromacetylbenzoesäure (BABA) und α-Chloracetylbenzoesäure (CABA). Diese Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können ferner ein nukleophiles Agens und/oder ein Disulfidreduktionsmittel umfassen. Geeignete Disulfidreduktionsmittel sind u.a. Phosphine, wie beispielsweise Tris(carboxyethyl)phosphin (TCEP).
Die vorliegende Erfindung offenbart ebenfalls verschiedene Kits, wie beispielsweise Kits zur Durchführung einer Kupplungsreaktion. Ein solcher Kit umfaßt in einer abgepackten Kombination ein erstes Reagens, das ein geschütztes Alkylierungsreagens umfaßt, welches CABA-Enolphosphat oder BABA-Enolphosphat enthält, und zwar jeweils in einer Menge, die zur Durchführung wenigstens einer Reaktion ausreicht.
Bei einer Variation enthält das erste Reagens eine Schutzgruppe aus Phosphatestern. Bei einer weiteren Variation enthält das erste Reagens eine Schutzgruppe aus Phosphat.
Ein geschütztes Haloketon der vorliegenden Erfindung umfaßt bevorzugt ein α-Haloketon, beispielsweise BABA oder CABA.
Der Kit kann ferner ein zweites Reagens umfassen, das als Katalysator eine alkalische Phosphatase umfaßt, der zur Entschützung des geschützten Alkylierungsreagens fähig ist. Bei verschiedenen Ausführungsformen sind die ersten und zweiten Reagentien in separaten Behältern vorhanden.
Die vorliegende Erfindung offenbart ebenfalls Kits zur Verwendung in einem Verfahren zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Homocystein in einer Probe, umfassend in abgepackter Kombination: Ein erstes Reagens, das ein geschütztes Alkylierungsreagens umfaßt, welches CABA-Enolphosphat oder BABA-Enolphosphat enthält, das in entschützter Form zur chemischen Modifikation von Homocystein unter Bildung von modifiziertem Homocystein fähig ist, ein zweites Reagens, das eine alkalische Phosphatase als Aktivierungsreagens umfaßt und zur Entschützung des geschützten Alkylierungsreagens fähig ist, und ein drittes Reagens, das zur spezifischen Bindung an das modifizierte Homocystein fähig ist, jeweils in einer Menge, die zur Durchführung wenigstens eines Tests ausreicht.
Bei verschiedenen Kits der vorliegenden Erfindung umfaßt das erste Reagens CABA- oder BABA-Enolphosphat als geschütztes Haloketon, das eine Phosphatschutzgruppe hat. Das erste Reagens kann ferner ein Homocysteindisulfidreduktionsmittel umfassen; es kann ebenfalls ferner eine mit modifiziertem Homocystein beschichtete Feststoffmatrix umfassen. Das modifizierte Homocystein kann das Produkt sein, das durch die Entschützung des geschützten Haloketons und der Reaktion des entschützten Haloketons mit Homocystein in der Probe gebildet wird. Als Alternative kann das modifizierte Homocystein ein 4-Carboxyphenacylsulfid-thioether von Homocystein (hcy-ABA) sein.
Bei verschiedenen alternativen Ausführungsformen umfaßt die Feststoffmatrix Latexkügelchen, Glaskügelchen, eine Mikrotiterplatte, Nitrocellulose, Agarose, Liposome und ähnliches. Bei Ausführungsformen, die ein Homocysteindisulfidreduktionsmittel enthalten, kann dieses Mittel ein Phosphin umfassen. Ein in den Kits der vorliegenden Erfindung geeignetes beispielhaftes Phosphin ist TCEP.
Bei anderen Ausführungsformen der Kits gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt das zweite Reagens ferner eine alkalische Phosphatase. Andere Variationen enthalten Kits, bei welchen das zweite Reagens ferner eine mit einem zur spezifischen Bindung von modifiziertem Homocystein fähigen Rezeptor beschichtete Feststoffmatrix umfaßt. Der Rezeptor kann einen Antikörper oder ein immunologisch aktives Fragment davon umfassen. Falls das zweite Reagens ferner eine Feststoffmatrix umfaßt, kann diese Matrix Latexkügelchen, Glaskügelchen, eine Mikrotiterplatte, Nitrocellulose, Agarose, Liposome und ähnliches umfassen.
Bei den verschiedenen Kits der vorliegenden Erfindung kann die Matrix ferner ein daran befestigtes signalgebendes Agens enthalten. Verschiedene geeignete signalgebende Agentien enthalten chemilumineszierende Agens, fluoreszierende Agens und chromogene Agens, um nur einige Beispiele zu nennen.
Bei einer weiteren Ausführungsform offenbart die Erfindung Verfahren zur Herstellung molekularer Konjugate, welche die folgenden Schritte umfassen:

(a) Markieren eines ersten Moleküls mit einem geschützten Alkylierungsreagens, das CABA-Enolphosphat oder BABA-Enolphosphat enthält;
(b) Versetzen des markierten ersten Moleküls mit einem zweiten Molekül, wobei das zweite Molekül eine oder mehrere daran gebundene nukleophile Gruppen enthält;
(c) Hinzufügen einer alkalischen Phosphatase als Enzym zur Mischung der ersten und zweiten Moleküle zum Starten einer Kupplungsreaktion.

Bei einer Variation enthält das erste Molekül eine Amino- oder Hydroxylgruppe. Das erste Molekül kann ein kleines Molekül oder ein großes Molekül (oder Polymer) sein.
Bei verschiedenen Ausführungsformen enthält das zweite Molekül eine Sulfhydrylgruppe. Wie beim ersten Molekül kann das zweite Molekül ein kleines Molekül (z.B. ein Lipid oder modifiziertes Lipid) oder ein großes Molekül (oder Polymer) sein. Bei Ausführungsformen, in welchen das zweite Molekül ein großes Molekül oder Polymer umfaßt, kann das große Molekül oder Polymer ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Proteinen, Glycoproteinen, Lipopolysacchariden, Lipoproteinen, modifizierten Sacchariden sowie modifizierten Nukleinsäuremolekülen.
Bezüglich des in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten geschützten Alkylierungsreagens handelt es sich bei dem Reagens um ein Haloketonenolphosphat, beispielsweise CABA (Chloracetylbenzoesäure)-Enolphosphat oder BABA (Bromacetylbenzoesäure)-Enolphosphat. Bei einer anderen Variation der offenbarten Verfahren handelt es sich bei dem Enzym um eine alkalische Phosphatase.
Die Erfindung offenbart ebenfalls Verfahren zur Bestimmung der Menge an Homocystein in einer Probe, von der vermutet wird, dass sie Homocystein enthält, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Zusammengeben
(1) der Probe,
(2) eines ersten Reagens, das ein geschütztes Alkylierungsreagens umfaßt, welches CABA-Enolphosphat oder BABA-Enolphosphat enthält und zur chemischen Modifikation der Sulfhydrylgruppen des Homocysteins unter Bildung von modifiziertem Homocystein aktiviert werden kann, und
(3) eines zweiten Reagens, das einen Liganden umfaßt, der zur spezifischen Bindung an das modifizierte Homocystein unter Bildung eines Immunkomplexes fähig ist, und
(4) eines dritten Reagens, das eine alkalische Phosphatase umfaßt und zur Aktivierung des geschützten Alkylierungsreagens fähig ist, in einem wässrigen Medium;
(b) Messen der Menge des Immunkomplexes, wobei dessen Menge mit der Menge an Homocystein in der Probe in Beziehung steht.

Bei einer Ausführungsform umfaßt das erste Reagens ferner ein Homocysteindisulfidreduktionsmittel. Bei dem geschützten Alkylierungsreagens handelt es sich um ein α-Haloketonenolphosphat. Gemäß der vorliegenden Erfindung geeignete α-Haloketonenolphosphate sind u.a. BABA-Enolphosphat und CABA-Enolphosphat.
Bei anderen offenbarten Variationen handelt es sich bei dem dritten Reagens um eine alkalische Phosphatase. Darüber hinaus kann das erste Reagens ferner eine mit hcy-ABA beschichtete Feststoffmatrix und/oder eine mit einem zur Bindung von modifiziertem Homocystein fähigen Rezeptor beschichtete Feststoffmatrix umfassen. Bei Ausführungsformen, die eine Feststoffmatrix enthalten, kann die Matrix Latexkügelchen, Glaskügelchen, eine Mikrotiterplatte, Nitrocellulose, Liposome, Agarose usw. umfassen. Eine weitere Ausführungsform offenbart, dass der Rezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Antikörper oder einem immunologisch aktiven Fragment eines Antikörpers.
Bei einer weiteren Ausführungsform offenbart die Erfindung Verfahren zur Bestimmung der Menge an Homocystein in einer Probe, wobei wenigstens ein Teil des Homocysteins in der Disulfidform vorliegt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Herstellen eines Ansatzes, umfassend:
(1) die Probe,
(2) ein Freisetzungsmittel zur Freisetzung des Homocysteins aus der Disulfidform,
(3) ein geschütztes Alkylierungsreagens, welches CABA-Enolphosphat oder BABA-Enolphosphat enthält und zur chemischen Modifikation der Sulfhydrylgruppen des Homocysteins unter Bildung von modifiziertem Homocystein aktiviert werden kann, und
(4) einen Rezeptor, der zur spezifischen Bindung an das modifizierte Homocystein unter Bildung eines Immunkomplexes fähig ist, und
(5) ein Aktivierungsreagens, das eine alkalische Phosphatase enthält und zur Entschützung des geschützten Alkylierungsreagens fähig ist;
(b) Untersuchen des Mediums hinsichtlich der Menge des Immunkomplexes, wobei dessen Menge mit der Menge an Homocystein in der Probe in Beziehung steht.

Gemäß verschiedener offenbarter Ausführungsformen kann das Freisetzungsmittel ein Phosphin (z.B. TCEP) sein; das geschützte Alkylierungsreagens kann ein halogenierten Enenolphosphat sein; der Rezeptor kann ein Antikörper oder ein immunologisch aktives Fragment davon sein; und das Aktivierungsreagens kann eine Phosphatase umfassen.
Hier ebenfalls offenbart sind Verfahren zur Herstellung eines stabilen, geschützten Haloketons, umfassend die Phosphorylierung des Haloketons, um sein entsprechendes Enolphosphat zu bilden. Bei einer Ausführungsform ist das geschützte Haloketon ein α-Haloketon; BABA und CABA sind Beispiele eines geschützten Haloketons, die gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind.
Die Erfindung offenbart weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Haloketonenolphosphats, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Reagieren von 4-Acetylbenzoesäureethylester und einer halogenisierenden Verbindung zur Herstellung eines halogenierten Acetylbenzoesäureesters;
(b) Phosphorylierung des Esters in THF mit Phosphorylchlorid in Gegenwart von Diisopropylethylamin zur Herstellung eines Enolphosphorylesters;
(c) Behandeln des Enolphosphorylesters mit wässrigem Natriumhydroxid zur Herstellung eines Enolphosphatester-Natriumsalzes; und
(d) Behandeln des Enolphosphatester-Natriumsalzes mit Natriumhydroxid, um Halovinylenolphosphat-Benzoesäurenatriumsalz zu erhalten.

