WO2021100841A1 - ２５ヒドロキシビタミンｄ測定試薬及び２５ヒドロキシビタミンｄ測定方法 - Google Patents

２５ヒドロキシビタミンｄ測定試薬及び２５ヒドロキシビタミンｄ測定方法 Download PDF

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WO2021100841A1
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vitamin
reagent
measuring
antibody
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光章 山本
美恵子 大田
朋久 西尾
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積水メディカル株式会社
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    • G01N33/82—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving vitamins or their receptors
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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    • G01N2470/00—Immunochemical assays or immunoassays characterised by the reaction format or reaction type
    • G01N2470/10—Competitive assay format

Definitions

  • the present invention relates to a 25-hydroxyvitamin D measuring reagent and a 25-hydroxyvitamin D measuring method.
  • the present invention relates to a 25-hydroxyvitamin D measuring reagent and a 25-hydroxyvitamin D measuring method based on a competitive immunoassay.
  • Vitamin D is an important substance that has many meanings in the biological processes of the human and animal bodies. Physiologically active vitamin D is known to regulate calcium absorption from the intestinal tract and bone calcification in particular. It also has the effect of increasing the calcium concentration in serum. Vitamin D deficiency or excess is known to have various consequences, and in particular, vitamin D deficiency is known to lead to serious diseases such as osteoporosis and rickets. Therefore, the quantification of vitamin D in the body is important for revealing potential deficiency or excess.
  • Vitamin D exists in the living body in two forms, namely vitamin D2 (ergocalciferol) and vitamin D3 (choleciferol) shown in FIG.
  • Vitamin D2 is an extrinsic vitamin D obtained from food
  • vitamin D3 is an endogenous vitamin D produced by the action of the ultraviolet rays of sunlight on the skin.
  • These vitamin Ds bind to vitamin D-binding proteins and are transported to the liver by this protein, where the carbon at position 25 is hydroxylated to 25 hydroxyvitamin D (25 (OH) VD).
  • part of the carbon at the 1-position is hydroxylated in the kidney to produce the active form 1,25 (OH) 2 VD.
  • vitamin D2 or vitamin D3 may be referred to as 25 hydroxyvitamin D2 or 25 hydroxyvitamin D3 (hereinafter, 25 (OH) VD2 and 25 (OH) VD3, respectively. These are collectively referred to as 25 hydroxy. It is metabolized to vitamin D (hereinafter sometimes referred to as 25 (OH) VD)). After that, 25 (OH) VD2 or 25 (OH) VD3 becomes 1,25 dihydroxyvitamin D2 or 1,25 dihydroxyvitamin D3 (hereinafter, simply 1,25 (OH) 2 D2, 1,25 (OH) 2 D3, respectively. , Collectively as 1,25 (OH) 2 VD). Among these metabolites, 25 (OH) VD, which is stable, is a useful index because it reflects the vitamin D sufficiency state in blood well.
  • “Lumipulse (registered trademark) 25-hydroxyvitamin D” is known as a reagent for a method for measuring 25 (OH) VD in serum or plasma by chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA method).
  • CLIA method chemiluminescent enzyme immunoassay
  • the method comprises a first reaction of forming an immune complex with anti-25 (OH) VD monoclonal antibody-bound ferrite particles and 25 (OH) VD in a sample, and enzyme-labeled anti-25 (OH) VD immunity with the complex.
  • This method requires a washing step after the first reaction and after the second reaction, respectively, and the step is complicated.
  • Patent Document 1 discloses an immunoassay of 25 (OH) VD using a disposable cone.
  • the method mixes the pretreated sample with an enzyme-labeled anti-vitamin D antibody in a well, incubates, then transfers to a vitamin D-immobilized cone for further incubation.
  • the antigen 25 (OH) VD in the sample and vitamin D immobilized on the cone compete with the antibody site of the enzyme-labeled anti-vitamin D antibody, and the unimmobilized product is removed by washing to remove the cone.
  • a complex of immobilized vitamin D and an enzyme-labeled anti-vitamin D antibody can be detected. Since the concentration of the complex is inversely proportional to the antigen concentration in the sample, 25 (OH) VD in the sample can be calculated.
  • this method also requires a cleaning step, and the step is complicated as described above.
  • the latex immunoturbidimetry method (hereinafter sometimes referred to as LTIA) is a method for measuring a test substance using latex particles on which an antigen or antibody is immobilized, and is widely used in the field of clinical examination. ..
  • LTIA latex particles on which an antibody against a test substance is immobilized are reacted with an antigen, which is a test substance, to form a sandwich-type immune complex, and aggregation of the latex particles accompanying the formation of the immune complex is performed.
  • sandwich LTIA sandwich LTIA
  • test substance synthetic antigen and an antigen
  • the formation of an immune complex between the latex particle and the antigen (test substance) is inhibited, and the test substance is based on the degree of inhibition of aggregation (inhibition of aggregation) of the latex particle accompanying the inhibition of formation of the immune complex. It can be roughly classified into a method for measuring (antigen) (hereinafter, may be referred to as competitive LTIA, etc.).
  • An object of the present invention is to provide a method and a measuring reagent for measuring 25 (OH) VD by competing LTIA. As a result, it is also an object to provide a method and a measurement reagent for measuring 25 (OH) VD based on a competitive immunoassay as well as a competitive LTIA.
  • the inventors prepared a polyvalent antigen in which two or more 25 (OH) VDs were bound to carriers such as proteins, and the maximum aggregation was achieved when the 25 (OH) VD concentration in blood was zero.
  • the measurement by competing LTIA so that the amount of agglutination decreased as the concentration of 25 (OH) VD in the blood increased. That is, a measurement system using a two-reagent kit containing the polyvalent antigen in the first reagent and an anti-25 (OH) VD antibody sensitized latex in the second reagent was examined.
  • a derivatized 25 (OH) VD to be measured was used as the multivalent antigen, the detection sensitivity was not sufficiently satisfactory.
  • the present invention has the following configuration. ⁇ 1> A reagent for measuring 25-hydroxyvitamin D based on a competitive immunoassay, which comprises at least the following constitution.
  • Vitamin D derivative represented by the following chemical formulas (I) and / or (II) Anti-25 hydroxyvitamin D antibody
  • A represents a tracer group capable of chemically binding to a carrier with high affinity.
  • X indicates a hydrocarbon group having a chain length of 3 to 20 which is not substituted or is substituted with a hetero atom.
  • the A is an amino group, a carboxyl group, a sulfhydryl group, biotin, digoxygenin, tyrosine, tyrosine substituted with FITC, a substituted amino acid, an amino acid and a peptide sequence, FITC, proteins and peptides, A protein, G protein, vitamin.
  • the 25-hydroxyvitamin D measurement reagent according to ⁇ 1> which is selected from D derivatives.
  • ⁇ 3> The above-mentioned ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein two or more vitamin D derivatives represented by the chemical formula (I) or (II) are bound to a carrier via A to form a polyvalent antigen.
  • ⁇ 4> The reagent for measuring 25 hydroxyvitamin D according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, which is a competitive immunoassay in which the measurement principle of the competitive immunoassay is selected from RIA, EIA, LTIA, and CLEIA.
  • ⁇ 5> The reagent for measuring 25 hydroxyvitamin D according to ⁇ 4>, wherein the competitive immunoassay is a competitive latex immunoturbidimetry (competitive LTIA).
  • 25-hydroxyvitamin D is the sum of 25-hydroxyvitamin D2 and 25-hydroxyvitamin D3, vitamin D derivatives are vitamin D2 derivatives and / or vitamin D3 derivatives, and anti-25-hydroxyvitamin D antibodies are anti-25-hydroxyvitamin D2 and /
  • the 25-hydroxyvitamin D measurement reagent according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, which is an anti-25-hydroxyvitamin D3 antibody.
  • ⁇ 7> The reagent for measuring 25 hydroxyvitamin D according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein the vitamin D3 derivative is a compound represented by the following chemical formula (III).
  • ⁇ 8> The reagent for measuring 25 hydroxyvitamin D according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, wherein either (1) or (2) is immobilized on an insoluble carrier.
  • ⁇ 9> The reagent for measuring 25 hydroxyvitamin D according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>, which is a reagent for an automatic analyzer.
  • a 25-hydrochivitamin D measuring method based on a competitive immunoassay which comprises at least the following steps.
  • A represents a tracer group capable of chemically binding to a carrier with high affinity.
  • X indicates a hydrocarbon group having a chain length of 3 to 20 which is not substituted or is substituted with a hetero atom.
  • A is an amino group, a carboxyl group, a sulfhydryl group, biotin, digoxygenin, tyrosine, tyrosine substituted with FITC, substituted amino acid, amino acid and peptide sequence, FITC, protein and peptides, A protein, G protein, vitamin D.
  • 25-hydroxyvitamin D is the sum of 25-hydroxyvitamin D2 and 25-hydroxyvitamin D3, vitamin D derivatives are vitamin D2 derivatives and / or vitamin D3 derivatives, and anti-25-hydroxyvitamin D antibodies are anti-25-hydroxyvitamin D2 and /
  • ⁇ 17> The 25-hydroxyvitamin D measuring method according to any one of ⁇ 10> to ⁇ 16>, wherein either (1) or (2) is immobilized on an insoluble carrier.