Bei einer Variation ist die halogenisierende Verbindung Sulfurylchlorid. Bei anderen Variationen wird das Halogen ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Cl, Br und I. Folglich ist bei einer Ausführungsform das Haloketonenolphosphat BABA-Enolphosphat; bei einer anderen Ausführungsform ist das Haloketonenolphosphat CABA-Enolphosphat.
Die Erfindung offenbart ebenfalls, dass in einem Verfahren zur Bestimmung der Menge an Homocystein in einer Probe, in welcher das Homocystein durch ein Reagens modifiziert wird, die Verbesserung das Bereitstellen eines Vorläufers des Reagens und ein Enzym umfaßt, das zur Umwandlung des Vorläufers in das Reagens fähig ist. Der Vorläufer ist ein geschütztes Alkylierungsreagens und das Enzym ist dazu fähig, das geschützte Alkylierungsreagens zu entschützen. Das Reagens ist ein CABA-Enolphosphat oder ein BABA-Enolphosphat und das Enzym ist eine alkalische Phosphatase.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Es hat sich herausgestellt, dass α-Haloketone durch Umwandlung in deren entsprechende Enolphosphate geschützt werden können. Die Enolphosphate sind zwar in wässrigen Lösungen stabil, können jedoch rasch durch den Zusatz einer alkalischen Phosphatase in freie α-Haloketone umgewandelt werden. Es hat sich nun als möglich erwiesen, die α-Haloketonenolphosphate in Gegenwart von nukleophilen Reagentien aufzubewahren, die ansonsten mit den ungeschützten α-Haloketonen reagieren würden. Bevor mit einer detaillierten Beschreibung anhand von verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung fortgefahren wird, kann es jedoch hilfreich sein, einige nützliche Definitionen anzugeben. Die nachfolgenden Definitionen gelten zu illustrativen und nicht zu beschränkenden Zwecken der vorliegenden Erfindung.
DEFINITIONEN
Wie hier verwendet bezieht sich der Begriff „Analyt" auf eine nachzuweisende Verbindung oder Zusammensetzung. Das Analyt kann ein Glied eines spezifischen Bindungspaares („sbp") sein und kann ein Ligand sein, der monovalent (monoepitopisch) oder polyvalent (polyepitopisch) ist, normalerweise antigenisch oder haptenisch, und ist eine Einzelverbindung oder eine Vielfalt von Verbindungen, die mindestens eine epitope oder determinante Stelle gemeinsam haben.
Neben anderen Aspekten stellt diese Erfindung Zusammensetzungen bereit, die in einer Vielfalt von Verfahren zum Nachweis eines Analyts in einer Probe geeignet sind, die ebenfalls ein Homolog des Analyts enthalten können, indem das Analyt und das Homolog chemisch modifiziert werden und das modifizierte Analyt dann nachgewiesen wird. Daher wird das Analyt durch Nachweisen eines Reaktionsproduktes festgestellt, dessen Gegenwart nur dann nachgewiesen wird, wenn das interessierende Analyt in der Probe gegenwärtig ist (d.h. das „modifizierte" Analyt wird in dem Test nachgewiesen). Das Analyt kann direkt in einer Probe nachgewiesen werden, z.B. als eine Körperflüssigkeit von einem Wirt, beispielsweise Urin, Blut, Plasma, Serum, Speichel, Sperma, Stuhl, Sputum, Rückenmarksflüssigkeit, Tränen, Schleim oder ähnlichem, jedoch bevorzugt in Serum oder Plasma. Die Probe kann wie nachfolgend beschrieben vorbehandelt sein.
Glied eines spezifischen Bindungspaares („sbp"-Glied): Wie hier verwendet beziehen sich diese Begriffe auf ein oder zwei verschiedene Moleküle mit einem Bereich auf der Oberfläche oder in einer Höhle, der sich spezifisch an eine bestimmte räumliche und polare Organisation des anderen Moleküls bindet und daher als komplementär desselben definiert wird. Die Glieder von sbp können als Ligand und Rezeptor (oder Antiligand) bezeichnet werden, wie z.B. die Glieder eines immunologischen Paares, z.B. eines Antigen-Antikörpers, oder sie können ein Operator-Repressor, Nuklease-Nukleotid, Biotin-Avidin, Hormone-Hormonrezeptoren, Nukleinsäure-Doppelstränge, IgG-Protein A, DNA-DNA, DNA-RNA und ähnliches sein.
Wie hier verwendet bezieht sich der Begriff „Ligand" auf jede Verbindung, für welche ein Rezeptor entweder natürlich existiert oder hergestellt werden kann.
Wie hier verwendet bezieht sich der Begriff „Rezeptor" auf jede Verbindung oder Zusammensetzung, die fähig ist, eine bestimmte räumliche und polare Organisation eines Moleküls zu erkennen, d.h. eine epitope oder determinante Stelle. Komplementäre sbp-Glieder binden aneinander, wie z.B. ein Ligand und sein komplementärer Rezeptor. Sbp-Glieder können immunologische Paare, wie z.B. Antigen und Antikörper, oder nicht-immunologische, wie z.B. Avidin und Biotin, oder die komplementären Stränge eines Oligonukleotids sein. Sbp-Glieder können ebenfalls kleine Moleküle oder Reste kleiner Moleküle und deren Rezeptoren sein. Illustrative Rezeptoren sind natürlich vorkommende Rezeptoren (z.B. Thyroxin-bindendes Globulin, Antikörper, Enzyme, Fab-Fragmente, Lektine, Nukleinsäuren, Repressoren, Schutzenzyme, Protein A, DNA-bindende Proteine und ähnliche).
Die Begriffe „Hilfsmittel", „Matrix" oder „feste Phase" können hier gegenseitig austauschbar verwendet werden und bedeuten jede nichtporöse oder poröse Oberfläche, die eine Form oder eine Reihe von Formen haben kann, wie z.B. ein Streifen, eine Stange, ein Partikel, eine Platte, ein Objektträger, Kügelchen mit verschiedenen Formen und Konturen, und ähnliches. Typische Hilfsmitteloberflächen sind Glas- oder Plastikkügelchen, Latex- oder Cellulosepartikel, Glas- oder Cellulosefilterpapier, Nitrocellulosemembrane, Styroporplatten, Magnetpartikel, Plastikröhrchen oder -behälter und ähnliches. Die Matrix kann aus jeglichem geeigneten Material bestehen, an welches ein Molekül sich nicht verbreitend gebunden werden kann und welches sich nicht auflöst oder nicht nachteilig mit dem Ligandmedium reagiert. Oftmals besteht das Hilfsmittel aus Plastik, wie z.B. aus Styropor, Polycarbonat, Polyacrylat, Polyvinylchlorid, Polyurethan, Teflon und ähnlichem. Alternativ kann die Matrix aus Metall bestehen, wie z.B. aus Stahl, Nickel, Kupfer oder Gold. Das Hilfsmittel kann ebenfalls aus einem Keramikmaterial hergestellt werden, wie z.B. aus Glas, Quarz und ähnlichem. Besteht das Hilfsmittel oder die Matrix aus Kügelchen, liegen die Kügelchen im allgemeinen in einer definierten und ungefähr gleichförmigen Größe, bevorzugt mit einem Durchmesser von etwa 0,2 bis 2,5 μm vor, und haben je nach Applikation entweder eine rauhe oder eine glatte Oberfläche.
Bei vielen der bevorzugten Ausführungsformen ist die Oberfläche bevorzugt glatt. Die Kügelchen sind bevorzugt abgerundet oder länglich, normalerweise ungefähr kugelförmig, und haben Oberflächeneigenschaften, die ein nicht-spezifisches Binden minimal halten. Wie in den Tests der vorliegenden Erfindung verwendet, hat das Hilfsmittel ein Molekül an sich gebunden – z.B. ein Ligand, ein Rezeptor oder, eher allgemein, ein Glied eines spezifischen Bindungspaares. Geeignete Materialien sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden z.B. in Ullman, et al. US-Patent Nr. 5,185,243 (siehe z.B. Spalten 10–11). Auf ähnliche Weise kann das Binden eines sbp-Glieds an das Hilfsmittel oder die Oberfläche durch bekannte Methoden ausgeführt werden, die üblicherweise in der Literatur zur Verfügung stehen. Siehe z.B. Chibata, „Immobilized Enzymes", Halsted Press, New York (1978) und Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245: 3059 (1970).
Je nach Art des verwendeten festen Hilfsmittels kann es ebenfalls eine Vorbehandlung erfordern, um die Bindung eines Proteins, Liganden oder Rezeptoren an seine Oberfläche zu gewährleisten, ohne störend in die Funktion des Proteins, Liganden oder Rezeptoren einzugreifen. Avidin oder Streptavidin beispielsweise, können kovalent an kugelförmige Glaskügelchen von 0,5–1,5 μm gebunden und dazu verwendet werden, einen biotinylierten Antikörper einzufangen.
Wie hier verwendet bedeutet der Begriff „Immunokomplex" oder „Immunkomplex" den Komplex, der durch die immunologische Bindung eines Antigens an einen Antikörper gebildet wird.
Wie hier verwendet bezieht sich das signalgebende System („sps") auf eine oder mehrere Komponenten, wobei mindestens eine Komponente eine Markierung ist, die ein nachweisbares Signal erzeugt, das in Beziehung zu der Menge der gebundenen und/oder ungebundenen Markierung steht. Bevorzugt handelt es sich bei der Markierung um einen Farbstoff, Fluoreszenzstrahler, eine Strahlenmarkierung, ein Enzym, Chemilumineszenzstrahler oder Photosensibilisator, der durch die Beobachtung der Enzymaktivität nachgewiesen wird, Lumineszenz, Fluoreszenz, Lichtabsorption, Radioaktivität oder einige visuelle Signale. Ein besonders geeignetes System ist eins, das photoaktivierte Chemilumineszenzmarkierungen einsetzt, was im nachfolgenden Abschnitt C näher beschrieben wird – man sollte jedoch zu schätzen wissen, dass die Erfindung nicht auf die hier beschriebenen beispielhaften Systeme beschränkt ist.
Zu Zwecken der Illustration und nicht der Beschränkung sind geeignete Markierungen Enzyme, wie z.B. die alkalische Phosphatase und Meerrettichperoxidase; ein Substrat für eine Replikase, wie z.B. QB-Replikase; Promotoren; Farbstoffe, Fluoreszenzstrahler, wie z.B. Fluorescein, Rhodaminverbindungen, Phykoerythrin, Phykocyanin, Allophykocyanin, o-Phthalaldehyd und Fluorescamin; Chemilumineszenzstrahler, wie z.B. Isoluminol; Sensibilisatoren; Coenzyme; Enzymsubstrate; Strahlenmarkierungen, wie z.B. ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁴C, ³H, ³²P und ³⁵S; Partikel, wie z.B. Latex- oder Kohlenstoffpartikel; Metallsol; Kristallit; Liposome; Zellen usw., die zusätzlich mit einem Farbstoff, Katalysator oder einer anderen nachweisbaren Gruppe und ähnlichem markiert werden können oder nicht. Geeignete Enzyme und Coenzyme werden in Litman, et al., US-Pat. Nr. 4,275,149, Spalten 19 bis 28 und in Boguslaski, et al., US-Pat. Nr. 4,318,980, Spalten 10 bis 14 offenbart; geeignete Fluoreszenzstrahler und Chemilumineszenzstrahler werden in Litman, et al., US-Pat. Nr. 4,275,149, in Spalten 30 und 31 offenbart. Besonders geeignete photoaktivierte Chemilumineszenzmarkierungen und -verfahren für deren Herstellung und Gebrauch sind im US-Patent Nr. 5,340,716, erteilt an Ullman et al., offenbart.
Wie hier verwendet bezieht sich der Begriff „Partikel" auf Partikel von mindestens etwa 20 nm und nicht mehr als etwa 20 Mikron, normalerweise von mindestens etwa 40 nm und nicht mehr als 10 Mikron, bevorzugt von etwa 0,10 bis 2,0 Mikron Durchmesser, normalerweise mit einem Volumen von weniger als 1 Picoliter. Partikel können organisch oder anorganisch, quellbar oder nichtquellbar, porös oder nichtporös sein, eine beliebige Dichte aufweisen, jedoch bevorzugt eine Dichte annähernd der von Wasser, im allgemeinen von etwa 0,7 bis etwa 1,5 g/ml, bevorzugt in Wasser suspendierbar sein und aus einem Material bestehen, das transparent, teilweise transparent oder undurchsichtig ist. Die Partikel können eine Ladung aufweisen oder nicht, und wenn diese geladen sind, dann sind sie bevorzugt negativ. Partikel können aus einem Feststoff (z.B. Polymer, Metall, Glas, organischem und anorganischem Material, wie z.B. Mineralen, Salzen und Diatomen), Öltröpfchen (z.B. Kohlenwasserstoff, Fluorkohlenwasserstoff, Siliziumflüssigkeit) oder aus Bläschen (z.B. synthetische, wie beispielsweise Phospholipid oder natürliche, wie beispielsweise Zellen und Organellen) bestehen. Die Partikel können Latex oder andere synthetische oder natürliche Materialien umfassen, einschließlich organische oder anorganische Polymere; Lipiddoppelschichten (z.B. Liposome, Phospholipid sowie nichtphospholipide Bläschen); Öltröpfchen; Siliziumpartikel; Metallsole; Zellen sowie Farbstoffkristallite.
Organische Partikel sind normalerweise Polymere, und zwar entweder Zusatz- oder Kondensationspolymere, die sich leicht in dem Testmedium dispergieren lassen. Die organischen Partikel sind bevorzugt ebenfalls adsorptiv oder können derart funktionalisiert werden, um ein sbp-Glied entweder direkt oder indirekt an deren Oberfläche zu binden und um einen Farbstoff, beispielsweise einen Fluoreszenzstrahler, einen Photosensibilisator oder eine Photochemisch aktivierbare Chemilumineszenzverbindung an deren Oberfläche zu binden oder in deren Volumen miteinzubinden.
Die Partikel können von natürlich vorkommenden Materialien, natürlich vorkommenden Materialien, die synthetisch modifiziert sind und von synthetischen Materialien abgeleitet sein. Natürliche oder synthetische Assemblierungen werden bevorzugt. Unter den organischen Polymeren von besonderem Interesse befinden sich Polysaccharide, insbesondere querverbundene Polysaccharide, wie z.B. Agarose (welche als SEPHAROSE erhältlich ist), Dextran (erhältlich als SEPHADEX und SEPHACRYL), Cellulose, Stärke und ähnliches; Zusatzpolymere, wie z.B. Styropor, Polyacrylamid, Homopolymere und Copolymere der Derivate von Acrylat und Methacrylat, insbesondere Ester und Amide mit freien Hydroxylfunktionalitäten, einschließlich Hydrogele und ähnliches. Anorganische Polymere sind Silikon, Glas, erhältlich als Bioglas und ähnliches. Sole sind Gold, Selen und andere Metalle. Partikel können ebenfalls dispergierte wasserunlösliche Farbstoffe sein, wie Prophyrine, Phthalocyanine, usw., die ebenfalls als Photosensibilisatoren wirken können. Partikel können ebenfalls Diatome, Zellen, Viruspartikel, Magnetosome, Zellkerne und ähnliches sein. Bei gewerblich erhältlichen Partikeln kann die Partikelgröße durch das Zerbrechen großer Partikel in kleinere Partikel durch mechanische Mittel, wie Z.B. durch Zermahlen, Ultraschallbehandlung, Verrühren, usw. variiert werden.
Die Partikel sind normalerweise polyfunktionell oder sind in der Lage, polyfunktionisiert zu werden, oder sind in der Lage an ein sbp-Glied, einen Photosensibilisator oder eine photochemisch aktivierbare Chemilumineszenzverbindung durch spezifische oder nichtspezifische kovalente oder nichtkovalente Wechselwirkungen gebunden zu werden. Eine große Vielfalt an funktionellen Gruppen steht zur Verfügung oder kann miteinbezogen werden. Beispielhafte funktionelle Gruppen sind Carbonsäuren, Aldehyde, Aminogruppen, Cyangruppen, Ethylengruppen, Hydroxylgruppen, Mercaptogruppen und ähnliche. Wird eine kovalente Anbindung eines sbp-Glieds, einer Chemilumineseszenzverbindung oder eines Photosensibilisators an das Partikel eingesetzt, so ist die Art und Weise der Vernetzung wohl bekannt und in der Literatur ausgiebig illustriert. Siehe z.B. Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245: 3059 (1970). Die Länge einer Verbindungsgruppe kann je nach der Art der zu vernetzenden Verbindung, der Art des Partikels, dem Effekt der Entfernung zwischen der zu vernetzenden Verbindung und dem Partikel, der Bindung des sbp-Glieds sowie dem Analyt und ähnlichem, stark variieren.
Partikel und andere Matrixmaterialien können ebenfalls mit Markierungsmitteln markiert werden. US-Patent Nr. 5,709,994 beschreibt zum Beispiel Verfahren zur Herstellung von Partikeln, die mit Photosensibilisator und/oder Chemilumineszenz und/oder Energieakzeptorverbindungen markiert sind. (Siehe z.B. Beispiele 1–2 des US-Patents Nr. 5,709,994.)
Es bestehen zahlreiche Verfahren, durch welche die Markierung ein durch externe Mittel nachweisbares Signal erzeugen kann, beispielsweise die visuelle Untersuchung, elektromagnetische Strahlung, elektrochemischer Nachweis, photoakustische Spektroskopie und ähnliches. Die Markierung, oder die anderen sps-Glieder, können ebenfalls an ein sbp-Glied, andere Moleküle oder an ein Hilfsmittel gebunden werden. Die Markierung kann ein Signal direkt erzeugen und daher sind zusätzliche Komponenten nicht erforderlich, um ein Signal zu erzeugen. Zahlreiche organische Moleküle, beispielsweise Fluoreszenzstrahler, sind dazu fähig, ultraviolettes und sichtbares Licht zu absorbieren, wobei die Lichtabsorption Energie an diese Moleküle übermittelt und sie in einen erregten Energiezustand anhebt. Diese absorbierte Energie wird durch die Emission von Licht bei einer zweiten Wellenlänge abgeleitet. Andere Markierungen, die ein Signal direkt erzeugen, sind radioaktive Isotope und Farbstoffe.
Alternativ erfordert die Markierung eventuell andere Komponenten, um ein Signal zu erzeugen, und das sps würde demzufolge sämtliche Komponenten enthalten, die zur Erzeugung eines messbaren Signals erforderlich sind, was Substrate, Coenzyme, Verstärkungsmittel, zusätzliche Enzyme, Substanzen, die mit enzymatischen Produkten reagieren, Katalysatoren, Aktivierungsmittel, Cofaktoren, Hemmstoffe, Radikalfänger, Metallione, spezifisch bindende Substanz, die zur Bindung von signalgebenden Substanzen erforderlich ist, und ähnliches beinhaltet. Eine detaillierte Erörterung von geeigneten signalgebenden Systemen ist in Ullman, et al., US-Pat. Nr. 5,185,243, Spalten 11–13, enthalten.
Die Markierung kann kovalent an zahlreiche sbp-Glieder gebunden werden: Ein Antikörper, der das modifizierte Analyt bindet; ein Rezeptor für einen Antikörper, der das modifizierte Analyt bindet; ein Rezeptor, der zur Bindung an ein kleines Molekül fähig ist, das zu einem Antikörper konjugiert ist, der das modifizierte Analyt bindet; oder ein Ligand, insbesondere ein Analogon des modifizierten Analyts. Das Binden an ein sbp-Glied kann durch chemische Reaktionen erreicht werden, die zum Austausch eines Wasserstoffatoms der Markierung mit einer Bindung an das sbp-Glied führen, oder kann eine Verbindungsgruppe zwischen der Markierung und dem sbp-Glied enthalten. Andere sps-Glieder können ebenfalls kovalent an sbp-Glieder gebunden werden. Zum Beispiel können zwei sps-Glieder, wie beispielsweise ein Fluoreszenzstrahler und Löscher, jeweils an ein Analogon des modifizierten Analyts und einen Antikörper des Analyts, der mit dem Analogon einen Komplex bildet, gebunden werden. Die Formation des Komplexes bringt den Fluoreszenzstrahler und den Löscher in unmittelbare Nähe, wodurch es dem Löscher ermöglicht wird, in Wechselwirkung mit dem Fluoreszenzstrahler zu treten, um das Signal zu löschen.
Verfahren der Konjugation sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe zum Beispiel Rubenstein, et al., US-Pat. Nr. 3,817,837. Diese Erfindung zieht ebenfalls in Erwägung, einen Antikörper an ein erstes Glied eines signalgebenden Systems und eine nachweisbare Markierung als das zweite Glied eines signalgebenden Systems zu binden. Wenn z.B. die nachweisbare Markierung an ein Analyt-Analogon gebunden ist, kann das Ausmaß der Bindung des Antikörpers an das Analogon durch den Nachweis des durch die Wechselwirkung der signalgebenden Systemglieder erzeugten Signals gemessen werden.
Hilfsmaterialien: Verschiedene Hilfsmaterialien werden häufig in den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt. Zum Beispiel sind sowohl Pufferlösungen normalerweise in dem Testmedium gegenwärtig als auch Stabilisatoren für das Testmedium und die Testkomponenten. Häufig werden zusätzlich zu diesen Zusatzstoffen Proteine verwendet, wie z.B. Albumine, organische Lösungsmittel, wie Formamid, quaternäre Ammoniumsalze, Polykationen, wie z.B. Dextransulfat oder Tenside, insbesondere nichtionische Tenside, Bindungsverstärker, z.B. Polyglykole, oder ähnliches.
Wie hier verwendet schließt der Begriff alkylierende Reagentien Haloketone ein. Diese Reagentien sind fähig mit Sulfhydryl-, Amino- und Hydroxylgruppen zu reagieren. Alkylierende Reagentien, die für Homocystein (hcy) verwendet werden, reagieren mit der Sulfhydrylgruppe von hcy.
„Kleine Moleküle", die hier alternativ als kleine organische Moleküle bezeichnet werden können (d.h. falls sie organische oder organometallische Gruppen enthalten), Analyte oder Haptene, neigen dazu ein Molekulargewicht von weniger als etwa 2.000, mehr bevorzugt von bis zu etwa 1.500 und noch mehr bevorzugt von bis zu etwa 1.000 zu haben. Bei verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen haben kleine Moleküle ein Molekulargewicht von mindestens etwa 100, mehr bevorzugt von 200 oder darüber und noch mehr bevorzugt von 250 oder darüber.
Viele der hier offenbarten geeigneten kleinen Molekühle haben ein Molekulargewicht von 100 bis 2000, bevorzugt von 150 bis 1000, und spezifische Rezeptoren für die entsprechenden kleinen Moleküle existieren entweder bereits, oder können hergestellt werden. Beispiele kleiner Moleküle sind Derivate von Biotin, Lysergsäure, Fluorescein oder ein Fluoresceinderivat sowie Vitamin B₁₂, wobei die entsprechenden Rezeptoren jeweils Avidin oder Streptavidin, Antilysergsäure, Antifluorescein, bzw. Intrinsic-Faktor sind. Antikörper an kleinen Moleküle können durch das Verbinden der kleinen Moleküle an einen immunogenen Träger hergestellt werden. Der Begriff „kleines Molekül", wie hier verwendet, umfaßt Arzneimittel, Metabolite, Pestizide, Schadstoffe und ähnliches, wie beispielsweise in den US-Patenten Nr. 5,340,716 und 5,709,994 beschrieben und beispielhaft erläutert.
Der Begriff „Polymere", der alternativ hier als „große Moleküle" oder „Moleküle mit großem Molekulargewicht (HMW)" bezeichnet wird, schließt eine Vielfalt von Molekülen ein, inklusive Proteine, Oligonukleotide, Lipide, Kohlenhydrate, Lipopolysaccharide, Glycoproteine und ähnliche. Polymere, wie z.B. Rezeptoranalyte, können Molekulargewichte aufweisen, die sich im allgemeinen in einem Bereich von etwa 10.000 bis 2 × 10⁸, gewöhnlicher von etwa 10.000 bis 10⁶ bewegen. Bei Immunglobulinen, wie z.B. IgA, IgG, IgE und IgM, variieren die Molekulargewichte im allgemeinen von zwischen etwa 160.000 bis etwa 10⁶. Enzyme liegen im allgemeinen in einem Bereich von etwa 10.000 bis 1.000.000 an Molekulargewicht, obwohl es bei einem Enzym auch denkbar ist, dass es ein Gewicht von weniger als 10.000 oder mehr als 1.000.000 aufweisen kann. Natürliche Rezeptoren und Bindungsmoleküle variieren stark an Molekulargewicht, wie auch deren synthetischen Versionen und Nachahmer dies tun, obwohl sie im allgemeinen in einem Bereich von etwa 25.000 bis 10⁶ und mehr liegen. Rezeptoren/Bindungsmoleküle, wie z.B. Avidin, DNA, RNA, Thyroxin-bindendes Globulin, Thyroxin-bindendes Voralbumin, Transcortin, Lektine, Protein A, komplementäre Komponenten und ähnliches sind nur einige Beispiele solcher HMW-Moleküle.
Geschützte alkylierende Reagentien, die zur Kopplung zweier Moleküle in wässrigen Lösungen geeignet sind, müssen eine Gruppe aufweisen, die zur Konjugation des Reagens an eines der Moleküle von Interesse geeignet ist. Die anderen Moleküle müssen eine nukleophile Gruppe aufweisen, wie z.B. OH, SH oder Amin, oder müssen derart modifiziert sein, um eine solche Gruppe zu beinhalten. Die beiden Moleküle werden durch das Kombinieren des an das Reagens konjugierten Moleküls, des Moleküls mit einer nukleophilen Gruppe und eines Aktivierungsmittels gekoppelt.
„Aktivierungsreagens", wie hier verwendet, bezieht sich auf einen Katalysator, normalerweise einen Biokatalysator, bevorzugt ein Enzym, Ribozym oder Katalysatorantikörper. In verschiedenen Ausführungsformen, enthalten bevorzugte AktivierungsReagentien Enzyme, wie z.B. Hydrolasen, einschließlich Phosphatasen, Phosphodiesterasen, Glycosidasen und andere Esterasen.
Beispiele geschützter alkylierender Reagentien, die der nachfolgenden Formel
entsprechen, werden nachfolgend illustriert. Die AktivierungsReagentien oder Enzyme, die zur Entschützung solcher geschützten alkylierenden Reagentien geeignet sind, werden ebenfalls im nachfolgenden Diagramm aufgeführt.

*Z = H oder ein organisches Molekül, oder NH₂. Z kann ein Biopolymer sein, wie z.B. ein Protein, Polypeptid, Nukleinsäure, Oligonukleotid, Polysaccharid, usw.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
A. Herstellung der geschützten Reagentien
Wie zuvor erwähnt ist eine Reihe von Schutzgruppen zur Herstellung von geschützten Reagentien zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet. Zu den geeigneten Schutzgruppen zählen zum Beispiel Ester oder Ether von Carboxylaten, Kohlenhydraten, Nukleinsäuren, Lipiden, Phosphaten und ähnlichem. Zur Entfernung solcher Schutzgruppen geeignete Enzyme zählen demnach Esterasen, Glycosidasen, Nukleasen, Ribozyme, Lipasen, Hydroxylasen und Phosphatasen.
Für eine geeignete Schutzgruppe kann Ester verwendet werden, bevorzugt eins, das unter milden Konditionen leicht entfernbar ist – z.B. über die Verwendung eines Enzyms. Zu dem beispielhaften Ester schützende Gruppen zählt Ameisensäureester, Benzoyl-Ameisensäureester, Essigsäureester, substituiertes Essigsäureester, Propionsäureester, Isobutansäureester, Levulinsäureester, Crotonsäureester, Benzoesäureester, Naphthensäureester und viele andere Ester. (Siehe zum Beispiel Greene, T. W., Protective Groups in Organic Chemistry, John Wiley & Sons, New York, 1981.) In ähnlicher Weise kann eine große Vielfalt von Kohlenhydraten, von einfachen Zuckern bis hin zu Polysacchariden, als Schutzgruppen eingesetzt werden, die über die Verwendung eines geeigneten Enzyms spezifisch entfernbar sind. Wie der Fachmann zu schätzen wissen wird, können modifizierte Schutzgruppenenzyme – z.B. Moleküle, die Ester, Kohlenhydrate, usw. sowie andere Anteile umfassen – ebenfalls als Schutzgruppen im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Es versteht sich daher, dass obwohl Phosphatgruppen hier als beispielhafte Schutzgruppen beschrieben werden, diese genau dies sind: Beispiele an Molekülen, die im Zusammenhang dieser Erfindung geeignet sind. Bei einer Variation der vorliegenden Erfindung hat sich herausgestellt, dass Enolphosphatderivate von BABA und CABA besonders für verschiedenen Applikationen geeignet sind, einschließlich der Konjugation von kleinen und großen Molekülen und dem Nachweis von verschiedenen Analyten im Testzusammenhang. Ein Beispiel des letzteren ist ein Test für Homocystein (hcy).
BABA wird zum Beispiel häufig als ein alkylierendes Reagens zur Unterscheidung und zum Antikörpernachweis von Serum- und Plasmahomocystein eingesetzt. Homocystein ist ein Marker für Nährstoffbewertung, kardiovaskulärer Risikofaktoren und Neugeborenen-Homocystinurie. BABA-Phosphat, ein „Pro-BABA", weist gegenüber BABA mehrere Vorteile auf. BABA verfügt über eine begrenzte Stabilität, wenn es über dem physiologischen pH-Wert gelagert wird, und über eine beschränkte Löslichkeit bei einem niedrigeren pH-Wert. BABA-Phosphat weist eine wesentlich erhöhte Stabilität bei einem höheren pH-Wert und eine erhöhte Löslichkeit über einen weiten pH-Wert Bereich auf. Es verfügt über den zusätzlichen Vorteil einer potentiellen Verträglichkeit mit Reagentien in einem Zweikomponentensystem. CABA-Phosphat verhält sich ähnlich und ist leichter herzustellen. CABA-Phosphat und BABA-Phosphat lassen sich leicht durch alkalische Phosphatase entschützen.
Die chemische Struktur von BABA und die der phosphatgeschützten Form seines nahen Verwandten, BABA, wird nachfolgend illustriert. Der Austausch von Br mit Cl in der ersten Struktur stellt die Struktur für CABA her; auf ähnliche Weise stellt der Austausch von Cl mit Br in der zweiten Struktur die Struktur für BABA-Phosphat her.
CABA und BABA alkylieren die Sulfhydrylgruppen von Cystein (cys) und Homocystein. Die Aminogruppe des alkylierten Cysteins, jedoch nicht des alkylierten Homocysteins, reagiert intern mit dem durch CABA oder BABA eingeführten Keton, um eine zyklische Struktur abzugeben. Verfahren zur Herstellung von BABA und CABA stehen auf dem Fachgebiet zur Verfügung; siehe z.B. US-Patent Nr. 5,478,729 (z.B. Spalten 21–22).
Weil Antikörper des aklylierten Homocysteins (hcy-ABA) hcy-ABA vom zyklischen alkylierten Cystein (cys-ABA) unterscheiden können, gibt ein Immunoassay für hcy unter Verwendung dieser Antikörper akkurate Ergebnisse ab, auch in Gegenwart von Cystein. Im Gegensatz dazu kann ein Immunoassay für hcy ohne vorherige Aklylierung und Verwendung von Antikörpern an hcy nicht zwischen diesen beiden homologen Aminosäuren unterscheiden.
BABA und CABA beziehen eine Vielfalt von bestimmten Funktionalitäten ein, die unbedingt beibehalten werden sollen. Zum Beispiel sind dabei die nachfolgenden Funktionalitäten von Wichtigkeit: 1) die Haloacetylgruppe hat eine rasche Reaktionsgeschwindigkeit mit Thiolen; 2) Der Phenylring kann einen hoch-immunogenen Anteil bieten, wenn er an ein Immunsystem bereitgestellt wird; 3) das Carbonsäureester stellt einen gewissen Grad an Wasserlöslichkeit sowohl als auch einen bequemen Bindungspunkt an ein Trägerprotein zur Herstellung eines Immunogens bereit; und 4) das Carbonyl der Haloacetylgruppe stellt ein bequemes Mittel zur Unterscheidung zwischen den Cystein- und Homocysteinaddukten bereit.
Um alle der vorgenannten Merkmale beizubehalten, während eine erhöhte Stabilität und Löslichkeit bereitgestellt wird, stellen geschützte Formen von BABA und CABA (d.h. „Pro-BABA" und „Pro-CABA") Aspekte der vorliegenden Erfindung dar. Die Verwendung von Enolphosphatderivaten von BABA und CABA (Pro-BABA und Pro-CABA) stellen diese Vorteile bereit und diese Derivate können leicht durch alkalische Phosphatase entschützt werden, um BABA oder CABA während des Verfahrens der Durchführung eines Tests zu ergeben.
Die Verwendung von Pro-BABA oder Pro-CABA stellt als einen weiteren Vorteil die Fähigkeit bereit, Reagentien zu kombinieren, die ansonsten unverträglich miteinander wären und ermöglicht somit die Durchführung von Tests mit weniger zusätzlichen Schritten. Zum Beispiel verlangt ein Test mit ungeschütztem BABA das Mischen der Probe mit einem Freisetzungsreagens, um hcy-Disulfide zu reduzieren. BABA wird dann zusammen mit einem Antigenreagens und einem Antikörperreagens hinzugefügt. Wenn Pro-BABA oder Pro-CABA verwendet wird, kann das Freisetzungsmittel und Pro-BABA oder Pro-CABA mit dem Antigen als ein erstes Reagens verbunden werden und die alkalische Phosphatase kann mit dem Antikörper als ein zweites Reagens verbunden werden, wodurch die Anzahl der TestReagentien von drei auf zwei reduziert wird.
Obwohl Enolphosphate Berichten zufolge nur schwierig zu synthetisieren sind (siehe z.B. Kearney and Valentino, Pharm. Res. 9: 3789 (1992)), waren wir in der Lage, diese mit großem Erfolg herzustellen. Zum Beispiel wird CABA-Phosphat erfolgreich auf einer 40-Gramm Skala mit einer guten Gesamtausbeute hergestellt. In Bezug auf das synthetische Schema (siehe Schema A) unten entsprechen die Zahlen in Fettdruck der in der Tabelle dargestellten Struktur, gewerblich erhältlicher 4-Acetylbenzoesäureethylester (1, 197 mmol) wird wahlweise monochloriert (siehe z.B. Rogic et al., J. Org. Chem. 46: 4486–9 (1981)) mit einem Ertrag von 78%, was ein 99% pures Produkt ergibt (wie unter Verwendung der kernmagnetischen Resonanzanalyse (NMR) festgestellt; siehe Tabelle A). Wurde die Bromierung verwendet, um das Vinlybromid-Enolphosphatanalogon von BABA zu erhalten, so fand eine teilweise oder vollständige Verdrängung des Broms durch Chlorid während dem Phosphorylierungsschritt statt. Das Chlorderivat stellte sich als wirkungsvolles Bromderivat in Tests unter Verwendung von photoaktivierten chemilumineszenten Markierungen heraus. Die auf dem Chlorderivat basierende Synthese ist sauberer und reproduzierbarer.
1. Materialien
Sämtliche Reagentien sind von Reagensgüte und werden ohne weitere Reinigung verwendet, mit Ausnahme von THF, welches vor der Verwendung aus Natrium frisch destilliert wird, und von Diisopropylethylamin, welches über 3 Å-Siebe getrocknet wird. Silica-Gel 250 Analyseobjektträger werden von der Firma Analtech (Newark, DE) bezogen. ¹H-NMR wird auf einem Bruker 250 MHz FT-NMR Spektrometer unter Verwendung von deuteriertem Lösungsmittel registriert, die von der Firma Aldrich (Milwaukee, WI, USA) bezogen werden. UV-Spektren werden auf einem Hewlett Packard Modell 8452A Diodentafelspektralphotometer abgelaufen. Sämtliche Reaktionen laufen unter einer Argonatmosphäre ab. Elementale Analysen, Massenspektren und NMR-Spektren (¹H, ³¹P) werden firmenintern oder durch gewerbliche Instanzen – z.B. Berkeley Labs, durchgeführt.
Schema – A: Synthese
Schema – B: Test
2. Synthese (siehe Synthetik – Schema A)
a. Herstellung von 4-(Chloracetyl)Benzoesäureester (2)
4-Acetylbenzoesäureester (Aldrich 99%, 37,87 g, 197 mmol) wird in 350 ml CCl₄ aufgelöst, zu welcher Lösung 11,3 ml (197 mmol) an wasserfreiem Ethanol hinzugefügt wird. Eine Lösung aus Sulfurylchlorid (20 ml, 236 mmol) in 50 ml CCl₄ wird tropfenweise über einen Zeitraum von 20 Minuten hinzugefügt. Nach 30 Minuten, wenn das Schäumen aufgehört hat, wird die Reaktion durch NMR und Dünnschichtchromatographie (TLC) geprüft. (Das Austauschverhältnis durch NMR lautet wie folgt: 2% Dichloro: 74% Monochloro: 24% (1). Weiteres Erhitzen 20 Minuten lang bei 50°C veränderte das Verhältnis nicht. TLC: 5 × 20 SiO₂: (1:3) 4% MeOH/CH₂CL₂-Hexan).
Weitere sechs (6,0) ml (71 mmol) Sulfurylchlorid in 20 ml CCl₄ wird tropfenweise hinzugefügt. Nach 20 Minuten hört das Schäumen auf. (Das NMR-Verhältnis lautet: 7,5% Dichloro: 92% Monochloro: 0,5% (1).) Nach zusätzlichen 15 Minuten wird die Reaktion langsam in 500 ml, gut verrührtes, gesättigtes wässriges NaHCO₃ gegossen und mit 100 ml CH₂Cl₂ gespült (um eine vorzeitige Kristallisierung zu vermeiden). Die Reaktion wird gerührt, bis das Schäumen aufhört (pH-Wert = 8). Die Phasen werden abgeschieden und die organische Phase wird einmal mit 500 ml Wasser gewaschen, mit Na₂SO₄ getrocknet und bis zur Trockenheit konzentriert.
Der Feststoff wird in 200 ml wasserfreiem Ethanol bei 80 wieder aufgelöst. (Das NMR-Verhältnis des aufbereiteten Produkts vor der Kristallisierung beträgt: 8,0% Dichloro: 92% Monochloro: 0,0% (1, Schema A).) Nach der Kristallisierung für 3 Stunden bei Raumtemperatur wird das Produkt gefiltert, mit 50 ml gefriergekühltem Ethanol gewaschen und getrocknet (0,1 mmHg), was einen ersten Ertrag von 25,5 g ergibt. Das Filtrat wird auf etwa 100 ml konzentriert und 2 Stunden lang im Gefriergerät gekühlt. Der zweite Ertrag wird zweimal mit 25 ml-Anteilen des gefriergekühlten Ethanols gewaschen und getrocknet (0,1 mmHg, 7,4 g).
Die kombinierten Produkte (99% pures Monochloro-Produkt durch NMR) werden direkt im nächsten Schritt verwendet. Ein drittes Produkt (1,9 g, pur durch TLC) wird ebenfalls eingesammelt. Die Gesamtausbeute dieser drei Produkte (34,8 g, 154 mmol) ist 78%.
b. Herstellung von 4-(Chloracetyl)Benzoesäureester Enolphosphatnatriumsalz (3, Schema A) (CABA-Phosphat)
Der 4-(Chloracetyl)Benzoesäureethylester (2, Schema A) (32,15 g, 141,8 mmol) wird in 400 ml THF aufgelöst. Diisopropylethylamin (86 ml, 496 mmol) wird zu der klaren, farblosen Lösung hinzugefügt. Die sich daraus ergebende klare, blaß grüngelbe Lösung wird zwei Minuten lang mit Argon geschäumt und in einem Eisbad gerührt, bis die interne Temperatur unter 10°C beträgt. Das in 50 ml THF aufgelöste POCl₃ (33 ml, 355 mmol) wird tropfenweise bei einer derartigen Rate hinzugefügt, dass die Temperatur 10°C nicht überschritten wird (1,5 Stunden). Die Reaktion wird über Nacht stehen gelassen, um sich auf Raumtemperatur zu erwärmen. Die weißen Kristalle (Aminhydrochloridsalze) werden durch Filtrierung entfernt und mit 100 ml THF in das Filtrat gewaschen. (Die Kristalle werden getrocknet und gewogen. Das Gewicht (18,71 g) des puren Amin-HCl-Salzes wird verwendet, um die Berechnung für die Menge an NaOH einzustellen, die im Hydrolyseschritt hinzugefügt wird.)
Das klare orangefarbene Filtrat wird tropfenweise zu 2,50 N eisbadgekühltem argongespültem wässrigem NaOH (1800 mmol) bei einer derartigen Rate hinzugefügt, dass die Reaktionstemperatur 15°C nicht überschritten wird (1,5 Stunden). (Die Menge an NaOH basiert auf 5 × 255 mmol an verwendetem POCl₃ + 142 mmol zu hydrolyliserendem Ester – 113 mmol Amin-HCl-Salze, durch Filtrierung entfernt). Die Reaktion wird über Nacht stehen gelassen, um sich auf Raumtemperatur zu erwärmen. Die durch die Filtrierung entfernten anorganischen Salze werden zweimal mit 100 ml THF-Anteilen in das Filtrat gewaschen. (Diese Salze enthalten lediglich Spuren des Produkts nach UV- Vergleich mit einem Standard.) Das Zweiphasen-Filtrat wird abgeschieden und die wässrige Phase wird zweimal mit 150 ml THF-Anteilen extrahiert. Die Gesamt-THF-Phase wird vernichtet. (Diese organische Phase wird derart berechnet, um weniger als 1 g an Produkt nach NMR-Analyse des konzentrierten Feststoffs zu enthalten.)
Die wässrige Phase wird mit 25 ml 2,5 N NaOH von einem pH-Wert von 10,9 auf einen pH-Wert von 12,5 eingestellt und die Lösung wird über Nacht gerührt, um den restlichen Ester zu hydrolysieren (die Menge an unhydrolysiertem Ester beträgt schätzungsweise 24% nach NMR). Die blaßgelbe Lösung (pH-Wert 11,8) wird bis zur Trockenheit bei 40°C konzentriert, wobei Spuren von restlichen organischen Lösungsmitteln sowie von Diisopropylethylamin entfernt werden. Der Rest (110 g) wird erneut in 170 ml Wasser bei 50°C aufgelöst, auf Raumtemperatur abgekühlt und der pH-Wert wird auf 3,0 eingestellt, wobei 90 ml 3 N HCl tropfenweise hinzugefügt wird. Die cremig weiße Suspension wird 2 Stunden lang im Kühlschrank gelagert und gefiltert. Der Filterkuchen wird zweimal mit 100 ml-Anteilen an Eiswasser gewaschen und auf ein Konstantgewicht (0,1 mmHg) getrocknet. Bei diesem pH-Wert ist das Präzipitat immer noch ziemlich wasserlöslich, weswegen die Wassermenge auf ein Mindestmaß gehalten werden muß. Bei einer beispielhaften Herstellung wog das getrocknete, pulverweiße Produkt 40,7 g. Das praktische Formelgewicht wird auf 351 mg/mmol nach 250 MHz ¹H-NRM unter Anwendung eines internen Standards (wird in den nachfolgenden beiden Absätzen beschrieben) berechnet, was gut dem von der elementalen Analyse erhaltenen Wert (360 mg/mmol) entspricht.
Dioxan (10,0 μl-10,00 ml D₂O, 0,00822 mmol/0,70 ml NMR-Lösung, 8 ¹H s 3,7, 1,954 Integrationseinheiten) wird als der interne Standard verwendet. Die CABA-Phosphat (25,4 mg/0,70 ml NMR-Lösung) Vinylproton E/Z Isomer- Integrationseinheiten (¹H d 6,5, 2,152 Integrationseinheiten) werden zusammengegeben. (Wenn unter Testbedingungen phosphoryliert, ergeben beide Isomere das gleiche Produkt).
Berechnung:

8 × 1,15 Vinyl ¹H × 0, 00822 = 0,0724 mmol CABA-Phosphat
1,954 Dioxan ¹H
25,4 mg/0,0724 mmol = 351 mg/mmol

Das Formelgewicht des vollständig protonierten CABA-Phosphats lautet 278 mg/mmol. Das praktische Formelgewicht berücksichtigt das Gewicht von Natrium-Gegenionen in dem Produkt, das Wasser der Hydration und das restliche Natriumchlorid. Bei Anwendung dieses Formelgewichts stellt 40,7 g 116 mmol CABA-Phosphat oder einen Ertrag von etwa 82% dar.
Das Produkt wird ebenfalls nach 400 MHz ¹H und ³¹P NMR auf das E/Z-Isomer-Verhältnis und auf Reinheit als organisches Phosphat (Daten nicht illustriert) analysiert. Die Massenspektren zeigen das Elternion (277 M-1) und (299 M-2 + Na) im negativen Ionenmodus an. Die elementale Analyse (Theorie-%: C 30,00, H 3,08, Cl 14,39, P 8,61, Na 8,69; gefunden %: C 30,04, H 2,93, Cl 14, 36, P 8, 62, Na 8, 64) stimmt mit dem Dihydrat des Mononatriumsalzes von CABA-Phosphat überein, und enthält 7.5 Gew.-% NaCl. Die Berechnungen basierend auf der elementalen Analyse dieser Charge stimmen mit einem 0,9 Äqu. Na+ Gegenion, 2 Äqu. Wasser der Hydration und 7,5% NaCl überein. Der Prozentsatz des restlichen Natriumchlorids kann durch zusätzliche Kaltwasserwäschen des gefällten Produkts mit einem gleichzeitigen Verlust an Produktausbeute weiter reduziert werden.
B. Beispielhafte Testverfahren
1. Allgemeine Übersicht
Geeignete Reaktionszustände werden zur Durchführung der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung gewählt. Die nachfolgende Beschreibung legt geeignete Konditionen dar, die je nach den spezifischen Reagentien und dem Testprotokoll, die für eine beliebige Applikation gewählt werden, der Modifikation eines Fachmanns unterliegen. Die Verfahren dieser Erfindung können zum Beispiel auf zahlreiche Arten von Tests angewendet werden, wie z.B. heterogene, homogene, kompetitive oder direkte Tests, und die verwendeten Konditionen und Reagentien werden entsprechend ausgewählt.
Die Probe, bevorzugt in einem geeigneten Medium, kann direkt untersucht werden oder kann vorbehandelt werden, bevor die Probe zu dem Testmedium hinzugefügt wird. Eine Vorbehandlung kann das Analyt einem oder mehreren der TestReagentien leichter zugänglich oder leichter nachweisbar machen, indem die Störung in dem Test durch das Entfernen von ungewünschten Materialien reduziert wird. Die Probe kann vorbehandelt werden, um Zellen abzuscheiden oder aufzulösen; um Proteine zu fällen, zu hydrolysieren oder zu denaturieren; um Lipide zu hydrolysieren; um das Analyt löslich zu machen und ähnliches. Solche Vorbehandlungen können ohne Einschränkung folgendes beinhalten: Zentrifugieren; Behandlung der Probe mit einem organischen Lösungsmittel (z.B. ein Alkohol, bevorzugt ein Alkohol mit weniger als etwa 7 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Methanol); Behandlung mit Reinigungsmitteln; und Behandlung mit Freisetzungsmittel, die Reduktionsmittel enthalten können.
Die Konzentration der zu testenden Verbindung variiert im allgemeinen von etwa 10^–4 bis 10^–15 M, allgemeiner von etwa 10^–5 bis 10^–12 M. Insbesondere bei einem hcy-Analyt variiert die Konzentration im allgemeinen von etwa 10^–4 bis 10^–8 M, allgemeiner von etwa 10^–5 bis 10^–7 M. Erwägungen, beispielsweise ob der Test qualitativ, semi-qualitativ oder quantitativ ist, die bestimmte Nachweismethode und die Konzentration des Analyts legen normalerweise die Konzentration der anderen Reagentien fest. Weiterhin wird die endgültige Konzentration jedes der Reagentien normalerweise erfahrungsgemäß festgestellt, um die Sensibilität des Test über den Interessenbereich zu optimieren.
Die nachfolgend beschriebenen relativen Mengen der verschiedenen in dem Test verwendeten und in den Kits abgepackten Reagentien können stark variiert werden, um Konzentrationen an Reagentien bereitzustellen, welche die Reaktionen wesentlich optimieren, die während dem vorliegenden Verfahren stattfinden müssen, und um die Sensibilität eines durchgeführten Tests im Wesentlichen weiter zu optimieren. Die Konzentration der Antikörper in dem Testmedium hängt von der Art des Tests ab (d.h. heterogen oder homogen, kompetitiv oder direkt, usw.). Normalerweise ist der antimodifizierte Analyt-Antikörper in dem Testmedium zu einer Konzentration von etwa der Hälfte von 10⁷ Mal der Konzentration des modifizierten Analyts gegenwärtig, normalerweise eher von etwa gleichwertig bis etwa 10³ Mal der Konzentration des modifizierten Analyts.
Bei der Ausführung der Verfahren dieser Erfindung wird bevorzugt ein wässriges Medium eingesetzt. Andere polare Hilfslösungsmittel können in dem Medium ebenfalls eingesetzt werden, normalerweise mit Sauerstoff angereicherte organische Lösungsmittel von 1–6, normalerweise eher von 1–4, Kohlenstoffatome, einschließlich Alkohole, Ether und ähnliche. Normalerweise sind diese Hilfslösungsmittel in einer Menge von weniger als etwa 70 Gewichtsprozent gegenwärtig, und am meisten in einer Menge von weniger als etwa 30 Gewichtsprozent.
Bei Tests gemäß der vorliegenden Erfindung liegt der pH-Wert für das Medium normalerweise in einem Bereich von etwa 5–10, wobei der Bereich von etwa 7–9 etwas vorgezogen wird. Der pH-Wert wird derart ausgewählt, um ein erhebliches Niveau an Bindung zwischen sbp-Gliedern aufrecht zu erhalten, während die signalgebende Leistung optimiert wird. In einigen Fällen wird zwischen diesen beiden Erwägungen ein Kompromiss geschlossen. Ferner kann der pH-Wert auch derart ausgewählt werden, um eine bestimmte strukturelle Konformation, wie z.B. die Cyclisierung, aufrechtzuerhalten. Verschiedene Puffer können verwendet werden, um den gewünschten pH-Wert zu erhalten und den pH-Wert während der Bestimmung aufrechtzuerhalten. Zu den illustrativen Puffern zählen Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und ähnliche. Der eingesetzte bestimmte Puffer ist für diese Erfindung nicht von großer Bedeutung, bei individuellen Tests kann jedoch ein Puffer einem anderen vorgezogen werden.
Normalerweise werden zur Ausführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung mäßige Temperaturen eingesetzt. Die Temperatur kann mit dem durchgeführten Schritt variieren. Typischerweise wird jedoch eine konstante Temperatur während dem relevanten Zeitraum beibehalten. Die Temperaturen liegen normalerweise in einem Bereich von etwa 10° bis etwa 50°C, gewöhnlich von etwa 15° bis etwa 40°C.
Während die Reihenfolge des Hinzufügens der verschiedenen Reagentien stark variieren kann, liegen je nach Art des verwendeten bestimmten Testformats bestimmte Bevorzugungen vor. Die Reagentien und die Probe können miteinander und dem Hilfsmittel gleichzeitig oder gänzlich oder teilweise aufeinander folgend verbunden werden. Wie hier verwendet bedeutet der Begriff „gänzlich oder teilweise aufeinander folgend", dass, wenn die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Probe und verschiedenen Reagentien nicht begleitend (gleichzeitig) verbunden werden, ein oder mehrere Reagentien nachfolgend allein oder zusammen mit anderen Reagentien hinzugefügt werden können. Zum Beispiel kann eine Probe, von der vermutet wird, dass die das Analyt und das Reduzierungsmittel enthält, zuerst verbunden werden, um die Reduktion etwa vorhandener Disulfidbindungen zu ermöglichen, gefolgt von dem gleichzeitigen oder dem schrittweisen Hinzufügen der restlichen Reagentien.
Als Option können nach jedem Hinzufügen eines Reagens ein oder mehrere Inkubationsschritte beteiligt sein, die im allgemeinen in einem Bereich von etwa 30 Sekunden bis 6 Stunden liegen, normalerweise eher von etwa 2 Minuten bis 1 Stunde. Es versteht sich, dass es bestimmte Reihenfolgen an Schritten gibt, die bequemer sind, und die Auswahl der bestimmten einzusetzenden Reihenfolge von der Auswahl der Reagentien und dem Testformat abhängt und für die Erfindung nicht von großer Bedeutung ist.
Der endgültige Schritt eines Immunoassays ist das Messen des Ausmaßes der Bindung zwischen dem modifizierten Analyt und dem Antikörper, der in Beziehung zu der Gegenwart oder der Menge des Analyts in der Probe steht. Es gibt zahlreiche Wege, das Ausmaß der Bindung zu messen, die alle auf dem Fachgebiet bekannt sind. Diese Verfahren neigen dazu, abhängig von der Art des Tests zu differieren – z.B. ob der Test ein kompetitiver, homogener, heterogener ist, usw.
Eine Messung des Ausmaßes der Bindung zwischen dem modifizierten Analyt und dem Antikörper kann durch das Hinzufügen eines nachweisbar markierten modifizierten Analyts, z.B. einem markierten Analyt-Analogen, und durch den Nachweis des durch die Bindung des markierten modifizierten Analyts mit dem Antikörper in Konkurrenz mit dem Binden des modifizierten Analyts erzeugten Signals erreicht werden. In einem homogenen Test kann die nachweisbare Markierung zum Beispiel ein Enzym sein und der endgültige Schritt könnte die Aktivierung der Enzymmarkierung durch das Hinzufügen eines Substrats beteiligen. Das erzeugte Signal steht in Beziehung zu dem Ausmaß der Bindung zwischen dem markierten modifizierten Analyt und dem Antikörper. Die Gegenwart oder die Menge des Signals steht dann in Beziehung to der Gegenwart oder der Menge das Analyts in der Probe.
Bei einer anderen Messung in einem kompetitiven, homogenen Test kann das Ausmaß der Bindung durch Anwendung eines Fluoreszezstrahler-markierten modifizierten Analyts und einem Löscher-markierten Antikörper festgestellt werden. Das Signal steht ebenfalls in Beziehung zu dem Ausmaß der Bindung, welches wiederum im umgekehrten Verhältnis mit der Menge an Analyt in Beziehung steht, die in der Probe gegenwärtig ist. Alternativ kann ein homogener nichtkompetitiver Test eingesetzt werden, in welchem das Fluoreszenzstrahler-markierte modifizierte Analyt nicht als ein separates Reagens hinzugefügt wird, sondern durch Reaktion des Analyts mit einem Fluoreszenzstrahler-markierten modifizierenden Reagens gebildet wird. In diesem Fall steht das Signal wieder in Beziehung zu dem Ausmaß der Bindung, die in direkter Beziehung zu der Menge des Analyts steht, die in der Probe gegenwärtig ist.
Bei einem heterogenen Test können unmarkierte Anti-(modifiziertes Analyt)Antikörper an ein Hilfsmittel gebunden werden. Nach der Inkubation des Hilfsmittels mit dem modifizierten Analyt und dem markierten modifizieren Analyt wird das Hilfsmittel von der flüssigen Phase abgeschieden und die Menge des Signals von der Feststoffphase oder der Flüssigphase dann festgestellt. Dies zeigt das Ausmaß der Bindung zwischen dem modifizierten Analyt und dem Antikörper an und daher auch die Menge des Analyts in der Probe. Für eine detaillierter Erläuterung der oben genannten Immunoassaymethoden sowohl als auch andere beispielhafte Methoden, die hier als geeignet offenbart werden, siehe Maggio, Edward T., „Enzyme-Immunoassay", CRC Press, Inc., Boca Raton, FL., 1980.
2. Beispiel: hcy-Test
Zu illustrativen Zwecken können die nachfolgenden Testprotokolle eingesetzt werden. Diese Illustrationen sollten nicht als eine Beschränkung des Wirkungsbereichs der Erfindung ausgelegt werden; sie gelten lediglich als Erläuterungen der qualitativen, semi-qualitativen und quantitativen Testprotokolle, in welchen die Verfahren dieser Erfindung zur Bestimmung von hcy oder cys in einer Probe verwendet werden können. Das in diesen Verfahren nachgewiesene Signal wird mit einem Standard oder einer Kontrollgruppe mit einer bekannten hcy-Konzentration verglichen.
Bei einem Test für hcy unter Anwendung eines alkylierenden Reagens wird ein monoklonaler Antikörper, der sich spezifisch an modifiziertes Hcy bindet – und nicht an modifiziertes cys – zur Verwendung bevorzugt. Eine Probe, von der vermutet wird, dass sie hcy und cys enthält, wird mit geschütztem alkylierenden Reagens in einem geeigneten Medium verbunden. Nach dem Hinzufügen eines Aktivierungsagens wird das geschützte alkylierende Reagens entschützt und die Reaktionen finden wie folgt statt: Alkylierungsreagens + hcy > modifiziertes hcy und Alkylierungsreagens + cys → modifiziertes cys, falls hcy und cys gegenwärtig sind. Ein Analogon von modifiziertem hcy, konjugiert auf Glucose-6-Phosphatdehydrogenase und der antimodifizierte hcy-Antikörper werden ebenfalls zu dem Medium hinzugefügt. Die Bindung des antimodifizierten hcy-Antikörpers an das zu G6PDH konjugierte modifizierte hcy führt zu einer Hemmung des Enzyms. Nach einer Inkubation von 30 Minuten wird Glucose-6-Phosphat hinzugefügt. Das erzeugte Signal steht in direkter Beziehung zu der Menge an hcy in der Probe.
Wie zuvor erwähnt wird in einem Probentest ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch für modifiziertes hcy ist (und nicht für modifiziertes cys), bevorzugt eingesetzt und wird an Glaskügelchen gebunden. Die Serumprobe wird zunächst mit Dithiothreitol (DTT) behandelt, um etwa als Disulfide festgebundenes hcy reduzierend freizusetzen. Überschüssiges DTT wird durch eine Behandlung mit Natriumarsenit maskiert. Die vorbehandelte Probe wird dann mit einem geschützten alkylierenden Reagens verbunden (der mit ³H markiert ist) und dann mit den an Glaskügelchen gebundenen Antikörper und das Aktivierungsreagens verbunden. Das Medium wird 10 Minuten lang inkubiert und die Kügelchen werden abgeschieden und gewaschen. Die Radioaktivität der Kügelchen wird dann gemessen. Das erzeugte Signal steht in direkter Beziehung zu der Menge an hcy in der Probe.
Bei einem beispielhaften Test für hcy unter Anwendung eines geschützten Alkylierungsreagens wird ein monoklonaler Antikörper, der sich spezifisch an modifiziertes hcy (und nicht an modifiziertes cys) bindet, an ein Hilfsmittel gebunden. Ein Analogon eines modifizierten hcy, zu Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiert, wird ebenfalls eingesetzt. Eine Probe, von der vermutet wird, dass sie hcy und cys enthält, wird mit TCEP verbunden. Tris (Carboxyethyl) Phosphin und geschützter Aklylierungsreagens in einem geeigneten Medium. TCEP wird verwendet, um ein Homocystein in einer Serumprobe zu reduzieren, die in Form eines Disulfids besteht. Nachdem ausreichend Zeit fortgeschritten ist, so daß die Reduktion etwa vorhandener Disulfide stattfinden kann, werden dann das antimodifizierte hcy-Hilfsmittelkonjugat, ein Aktivierungsreagens und das modifizierte hcy-HRP-Konjugat zu dem Medium hinzugefügt. Nach einer Inkubation der Suspension 30 Minuten lang werden die flüssigen und festen Phasen abgeschieden und die feste Phase wird gewaschen. Ein wässriges Medium, zu welchem Substrat hinzugefügt wurde, wird dann zu der festen Phase hinzugefügt und das erzeugte Signal steht in inverser Beziehung zu der Menge an hcy in der Probe.
Ein geeignetes geschütztes Alkylierungsreagens ist CABA-Phosphat, das ein Enolphosphat von 4-(α-Chloracetyl)-Benzoesäure ist. Diese Verbindung hat sich im Gegensatz zu ungeschützten AlkylierungsReagentien auch in Gegenwart von TCEP als stabil herausgestellt. Aufgrund der Verwendung der Enolphosphat-Schutzgruppe konnten diese ansonsten unverträglichen Reagentien zusammen gelagert werden und der Test konnte deshalb unter Verwendung von nur zwei Reagentien durchgeführt werden. Das erste Reagens enthielt TCEP, das Enolphosphat von CABA, und mit Photosensibilisator gefärbte Partikel, die mit einem durch alkylierendes Homocystein mit CABA (hcy-ABA) gebildeten Produkt beschichtet sind. Das Mischen dieser verbundenen Reagentien mit der Probe verursacht eine Reduktion der Homocysteindisulfide. Das zweite Reagens enthielt eine alkalische Phosphatase und mit Antikörpern an hcy-ABA beschichtete Chemilumineszenzkügelchen. (Im allgemeinen handelt es sich bei Chemilumineszenzkügelchen um Latexpartikel, in welche eine einfache sauerstoffaktivierbare Chemilumineszenzmarkierung eingearbeitet wurde. Sensibilisatorkügelchen sind Partikel oder Kügelchen, in welche ein Sensibilisatorfarbstoff eingearbeitet wurde.) Nachdem dieses zweite Reagens hinzugefügt wird, wird das Enolphosphat zunächst hydrolysiert. Das daraus entstandene freie CABA reagiert dann mit Homocystein und das gebildete hcy-ABA bindet sich an die Chemilumineszenzkügelchen. Jegliche Chemilumineszenzkügelchen, die noch einen freien Antikörper aufweisen, binden sich an die Sensibilisatorkügelchen. Die daraus resultierenden Kügelchenpaare werden durch Bestrahlung und Messung der darauf folgenden Chemiluminseszenzlichtemission nachgewiesen.
CABA-Enolphosphate und BABA-Enolphosphate werden als besonders geeignet beschrieben, es versteht sich jedoch, dass sie als beispielhaft und die Erfindung nicht beschränkend beschrieben werden. Andere α-Haloketon Enolphosphate, wie auch verschiedene Halovinylglykoside, können ähnlich hergestellt und wie hier offenbart verwendet werden.
C. Einfache sauerstoffaktivierbare Chemilumineszenzmarkierungen und Verfahren
Einfache sauerstoffaktivierbare Chemilumineszenzmarkierungen und Verfahren sowie die Verwendung derselben sind besonders bei den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geeignet. Es versteht sich jedoch, dass solche Markierungen, Verfahren und zugehörige Zusammensetzungen (d.h. markierte Partikel) nicht die einzigen Mittel zur Ausführung der vorliegenden Erfindung sind.
Daher sind in verschiedenen Aspekten der Erfindung die in den US-Patent Nummern 5,709,994, 5,340,716 und 5,478,729 beschriebenen Markierungen, Partikel und andere Zusammensetzungen wie in der vorliegenden Spezifikation offenbart besonders geeignet. Zum Beispiel beschreibt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Kügelchen (oder anderen Matrizen), die mit Chemilumineszenz- und/oder Sensibilisierungspartikeln, Verbindungen, Zusammensetzungen oder Molekülen markiert sind. Verfahren zur Herstellung solcher Chemilumineszenzpartikel werden in den zuvor erwähnten US-Patenten beschrieben – siehe z.B. Spalten 25–33 und 41–43 der US-Patent Nr. 5,709,994 oder Spalten 21–22 der US-Patent Nr. 5,340,716.
Geeignete Photosensibilisatoren und Chemilumineszenzmaterialien werden ebenfalls in den zuvor erwähnten Patentoffenbarungen eingehend behandelt, wie auch Verfahren zum Anbinden dieser Materialien an eine Matrix, sei die Matrix ein Feststoff (d.h. ein Suspensionspartikel) oder eher „flüssiger" oder „flüssig/fester" Natur (d.h. ein Öltröpfchen oder Liposom). Eine ausgezeichnete Erörterung eines geeigneten signalgebenden Systems ist auch im US-Patent Nr. 5,185,243 von Ullman, et al., enthalten.
D. Verfahren zur Herstellung von geeigneten Antikörpern
Das Verfahren dieser Erfindung umfaßt ferner die Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern an Immunogene, die homolog zu dem immunologisch ausgeprägten Analyt sind, z.B. das "modifizierte" Analyt. Das zum Erhalten der in den Verfahren der vorliegenden Erfindung geeigneten Antikörper geeignete Immunogen ist das modifizierte Analyt, welches durch das Reagieren der zu testenden Verbindung mit dem ausgewählten Modifizierungsreagens erhalten wird. Normalerweise werden zur Herstellung des Immunogens zuerst die löslich machenden Gruppen der ModifizierungsReagentien zur Anbindung des Reagens an das immunogene Trägerprotein verwendet. Diese Anbindungsgruppen werden gewöhnlich zuerst aktiviert und das Reagens wird dann an das Trägerprotein gekoppelt. Dem daraus resultierenden Reagens-Proteinkonjugat wird dann ermöglicht, mit dem Analyt zu reagieren, wird gereinigt und als Immunogen verwendet.
Diese Erfindung umfaßt Reagentien, Kits und Verfahren, die zum Nachweis einer ersten Verbindung in Gegenwart einer zweiten Verbindung, enthaltend Umstände, in welchen die zweite Verbindung ein Homolog der ersten ist, geeignet sind. Daher werden die oben beschriebenen Antikörper auf deren Fähigkeit, spezifisch mit dem Reaktionsprodukt des Modifizierungsreagens und entweder der ersten Verbindung (Analyt) oder der zweiten Verbindung zu reagieren, geprüft; z.B. auf deren Fähigkeit, sich entweder an das modifizierte Analyt oder die modifizierte zweite Verbindung zu binden. Bei einem Test für hcy wäre das Immunogen zum Beispiel das abgeleitete hcy, das an ein immunogenes Trägerprotein geknüpft ist. Die daraus resultierenden Antikörper wären dann dazu fähig, das modifizierte hcy-Analyt spezifisch zu erkennen und würden nicht das modifizierte cys erkennen.
Verschiedene Anteile, die dazu fähig sind, das Modifizierungsreagens an den Proteinträger anzubinden, können verwendet werden, einschließlich z.B. Aldehyde, Ketone, Diazoniumsalze, Alkylierungsmittel, usw. In geeigneter Weise werden Carbonsäuren oder Sulfonsäuren zur Konjugation in aktive Ester oder Säurehalogenide umgewandelt. Das Trägerprotein kann jedes Protein sein, bevorzugt jedoch eins, das dem zu immunisierenden Tier fremd ist, wie z.B. Altschnecken-Hemocyanin oder Rinderserum-Albumin, falls es sich bei dem Tier beispielsweise um eine Maus, einen Hasen, ein Schaf oder eine Ziege handelt.
Die Herstellung der in den Verfahren dieser Erfindung geeigneten Antikörper wird durch Verwendung von Verfahren erreicht, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Monoklonare Antikörper werden beispielsweise im wesentlichen durch ein Verfahren erhalten, das dem in Kohler und Milstein, Nature 256: 495–497 (1975) beschriebenen Verfahren ähnlich ist. Die Einzelheiten des Milstein-und-Kohler-Verfahrens sind gängig; im allgemeinen umfaßt das Verfahren das Injizieren eines Wirts, gewöhnlich einer Maus oder eines geeigneten Tiers, mit einem Immunogen. Zellen werden von der Milz des Wirtstiers entnommen. Alternativ kann der Wirt auch desensibilisierte Milzzellen umfassen, die in vitro dem Immunogen gegenüber desensibilisiert sind. Die daraus resultierenden Zellen werden dann mit Myelomzellen verschmolzen; das Ergebnis ist eine als ein „Hybridom" bezeichnete Hybridzelle, die in vitro kultiviert werden kann. Die Bevölkerung von Hybridomen wird geprüft und derart manipuliert, um individuelle Klone zu isolieren, wobei jeder einen einzigen Antikörper an das Antigen abgibt.
Wenn ein Immunogen in einen Wirt eingeführt wird, reagiert das Immunsystem des Wirts, indem es eine Vielzahl von Antikörpern produziert, die in der Lage sind, verschiedene Stellen am Immunogen zu erkennen. Diese zahlreichen Antikörper weisen verschiedene Affinitäten und Spezifitäten auf. Um diese Antikörper zu erhalten, die die gewünschten Affinitäts- und Spezifitätseigenschaften für ein bestimmtes einzusetzendes Testverfahren haben, werden die verschiedenen Hybridom-Zellinien geprüft, bis ein Antikörper mit den gewünschten Eigenschaften identifiziert worden ist.
E. Herstellung von Konjugaten
Andere Applikationen des zuvor genannten Verfahrens umfassen die Herstellung von Konjugaten. Zum Beispiel ein Protein, dessen Sulfhydrylgruppen mit nicht mehr als einem Molekül von CABA Enolphosphat pro Proteinmolekül markiert ist. Das Konjugat ist stabil, weil CABA Phosphat kein Alkylierungsmittel ist. Dieses markierte Material wird dann mit einem Überschuss an Sulfhydryl enthaltenden Protein zugemischt. Der Zusatz einer alkalischen Phosphatase leitet eine Kopplungsreaktion ein, die wegen der hohen Reaktivität von CABA nahezu quantitativ wäre.
Deshalb werden angemessene Ausbeuten von 1:1 an Proteinkonjugaten leicht ohne störende Polymerisation des CABA markierten Proteins erzielt. Auf ähnliche Weise werden Arzneimittelkonjugate mit ähnlichen Verfahren wie oben beschrieben hergestellt; d.h. ein Sulfhydryl enthaltendes Arzneimittel wird anstelle von Sulfhydryl enthaltendem Protein verwendet.
F. Kits
Der Einfachheit halber können die in der vorliegenden Erfindung zur Verwendung kommenden Reagentien in einem Kit zur Anwendung in einem Testverfahren, in einem Verfahren zur Konjugation eines Moleküls an ein anderes (d.h. Proteinkonjugation) oder in jeder praktischen Applikation der Erfindung bereitgestellt sein. Ein typischer Kit zur Verwendung in einem Verfahren zum Nachweis von hcy umfaßt in abgepackter Kombination: ein geschütztes Alkylierungsreagens das nach Aktivierung fähig ist, hcy und cys chemisch zu modifizieren, um modifiziertes hcy und modifiziertes cys zu bilden, einen Antikörper, der fähig ist, sich spezifisch an das modifizierte hcy, aber nicht an das modifizierte cys zu binden sowie ein Aktivierungsreagens. Der Kit kann ferner ein markiertes Analogon des modifizierten hcy umfassen.
Wie bereits an anderer Stelle erwähnt, kann modifiziertes hcy das durch die Wechselwirkung eines Alkylierungsreagens mit Homocystein in der Probe gebildete Produkt umfassen – d.h. die Modifikation der Sulfhydrylgruppen kann stattfinden. Bei einer Variation ist das modifizierte Homocystein ein Carboxyphenacylsulfid von Homocystein (hcy-ABA).
Der Kit kann ebenfalls ein Freisetzungsmittel umfassen. Geeignete Freisetzungsmittel, die in der Lage sind, die hcy und cys Sulfurverbindungen von den Serumproteinen freizusetzen sind auf dem Fachgebiet bekannt, und enthalten ohne Einschränkung Reduktionsmittel, wie Natrium und Kaliumborhydrid; Thiole, wie Dithiothreitol, Dithioerythritol, 2-Mercaptoethanol, Thioglykolsäure und Glutathion; und Phosphine und Trialkylphosphine, wie Tributylphosphin und Tris-(2- carboxyethyl)phosphin. Besonders geeignete Reduktionsmittel sind Dithiothreitol und Tris-(2-carboxyethyl)Phosphin (TCEP), wobei das letztere in Burns, et al., J. Org. Chem. 56 (8): 2648–2650 (1991) beschrieben ist als ein Agens, das zur Freisetzung jedes Hcy in Disulfidform geeignet ist.
Ein Kit für die Kopplung von zwei Molekülen in einem wässrigen Medium enthält bevorzugt ein geschütztes Alkylierungsreagens mit einer Bindungsgruppe und einem Aktivierungsreagens in separaten Behältern.
Unter entsprechenden Umständen können ein oder mehrere der Reagentien in dem Kit als Lösung oder als ein Trockenpulver, gewöhnlich gefriergetrocknet, einschließlich der Arzneistoffträger, bereitgestellt sein, welches bei Auflösung eine Reagenslösung mit den entsprechenden Konzentrationen zur Durchführung eines Verfahrens oder Tests gemäß der vorliegenden Erfindung bereitstellt. Um die Vielseitigkeit der betreffenden Erfindung noch zu erhöhen, kann das Reagens in abgepackter Kombination, im selben oder einem separaten Behälter, derart bereitgestellt sein, daß das Verhältnis der Reagentien eine wesentliche Optimierung des Verfahrens und der Tests bereitstellt. Je nach der Kreuzreaktivität und Stabilität der Reagentien können sich die Reagentien jeweils in separaten Behältern oder verschiedene Reagentien können sich verbunden in einem oder mehreren Behältern befinden. Der Einfachheit halber können die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Reagentien in vorher festgelegten Mengen bereitgestellt werden. Der Kit enthält ebenfalls schriftliche Anweisungen über den Gebrauch der Reagentien und/oder wie ein bestimmter Test durchgeführt wird, zum Beispiel in Form einer Packungsbeilage.
Es versteht sich, daß verschiedene Kombinationen der hier beschriebenen Ausführungsformen im Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung enthalten sind. Andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den obigen Beschreibungen, aus den nachfolgenden Beispielen und aus den Ansprüchen.
ABKÜRZUNGEN