  • ⁇ 18> The 25-hydroxyvitamin D measuring method according to any one of ⁇ 10> to ⁇ 17>, which is measured using an automatic analyzer.
  • ⁇ 19> A multivalent antigen used in the 25-hydrochivitamin D3 measurement method based on a competitive immunoassay, in which a vitamin D3 derivative represented by the following chemical formula (III) is immobilized on a carrier.
  • competitive LTIA allows measurement of 25 (OH) VD in a sample even at low concentrations.
  • the state of the 25 (OH) VD concentration in the patient sample can be accurately grasped, which can contribute to grasping the pathological condition.
  • the competitive LTIA can be performed by an automatic analyzer which is a general-purpose instrument, it has become possible to measure a large number of samples in a short time.
  • the concentration of hydroxyvitamin D in the sample is lower by using the polyvalent antigen of the present invention. It is possible to measure up to the area.
  • the effect of improving the reproducibility of measurement can be expected even in a low concentration region that has already been measurable.
  • the method for measuring 25 (OH) VD of the present invention is a measuring method based on a competitive immunoassay and includes at least the following steps (1) and (2).
  • (1) In the presence of the vitamin D derivative represented by the following chemical formulas (I) and / or (II), a sample and an anti-25 hydroxyvitamin D antibody (hereinafter, sometimes referred to as an anti-25 (OH) VD antibody) are used.
  • Step of contact (2) Step of measuring the degree of inhibition of the antigen-antibody reaction between the vitamin D derivative and the anti-25 (OH) VD antibody according to the 25 (OH) VD concentration in the sample.
  • A represents a tracer group capable of chemically binding to a carrier with high affinity.
  • X indicates a hydrocarbon group having a chain length of 3 to 20 which is not substituted or is substituted with a hetero atom.
  • Examples of the measurement principle of the competitive immunoassay include RIA, EIA, LTIA, and CLEIA. It is desirable that either the vitamin D derivative or the anti-25 (OH) VD antibody is immobilized on an insoluble carrier.
  • a configuration in which a multivalent antigen immobilized on a carrier such as a protein is formed is typical.
  • a case where a vitamin D derivative that forms a multivalent antigen is used will be described.
  • ⁇ Reagent configuration example> (1-1) Antibody sensitization system Anti-25 (OH) VD antibody-immobilized latex particles Multivalent antigen with vitamin D derivative immobilized on a carrier (1-2) Antigen sensitization system Free anti-25 (OH) ) VD antibody (secondary antibody may be added) Latex particles on which a vitamin D derivative is immobilized A secondary antibody may be added to the test solution containing the free anti-25 (OH) VD antibody.
  • ⁇ Reagent configuration example> (3-1) Antibody sensitization system Magnetic particles on which anti-25 (OH) VD antibody is immobilized Labeled polyvalent antigen with vitamin D derivative immobilized on a carrier (3-2) Antigen sensitization system Labeled anti-antibody 25 (OH) VD antibody Magnetic particles on which a vitamin D derivative is immobilized (or magnetic particles on which a polyvalent antigen on which a vitamin D derivative is immobilized on a carrier is immobilized)
  • the origin of the sample is not particularly limited, and it may be an environmental sample or the like as well as a biological sample derived from an organism.
  • Organisms from which biological samples are derived include, for example, mammals (eg, humans, monkeys, mice, rats, rabbits, cows, pigs, horses, goats, sheep), birds (eg, chickens) and other animals and insects. , Microorganisms, plants, fungi, and fish, preferably mammals, fungi, and fish, more preferably mammals, and even more preferably humans.
  • the biological sample may be blood itself or a blood-derived sample such as whole blood, serum, plasma, saliva, urine, milk, tissue or cell extract, or a mixture thereof. Of these, blood-related samples are preferable.
  • Examples of environmental samples include samples derived from soil, seawater, and freshwater. The sample may be appropriately diluted or filtered before use.
  • the measurement target is 25-hydroxyvitamin D (25 (OH) VD) hydroxylated at the 25-position. That is, 25 (OH) VD2, 25 (OH) VD3, or the sum of these is all measured.
  • 25 hydroxyvitamin D (25 (OH) VD) means that 25 (OH) VD2, 25 (OH) VD3, or the sum of these is included unless otherwise specified. is there.
  • the vitamin D derivative of the present invention is a vitamin D2 derivative and / or a vitamin D3 derivative
  • the anti-25 hydroxyvitamin D antibody is an anti-25 hydroxyvitamin D2 and / or an anti-25 hydroxyvitamin D3 antibody. .. Each vitamin D derivative and anti-25 hydroxyvitamin D antibody will be described later.
  • the vitamin D derivative in the present invention refers to a derivative that has been chemically modified to bind vitamin D to the carrier surface, and corresponds to a vitamin D to which a hydrocarbon group and a tracer are bound.
  • Examples of the vitamin D3 derivative and the vitamin D2 derivative include compounds represented by the following general formulas (I) and (II).
  • A represents a tracer group capable of chemically binding to a carrier with high affinity.
  • A is an amino group, a carboxyl group, a sulfhydryl group (-SH), biotin, digoxigenin, tyrosine, tyrosine substituted with FITC, substituted amino acids, amino acids and peptide sequences, FITC, peptides.
  • X indicates a hydrocarbon group having a chain length of 3 to 20 which is not substituted or is substituted with a hetero atom. Examples of heteroatoms include atoms such as S, O, N, and P.
  • carriers include proteins and insoluble carriers. Examples of the insoluble carrier include metallic particles, latex particles, and plates, and examples of the protein include BSA and vitamin D-binding protein.
  • A can be attached to the carrier by using an amino group, a carboxyl group, or a sulfhydryl group as the terminal structure.
  • an amino group, a carboxyl group, or a sulfhydryl group can be chemically bonded to any carrier protein by activating it with a further known "protein cross-linking agent" or "labeling agent".
  • proteins cross-linking agent or "labeling agent”.
  • Examples of the above-mentioned protein cross-linking agent and labeling agent include biotin labeling agent, divalent reagent, protein labeling reagent, derivatizing reagent for HPLC, and the like. Can be mentioned.
  • (I) Method for converting carboxylic acid to carbodiimide This is a method for activating with reagents such as DCC (Dicyclohexylcarbodiimide) and EDC (1-Etyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide.
  • the carrier is an insoluble carrier or metallic particles
  • the measurement sensitivity of the competitive immunoassay is considered to depend on the balance between the affinity of the antibody for the measurement target (free 25 (OH) VD in the sample) and the affinity for the polyvalent antigen.
  • the affinity for the free antigen 25 (OH) VD is relatively increased, and the low concentration of the free antigen 25 (OH) VD is used. Even if there is, it is considered that detection has become possible.
  • those skilled in the art will use a polyvalent antigen having the same structure as the free antigen 25 (OH) VD at least in the epitope portion as the competing multivalent antigen. It was surprising that the detection sensitivity increased as a result of trying to use the body.
  • the affinity of the anti-25 (OH) VD antibody for the polyvalent antigen is intentionally lowered, and the affinity for the free antigen 25 (OH) VD is relatively increased, so that the low concentration region is released. Since the action of enabling the detection of antigen 25 (OH) VD is an action that can be applied not only to competitive immunoassays but also to competitive immunoassays in general, application to competitive immunoassays is also included in the scope of the present invention.
  • the multivalent antigen used in the present invention refers to one in which two or more vitamin D derivatives of the present invention are bound to the surface of a carrier.
  • the vitamin D derivative as the multivalent antigen of the present invention is a VD3 derivative represented by the formula (I), a VD2 derivative represented by the formula (II), or a combination thereof, depending on the affinity of the anti-25 hiroxyvitamin D antibody used for measurement. Can be mentioned.
  • the carrier used for the polyvalent antigen is not particularly limited, but a polymer is preferable, and specifically, bovine serum albumin (BSA), keyhole limpet hemocyanin (KLH), blue carrier protein (BCP), and ovalbumin. Examples include proteins such as (OVA). In particular, BSA is preferable in the present invention.
  • Preprocessing 25 (OH) VD is known to be tightly bound to binding protein (DBP) in the blood. Therefore, in order to accurately measure 25 (OH) VD using the antigen-antibody reaction, a dissociation operation (pretreatment) between vitamin D and DBP is required.
  • a pretreatment it is desirable to pretreat by a well-known method such as a denaturing agent such as an acid, a protein denaturing agent, a surfactant, a hydrolase, or an organic solvent.
  • a denaturing agent such as an acid, a protein denaturing agent, a surfactant, a hydrolase, or an organic solvent.
  • operations such as centrifugation, extraction, filtration, precipitation, heating, freezing, refrigeration, and stirring may be performed as necessary.
  • the anti-25 (OH) VD antibody includes a polyclonal antibody or a monoclonal antibody against a 25 (OH) VD or a 25 (OH) VD derivative to be measured, as well as functional fragments thereof. That is, when the measurement target is 25 (OH) VD2, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody against a 25 (OH) VD2 or a 25 (OH) VD2 derivative, as well as functional fragments thereof can be mentioned.