Tris HCl

– Tris(hydroxymethyl)aminomethan-HCl (eine 10× Lösung) von BioWhittaker, Walkersville, MD, U.S.A.

DTT

– Dithiothreitol von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, U.S.A.

HPLC

– Hochleistungs-Flüssigchromatographie.

DPP

– 4.7-Diphenylphenathrolin von Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI, U.S.A.

BSA

– Rinderserum-Albumin von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, U.S.A.

ELISA

– enzymgekoppelter Immunnachweis, wie in "Enzyme-Immunossay", Edward T. Maggio, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida (1980) beschrieben.

g

– Gramm

mmol

– Millimol

DMF

– Dimethylformamid

THF

– Tetrahydrofuran

MS

– Massenspektroskopie

NMR

– kernmagnetische Resonanzspektroskopie

TMSCl

– Trimethylsilylchlorid

EDAC

– 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid.

MES

– 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure.

SPDP

– N-Succinimidyl3-(2-pyridylsulfid)-propionsäure.

Sulfo-SMCC

– 4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexan-1-carbonsäureester.

TCEP

– Tris-Carboxyethylphosphin.

BEISPIELE
Die nachfolgenden Beispiele illustrieren die vorliegende Erfindung, ohne diese einzuschränken.
Beispiel 1
Demonstration der Entschützung der Alkylierungsgruppe
1. Entschützung einer Phosphatschutzgruppe durch alkalische Phosphatase
Eine Mischung aus BABA-Phosphat und CABA-Phosphat (das Resultat aus der Herstellung von BABA-Phosphat), 5 mg in 1 ml pH-Wert 8–9 NaOD-D₂O wird mit 1 mg (15 Einheiten) alkalischer Phosphatase (Sigma, menschliche Plazenta) 15 Minuten lang bei Raumtemperatur behandelt. Die TLC-Analyse (250 Mikron SiO₂ (Analtech Uniplate), unter Verwendung von 20% H₂O-ACN deutet darauf hin, das die Phosphatgruppe des geschützten Alkylierungsreagens durch die Behandlung mit der alkalischen Phosphatase entfernt worden ist, wobei das nicht behandelte geschützte Alkylierungsreagens intakt bleibt. Dies wird ferner durch die NMR (D₂O) Analyse bestätigt, welche das Verschwinden des Vinylproton-Höchstwertes (normalerweise bei 6,3 ppm für das Enolphosphat) anzeigt.
Weitere Demonstrationen der wirksamen Entfernung der Schutzgruppe werden durch die TLC-Analyse (wie oben) der Reaktion des entschützten Alkylierungsreagens mit Cystein angezeigt. Die Reaktion des Rohproduktes der Reaktion mit alkalischer Phosphatase, etwa zehn (10) Minuten lang, mit Cystein resultiert in dem Verschwinden des ersten Produktes, dem entschützten Alkylierungsreagens, und dem Auftreten eines mehr polaren Produktes. Bei dem letzteren wird vermutet, daß es sich um ein Addukt des Alkylierungsreagens und von Cystein handelt.
2. Stabilität eines geschützten Alkylierungsreagens in Gegenwart eines Reduktionsmittels
Die Stabilität einer Mischung aus CABA-Phosphat (geschütztes Alkylierungsreagens) und einem Reduktionsmittel (Tris(carboxyethyl)phosphin oder TECEP) wird durch die wie oben beschriebene TLC-Analyse unter Anwendung von BABA, CABA-Phosphat und TCEP als Standards demonstriert. Die Analyse einer Mischung aus BABA und TCEP (jeweils 5 mm in einem Phosphatpuffer mit pH-Wert 7) demonstriert, daß die Reaktion des Alkylierungsmittels mit dem Reduktionsmittel nach einer Inkubation der Mischung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur nahezu komplett ist. Im Gegensatz zu dem freien Alkylierungsreagens hat sich das Alkylierungsreagens (CABA-Phosphat) als resistent gegenüber einer Reaktion mit TCEP nach Inkubation einer Mischung aus den beiden Reagentien (jeweils 5 mm in einem Phosphatpuffer, pH-Wert 7) sechzehn (16) Stunden lang bei Raumtemperatur herausgestellt.
Beispiel 2
Homocysteintest unter Anwendung von LOCI
(Lumineszenzsauerstoff-Channeling-Immunoassay)
Eine Vielzahl von Testverfahren und Zusammensetzungen sind für den Nachweis von Verbindungen und Zusammensetzungen in biologischen Proben geeignet – z.B. in Serumproben. Ein geeigneter Test, der die hier beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren anwendet, wird hier als LOCI bezeichnet. (Siehe US-Patente Nr. 5,709,994, 5,340,716 und 5,478,729 zwecks weiterer Einzelheiten bezüglich Lumineszenzsauerstoff-Channeling-Immunoassays.)
Hcy existiert in zahlreichen Formen in Plasma – z.B. als ein kleiner Prozentsatz in freier Form, einige als Disulfide mit sich selbst und Cystein, und einige als Disulfide mit Albumin (etwa 70%). Das Gesamt-hcy ist das klinisch relevante Maß, jedoch bei Referenzwerten in fastenden Probanden von etwa 5 bis 15 μmol/L. Sogar ein mäßiger Anstieg an Plasma-hcy, als Hyperhomocysteinemie bezeichnet, wird als ein Risikofaktor für frühzeitige Herz-Kreislauf-Erkrankungen unter der allgemeinen Bevölkerung erachtet.
Tests basierend auf Antikörpern sind beliebte Ausführungen und wären leicht auf automatisierte Formen mit hohen Durchsatzraten anpassungsfähig, wenn das Problem der Probenvorbehandlung – insbesondere eine Offline-Probenvorbehandlung – gelöst werden könnte. Deshalb stellt die vorliegende Offenbarung eines Mittels, das den raschen und vollautomatisierten Nachweis von Homocystein (hcy) und/oder anderer Moleküle und Zusammensetzungen ermöglicht, ein wertvolles Werkzeug dar, das unter Anwendung der hier offenbarten Verfahren und Zusammensetzungen leicht demonstrierbar ist.
Im Wesentlichen enthalten die Schritte eines derartigen Tests (1) die Umwandlung von hcy-Disulfiden in freies hcy, z.B. mit Tris-(2-carboxyethyl)phosphinhydrochloridreduktion; (2) der Derivatisierung von hcy mit Bromacetylbenzoesäure (BABA) oder einem Enolphosphatderivat von BABA zur Herstellung von hcy-ABA; und (3) dem Nachweis und der Bestimmung der Menge an hcy-ABA durch LOCI. Der Test wird weiter durch die Verwendung von geschützten Haloketonen aufgewertet, z.B. Enolphosphatderivate von BABA oder CABA, da deren Derivatisierungsagens über einen breiten pH-Wertbereich hinaus eine besser Löslichkeit und eine längere Haltbarkeit aufweisen, als entschützte Formen. Weiterhin hat die Verwendung solcher geschützten Haloketone den zusätzlichen Vorteil der Einfachheit, indem sie die Verwendung eines Zwei-Reagensprotokolls auch in einem automatisierten Zusammenhang ermöglicht.
Zu illustrativen Zwecken wird hier ein automatisiertes Testverfahren beschrieben. Es versteht sich, daß nicht automatisierte Tests und Tests, die verschiedene Komponenten und Schritte einsetzen, ebenfalls zur Anwendung der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung denkbar sind, und daher im Geltungsbereich der Erfindung liegen.
A. Materialien
Die folgenden Reagentien, die in verschiedenen nachfolgend beschriebenen Verfahren verwendet werden, können von den angegebenen gewerblichen Quellen bezogen werden, sind jedoch auch von einer breiten Vielfalt von anderen Quellen erhältlich. Rinderserum-Albumin (BSA; ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA, U.S.A.); Kälberdarm alkalische Phosphatase (CIAP; Pierce Chemicals, Rockford, IL, U.S.A.); Sulfosuccinimidyl 6-(Biotinamido)hexansäureester (NHS-LC-Biotin; Pierce, Rockford, IL, U.S.A.); L-Homocystein, Cystein und Methionin (Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.); L-Homocysteinthiolaktonhydrochlorid (HCTL; Fluka, Milwaukee, WI, U.S.A.) Tris-(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid (TCEO; Molecular Probes, Eugene, OR, U.S.A.); Dextran T-500 (Pharmacia Co., Piscataway, NJ, U.S.A.); HBR-1 (heterophiles Blockierungsreagens 1; Scantibodies Lab., Inc., Santee, CA, U.S.A.). Soweit nicht anderweitig angegeben sollte angenommen werden, daß alle anderen hier verwendeten Chemikalien von Reagensgüte sind.
Die nachfolgenden Reagentien wurden intern hergestellt: Bromacetylbenzoesäure (BABA); Bromacetylbenzoesäure-N-Hydroxysuccinamidester (BABA-NHS); „Pro-CABA" oder CABA-Phosphat (ein Enolphosphatderivat von CABA); und Homocystein-Acetylbenzoesäure (hcy-ABA). Ein Anti-hcy-ABA monoklonaler Antikörper (z.B. Klon I5C12 zum hcy-ABA-BSA-Konjugat aus der Syva monoklonalen Gruppe) wird wie nachfolgend beschrieben verwendet. Andere Äquivalente, geeignete monoklonale und polyklonale Antikörper können unabhängig von den dem Fachmann bekannten Methoden (siehe z.B. Abschnitt D oben) leicht erzeugt werden.
Serumkalibratoren werden mit bekannten Mengen an Homocystein hergestellt, das in Serumproben von zusammengefassten normalen Einzelsera beimpft wurde. Der Homocysteinpegel in diesem zusammengefassten Serum wird durch HPLC gemäß standardmäßigen Methoden festgestellt. Viele Referenzlaboratorien – z.B. die Cleveland Clinic, Cleveland, OH – sind z.B. ausgerüstet, solche Protokolle durchzuführen.
Eine Feststoffmatrix, bevorzugt eine in Kügelchenform, wird mit Anti-hcy-ABA monoklonalen Antikörpern (mAbs) markiert; was wir hier mit „Ab-Akzeptorkügelchen" bezeichnen, wird im Wesentlich wie folgt hergestellt. Styroporkügelchen werden zunächst mit Akzeptorfarbstoff (z.B. C-28 Thioxen, DPP/Eu(TTA)3) gefärbt und dann mit Dextran beschichtet.
C-28 Thioxen wurde wie folgt hergestellt:
Zu einer Lösung aus 4-Bromanilin (30 g, 174 mmol) in trockenem DMF (200 ml) wurde 1-Bromtetradecan (89,3 ml, 366 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (62,2 ml, 357 mmol) hinzugefügt. Die Reaktionslösung wurde 16 Stunden lang unter Argon auf 90°C erhitzt, bevor sie auf Raumtemperatur abgekühlt wurde. Zu dieser Reaktionslösung wurde wiederum 1-Bromtetradecan (45 ml, 184 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (31 ml, 178 mmol) hinzugefügt und die Reaktionsmischung wurde weitere 15 Stunden lang auf 90°C erhitzt. Nach Abkühlen wurde die Reaktionslösung im Vakuum konzentriert und der Rest wurde mit CH₂Cl₂ (400 ml) verdünnt. Die CH₂Cl₂-Lösung wurde mit 1 N wässrigem NaOH (2×), H₂O und Salzlauge gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum getrocknet, um ein dunkelbraunes Öl (etwa 110 g) zu erhalten. Eine präparative Säulenchromatographie auf Kieselgel durch ein mit Hexan auswaschendem Waters 500 Prep-LC-System ermöglichte ein gelbes Öl, das hauptsächlich das Produkt (4-Brom-N,N-di-(C₁₄H₂₉)-anilin) zusammen mit einer geringfügigen Komponente 1-Bromtetradecan enthielt. Die letztere Verbindung wurde durch Vakuumdestillation (bp 105–110°C, 0,6 mm) aus der Mischung entfernt, um 50,2 g (51%) des Produktes als braunes Öl zurückzulassen. Zu einer Mischung aus Magnesiumspänen (9,60 g, 395 mmol) in trockenem THF (30 ml) unter Argon wurde eine Lösung aus dem oben substituierten Anilinprodukt (44,7 g, 79 mmol) in THF (250 ml) tropfenweise hinzugefügt. Ein paar Jodkristalle wurden hinzugefügt, um die Bildung des Grignard-Reagens einzuleiten. Als die Reaktionsmischung warm wurde und mit dem Rückfluß begann, wurde die Zusatzrate kontrolliert, um einen sanften Rückfluß aufrechtzuerhalten. Nachdem der Zusatz fertiggestellt war, wurde die Mischung bei einem Rückfluß eine zusätzliche Stunde lang erhitzt. Die abgekühlte Überstandslösung wurde über eine Kanüle an einen zusätzlichen Trichter überführt und tropfenweise (über 2,5 Stunden) zu einer Lösung aus Phenylglyoxal (11,7 g, 87 mmol) in THF (300 ml) bei –30°C unter Argon hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde allmählich auf 0°C über 1 Stunde aufgewärmt und 30 weitere Minuten lang verrührt. Die resultierende Mischung wurde in eine Mischung aus Eiswasser (800 ml) und Essigsäurethylester (250 ml) gegossen. Die organische Phase wurde abgeschieden und die wässrige Phase wurde mit Essigsäurethylester (3×) extrahiert. Die verbundenen organischen Phasen wurden mit H₂O (2×), Salzlauge gewaschen und über MgSo₄ getrocknet. Eine Verdampfung des Lösungsmittels ergab 48,8 g des Rohproduktes als eine dunkelgrüne ölige Flüssigkeit. Eine Verdampfungssäulenchromatographie dieser Flüssigkeit (Gradientauswaschung mit Hexan, 1,5:98,5, 3:97, 5:95 Essigsäurethylester:Hexan) ergab 24,7 g (50%) des Benzoeproduktes (MS (C₄₂H₆₉NO₂): [M – H] + 618,6, 1NMR (250 MHz, CDEL₃) entsprach dem erwarteten Benzoeprodukt. Zu einer Lösung aus dem Benzoeprodukt von oben (24,7 g, 40 mmol) in trockenem Toluol (500 ml) wurde darauf folgend 2-Mercaptoethanol (25 g, 320 mmol) und TMSCl (100 ml, 788 mmol) hinzugefügt. Die Reaktionslösung wurde bei Rückfluß 23 Stunden lang unter Argon erhitzt, bevor sie auf Raumtemperatur abgekühlt wurde. Zu dieser wurde zusätzliches TMSCl (50 ml, 394 mmol) hinzugefügt; und die Reaktionslösung wurde bei Rückfluß weitere 3 Stunden lang erhitzt. Die resultierende Lösung wurde abgekühlt, mit kaltem 2,5 N wässrigem NaOH basisch gemacht und mit CH₂Cl₂ (3×) extrahiert. Die verbundenen organischen Schichten wurden mit gesättigter wässriger NaHCO₃ (2×) Salzlauge gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, um eine braune ölige Flüssigkeit abzugeben. Eine präparative Säulenchromotographie auf Kieselgel unter Verwendung eines Waters 500 Prep-LC-Systems (Gradientauswaschung mit Hexan, 1:99, 2:98 Essigsäurethylester:Hexan) stellte 15,5 g (60%) des C-28 Thioxens als ein orangegelbes Öl (MS (C₄₄H₇₁NOS): [M – H] + 661,6, 1H NMR (200 MHz, CDC₁₃) bereit, und entsprach dem erwarteten C-28 Thioxenprodukt 2-(4-(N,N-Di-(C₁₄H₂₉)-anilino-3-phenylthioxen.
DPP/Eu(TTA)3 wurde wie folgt hergestellt:
8,69 g Eu(TTA)3. 3H₂O (10 mmol, Kodak Chemical Company, Rochester, NY, U.S.A.) und 1,8 g 1,10-Phenanthrolin (10 mmol, Aldrich) wurden in 50 ml trockenem Toluol verbunden und 1 Stunde lang in einem Ölbad auf 95°C erhitzt. Das Toluol wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der aschgraue Feststoff wurde aus 10 ml Toluol kristallisiert um 10 Gramm DPP/Eu(TTA)3 zu ergeben. Absorptionsspektrum: 270 nm (20.000), 340 nm (60.000) (Toluol) 1.R(KBr): CM^–1: 3440(s), 1600(s), 1540(s), 1400(s), 1300(s).
Die Caboxyl-Akzeptorkügelchen wurden wie folgt hergestellt:
Bei den Ausgangskügelchen handelte es sich um Carbonsäureester-modifizierteesten Latex, bezogen von der Firma Seradyn Particle Technology, Indianapolis, IN. Vier ml einer 10%igen Suspension (400 mg) aus gewaschenem 175 nm Carbonsäureester-modifizierte Latex wurde mit 3 ml Ethoxyethanol in einem 25 ml Rundkolben mit Rühranker verdünnt. Der Rundkolben wurde dann in ein Ölbad mit 105°C gegeben und 10 Minuten lang gerührt. Danach wurden 3,3 mm C-28 Thioxen und 15,5 mm Eu(TTA)3DPP in Benzylalkohol hinzugefügt; die Kügelchen wurden weitere 5 Minuten lang gerührt.
An dieser Stelle wurden 1,0 ml 0,1 N NaOH langsam über 5 Minuten hinzugefügt. Während sämtlicher Zusätze wurde die Ölbadtemperatur bei 105°C aufrechterhalten. Die Ölbadtemperatur wurde über einen Zeitraum von 2 Stunden langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Nach dem Abkühlen wurde die Mischung mit 20 ml Ethanol verdünnt und zentrifugiert (12.500 U/Min, 30 Minuten lang). Die Überstände wurden vernichtet und die Kügelchen durch Ultraschallbehandlung in Ethanol resuspendiert. Das Zentrifugieren wurde wiederholt und die Kügelchen in Wasser resuspendiert; und das Zentrifugieren wurde nochmals wiederholt. Die Kügelchen wurden in 5 ml wässrigem Ethanol auf ein endgültiges Volumen von 40 ml resuspendiert.
Herstellung von Aminodextran:
Hydroxypropylaminodextran: (1NH₂/6 Glucose) wurde durch Auflösen von Dextran T-500 (Pharmacia, Uppsala, Schweden) (50 g) in 150 ml H₂O in einem 3-halsigen Rundkolben, der mit einem mechanischen Rührwerk und Tropftrichter ausgerüstet ist, hergestellt. Zu der oben genannten Lösung wurden 18,8 g Zn (BF₄)₂ hinzugefügt und die Temperatur wurde mit einem Heißwasserbad auf 87°C gebracht. Epichlorohydrin (350 ml) wurde tropfenweise durch Rühren über einen Zeitraum von etwa 30 Minuten hinzugefügt, während die Temperatur bei 87–88°C aufrechterhalten wurde. Die Mischung wurde 4 Stunden lang gerührt, während die Temperatur bei zwischen 80°C und 95°C aufrechterhalten wurde, danach wurde die Mischung auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Chlorodextranprodukt wurde durch langsames Eingießen in 3 l Methanol unter kräftigem Rühren gefällt, durch Filtrierung zurückgewonnen und über Nacht in einem Vakuumofen getrocknet.
Das Chlorodextranprodukt wurde in 200 ml Wasser aufgelöst und zu 2 l konzentriertem wässrigen Ammoniak (36%) hinzugefügt. Diese Lösung wurde 4 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt, dann auf etwa 190 ml auf einem Rotationsverdampfungsapparat konzentriert. Das Konzentrat wurde in zwei gleichgroße Chargen aufgeteilt und jede Charge wurde gefällt, indem sie langsam in 2 l rasch gerührtem Methanol gegossen wurde. Das Endprodukt wurde durch Filtrierung zurückgewonnen und unter Vakuum getrocknet.
Hydroxypropylaminodextran (1NH₂/7 Glucose), wie oben hergestellt, wurde in 50 mm MOPS, pH-Wert 7,2, zu 12,5 mg/ml aufgelöst. Die Lösung wurde 8 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, im Kühlschrank gelagert und 45 Minuten lang bei 15.000 U/Min. in einer Sorvall RC-5B Zentrifuge unmittelbar vor dem Gebrauch zentrifugiert, um Spuren an Feststoffmaterial zu entfernen. Zu 10 ml dieser Lösung wurden 23,1 mg Sulfo-SMCC in 1 ml Wasser hinzugefügt. Diese Mischung wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert und ohne weitere Reinigung verwendet.
Maleimidaminodextran (MAD) wurde wie folgt hergestellt:
Sulfo-SMCC (11,55 mg) wurde in 0,5 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Langsam, über einen Zeitraum von 10 Sekunden, wurde die oben genannte Lösung zu 5 ml gerührtem Aminodextranlösung (12,5 mg/ml in 50 mm MOPS, pH-Wert 7,2), wie oben hergestellt, hinzugefügt. Die Mischung wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Zu der oben genannten gerührten Lösung wurden 5 ml von 20 mg/ml (100 mg) der auf Seite 54 hergestellten Sensibilisierungskügelchen in destilliertem Wasser hinzugefügt. Dann wurde 1 ml von 200 mg/ml NHS (frisch in 50 mm MES, pH-Wert eingestellt auf 6,0 mit 6 N NaOH) hinzugefügt. 200 mg EDAC wurde in 1 ml destilliertem Wasser aufgelöst und diese Lösung wurde langsam durch Rühren zu den Sensibilisierungskügelchen hinzugefügt. Der pH-Wert wurde auf 6,0 durch den Zusatz von 450 μl von 1 N HCl eingestellt und die Mischung wurde im Dunkeln über Nacht inkubiert. Eine Lösung aus 100 mg Succinanhydrid in 0,5 ml DMSO wurde zu den Sensibilisierungskügelchen hinzugefügt und die Mischung wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Zu dieser Mischung wurde 0,13 ml 10%iges Tween-20 hinzugefügt, wobei die endgültige Konzentration von Tween-20 auf 0,1% gebracht wurde. Die Kügelchen wurden 45 Minuten lang bei 15.000 U/Min wie oben beschrieben zentrifugiert. Der Überstand wurde vernichtet und die Kügelchen wurden in 10 ml eines Puffers (50 mm MOPS, 50 mm EDTA und 0,1% Tween-20, pH-Wert 7,2) resuspendiert. Die Mischung wurde mit Ultraschall behandelt, um die Kügelchen zu dispergieren. Die Kügelchen wurden 30 Minuten lang wie oben beschrieben zentrifugiert, der Überstand wurde vernichtet und die Kügelchen wurden resuspendiert. Dieses Verfahren wurde insgesamt dreimal wiederholt. Danach wurden die Kügelchen auf 40 mg/ml in 2,5 ml des oben genannten Puffers resuspendiert, mit Argon gesättigt und Tween-20 wurde zu einer Konzentration von 0,1% hinzugefügt. Die Kügelchen wurden bei 4°C gelagert.
Die mit MAD beschichteten Akzeptorkügelchen wurden wie folgt hergestellt:
Carboxylakzeptorkügelchen wie oben hergestellt (99 mg in 4,5 ml Wasser) wurden langsam unter Verwirbeln zu 5,5 ml des oben genannten MAD (Maleimidaminodextran) hinzugefügt, gefolgt von 1 ml an 200 mg/ml NHS in 50 mm MES, pH-Wert 6,1 ml an 200 mg/ml EDAC in Wasser und 450 μl an 1 M HCl, endgültiger pH-Wert 6. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert, dann mit 200 mg Succinanhydrid in 0,5 ml DMSO 30 Minuten lang bei Raumtemperatur reagieren lassen. Frisch geöffnetes Surfact-Amps Tween-20 (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, U.S.A.) wurde hinzugefügt und die Kügelchen wurden 30 Minuten lang bei 15.000 U/Min in einer Sorvall RC-5B Zentrifuge zentrifugiert, durch Zentrifugieren mit drei 10 ml Anteilen an 50 mm MOPS, 50 mm EDTA, 0,1% Surfact-Amps Tween-20 (Pierce chemical Company), pH-Wert 7,2 gewaschen und in 3 ml desselben resuspendiert.
Die mit Antikörpern beschichteten Akzeptorkügelchen wurden wie folgt hergestellt:
Monoklonales Anti-hcy-ABA Ab wurde durch das Mischen von 622 μl (4,28 mg) mit 10, 2 μl SATA (1,25 mg/ml in Ethanol, 2 Äqu.) thioliert, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert und gegen 2 × 2 l an 150 mm NaCl, 10 mm Na₂HPO₄, 1 mm EDTA, pH-Wert 7 kaltdialysiert. Der thioacetylierte Antikörper wurde durch Hinzufügen von 62,2 μl Hydroxylamin (1 m H₂NOH, 50 mm MOPS, 25 mm EDTA, pH-Wert 7) deacetyliert unter Bläschenbildung mit Argon und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das Produkt wurde auf einer Pharmacia PD-10 Säule (G-25) angewendet und mit 50 mm MOPS, 50 mm EDTA, pH-Wert 7,2 unter Bläschenbildung mit Argon ausgewaschen. Nach einem 2,5 ml Zwangslauf wurden drei 1 ml Fraktionen aufgefangen und verbunden. Die Zurückgewinnung des Antikörpers betrug 3,66 mg oder 86 nach A280. Surfact-Amps Tween-20 (10 5) wurde hinzugefügt, um 0,2% an endgültiger Konzentration zu ergeben.
Ein 1,4 ml Aliquot des wie oben thiolierten Antikörpers (1,71 mg Antikörper) wurde unmittelbar zu 300 μl (10 mg) wie oben hergestellten maleimidierten Kügelchen hinzugefügt, plus ausreichend 10%iges Tween-20, um die endgültige Konzentration in der Mischung auf 0,2% zu bringen. Das Röhrchen wurde mit Argon gereinigt und über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Zu dem oben genannten wurde 3,4 μl 1 m HSCH₂COOH in Wasser hinzugefügt. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wurden 6,8 μl ICH₂COOH (1 m in Wasser) hinzugefügt. Nach 30 Minuten wurde 3,5 ml an 0,17 m Glycin, 0,1 m NaCl, 0,1% (V/V) Tween-20, 10 mg/ml BASA, pH-Wert 9,2 hinzugefügt und die Kügelchen wurden zentrifugiert (30 Minuten bei 15.000 U/min), 3 Stunden lang in 5 ml desselben Puffers inkubiert, zentrifugiert, durch Zentrifugieren mit drei 5 ml anteilen an Puffer C gewaschen, in 5 ml an Puffer C resuspendiert und im Kühlschrank gelagert. Die im Puffer C festgestellte Größe der Kügelchen betrug 301 ± 56 nm.
Kügelchen, die hier mit „Sensibilisierungs"-Kügelchen bezeichnet sein können, sind mit hcy-ABA (hcy-Sensibilisierungskügelchen) markiert. Die Herstellung der Styroporkügelchen, die mit Sensibilisierungsfarbstoff (z.B. Silicontetra-t-Butylphthalocyanin) gefärbt sind, wird im Wesentlichen wie folgt ausgeführt.
Silicontetra-t-Butylphthalocyanin:
Frisch geschnittenes Natriummetall (5,0 g, 208 mmol = wurde zu 300 ml wasserfreiem Methanol in einem Zwei-Liter, dreihalsigen Kolben, ausgestattet mit einem Magnetrührer, Rücklaufkondensator, einem Trockenrohr und einem Gasspüler, hinzugefügt. Nachdem das Natrium vollständig aufgelöst war, wurde unter Anwendung eines Trichters 4-t-Butyl-1,2-dicyanobenzol (38,64 g, 210 mmol, bezogen von TCI Chemicals, Portland, OR, U.S.A.) hinzugefügt. Die Mischung wurde klar und die Temperatur wurde auf etwa 50°C erhöht. An dieser Stelle wurde ein stetiger wasserfreier Ammoniakgasstrom durch den Gasspüler 1 Stunde lang in die Reaktionsmischung eingeführt. Die Reaktionsmischung wurde dann unter Rückfluß 4 Stunden lang erhitzt, während der Ammoniakgasstrom weiter geführt wurde. Während dem Verlauf der Reaktion begann sich ein Feststoff zu fällen. Die daraus resultierende Suspension wurde bis zur Trockenheit (Hausvakuum) verdampft und der Rest wurde in Wasser (400 ml) suspendiert und gefiltert. Der Feststoff wurde getrocknet (60°C, Hausvakuum, P₂O₅). Die Ausbeute des Produktes (1,3-Diiminoisoindolin, 42,2 g) war nahezu quantitativ. Dieses Material wurde ohne weitere Reinigung für den nächsten Schritt verwendet. Das oben genannte Produkt (18 g, 89 mmol) und Chinolin (200 ml, Aldrich Chemical Company, St. Louis, MO, U.S.A.) wurde in einem 1-Liter, dreihalsigen Kolben, der mit einem Kondensator und einem Trockenrohr ausgerüstet war, gegeben. Silicontetrachlorid (11 ml, 95 mmol, Aldrich Chemical Company) wurde mit einer Spritze zu der gerührten Lösung über einen Zeitraum von 10 Minuten hinzugefügt. Nachdem der Zusatz fertig gestellt war, wurde die Reaktionsmischung 1 Stunde lang in einem Ölbad auf 180–185°C erhitzt. Die Reaktion wurde zum Abkühlen auf Raumtemperatur stehen gelassen und konzentriertes HCl wurde sorgfältig hinzugefügt, um die Reaktionsmischung anzusäuern (pH-Wert 5–6). Die dunkelbraune Reaktionsmischung wurde abgekühlt und gefiltert. Der Feststoff wurde mit 100 ml Wasser gewaschen und getrocknet (Hausvakuum, 60°C, P₂O₅). Das Feststoffmaterial wurde in einen 1-Liter Rundkolben gegeben und konzentrierte Schwefelsäure (500 ml) wurde unter Rühren hinzugefügt. Die Mischung wurde 4 Stunden lang bei 60°C gerührt und dann sorgfältig mit zerkleinertem Eis (2000 g) verdünnt. Die daraus resultierende Mischung wurde gefiltert und der Feststoff wurde mit 100 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Der dunkelblaue Feststoff wurde in einen 1-Liter Rundkolben übertragen, konzentriertes Ammoniak (500 ml) wurde hinzugefügt und die Mischung wurde erhitzt und unter Rückfluß 2 Stunden lang gerührt, auf Raumtemperatur abgekühlt und gefiltert. Der Feststoff wurde mit 50 ml Wasser gewaschen und unter Vakuum (Hausvakuum, 60°C, P₂O₅) getrocknet, um 12 g des Silicon-tetra-t-butylphthalocyanin-Produkt als einen dunkelblauen Feststoff zu ergeben. 3-Picolin (12 g, von Aldrich Chemical Company), Tri-n-butylamin (wasserfrei, 40 ml) und Tri-n-hexalchlorosilan (11,5 g) wurden zu 12 g des oben genannten Produktes in einen 1-Liter, dreihalsigen Koben hinzugefügt, der mit einem Magnetrührer und einem Rücklaufkondensator ausgestattet war. Die Mischung wurde unter Rückfluß 1,5 Stunden lang erhitzt und danach auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Picolin wurde unter Hochvakuum (Ölpumpe bei etwa 1 mm Hg) zur Trockenheit abdestilliert. Der Rest wurde in CH₂Cl₂ aufgelöst und unter Anwendung einer Kieselgelsäule (Hexan) aufgereinigt, um 10 g an purem Di-(tri-n-hexylsilyl)-silicontetra-t-butylphthalocyanin-Produkt als ein dunkelblauer Feststoff zu ergeben. (LSIMS: [M – H]+ 1364,2, Absorptionsspektrum: Methanol: 674 nm (ε 180.000): Toluol 678 nm, ¹H NMR (250 MHz, CDCl₃): δ: –2,4 (m, 12 H), –1,3(m, 12H), 0,2–0,9 (m, 54H), 1,8 (s, 36H), 8,3 (d, 3H) und 9,6 (m, 8H) entsprach dem oben genannten erwarteten Produkt.
Herstellung der gefärbten Sensibilisierungskügelchen:
Die Sensibilisierungskügelchen wurden hergestellt, indem 600 ml an 10%igen festen Carbonsäureester-modifizierten Kügelchen (Seradyn) in einen dreihalsigen Rundkolben gegeben wurden, der mit einem mechanischen Rührer, einem mit einem an seinem Hals und einem Trichter am gegenüberliegenden Hals befestigten Glasstopfen ausgestattet war. Der Kolben war in ein Ölbad mit einer konstanten Temperatur von 94 ± 1°C eingetaucht. Die Kügelchen wurden durch den Trichter am Hals in den Kolben gegeben und der Kügelchenbehälter wurde mit 830 ml Ethoxyethanol ausgespült, 1700 ml Ethylenglycol und 60 ml 0,1 N NaOH und die Spüllösung wurden durch den Trichter in den Kolben zugegeben. Der Trichter wurde mit einer 24–40 Scheidewand aus Gummi ersetzt. Die Kügelchen wurden bei 765 U/min bei einer Temperatur von 94 ± 1°C 40 Minuten lang gerührt.
Silicon-tetra-t-Butylphthalocyanin (10,0 g), aufgelöst in 300 ml Benzylalkohol bei 60 ± 5°C, wurde zu dem oben genannten Rundkolben durch die Scheidewand mittels einer Spritze zugegeben, die auf 120 ± 10°C bei einer Rate von 3 ml pro Minute erhitzt war. Nach 15 Minuten wurden 900 ml entionisiertes Wasser und 75 ml 0,1 N NaOH tropfenweise über einen Zeitraum von 40 Minuten hinzugefügt. Das Ölbad wurde stehen gelassen, sodaß sich die Temperatur langsam auf 40 ± 10°C senken konnte, woraufhin das Rühren eingestellt wurde. Die Kügelchen wurden danach durch einen 43 Mikron Polyesterfilter gefiltert und einem Microgon Tangentialfluss-Filtrierapparat (Microgon Inc., Laguna Hills, CA, U.S.A.) unter Anwendung von Ethanol:Wasser, 100:0 bis 10:90 unterworfen.
Herstellung von hcy-ABA Sensibilisierungskügelchen:
Die Immobilisierung von hcy-ABA in Partikel – z.B. in Sensibilisierungskügelchen – wird im Wesentlichen wie folgt ausgeführt (siehe ebenfalls US-Patent Nr. 5,478,729). Zunächst werden Carboxy-Sensibilisierungskügelchen gemäß dem nachfolgenden Protokoll in Aminodextran-beschichtete Sensibilisierungskügelchen umgewandelt. 135 mg Aminodextran wurde in 1,35 ml an 0,2 M MES pH-Wert 6,0 unter Rühren aufgelöst; dann wurden 9,0 ml Carboxy-Sensibilisierungskügelchen zu 3 mg/ml herunter zentrifugiert und jeweils in 1,35 ml entionisiertem H₂O resuspendiert. Die Kügelchen wurden tropfenweise zu einer Aminodextranlösung unter Rühren hinzugefügt, gefolgt von 177,2 μl EDAC zu 80 mg/ml entionisiertem H₂O; und die Mischung wurde bei Raumtemperatur (RT) über Nacht im Dunkeln inkubiert. Als nächstes wurden 5 N NaCl hinzugefügt, um eine endgültige Konzentration von 0,5 N herzustellen, und die Mischung wurde dann bei RT 30 Minuten lang inkubiert. Schließlich wurde die Kügelchensuspension herunter zentrifugiert und mit 4 × 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer gewaschen, der 0,1 N NaCl und 10 mm EDTA pH-Wert 7,0 enthielt, und in demselben Puffer zu 24 mg Kügelchen/ml gelagert.
Als nächstes wurde die nachfolgende Reaktion mit BABA-NHS durchgeführt. (1) 1,0 ml der Aminodextran-beschichteten Kügelchen (24 mg/ml) wurde herunter zentrifugiert und in 0,5 ml in 0,1 M Phosphat mit 0,1 N NaCl pH-Wert 7,0 resuspendiert. (2) 28 mg BABA-NHS wurden in 1,0 ml DMSO aufgelöst und 250 μl wurde zu jeder Aminodextran-beschichteten Kügelchensuspension hinzugefügt, gefolgt von 250 μl 0,1 M Phosphatpuffer pH-Wert 7,0. Die Reaktionsmischung wurde 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. (3) 0,5 ml an 0,1 M Phosphat, pH-Wert 7,0, wurde hinzugefügt und die Reaktionsmischung wurde für 1 weitere Stunde inkubiert. (4) Die Kügelchen wurden herunter zentrifugiert und mit 4 × 6 ml 0,1 M Phosphat (pH-Wert 7,0) gewaschen und in 1,0 ml desselben Puffers resuspendiert.
Die oben genannten Kügelchen gingen dann wie folgt eine Reaktion mit Homocystein-Thiolactonhydrochlorid (HCTL) ein: 92,5 mg HCTL wurde in 1,25 ml 1,0 N NaOH aufgelöst und 10 Minuten lang bei 37°C inkubiert. 5 ml eines 0,5 M Phosphatpuffers, pH-Wert 7,0, wurde hinzugefügt (den pH-Wert auf 7,0 bringen). Die Reaktionsmischung wurde mit Stickstoffgas gespült. 1,0 ml der HCTL-Lösung wurde in zwei Aliquoten zu 1,0 ml entgaster Kügelchensuspension aus Schritt (4) im vorstehenden Absatz hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde bei 37°C 4 Stunden lang inkubiert und die Kügelchen wurden mit 5 ml an 0,17 M Glycin, 0,1 M NaCl, 10 mg/ml BSA, 10 mm EDTA pH-Wert 9,2 Puffer 1 Stunde lang bei RT blockiert. Die Kügelchensuspension wurde mit 1 × 5 ml Puffer aus 0,17 M Glycin, 0,1 M NaCl, 10 mg/ml BSA, 10 mm EDTA, pH-Wert 9,2, gefolgt von 4 × 5 ml LOCI an Puffer gewaschen und bei 4°C in 5,0 ml an LOCI-Puffer gelagert.
Der hier verwendete allgemeine Testpuffer, der auch als „LOCI-Puffer" bezeichnet wird, enthält folgendes: 0,1 M Trisbase, 0,3 M NaCl, 25 mm EDTA, 0,1% BSA, 0,1% Dextran T-500, 0,05% Kathon, 0,01% Gentamicin, 0,1% Zwittergent 3-14 und HBR-1 zu 1/320. Der pH-Wert wird mit konzentriertem HCl (Milli-Q Wasser wird bei dieser Pufferherstellung verwendet) auf 8,2 eingestellt.
Zugehörige Puffer werden wie folgt hergestellt: LOCI-Prestress-Puffer: Der LOCI-Puffer enthält 10 mm Bis-Tris und einen auf 9,0 eingestellten pH-Wert. LOCI-hcy-Testpuffer (Testpuffer): 50 mm Boratpuffer, 0,3 m NaCl, 0,1% Dextran T-500, 0,05% Kathon, 0,01% Gentamincin, 0,1% Tween-20 und HBR-1 bei einer 1/50 Verdünnung der Vorratslösung. Der pH-Wert wird auf 9,2 eingestellt.
Die Reaktionsbeimischung wird 4 Stunden lang bei 37°C inkubiert und die Kügelchen werden mit 5 ml eines 0,17 M Glycin, 0,1 M NaCl, 10 mg/ml BSA, 10 mm EDTA, pH-Wert 9,2 Puffers 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert, die Kügelchensuspension wird mit 1 × 5 ml Puffer aus 0,17 m Glycin, 0,1 m NaCl, 10 mg/ml BSA, 10 mm EDTA, pH-Wert 9,2, gefolgt von einem 4 × 5 ml LOCI-Puffer gewaschen und bei 4°C in einem 5,0 ml LOCI-Puffer gelagert.
Zugehörige Puffer werden wie folgt hergestellt: LOCI-Prestress-Puffer: Der LOCI-Puffer enthält 10 mm Bis-Tris und einen auf 9,0 eingestellten pH-Wert. LOCI-hcy- Testpuffer (Testpuffer): 50 mm Boratpuffer, 0,3 m NaCl, 0,1% Dextran T-500, 0,05% Kathon, 0,01% Gentamincin, 0,1% Tween-20 und HBR-1 bei einer 1/50 Verdünnung der Vorratslösung. Der pH-Wert wird auf 9,2 eingestellt.
Die nachfolgenden Testprotokolle werden bevorzugt an einem automatisierten Instrument ausgeführt (z.B. einem automatisierten Tecan-1 Instrument), können jedoch ebenso zur Verwendung mit anderen automatisierten Instrumenten oder für nicht automatisierte Zwecke angepasst werden. Der Fachmann wird in der Lage sein, die nachfolgenden Protokolle entsprechend zu modifizieren.
B. Drei-Reagensprotokoll
Eine 50 μl Mischung an hcy-ABA-Sensibilisierungskügelchen (0,1 mg/ml) und 2 mm TCEP werden zu 5 μl hcy-Serumkalibrator in einer Reaktionsküvette hinzugefügt, gefolgt von dem Zusatz von 50 μl Testpuffer. Die Mischung wird 417 Sekunden lang inkubiert. Danach werden 50 μl an 5 mm BABA hinzugefügt, gefolgt von 45 μl Testpuffer. Nach der Inkubation von 157 Sekunden werden 50 μl an Ab-beschichteten Akzeptorkügelchen (zu 0,25–0,5 mg/ml) hinzugefügt. Nach der Inkubation von 154 Sekunden wird die Probe abgelesen.
C. Zwei-Reagensprotokoll
Aufgrund der Unverträglichkeit der Bromacetylbenzoesäure (BABA) mit anderen Reagentien sowohl als auch ihrer beschränkten Löslichkeit und Stabilität wird ebenfalls ein Enolphosphatderivat von CABA (CABA-Phosphat), eine Pro-CABA-Verbindung, untersucht. Ein weiterer Vorteil der Verwendung eines Enolphosphatderivats eines Haloketons als ein Derivatisierungsagens ist die Möglichkeit der Verwendung des Zwei-Reagensprotokolls mit einem automatisierten Instrument, wie z.B. dem in automatisierten LOCI-Tests verwendeten Instrument.
Eine 50 μl Mischung an hcy-ABA-Sensibilisierungskügelchen (0,1 mg/ml) und 2 mm TCEP und 5 mm CABA-Phosphat werden zu 5 μl hcy-Serumkalibrator in einer Reaktionsküvette hinzugefügt, gefolgt von dem Zusatz von 100 μl Testpuffer. Die Mischung wird 417 Sekunden lang inkubiert. Danach wird eine 50 μl Mischung an Ab-beschichteten Akzeptorkügelchen (0,5 mg/ml) und alkalische Phosphatase (1 mg/ml) hinzugefügt, gefolgt von 45 μl Testpuffer. Nach der Inkubation von 157 Sekunden wird die Probe wie in dem Drei-Reagens Standardprotokoll abgelesen.
D. Leistungsverhalten eines Drei-Reagensprotokolls mit BABA:
In dem so genannten Drei-Reagens Testformat werden hcy-Sensibilisierungskügelchen, gemischt mit TCEP, als das erste Reagens verwendet. Ab-beschichtete Akzeptorkügelchen werden als das dritte Reagens verwendet, das nach dem Proben-Derivatisierungsschritt hinzugefügt wird. Dies resultiert in einem gleichmäßigen Wettbewerb zwischen dem löslichen und dem Kügelchen-gebundenen hcy-ABA für Ab an Akzeptorkügelchen im dritten Schritt. Das maximale Signal wird aufgrund der spezifischen Kügelchenaggregation in Abwesenheit von hcy im Serum erhalten. Diese Kügelchenaggregation wird durch hcy in der Serumprobe gehemmt, so daß das Signal umgekehrt proportional zu der Menge an hcy im Serum ist. Homocystein im Puffer wird als Kalibrator verwendet.
Ein LOCI-Homocysteintest wird mit dem automatisierten LOCI-Tecan-Instrument durchgeführt. Die Reagentien und Serumproben werden an diesem Instrument bei 4°C gehalten, der Testpuffer und die Reaktionsküvetten werden jedoch bei 37°C gehalten. Der Test wird bei 37°C durchgeführt und das Drei-Reagensprotokoll wird wie hier beschrieben verwendet, während das Zwei-Reagens Testprotokoll ebenfalls in nachfolgenden Arbeiten mit CABA-Phosphat als ein alternativer Derivatisierungsreagens eingesetzt wird.
Eine Homocystein-Standardkurve wird unter Anwendung von sechs Kalibratoren angelegt, die durch Beimpfung von Homocystein in zusammengefasstes Serum hergestellt werden, welches durch HPLC quantifiziert wird. Über 60% einer Signalmodulation wird unter Verwendung von 2% Serumprobe erhalten (Daten nicht dargestellt). Die Volumen der Reaktionsmischung in verschiedenen Schritten werden für eine maximale Konzentration des Reduktionsmittels optimiert, da dieser Schritt langsamer ist, als der Alkylierungsschritt. Die endgültige Menge an verwendetem TCEP ist niedriger, als das Alkylierungsmittel.
Die Intra-Assay-CVs werden durch Bestimmung der Kalibratoren in Wiederholungen (unter Verwendung der selben Probe) erhalten. Die CVs der Signalmessung und der Konzentrationsbestimmung sind in Tabelle 1 aufgeführt. In Tabelle 1 werden das Drei-Reagens Testprotokoll und das Zwei-Reagens Testprotokoll wie oben beschrieben verwendet.
Die Stabilität von BABA wird an drei verschiedenen pH-Konditionen wie in Tabelle 2 aufgeführt untersucht. In Tabelle 2 wird das Drei-Reagensprotokoll wie zuvor beschrieben verwendet, wobei 5 mm BABA in einem verschiedenen pH-Puffer als R-2 (Reagens 2) gelagert wird.
Die Aktivität von BABA wird durch die Menge an Gesamttestsignalmodulation überwacht, die durch LOCI unter Verwendung des Drei-Reagensprotokolls erhalten wird. Es wird nur eine beschränkte Stabilität von BABA erhalten, auch zu der optimalen Kondition, die bei dem pH-Wert von 6,0 liegt.
E. Leistungsverhalten von CABA-Phosphat als Derivatisierungsagens:
Ein Enolphosphatderivat von CABA wird synthetisiert. CABA-Phosphat ist über einen breiten pH-Bereich hinweg leicht löslich und bleibt inaktiv bis es durch ein Enzym ausgelöst wird, welches an dem definierten Schritt in dem Test hinzugefügt wird. Deshalb ist es potentiell für einen Zwei-Komponententest geeignet. In dem Zwei-Reagensprotokoll ist Reagens-1 (R1) eine Mischung aus hcy-markierten Sensibilisierungskügelchen zu 50 μg/ml, 2 mm TCEP und 5 mm CABA-Phosphat in Testpuffer; Reagens-2 (R-2) besteht aus Ab-beschichteten Akzeptorkügelchen zu 0,1 mg/ml, gemischt mit alkalischer Phosphatase zu 1 mg/ml in Testpuffer. Bei diesem Protokoll werden 50 μl an R1, 5–10 μl der Probe und 50 μl an Testpuffer gemischt und 7 Minuten lang bei 37°C (Schritt 1) inkubiert, dann werden 50 μl an R2 und 100 μl an Testpuffer hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wird weitere 3 Minuten lang inkubiert. Der LOCI-Ablesung wird wie oben beschrieben durchgeführt. Die Standardkurve von hcy-Serumkalibratoren unter Verwendung von CABA-Phosphat als Derivatisierungsagens und das Zwei-Reagensprotokoll werden festgestellt (nicht dargestellt). Über 60% an Signalmodulation wird unter Verwendung von 2% der Serumprobe erhalten.
Das Drei-Reagens Testprotokoll unter Verwendung von CABA-Phosphat als Derivatisierungsagens wird ebenfalls analysiert. Ähnliche Ergebnisse werden mit hcy-Serumkalibratoren erhalten, wie in dem Drei-Reagensprotokoll unter Verwendung von BABA (nicht dargestellt). Die Stabilität von CABA wird ebenfalls untersucht. Die Aktivität von CABA-Phosphat als Derivatisierungsagens wird durch die Menge an Gesamttestsignalmodulation überwacht, die unter Verwendung des Drei-Reagensprotokolls durch LOCI erhalten wird. Wie in Tabelle 3 aufgeführt, weist es eine wesentlich längere Haltbarkeit auf, als BABA. In Tabelle 3 wird das Drei-Reagens Testprotokoll verwendet, wobei CABA-Phosphat bei zwei Temperaturen in einem pH-Wert von 9,0 als R-2 gelagert wird; gemischte hcy-Sensibilisierungskügelchen und TCEP als R-1; gemischte Ab-Akzeptorkügelchen und alkalische Phosphatase als R-3.
F. Korrelationsstudien:
Dasselbe Drei-Reagensprotokoll, das mit BABA sowohl als auch mit CABA-Phosphat als Derivatisierungsagens verwendet wurde, wird auch in dieser Korrelationsstudie verwendet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4-a aufgeführt. Ähnliche Ergebnisse werden mit BABA und auch mit CABA-Phosphat als Derivatisierungsagens unter Verwendung des Drei-Reagensprotokolls durch LOCI wie in Tabelle 4-a gezeigt erhalten. Die Korrelation von LOCI gegenüber HPLC unter Verwendung des Zwei-Reagensprotokolls wird in Tabelle 4-b aufgeführt. Das Zwei-Reagensprotokoll ergibt eine etwas bessere Korrelation mit HPLC, als dem Drei-Reagensprotokoll. Dieses Ergebnis kann auf eine besseren Testgenauigkeit mit dem Zwei-Reagensprotokoll, als mit dem Drei-Reagensprotokoll hindeuten, auch mit dem automatisierten Instrument. Hierdurch wird die Durchführbarkeit eines raschen – und sogar vollautomatisierten – Test auf Antikörperbasis für die hcy-Quantifizierung demonstriert.
TABELLE 1 INTRA-ASSAY GENAUIGKEIT
TABELLE 2 STABILITÄT VON BABA (5 mm) GELAGERT IN VERSCHIEDENEN PH-PUFFERN (NACHWEIS VON HOMOCYSTEIN IN SERUM BEI 2%)
TABELLE 3 STABILITÄT VON CABA-PHOSPHAT GELAGERT BEI ZWEI TEMPERATUREN (5 mm in 50 mm BORATPUFFER pH-WERT 9,0)
TABELLE 4 TESTKORRELATIONSSTUDIEN
Beispiel 3
EIA zur Bestimmung von Homocystein in Serum/Plasma
A. Materialien
Ein Enzym-Immunoassay (EIA) für Homocystein (hcy) wird üblicherweise gemäß Standardverfahren durchgeführt, im Wesentlichen wie folgt. Die nachfolgenden Komponenten können beispielsweise verwendet werden: Nichtbeschichtete Röhrchen; mit Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatten; ein Reduktionsmittel (z.B. TCEP) in Wasser; CABA-Phosphat im Puffer; alkalische Phosphataselösung; eine Lösung aus einem Anti-Homocystein-ABA monoklonalen Antikörper, der mit Biotin konjugiert ist; eine Lösung aus Homocystein-ABA, die auf Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiert ist, HRP-Substratlösung und Spülpuffer. Homocysteinkalibratoren werden bevorzugt durch Beimpfung des zusammengefassten Serums oder Plasmas mit bekannten Konzentrationen des Analyts gemäß Standardprotokollen hergestellt.
B. Verfahren
Zunächst werden 5 μl Serum, Plasmaprobe oder Kalibratorkontrolle mit 10 μl an 10 mm TCEP in Wasser in Probenherstellungsröhrchen gemischt. Die Mischung wird 10 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Als nächstes werden 50 μl an 8 mm CABA-Phosphat (in 0,1 m Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,5) und 50 μl an alkalischer Phosphataselösung (1 mg/ml, im Boratpuffer, pH-Wert 9,2) angesetzt; die Mischung wird 5 Minuten lang bei 37°C inkubiert.
350 μl Boratpuffer (pH-Wert 9,0) werden dann zu der Reaktionsmischung hinzugefügt und 100 μl dieser verdünnten Reaktionsmischung werden dann in eine mit Streptavidin beschichtete Mikrotitervertiefung überführt. Als nächstes werden 25 μl mit einem Anti-ABA-Homocystein monoklonalen Antikörper markiertem Biotin (enthaltend 2 Picomol Antikörper) in jede Mikrotitervertiefung hinzugefügt und die Mischungen werden 20 Minuten lang unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert.
25 μl an HRP-ABA-Homocysteinkonjugat (enthaltend 0,15 μg des Enzymkonjugats) werden zu jeder Reaktionsmischung hinzugefügt und die Mischungen werden weitere 10 Minuten lang unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktionsmischungen werden dann aspiriert und die Mikrotitervertiefungen werden mit 0,05% Tween 20 enthaltendem Phosphatpuffer gewaschen.
Die HRP-Substratlösung (z.B. K-Blue von ELISA Tech.) wird zu den gewaschenen Vertiefungen hinzugefügt und die Farbentwicklung wird nach 10 bis 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur unter Verwendung eines gewerblich erhältlichen Mikrotiterplattenlesers abgelesen. Die Farbentwicklung steht in direkter Beziehung mit der Menge des Enzymkonjugats, das durch die Wechselwirkung mit dem Antikörper an die Mikrotitervertiefung gebunden ist. Die Menge des gebundenen Enzymkonjugats steht umgekehrt in Beziehung mit der Menge an Homocystein in der Probe. Die Bestimmung von Homocystein in der Probe wird aus einer Standardkurve errechnet, die durch die Bestimmung der Kalibratoren (siehe unten) hergestellt wird.
HRP-ABA-Homocysteinkonjugat wird durch ein Verfahren hergestellt, das dem zur Immobilisierung von ABA-Homocystein auf festen Oberflächen beschriebenen Verfahren ähnlich ist. Ein Biotin-markierter monoklonaler Antikörper wird durch Verfahren hergestellt, die dem Fachmann auf dem relevanten Fachgebiet bekannt sind.
Biotinylisierte Antikörper: Ein Anti-Homocystein-ABA monoklonaler Antikörper (z.B. 15C12 von Dade Behring, Deerfield, IL, U.S.A.) oder jeder beliebig geeignete Anti-hcy-ABA-Antikörper wird im Wesentlichen wie folgt biotinylisiert. Insgesamt 7,5 mg (9,75 ml) Aliquot wird gegen 2 × 2 l an 0,1 m NaHCO₃ (pH-Wert 8,0) in kalten Konditionen dialysiert und auf dem Centriprep 30 auf ein Volumen von 4,65 ml konzentriert. Die Konzentration wird durch UV (1,1 mg/ml) mit einer Rückgewinnung von 5,13 mg bestimmt. Eine Gelelektrophorese (z.B. Paragon-Gelelektrophorese) wird verwendet, um die Gegenwart eines Einzelbandes zu bestätigen.
Als nächstes wird Biotinamidhexanoat N-Hydroxysuccinimidester wird in DMSo zu 13 mm aufgelöst und dann zu der Antikörperlösung hinzugefügt, um 5:1, 10:1 und 25:1 Molarverhältnisse zu erhalten. 1,5 mg des Ab wird für jede Herstellung verwendet. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln werden die Reaktionsmischungen gegen 2 × 2 l Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS; 10 mm Na₂HPO₄, 150 mm NaCl, pH-Wert 7,4) in kalten Konditionen dialysiert. Die Konzentration wird durch UV bestimmt. Die Produkte werden mit 0,05% Natriumazid gekühlt gelagert.
Serumkalibratoren: Serumkalibrierungskurven werden mit bekannten Mengen an Homocystein erzeugt, die in die durch zusammengefasste Sera von Normalpersonen (z.B. von 38 Normalpersonen) erzeugte Serumproben geimpft wurden. Die Serumkalibratoren werden entweder mit ausgebeutetem oder unbehandeltem zusammengefassten Serum hergestellt. Die Homocysteinkonzentration wird vor und nach der Behandlung durch HPLC, z.B. in einem Referenzlabor, bestätigt.