  • the measurement target is 25 (OH) VD3
  • a polyclonal antibody or a monoclonal antibody against a 25 (OH) VD3 or a 25 (OH) VD3 derivative, as well as functional fragments thereof can be mentioned.
  • the measurement target is the sum of 25 (OH) VD2 and 25 (OH) VD3, either 25 (OH) VD2 or 25 (OH) VD2 derivative, and 25 (OH) VD3 or 25 (OH) VD3.
  • functional fragments thereof can be mentioned.
  • the polyclonal antibody is a subject purified by immunizing an animal with a 25 (OH) VD or 25 (OH) VD derivative bound to a carrier protein as an immunogen and obtaining the serum of this animal. It can be obtained by recovering the antibody and separating the target antibody from the other components of the serum.
  • a carrier protein BSA, KLH (Bovine limpet hemocyanin) and the like can be used.
  • the monoclonal antibody can be obtained by a hybridoma technique well known to those skilled in the art, or may be a recombinant antibody obtained by genetic engineering using a technique well known to those skilled in the art.
  • Examples of the functional fragment of the antibody include F (ab') 2 , Fab', which are fragments having an antigen-antibody reaction activity. Functional fragments of these antibodies can be produced by treating the full-length antibody thus obtained with a proteolytic enzyme (eg, pepsin, papain, etc.).
  • a proteolytic enzyme eg, pepsin, papain, etc.
  • the insoluble carrier used in the present invention may be an insoluble carrier that can carry an anti-25 (OH) VD antibody or a polyvalent antigen and can measure 25 (OH) VD in the sample by contacting the sample.
  • examples include solid phases such as particles and plates.
  • the particles include latex particles, magnetic particles, metal particles and the like.
  • Latex particles examples of the latex particles used in the competitive LTIA of the present invention include polystyrene, styrene-styrene sulfonate copolymer, methacrylic acid polymer, acrylic acid polymer, acrylonitrile butadiene styrene copolymer, vinyl chloride-acrylic acid ester. Examples thereof include copolymers and polyvinyl acetate acrylates.
  • the average particle size of the latex particles is appropriately selected from 50 ⁇ m to 400 ⁇ m in consideration of the concentration of the test substance in the test sample, the detection sensitivity of the measuring device, and the like.
  • an insoluble carrier on which an antigen or antibody is immobilized As a method for immobilizing an antigen or antibody on an insoluble carrier such as latex particles, either a physical adsorption (hydrophobic bond) method or a chemical bond method is appropriately used depending on the characteristics of the antigen or antibody to be immobilized. You can choose.
  • a binding functional group such as a maleimide group is introduced into the antibody, and when the antigen or antibody has a sugar, it is used to bind to and immobilize the binding functional group on the surface of the insoluble carrier. can do.
  • composition of the reagent for competing LTIA of the present invention is as described above, but a more specific composition will be described.
  • immobilizing an antibody on latex it contains at least the following (1) and (2). It is desirable that (1) and (2) have a structure divided into a first reagent and a second reagent.
  • (1) and (2) are exemplified in the case of being in a solution state, it is also possible to make a dried product at the time of storage. do it.
  • a kit may include a plurality of reagent configurations.
  • a solution containing a polyvalent antigen (vitamin D derivative-carrier complex) in which a vitamin D derivative is immobilized on a carrier (sometimes referred to as a first reagent solution).
  • a carrier sometimes referred to as a first reagent solution.
  • Latex particle solution on which anti-25 (OH) VD antibody is immobilized (sometimes referred to as latex test solution, second test solution, etc.)
  • the reagent composition of the present invention may include the following (3), (4) and (5).
  • Standard substance for concentration conversion sometimes called by a name such as a calibrator
  • a solution for dissolving or diluting a standard substance for concentration conversion (sometimes referred to as a calibrator diluent)
  • the antigen When the antigen is immobilized on the latex, it contains at least the following (i) and (ii), and other than that, it is the same as the case where the antibody is immobilized on the latex.
  • (I) Solution containing anti-25 (OH) VD antibody (sometimes referred to as the first reagent solution)
  • IIi When it is called a latex particle solution in which a vitamin D derivative is directly immobilized, or a latex particle solution in which a polyvalent antigen in which a vitamin D derivative is immobilized on a carrier is immobilized (latex test solution, second test solution, etc.) There is)
  • the measurement of the aggregation signal in the competitive LTIA may be any method usually used for the measurement of the aggregation inhibition reaction, and is evaluated by the absorbance ratio, the number of particles, the particle size (the size increases when aggregated), and the scattered light. Means that can be used by those skilled in the art such as measurement and measurement of absorption spectrum (increase or shift when aggregated) can be mentioned. In addition, optical detection can be replaced by electrochemical detection to the extent possible.
  • a reagent containing a polyvalent antigen carrying a plurality of vitamin D derivatives and latex particles carrying an anti-25 (OH) VD antibody is added to a sample containing 25 (OH) VD to be measured, and the temperature is constant at a constant temperature. Warm for a period of time, measure the absorbance during this period, detect the amount of change in absorbance, and calculate the concentration of 25 (OH) VD in the test sample from a line using a standard solution whose concentration is known in advance. Can be done.
  • the absorbance having a wavelength of 500 to 900 nm is usually used, and the amount of change in the absorbance during the reaction is generally used for quantification.
  • the measurement range using the present invention can be appropriately set to a desired measurement range in consideration of the type of measurement target, the avidity of the binding partner, the amount ratio of the binding partner and the multivalent antigen, and the like.
  • the measurement of 25 (OH) VD in the sample of the present invention may be carried out by a manual method, or may be carried out by using a device such as a measuring device.
  • the measuring device may be a general-purpose automatic analyzer or a dedicated measuring device (dedicated machine).
  • the competitive LTIA can be carried out by a general-purpose automatic analyzer, and can also be carried out by a method performed by a plurality of operation steps such as a two-step method (two-reagent method).
  • two-reagent method two-reagent method
  • Example 1 Preparation of vitamin D3 derivative-BSA complex (1) Bovine serum albumin (BSA) was dissolved in 0.1 M Bicine buffer at 1.0 mg / mL and dialyzed against the same buffer. (2) The vitamin D3 derivative was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) at a concentration of 10 mg / mL. This was added to the BSA solution of (1) in an amount of 1/30 (v / v), and the mixture was stirred with a vortex. (3) Incubated at room temperature for 2 hours in the dark. (4) 1 M Tris-HCl pH 8.0 was added in an amount of 1/10 (v / v) of the total amount, and the mixture was stirred with vortex to stop the reaction to obtain a vitamin D3 derivative-BSA complex.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Example 1 Preparation of 25 (OH) VD3 Derivative-BSA Complex The same procedure was carried out in Example 1 (2) except that the 25 (OH) VD3 derivative was used instead of the vitamin D3 derivative. ) A VD3 derivative-BSA complex was prepared.
  • the culture supernatant was dispensed at 50 ⁇ L / well and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • 50 ⁇ L / well of HRP-labeled goat anti-mouse polyclonal antibody diluted 10000 times with 1% BSA-PBST solution was dispensed and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • the orthophenylenediamine color-developing solution was dispensed at 50 ⁇ L / well and allowed to stand at room temperature for 10 minutes.
  • the reaction terminator was dispensed at a rate of 50 ⁇ L / well, the absorbance at a wavelength of 492 nm was measured, and a strain having a high absorbance was selected.
  • vitamin D2, vitamin D3, 25 (OH) VD2 or 25 (OH) VD3 were dissolved as inhibitory antigens in DMSO at 0, 0.1, 1, and 10 ⁇ g / mL.
  • the solution was added in increments of 25 ⁇ L / well. Further, 25 ⁇ L / well of the culture supernatant was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • 50 ⁇ L / well of HRP-labeled goat anti-mouse polyclonal antibody diluted 10000 times with 1% BSA-PBST solution was dispensed and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • the orthophenylenediamine color-developing solution was dispensed at 50 ⁇ L / well and allowed to stand at room temperature for 10 minutes.
  • the reaction terminator was dispensed at a rate of 50 ⁇ L / well, and the absorbance at a wavelength of 492 nm was measured. Strains with high absorbance when free vitamin D2 and vitamin D3 were used as inhibitory antigens and low absorbance when free 25 (OH) VD2 and 25 (OH) VD3 were used as inhibitory antigens were selected.
  • the obtained antibody-sensitized latex solution was filtered through a filter having a pore size of 0.8 ⁇ m and then diluted so that the absorbance at a wavelength of 600 nm was 3.0 OD to prepare a second reagent having the following composition.
  • Composition of second reagent 5 mM MOPS-NaOH pH 7.0 3.0 OD (600 nm) anti-25 (OH) VD3 antibody sensitized latex 0.05% ProClin300
  • Example 2 I In “Preparation of Reagent”, the reagent was prepared in the same manner except that the vitamin D3 derivative-BSA complex added to the first reagent was changed to the 25 (OH) VD3 derivative-BSA complex. It was measured in the same manner as the “Measurement method" of. The measurement results are shown in Table 2 and FIG. 2 together with the results of Example 2.
  • the concentration of 25 (OH) VD3 required to reduce the measurement sensitivity by 10% is about 55 nM in Example 2 as compared with the case where 25 (OH) VD3 is 0 nM. In Example 2, it was about 150 nM, and the measurement sensitivity was about tripled. Therefore, when the vitamin D3 derivative-BSA complex is used as the multivalent antigen of the 25 (OH) VD measurement reagent by the competitive inhibition method, the competitive reaction is higher than when the 25 (OH) VD3 derivative-BSA complex is used. It was found that the degree of is large and highly sensitive detection is possible.
  • the present invention it has become possible to provide a measurement method and a measurement reagent based on a competitive immunoassay having good sensitivity even when the 25 (OH) VD concentration in a sample is low. Further, when the present invention is applied to a competing LTIA, by applying it to an automatic analyzer which is a general-purpose instrument, 25 (OH) VD measurement of a large amount of sample becomes possible in a short time.

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Abstract

本発明は、競合イムノアッセイにもとづく２５ヒドロキシビタミンＤの測定を行う方法および測定試薬を提供することを課題とする。　本発明は、競合イムノアッセイにもとづく２５ヒドロキシビタミンＤ測定用 試薬であって、少なくとも以下の構成を含む２５ヒドロキシビタミンＤ測定用試薬を提供する。 （１）化学式（Ｉ）及び／又は（II）に示されるビタミンＤ誘導体 （２）抗２５ヒドロキシビタミンＤ抗体　また、特にビタミンＤ誘導体又は抗２５ヒドロキシビタミン抗体がラテックスに固定化された競合ラテックス免疫比濁法（競合ＬＴＩＡ）にもとづくビタミンＤ測定用試薬を提供する。

Description

２５ヒドロキシビタミンＤ測定試薬及び２５ヒドロキシビタミンＤ測定方法
　本発明は、２５ヒドロキシビタミンＤ測定試薬及び２５ヒドロキシビタミンＤ測定方法に関する。特に、競合イムノアッセイにもとづく２５ヒドロキシビタミンＤ測定試薬及び２５ヒドロキシビタミンＤ測定方法に関する。
　ビタミンＤは、ヒトや動物の体の生物学的プロセスにおいて多くの意味を持つ重要な物質である。生理的に活性なビタミンＤは、特に、腸管からのカルシウム吸収及び骨の石灰化を調整することが知られている。また、血清のカルシウム濃度を上昇させる作用も有する。ビタミンＤの欠乏症又は過剰症は、様々な結果をもたらすことが知られており、特に、ビタミンＤ欠乏症は、骨粗鬆症やくる病といった重大な疾病に繋がることが知られている。したがって、体内のビタミンＤの定量は、潜在的な欠乏症又は過剰症を明らかにするために重要である。
　ビタミンＤは生体中において、２種類の形態、すなわち図１で表されるビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）及びビタミンＤ３（コレカルシフェロール）として存在する。
　ビタミンＤ２は、食物から得られる外因性のビタミンＤであり、ビタミンＤ３は、日光の紫外線が皮膚に及ぼす作用により、生成される内因性のビタミンＤである。これらのビタミンＤは、ビタミンＤ結合タンパク質と結合し、このタンパク質によって肝臓に運ばれ、肝臓において２５位の炭素が水酸化され、２５ヒドロキシビタミンＤ（２５（ＯＨ）ＶＤ）となる。さらに一部は腎臓において１位の炭素が水酸化され、活性型である１，２５（ＯＨ）２ＶＤが生成する。
　上記のビタミンＤの生体内で行われる２段階の代謝を図１をもとに説明する。最初の段階でビタミンＤ２又はビタミンＤ３は、２５ヒドロキシビタミンＤ２又は２５ヒドロキシビタミンＤ３（以下、それぞれ２５（ＯＨ）ＶＤ２、２５（ＯＨ）ＶＤ３と表記することがある。これらを、総称して２５ヒドロキシビタミンＤ（以下、２５（ＯＨ）ＶＤと表記することがある））に代謝される。その後、２５（ＯＨ）ＶＤ２又は２５（ＯＨ）ＶＤ３は、１，２５ジヒドロキシビタミンＤ２又は１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３（以下、単にそれぞれ１，２５（ＯＨ）２Ｄ２、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３、総称して１，２５（ＯＨ）２ＶＤと表記することがある）に代謝される。
　これらの代謝産物の中でも安定な２５（ＯＨ）ＶＤは、血中におけるビタミンＤの充足状態を良く反映することから有用な指標となる。
　ここで、２５（ＯＨ）ＶＤの測定方法としては以下に挙げる方法が知られている。
　「ルミパルス(登録商標）２５－ヒドロキシビタミンＤ」は、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）により、血清又は血漿中の２５（ＯＨ）ＶＤを測定する方法の試薬として知られている。本方法は、抗２５（ＯＨ）ＶＤモノクローナル抗体結合フェライト粒子とサンプル中の２５（ＯＨ）ＶＤによる免疫複合体を形成する第１の反応と、前記複合体と酵素標識抗２５（ＯＨ）ＶＤ免疫複合体モノクローナル抗体による免疫複合体を形成する第２の反応を経て、酵素反応により発光量を測定することにより、サンプル中の２５（ＯＨ）ＶＤ濃度を測定する方法である。本方法は、第１の反応の後、及び第２の反応の後にそれぞれ洗浄工程が必要であり工程が複雑である。
　また、特許文献１には、使い捨てコーンを使用した２５（ＯＨ）ＶＤの免疫アッセイが開示されている。本方法は、前処理された試料と酵素標識抗ビタミンＤ抗体をウエル中で混合し、インキュベーションし、その後、ビタミンＤが固定化されたコーンに移し、さらにインキュベーションする。この間に、試料中の抗原である２５（ＯＨ）ＶＤとコーンに固定化されたビタミンＤが酵素標識抗ビタミンＤ抗体の抗体部位に対して競合し、洗浄により非固定化物を除去することでコーンに固定化されたビタミンＤと酵素標識抗ビタミンＤ抗体の複合体を検出できる。当該複合体の濃度は、試料中の抗原濃度に反比例することから試料中の２５（ＯＨ）ＶＤを算出することができる。しかし、本方法も洗浄工程が必要であり前記同様に工程が複雑である。
特表2016-531306号公報
　従来の２５（ＯＨ）ＶＤの測定方法は、上述のとおり、工程が複雑であり、洗浄工程が不要なホモジーニアス測定法であるラテックス免疫比濁法にもとづく方法は存在しなかった。
　ラテックス免疫比濁法（以下、ＬＴＩＡということがある）とは、抗原あるいは抗体を固定化したラテックス粒子を用いて、被検物質を測定する方法であり、臨床検査の分野で広く使用されている。ＬＴＩＡには、被検物質に対する抗体を固定化したラテックス粒子と、被検物質である抗原とを反応させ、サンドイッチ型の免疫複合体を形成させ、免疫複合体形成に伴う当該ラテックス粒子の凝集の程度から被検物質（抗原）を測定する方法（以下、サンドイッチＬＴＩＡということがある）と、抗体を固定化したラテックス粒子存在下、合成抗原と被検試料中の抗原（被検物質）とを競合させることにより、当該ラテックス粒子と抗原（被検物質）との免疫複合体の形成を阻害し、免疫複合体の形成阻害に伴う当該ラテックス粒子の凝集阻害（凝集阻止）の程度から被検物質（抗原）を測定する方法（以下、競合ＬＴＩＡ、などということがある）に大別することができる。
　本発明は、競合ＬＴＩＡにより２５（ＯＨ）ＶＤの測定を行う方法及び測定試薬を提供することを課題とする。ひいては、競合ＬＴＩＡに限らず競合イムノアッセイにもとづく２５（ＯＨ）ＶＤの測定を行う方法及び測定試薬を提供することをも課題とする。
　発明者らは、競合ＬＴＩＡでは、タンパク質などのキャリアに２５（ＯＨ）ＶＤを２つ以上結合させた多価抗原を調製し、血液中の２５（ＯＨ）ＶＤ濃度がゼロのときに最大の凝集が生じる状態とし、血液中の２５（ＯＨ）ＶＤ濃度増加とともに凝集量が減るような競合ＬＴＩＡによる測定について検討を行った。すなわち、第１試薬に前記多価抗原を含み、第２試薬に抗２５（ＯＨ）ＶＤ抗体感作ラテックスを含む２試薬系のキットを用いた測定系の検討を行った。ここで、多価抗原として測定対象である２５（ＯＨ）ＶＤを誘導体化したものを使用した場合、検出感度は十分満足のいくものではなかった。しかし、競合させる多価抗原として測定対象の２５（ＯＨ）ＶＤとは異なる化学式（Ｉ）に示すビタミンＤを誘導体化した構造を使用したところ、意外にも測定感度が上昇することを発見した。　