Claims

Kit zur Verwendung in einem Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung der Menge an Homocystein in einer Probe, wobei der Kit in abgepackter Kombination ein erstes Reagens, das ein geschütztes Alkylierungsreagens umfaßt, welches CABA(α-Chloracetylbenzoesäure)-Enolphosphat oder BABA(α-Bromacetylbenzoesäure)-Enolphosphat enthält und in entschützter Form zur chemischen Modifikation von Homocystein unter Bildung von modifiziertem Homocystein fähig ist, ein zweites Reagens, das eine alkalische Phosphatase als Aktivierungsreagens umfaßt und zur Entschützung des geschützten Alkylierungsreagens fähig ist, und ein drittes Reagens, das zur spezifischen Bindung an das modifizierte Homocystein fähig ist, jeweils in einer Menge, die zur Durchführung wenigstens eines Tests ausreicht, umfaßt.
Kit nach Anspruch 1, wobei das erste Reagens ferner ein Homocysteindisulfidreduktionsmittel umfaßt.
Kit nach Anspruch 1, wobei das erste Reagens ferner eine mit modifiziertem Homocystein beschichtete Feststoffmatrix umfaßt.
Kit nach Anspruch 3, wobei die Feststoffmatrix Latex- oder Glasskügelchen umfaßt.
Kit nach Anspruch 1, wobei das zweite Reagens ferner eine mit einem zur spezifischen Bindung von modifiziertem Homocystein fähigen Rezeptor beschichtete Feststoffmatrix umfaßt.
Kit nach Anspruch 5, wobei es sich bei dem Rezeptor um einen Antikörper oder um ein immunologisch aktives Fragment davon handelt.
Kit nach Anspruch 3 oder 5, wobei die Matrix ferner ein daran befestigtes signalgebendes Agens enthält.
Kit nach Anspruch 7, wobei das signalgebende Agens einen chemilumineszierendes Agens, ein fluoreszierendes Agens oder ein chromogenes Agens umfaßt.
Verfahren zur Herstellung molekularer Konjugate, das die folgenden Schritte umfaßt: (a) Markieren eines ersten Moleküls mit einem geschützten Alkylierungsreagens, das CABA(α-Chloracetylbenzoesäure)-Enolphosphat oder BABA(α-Bromacetylbenzoesäure)-Enolphosphat enthält; (b) Versetzen des markierten ersten Moleküls mit einem zweiten Molekül, wobei das zweite Molekül eine oder mehrere daran gebundene nukleophile Gruppen sowie als Enzym zum Starten einer Kupplungsreaktion eine alkalische Phosphatase enthält.
Verfahren zur Bestimmung von Homocystein in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie Homocystein enthält, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: (a) Zusammengeben (1) der Probe, (2) eines ersten Reagens, das ein geschütztes Alkylierungsreagens umfaßt, welches CABA(α-Chloracetylbenzoesäure)-Enolphosphat oder BABA(α-Bromacetylbenzoesäure)-Enolphosphat enthält und zur chemischen Modifikation der Sulfhydrylgruppen des Homocysteins unter Bildung von modifiziertem Homocystein aktiviert werden kann, und (3) eines zweiten Reagens, das einen Liganden umfaßt, der zur spezifischen Bindung an das modifizierte Homocystein unter Bildung eines Immunkomplexes fähig ist, und (4) eines dritten Reagens, das eine alkalische Phosphatase umfaßt und zur Aktivierung des geschützten Alkylierungsreagens fähig ist, in einem wässrigen Medium; (b) Messen der Menge des Immunkomplexes, wobei dessen Menge mit der Menge an Homocystein in der Probe in Beziehung steht.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das erste Reagens ferner ein Disulfidreduktionsmittel umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das erste Reagens ferner eine mit hcy-ABA beschichtete Feststoffmatrix umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das erste Reagens ferner eine mit einem zur Bindung von modifiziertem Homocystein fähigen Rezeptor beschichtete Feststoffmatrix umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Feststoffmatrix Latex- oder Glasskügelchen umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Feststoffmatrix eine Mikrotiterplatte umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei es sich bei dem Rezeptor um einen Antikörper oder um ein immunologisch aktives Fragment eines Antikörpers handelt.
Verfahren zur Bestimmung von Homocystein in einer Probe, wobei das Homocystein wenigstens zu einem Teil in der Disulfidform vorliegt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: (a) Herstellen eines Ansatzes, umfassend: (1) die Probe, (2) ein Freisetzungsmittel zur Freisetzung des Homocysteins aus der Disulfidform, (3) ein geschütztes Alkylierungsreagens, welches CABA(α-Chloracetylbenzoesäure)-Enolphosphat oder BABA(α-Bromacetylbenzoesäure)-Enolphosphat enthält und zur chemischen Modifikation der Sulfhydrylgruppen des Homocysteins unter Bildung von modifiziertem Homocystein aktiviert werden kann, und (4) einen Rezeptor, der zur spezifischen Bindung an das modifizierte Homocystein unter Bildung eines Immunkomplexes fähig ist, und (5) ein Aktivierungsreagens, das eine alkalische Phosphatase enthält und zur Entschützung des geschützten Alkylierungsreagens fähig ist; (b) Untersuchen des Mediums hinsichtlich der Menge des Immunkomplexes, wobei dessen Menge mit der Menge an Homocystein in der Probe in Beziehung steht.
Verwendung (a) eines Vorläufermoleküls von geschützten Alkylierungsreagentien, die CABA(α-Chloracetylbenzoesäure)-Enolphosphat oder BABA(α-Bromacetylbenzoesäure)-Enolphosphat enthalten, wobei das Vorläufermolekül zur Modifikation von Homocystein fähig ist, und (b) eines Enzyms, wie beispielsweise einer alkalischen Phosphatase, das zur Umwandlung des Vorläufermoleküls in die Reagentien fähig ist, in einem Verfahren zur Bestimmung der Menge an Homocystein in einer Probe.