　また、この見出した作用が競合ＬＴＩＡに限らず競合イムノアッセイにも応用可能であることも見出し本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の構成を有する。
＜１＞
競合イムノアッセイにもとづく２５ヒドロキシビタミンＤ測定用試薬であって、少なくとも以下の構成を含む２５ヒドロキシビタミンＤ測定用試薬。
（１）以下の化学式（Ｉ）及び／または（II）に示されるビタミンＤ誘導体
（２）抗２５ヒドロキシビタミンＤ抗体
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 ここでＡは高い親和性でキャリアに化学的に結合することが可能であるトレーサー基を表す。
Ｘは置換されていないか、又はヘテロ原子で置換された、鎖長３～２０の炭化水素基を示す。
＜２＞
前記Ａは、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ビオチン、ジゴキシゲニン、チロシン、ＦＩＴＣで置換されたチロシン、置換されたアミノ酸、アミノ酸及びペプチド配列、ＦＩＴＣ、タンパク質及びペプチド類、Ａタンパク質、Ｇタンパク質、ビタミンＤ誘導体から選択される＜１＞に記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定用試薬。
＜３＞ 
前記化学式（Ｉ）または（II）に示されるビタミンＤ誘導体が、Ａを介してキャリアに２つ以上結合し、多価抗原を形成している構成である＜１＞又は＜２＞に記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定用試薬。
＜４＞
競合イムノアッセイの測定原理が、ＲＩＡ、ＥＩＡ、ＬＴＩＡ、ＣＬＥＩＡから選択される、競合イムノアッセイである＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定用試薬。
＜５＞
競合イムノアッセイが、競合ラテックス免疫比濁法（競合ＬＴＩＡ）である、＜４＞に記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定用試薬。
＜６＞
２５ヒドロキシビタミンＤが２５ヒドロキシビタミンＤ２と２５ヒドロキシビタミンＤ３の総和であり、ビタミンＤ誘導体が、ビタミンＤ２誘導体及び／またはビタミンＤ３誘導体であり、抗２５ヒドロキシビタミンＤ抗体が抗２５ヒドロキシビタミンＤ２及び／または抗２５ヒドロキシビタミンＤ３抗体である、＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定用試薬。
＜７＞
ビタミンＤ３誘導体が以下の化学式（III）に示される化合物である＜１＞～＜６＞のいずれかに記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定用試薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 ＜８＞
前記（１）又は（２）のいずれかが不溶性担体に固定化されている＜１＞～＜７＞のいずれかに記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定用試薬。
＜９＞
自動分析装置用の試薬である、＜1＞～＜８＞のいずれかに記載に２５ヒドロキシビタミンＤ測定用試薬。
＜１０＞
競合イムノアッセイにもとづく２５ヒドロキビタミンＤ測定方法であって、少なくとも以下の工程を含む２５ヒドロキビタミンＤ測定方法。
（１）化学式（Ｉ）及び／又は（II）に示されるビタミンＤ誘導体の存在下、サンプルと抗２５ヒドロキシビタミンＤ抗体とを接触する工程
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 ここでＡは高い親和性でキャリアに化学的に結合することが可能であるトレーサー基を表す。
Ｘは置換されていないか、又はヘテロ原子で置換された、鎖長３～２０の炭化水素基を示す。
（２）サンプル中の２５ヒドロキシビタミンＤに応じた前記ビタミンＤ誘導体と前記抗２５ヒドロキシビタミンＤ抗体との抗原抗体反応の阻害度合いを測定する工程
＜１１＞
Ａは、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ビオチン、ジゴキシゲニン、チロシン、ＦＩＴＣで置換されたチロシン、置換されたアミノ酸、アミノ酸及びペプチド配列、ＦＩＴＣ、タンパク質及びペプチド類、Ａタンパク質、Ｇタンパク質、ビタミンＤ誘導体から選択される＜１０＞に記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定方法。
＜１２＞
前記化学式（Ｉ）または（II）に示されるビタミンＤ誘導体が、Ａを介してキャリアに２つ以上結合し、多価抗原を形成している構成である＜１０＞又は＜１１＞に記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定方法。
＜１３＞
競合イムノアッセイの測定原理が、ＲＩＡ、ＥＩＡ、ＬＴＩＡ、ＣＬＥＩＡから選択される、競合イムノアッセイである＜１０＞～＜１２＞のいずれかに記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定方法。
＜１４＞
競合イムノアッセイが、競合ラテックス免疫比濁法（競合ＬＴＩＡ）である、＜１３＞に記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定方法。
＜１５＞
２５ヒドロキシビタミンＤが２５ヒドロキシビタミンＤ２と２５ヒドロキシビタミンＤ３の総和であり、ビタミンＤ誘導体が、ビタミンＤ２誘導体及び／またはビタミンＤ３誘導体であり、抗２５ヒドロキシビタミンＤ抗体が抗２５ヒドロキシビタミンＤ２及び／または抗２５ヒドロキシビタミンＤ３抗体である、＜１０＞～＜１４＞のいずれかに記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定方法。
＜１６＞
ビタミンＤ３誘導体が以下の化学式（III）に示される化合物である＜１０＞～＜１５＞のいずれかに記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 ＜１７＞
前記（１）又は（２）のいずれかが不溶性担体に固定化されている＜１０＞～＜１６＞のいずれかに記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定方法。
＜１８＞
自動分析装置を用いて測定される＜１０＞～＜１７＞のいずれかに記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定方法。
＜１９＞
競合イムノアッセイにもとづく２５ヒドロキビタミンＤ３測定方法に用いられる多価抗原であって、以下の化学式（III）に示されるビタミンＤ３誘導体がキャリアに固定化された多価抗原。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　本発明によれば、競合ＬＴＩＡにより、サンプル中の２５（ＯＨ）ＶＤが低濃度であっても測定できるようになった。また、検出感度が上がることにより患者サンプル中の２５（ＯＨ）ＶＤ濃度の状態を正確に把握することができ、病態の把握に貢献できる。また、競合ＬＴＩＡは、汎用機器である自動分析装置によって行うことができることから、短時間に大量のサンプルの測定が可能となった。
　さらにまた、従来の化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）等などのイムノアッセイによるヒドロキシビタミンＤ測定方法においても、本発明の多価抗原を利用することで、サンプル中のヒドロキシビタミンＤをより低濃度領域まで測定することが可能となる。
　また、既に測定可能であった低濃度領域においても、測定の再現性が向上するといった効果も期待できる。
ビタミンＤの生体内における代謝を示す概念模式図である。 競合ＬＴＩＡにおいて、測定試薬に２５（ＯＨ）ＶＤ３誘導体-ＢＳＡ複合体（比較例２）またはＶＤ３誘導体-ＢＳＡ複合体（実施例２）を添加した場合の各希釈系列における測定感度（ｍＡｂｓ．）を２５（ＯＨ）ＶＤ３濃度ゼロに対する相対感度（％）として表したグラフである。
（測定方法／測定試薬）
　本発明の２５（ＯＨ）ＶＤの測定方法は、競合イムノアッセイにもとづく測定方法であり、少なくとも以下の（１）及び（２）の工程を含む方法である。
（１）以下の化学式（Ｉ）及び／または（II）に示されるビタミンＤ誘導体の存在下、サンプルと抗２５ヒドロキシビタミンＤ抗体（以下、抗２５（ＯＨ）ＶＤ抗体ということがある）とを接触する工程
（２）サンプル中の２５（ＯＨ）ＶＤ濃度に応じた前記ビタミンＤ誘導体と前記抗２５（ＯＨ）ＶＤ抗体との抗原抗体反応の阻害度合いを測定する工程
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 　ここでＡは高い親和性でキャリアに化学的に結合することが可能であるトレーサー基を表す。
　Ｘは置換されていないか、又はヘテロ原子で置換された、鎖長３～２０の炭化水素基を示す。
　競合イムノアッセイの測定原理としては、ＲＩＡ、ＥＩＡ、ＬＴＩＡ、ＣＬＥＩＡが挙げられる。前記ビタミンＤ誘導体又は前記抗２５（ＯＨ）ＶＤ抗体のいずれか一方は不溶性担体に固定化されていることが望ましい。なお、本発明のビタミンＤ誘導体の例としてはタンパクなどのキャリアに固定化された多価抗原を形成している構成が典型的である。以下、多価抗原を形成するビタミンＤ誘導体を用いた場合について説明する。
（１）競合ＬＴＩＡへの応用
　不溶性担体としてラテックス粒子を用いた競合ラテックス免疫法（競合ＬＴＩＡ）による２５（ＯＨ）ＶＤの測定方法について説明する。例えば、ビタミンＤ誘導体がキャリアに固定化された多価抗原の存在下で、サンプルと抗２５（ＯＨ）ＶＤ抗体が固定化されたラテックス粒子とを接触させる場合は（下記（１－１））、サンプル中の２５（ＯＨ）ＶＤの濃度に応じて前記ラテックス粒子の凝集度は減少するため、ラテックスの凝集の程度を光学的あるいは電気化学的に観察することにより２５ヒドロキシビタミンＤを測定することが可能である。
　競合ＬＴＩＡの試薬構成例を以下に示す。
＜試薬構成例＞
（１－１）抗体感作系
　抗２５（ＯＨ）ＶＤ抗体が固定化されたラテックス粒子
　ビタミンＤ誘導体をキャリアに固定化した多価抗原
（１－２）抗原感作系
　遊離の抗２５（ＯＨ）ＶＤ抗体（２次抗体が添加されていても良い）
　ビタミンＤ誘導体が固定化されたラテックス粒子
　なお、前記の遊離の抗２５（ＯＨ）ＶＤ抗体を含む試液には、２次抗体が添加されていても良い。
（２）ＥＬＩＳＡ法への応用
　前記不溶性担体としてプレートを用いた、ＥＬＩＳＡによる２５ヒドロキシビタミンＤの測定方法について説明する。例えば、ビタミンＤ誘導体がキャリアに固定化された多価抗原がプレートのウエルに固定化されており、プレートのウエルにサンプルと遊離の抗２５（ＯＨ）ＶＤ抗体とを添加する場合は、サンプル中の２５（ＯＨ）ＶＤと固定化されたビタミンＤ誘導体との間で抗２５（ＯＨ）ＶＤ抗体の競合が起こるため、サンプル中の２５（ＯＨ）ＶＤの濃度に応じた免疫反応の阻害の程度を光学的あるいは電気化学的に観察することにより２５（ＯＨ）ＶＤを測定することが可能である。
　ＥＬＩＳＡの試薬構成例を以下に示す。
＜試薬構成例＞
　ビタミンＤ誘導体が固相化されたプレート
　遊離の抗２５（ＯＨ）ＶＤ抗体
　なお、前記の遊離の抗２５（ＯＨ）ＶＤ抗体を含む試液には、2次抗体が添加されていても良い。
（３）磁性粒子を用いた化学発光法への応用
　不溶性担体として磁性粒子を用いた化学発光法による２５（ＯＨ）ＶＤの測定方法について説明する。例えば、ビタミンＤ誘導体がキャリアに固定化された標識多価抗原の存在下で、サンプルと抗２５（ＯＨ）ＶＤ抗体が固定化された磁性粒子とを接触させる場合は（下記（３－１））、サンプル中の２５（ＯＨ）ＶＤの濃度に応じて前記磁性粒子の抗体と標識多価抗原の複合体は減少するため、回収した磁性粒子の標識を光学的に観察することにより２５（ＯＨ）ＶＤを測定することが可能である。ビタミンＤ誘導体が固定化された磁性粒子（（又はビタミンＤ誘導体をキャリアに固定化した多価抗原が固定化された磁性粒子も含む）の存在下で、サンプルと標識抗２５（ＯＨ）ＶＤ抗体とを接触させる場合は（下記（３－２））、サンプル中の２５（ＯＨ）ＶＤの濃度に応じて前記磁性粒子と標識抗体の複合体は減少するため、回収した磁性粒子の標識を光学的に観察することにより２５（ＯＨ）ＶＤを測定することが可能である。
　磁性粒子を用いた免疫法の試薬構成例を以下に示す。
＜試薬構成例＞
（３－１）抗体感作系
　抗２５（ＯＨ）ＶＤ抗体が固定化された磁性粒子
　ビタミンＤ誘導体をキャリアに固定化した標識多価抗原
（３－２）抗原感作系
　標識されている抗２５（ＯＨ）ＶＤ抗体
　ビタミンＤ誘導体が固定化された磁性粒子（又はビタミンＤ誘導体をキャリアに固定化した多価抗原が固定化された磁性粒子も含む）
（サンプル）
　サンプルの由来は特に限定されず、生物由来の生物学的サンプルのほか、環境サンプルなどであってもよい。生物学的サンプルが由来する生物としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）、鳥類（例、ニワトリ）等の動物、昆虫、微生物、植物、菌類、魚類が挙げられるが、好ましくは哺乳動物、菌類、魚類であり、より好ましくは哺乳動物であり、さらに好ましくはヒトである。
　生物学的サンプルは、血液自体または血液に由来するサンプルである全血、血清、血漿などの血液関連サンプル、唾液、尿、乳汁、組織または細胞抽出液、あるいはこれらの混合物であってもよいが、このうちでも血液関連サンプルが好ましい。
　環境サンプルとしては、土壌、海水、淡水由来のサンプルが挙げられる。
　サンプルは適宜希釈されたり、濾過などが行われて用いられることもある。
（測定対象）
　本明細書において、測定対象は、２５位でヒドロキシ化された２５ヒドロキシビタミンＤ（２５（ＯＨ）ＶＤ）である。すなわち２５（ＯＨ）ＶＤ２、２５（ＯＨ）ＶＤ３、またはこれらの総和のいずれも測定対象とする。本明細書中、２５ヒドロキシビタミンＤ（２５（ＯＨ）ＶＤ）と表記した場合は、特に断らない限りは、２５（ＯＨ）ＶＤ２、２５（ＯＨ）ＶＤ３、またはこれらの総和のいずれも含む意味である。総和を測定する場合は、本発明のビタミンＤ誘導体は、ビタミンＤ２誘導体及び／またはビタミンＤ３誘導体であり、抗２５ヒドロキシビタミンＤ抗体は抗２５ヒドロキシビタミンＤ２及び／または抗２５ヒドロキシビタミンＤ３抗体である。各ビタミンＤ誘導体及び抗２５ヒドロキシビタミンＤ抗体については後述する。
（ビタミンＤ誘導体）
　本発明におけるビタミンＤ誘導体とは、ビタミンＤをキャリア表面に結合させるための化学的な修飾をしたものをいい、ビタミンＤに炭化水素基及びトレーサーを結合させたものが該当する。
　ビタミンＤ３誘導体及びビタミンＤ２誘導体は、以下の一般式（Ｉ）、（II）で示される化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 　ここで、Ａは、高い親和性でキャリアに化学的に結合することが可能であるトレーサー基を表す。
　前記Ａは、具体的にはアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基（－SHのこと）、ビオチン、ジゴキシゲニン、チロシン、ＦＩＴＣで置換されたチロシン、置換されたアミノ酸、アミノ酸及びペプチド配列、ＦＩＴＣ、ペプチド類、Ａタンパク質、Ｇタンパク質、ビタミンＤ誘導体などが挙げられる。また、これらのトレーサー基は活性化されていてもよい。
　Ｘは置換されていないか、又はヘテロ原子で置換された、鎖長３～２０の炭化水素基を示す。
　なお、ヘテロ原子としてはＳ、Ｏ、Ｎ、Ｐのような原子が挙げられる。
　キャリアとしては、タンパク質や不溶性担体が挙げられる。不溶性担体としては金属性粒子、ラテックス粒子、プレート、タンパク質としてはＢＳＡ、ビタミンＤ結合タンパク質などが挙げられる。
　キャリアがタンパク質である場合、Ａとしては、末端の構造をアミノ基、カルボキシル基、またはスルフヒドリル基とすることにより、キャリアにＡを結合することができる。
　また、アミノ基、カルボキシル基、またはスルフヒドリル基をさらに公知の「タンパク質架橋剤」「ラベル化剤」を使用して活性化することにより、任意のキャリア蛋白と化学結合させることもできる。
　当該キャリア蛋白の結合部位とＡの結合部位の構造の組み合わせとしては、以下が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　上記のタンパク質架橋剤やラベル化剤としては、ビオチンラベル化剤、二価性試薬、タンパク質標識試薬、ＨＰＬＣ用誘導体化試薬などがあるが、代表的な活性化方法として、例えば、以下の方法が挙げられる。
（i）カルボン酸を、カルボジイミドとする方法
　DCC（Dicyclohexylcarbodiimide）（ジシクロヘキシルカルボジイミド）やEDC（1-Etyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimideなどの試薬を用いて活性化する方法である。
（ii）カルボン酸をN-ヒドロキシスクシンイミド活性エステルとする方法（後述する実施例）
EDCに続けてNHS（N-ヒドロキシコハク酸イミド）を作用させる方法。
（iii）カルボン酸をイミド型とする方法
DMP（Dimethyl pimelimidateを使用する方法。
（iv）スルフヒドリル基をマレイミド基と結合させる方法
　また、キャリアが不溶性担体や金属性粒子などの場合も、当該担体や粒子の表面を活性化させ、Ａと結合できる構造とすることでキャリアとビタミン誘導体の結合体（複合体）を得ることができる。
　化学式（II）で示されるビタミンＤ３誘導体において、Ａが活性化されたカルボキシル基の場合を以下の化学式（III）として示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　競合イムノアッセイの測定感度は、抗体の測定対象（サンプル中の遊離の２５（ＯＨ）ＶＤ）への親和性と多価抗原への親和性のバランスに依存すると考えられるところ、本発明では抗２５（ＯＨ）ＶＤ抗体の多価抗原への親和性を意図的に低下させたことで、相対的に遊離抗原２５（ＯＨ）ＶＤへの親和性が高まり、低濃度の遊離抗原２５（ＯＨ）ＶＤであっても検出が可能となったと考えられる。通常、当業者は、競合させる多価抗原として、遊離抗原２５（ＯＨ）ＶＤと少なくともエピトープ部分は同一構造である多価抗原を使用すると考えられることから、ヒドロキシ体の誘導体ではなく、あえて非ヒドロキシ体使用を試みた結果検出感度が上昇したことは意外なことであった。そしてこのような抗２５（ＯＨ）ＶＤ抗体の多価抗原への親和性を意図的に低下させ、相対的に遊離抗原２５（ＯＨ）ＶＤへの親和性が高まることで、低濃度領域の遊離抗原２５（ＯＨ）ＶＤの検出が可能となるという作用は競合イムノアッセイのみならず競合イムノアッセイ全般に応用可能な作用であることから、競合イムノアッセイへの応用も本発明の範囲に含まれる。
（多価抗原）
　本発明に用いる多価抗原は、キャリアの表面に２つ以上の本発明のビタミンＤ誘導体を結合させたものをいう。
　本発明の多価抗原としてのビタミンＤ誘導体は、測定に用いる抗２５ヒロキシビタミンＤ抗体の親和性によって、式（Ｉ）に示すＶＤ３誘導体、式（II）に示すＶＤ２誘導体、これらの組み合わせが挙げられる。
　多価抗原に用いられるキャリアは特に限定されるものではないが、高分子が好ましく、具体的には、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、ブルーキャリアプロテイン（ＢＣＰ）、オブアルブミン（ＯＶＡ）などのタンパク質が挙げられる。特に本発明では、ＢＳＡが好ましい。
（前処理）
　２５（ＯＨ）ＶＤは、血中で結合タンパク質（ＤＢＰ）と強固に結合していることが知られている。したがって、２５（ＯＨ）ＶＤを抗原抗体反応を利用して正確に測定するためには、ビタミンＤとＤＢＰの解離操作（前処理）が必要とされる。このような前処理としては、酸、タンパク変性剤、界面活性剤、加水分解酵素などの変性剤や有機溶媒など周知の方法により前処理することが望ましい。また、これらの前処理のほかに、遠心分離、抽出、ろ過、沈殿、加熱、凍結、冷蔵、攪拌などの操作が必要に応じて行われることもある。
(２５ヒドロキシビタミンＤに対する抗体）
　本発明において、抗２５（ＯＨ）ＶＤ抗体とは、測定対象である２５（ＯＨ）ＶＤ又は２５（ＯＨ）ＶＤ誘導体に対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のほか、これらの機能性断片が挙げられる。すなわち、測定対象が２５（ＯＨ）ＶＤ２であれば、２５（ＯＨ）ＶＤ２又は２５（ＯＨ）ＶＤ２誘導体に対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のほか、これらの機能性断片が挙げられる。また、測定対象が２５（ＯＨ）ＶＤ３であれば、２５（ＯＨ）ＶＤ３又は２５（ＯＨ）ＶＤ３誘導体に対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のほか、これらの機能性断片が挙げられる。また、測定対象が２５（ＯＨ）ＶＤ２と２５（ＯＨ）ＶＤ３の総和であれば、２５（ＯＨ）ＶＤ２若しくは２５（ＯＨ）ＶＤ２誘導体のいずれか、及び２５（ＯＨ）ＶＤ３若しくは２５（ＯＨ）ＶＤ３誘導体のいずれか、の両方に作用するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のほか、これらの機能性断片が挙げられる。
　ポリクローナル抗体は、免疫原として被検対象である２５（ＯＨ）ＶＤ又は２５（ＯＨ）ＶＤ誘導体をキャリア蛋白に結合したもので動物を免疫化し、この動物の血清を取得することで精製された対象抗体を回収し、上記血清の他の成分から対象抗体を分離することにより得ることができる。キャリア蛋白としては、ＢＳＡやＫＬＨ（スカシガイヘモシアニン）などが利用できる。
　モノクローナル抗体は、当業者に周知のハイブリドーマ技術によって得ることができ、また、当業者に周知の技術を利用して、遺伝子工学により得られた組み換え抗体であってもよい。
　抗体の機能性断片としては抗原抗体反応活性を有する断片であるＦ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'などが挙げられる。これらの抗体の機能性断片は前記のようにして得られた全長抗体をタンパク質分解酵素（例えば、ペプシンやパパインなど）で処理することにより製造できる。
（不溶性担体）
　本発明に用いる不溶性担体としては、抗２５（ＯＨ）ＶＤ抗体又は多価抗原を担持でき、サンプルと接触させてサンプル中の２５（ＯＨ）ＶＤの測定ができるような不溶性担体であればよく、粒子、プレートなどの固相が挙げられる。粒子としては例えば、ラテックス粒子、磁性粒子、金属粒子等が挙げられる。
（ラテックス粒子）
　本発明の競合ＬＴＩＡに用いられるラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレン、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、塩化ビニル－アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。ラテックス粒子の平均粒径は、被検物質の被検試料中での濃度あるいは測定機器の検出感度などを考慮し、５０μｍ～４００μｍのものが適宜選択される。
（抗原又は抗体を固定化した不溶性担体）
　本発明において、抗原又は抗体をラテックス粒子などの不溶性担体に固定化する方法は、固定化しようとする抗原又は抗体の特性に応じて物理吸着（疎水結合）法、化学結合法のいずれかを適宜選択することができる。化学結合法においてはマレイミド基などの結合性の官能基を抗体に導入したり、抗原又は抗体が糖を有する場合にはこれを利用して不溶性担体表面の結合性の官能基に結合させ固定化することができる。
（競合ＬＴＩＡ用試薬、試薬キット）
　本発明の競合ＬＴＩＡ用試薬の構成概略は前述のとおりであるが、より具体的な構成について説明する。
　ラテックスに抗体を固定化させる場合は、以下の（１）及び（２）を少なくとも含み、
(１)及び（２）は第１試薬及び第２試薬に分けられた構成を採っていることが望ましい。
　なお、以下の(１)及び（２）は溶液状態である場合を例示したが、保存時は乾燥品とすることも可能であり、この場合は、使用時に希釈液などにより溶解して液状とすればよい。複数の試薬構成を含む場合をキットということがある。
（１）ビタミンＤ誘導体をキャリアに固定化した多価抗原（ビタミンＤ誘導体－キャリア複合体）を含む溶液（第一試液などの名称で呼ばれる場合がある）
（２）抗２５（ＯＨ）ＶＤ抗体が固定化されたラテックス粒子溶液（ラテックス試液、第二試液などの名称で呼ばれる場合がある）
　さらに、本発明の試薬構成は、以下の（３）、（４）及び（５）を含むこともある。
（３）濃度換算用標準物質（キャリブレータなどの名称で呼ばれる場合がある）
（４）濃度換算用標準物質を溶解または希釈するための溶液（キャリブレータ希釈液などの名称で呼ばれる場合がある）
（５）２５（ＯＨ）ＶＤをビタミンＤ結合タンパクから遊離させるための前処理液
　ラテックスに抗原を固定化させる場合は、以下の（i）及び（ii）を少なくとも含み、それ以外は上記ラテックスに抗体を固定化させる場合と同様である。
（i）抗２５（ＯＨ）ＶＤ抗体を含む溶液（第一試液などの名称で呼ばれる場合がある）
（ii）ビタミンＤ誘導体が直接固定化されたラテックス粒子溶液、またはビタミンＤ誘導体をキャリアに固定化した多価抗原が固定化されたラテックス粒子溶液（ラテックス試液、第二試液などの名称で呼ばれる場合がある）
（凝集シグナルの測定方法）
　競合ＬＴＩＡにおける凝集シグナルの測定は、通常、凝集阻止反応測定に用いられる方法であればいずれでもよく、吸光度比による評価、粒子数測定、粒子サイズ測定（凝集すればサイズは大きくなる）、散乱光測定や吸収スペクトルの測定（凝集すれば増大もしくはシフトする）など当業者が用いうる手段があげられる。さらに、光学的な検出を可能な範囲で電気化学的な検出によって置き換えることも可能である。
　凝集シグナルの測定は、前記の如く種々の方法があるが、ラテックス粒子と汎用の生化学分析装置を用いる方法が便利である。例えば、測定対象である２５（ＯＨ）ＶＤを含むサンプルに、複数のビタミンＤ誘導体を担持した多価抗原、抗２５（ＯＨ）ＶＤ抗体を担持したラテックス粒子を含む試薬を加え、一定温度で一定時間加温し、この間の吸光度を測定し、吸光度の変化量を検出し、予め濃度の判っている標準液を試料とした線から被検試料中の２５（ＯＨ）ＶＤの濃度を算出することができる。ラテックス免疫比濁法では、通常５００～９００ｎｍの波長の吸光度が用いられ、反応時の吸光度の変化量を定量に用いるのが一般的である。本発明を利用した測定範囲は、測定対象の種類、結合パートナーのアビディティー、結合パートナーと多価抗原との量比などを考慮して適宜所望の測定範囲に設定できる。
  本発明のサンプル中の２５（ＯＨ）ＶＤの測定は、用手法により行ってもよいし、又は測定装置等の装置を用いて行ってもよい。 測定装置は、汎用自動分析装置であっても、専用の測定装置（専用機）であってもよい。 特に競合ＬＴＩＡは、汎用自動分析装置によって実施することが可能であり、２ステップ法（２試薬法）等の複数の操作ステップにより行う方法によって実施することも可能である。
　以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
１．試験材料
　以下の実施例で使用した主な材料と製造元を以下に示す。
ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）
スカシ貝ヘモシアニン（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）
オブアルブミン（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）
ビタミンＤ２（別名Ｅｒｇｏｃａｌｃｉｆｅｒｏｌ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）
ビタミンＤ３（別名Ｃｈｏｌｅｃａｌｃｉｆｅｒｏｌ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）
２５ヒドロキシビタミンＤ２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）
２５ヒドロキシビタミンＤ３（別名Ｃａｌｃｉｆｅｄｉｏｌ）（富士フィルム和光純薬株式会社）
ＰｒｏＣｌｉｎ３００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）
ジメチルスルホキシド（別名ＤＭＳＯ）（富士フィルム和光純薬株式会社）
〔試験例１〕２５（ＯＨ）ＶＤ３誘導体の取得
　以下の化学式（ＩＶ）で示される２５（ＯＨ）ＶＤ３誘導体を、外部業者に合成を委託して入手し、以下の試験例に用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
〔試験例２〕ビタミンＤ３誘導体の取得
　以下の化学式（III）で示されるビタミンＤ３誘導体を、外部業者に合成を委託し、入手し、以下の試験例に用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
〔実施例１〕ビタミンＤ３誘導体－ＢＳＡ複合体の調製
（１）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、０．１Ｍ　Ｂｉｃｉｎｅバッファーに、１．０ｍｇ／ｍＬとなるよう溶解し、同バッファーで透析した。
（２）ビタミンＤ３誘導体を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に１０ｍｇ／ｍＬとなるよう溶解した。これを（１）のＢＳＡ溶液に３０分の１量（ｖ／ｖ）添加し、ボルテックスで攪拌した。
（３）室温で２時間、遮光下でインキュベートした。
（４）１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ８．０を全量の１０分の１量（ｖ／ｖ）添加し、ボルテックスで攪拌して、反応を停止し、ビタミンＤ３誘導体－ＢＳＡ複合体を得た。
〔比較例１〕２５（ＯＨ）ＶＤ３誘導体－ＢＳＡ複合体の調製
　実施例１（２）で、ビタミンＤ３誘導体の代わりに２５（ＯＨ）ＶＤ３誘導体を使用したこと以外は同様に行い、２５（ＯＨ）ＶＤ３誘導体－ＢＳＡ複合体を調製した。
〔試験例３〕抗２５（ＯＨ）ＶＤ３抗体の取得
１．抗体の取得
　２５（ＯＨ）ＶＤ３誘導体を、スカシ貝ヘモシアニン、オブアルブミン等に結合させ、これを免疫原としてマウスに定法にて免疫した。最終免疫は細胞融合の３～４日前に行い、脾臓細胞及びリンパ節細胞を回収し、電気融合法またはＰＥＧ法でミエローマ細胞（ＳＰ２／Ｏ）と融合した。融合細胞は９６穴プレートで培養し、細胞融合から７～８日後に培養上清を回収して、下記に示すスクリーニングを行った。スクリーニングによって選択された株はクローン化され、抗体精製に用いられた。
２．スクリーニング
２－１．１次スクリーニング
　以下に示す抗原固相化ＥＬＩＳＡを用いて、固相化した２５（ＯＨ）ＶＤ３誘導体と反応する株を選択した。
（１）９６穴ＥＬＩＳＡ用マイクロプレートに、固相化抗原として、ＰＢＳで１．０μｇ／ｍＬに希釈した２５（ＯＨ）ＶＤ３誘導体－ＢＳＡ複合体を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で２時間静置した。
（２）０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）（４００μＬ／ｗｅｌｌ）で３回洗浄後、ブロッキング液として１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を分注し、室温で１時間静置した。
（３）ブロッキング液を除去後、培養上清を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
（４）ＰＢＳＴで３回洗浄後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴ溶液で１００００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスポリクローナル抗体を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
（５）ＰＢＳＴで３回洗浄後、オルトフェニレンジアミン発色液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１０分静置した。
（６）反応停止液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、波長４９２ｎｍの吸光度を測定し、吸光度の高い株を選定した。
２－２．２次スクリーニング
　１次スクリーニングで選定された株に対して、さらに以下に示す競合ＥＬＩＳＡを実施し、遊離の２５（ＯＨ）ＶＤ２及び２５（ＯＨ）ＶＤ３と反応し、かつ遊離のビタミンＤ２及びビタミンＤ３と反応しない株を選択した。
（１）９６穴ＥＬＩＳＡ用マイクロプレートに、固相化抗原として、ＰＢＳで１．０μｇ／ｍＬに希釈した２５（ＯＨ）ＶＤ３誘導体－ＢＳＡ複合体を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で２時間静置した。
（２）ＰＢＳＴで３回洗浄後、ブロッキング液として１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を分注し、室温で１時間静置した。
（３）ブロッキング液を除去後、阻害抗原としてビタミンＤ２、ビタミンＤ３、２５（ＯＨ）ＶＤ２または２５（ＯＨ）ＶＤ３を、ＤＭＳＯで０、０．１、１、及び１０μｇ／ｍＬとなるよう溶解した溶液を２５μＬ／ｗｅｌｌずつ添加した。さらに、培養上清を２５μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、室温で１時間静置した。
（４）ＰＢＳＴで３回洗浄後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴ溶液で１００００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスポリクローナル抗体を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
（５）ＰＢＳＴで３回洗浄後、オルトフェニレンジアミン発色液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１０分静置した。
（６）反応停止液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。遊離のビタミンＤ２及びビタミンＤ３を阻害抗原として用いた場合に吸光度が高く、遊離の２５（ＯＨ）ＶＤ２及び２５（ＯＨ）ＶＤ３を阻害抗原として用いた場合に吸光度が低い株を選定した。
２－３．結果
　計６株のハイブリドーマを取得した。
〔実施例２〕免疫学的測定
　ラテックス競合阻害法を用いて、２５（ＯＨ）ＶＤ３の測定を行った。
Ｉ．測定方法と手順
１．試薬の調製
（１）第一試薬の調製
　実施例１で調製したビタミンＤ３誘導体－ＢＳＡ複合体を、０．１μｇ／ｍＬ含む、以下の組成の第一試薬を調製した。
〔第一試薬の組成〕
１００ｍＭ           Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ　ｐＨ７．０
３００ｍＭ           ＮａＣｌ
０．０５％           ＰｒｏＣｌｉｎ３００
０．５％             ＢＳＡ
０．１μｇ／ｍＬ     ビタミンＤ３誘導体－ＢＳＡ複合体
（２）第二試薬の調製
　試験例３で取得した抗２５（ＯＨ）ＶＤ３抗体を０．３６ｍｇ含む緩衝液１．０ｍＬに、平均粒径約３５０ｎｍの１％ラテックス（自社製）懸濁液１．０ｍＬを添加し、４℃で２時間撹拌した。続いて０．１％ＢＳＡを含む緩衝液１．０ｍＬを添加し、４℃で１時間撹拌した。得られた抗体感作ラテックス液を孔径０．８μｍのフィルターでろ過した後、波長６００ｎｍにおける吸光度が３．０　ＯＤとなるよう希釈し、以下の組成の第二試薬を調製した。
〔第二試薬の組成〕
５ｍＭ　　　　　　　　　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ　ｐＨ７．０
３．０ＯＤ（６００ｎｍ）抗２５（ＯＨ）ＶＤ３抗体感作ラテックス
０．０５％　　　　　　　ＰｒｏＣｌｉｎ３００
（３）２５（ＯＨ）ＶＤ３希釈系列の調製
　２５（ＯＨ）ＶＤ３をＤＭＳＯに溶解し、７５０ｎＭ溶液を調製した。さらに本品をＤＭＳＯで希釈し、３７５、１８８、９４、４７、２３ｎＭ溶液を調製した。これらを、２５（ＯＨ）ＶＤ３希釈系列と呼称し、以下の測定でサンプルとして用いた。
２．測定方法
　測定には、日立７１７０形自動分析装置を使用した。サンプル３．０μＬと第一試薬１００μＬを反応セルに添加し、３７℃で５分間反応させた。さらに第二試薬１００μＬを反応セルに添加し、３７℃で５分間反応させ、２ポイントエンド法（測光ポイント１９－３４）、主波長５７０ｎｍで吸光度変化量を測定した。
II．測定結果
　サンプルとして２５（ＯＨ）ＶＤ３希釈系列及びネガティブコントロール（２５（ＯＨ）ＶＤ３濃度ゼロ）としてＤＭＳＯを測定した。２５（ＯＨ）ＶＤ３の各希釈系列における測定感度（ｍＡｂｓ．）を表２に示した。また、濃度ゼロに対する、各希釈系列の相対感度（％）を図２に示した。
〔比較例２〕
　実施例２のＩの１．「試薬の調製」において、第一試薬に添加されるビタミンＤ３誘導体－ＢＳＡ複合体を２５（ＯＨ）ＶＤ３誘導体－ＢＳＡ複合体とした以外は同様に試薬を調製し、２．の「測定方法」と同様に測定した。測定結果を表２及び図２に実施例２の結果と合わせて示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
〔考察〕
　図２より、２５（ＯＨ）ＶＤ３が０ｎＭの場合と比較し、測定感度が１０％低下するために必要な２５（ＯＨ）ＶＤ３濃度は、実施例２では図２より約５５ｎＭと読み取れるが、比較例２では約１５０ｎＭであり、測定感度がおよそ３倍になった。
　したがって、競合阻害法による２５（ＯＨ）ＶＤ測定試薬の多価抗原として、ビタミンＤ３誘導体－ＢＳＡ複合体を用いた場合に、２５（ＯＨ）ＶＤ３誘導体－ＢＳＡ複合体を用いた場合よりも競合反応の程度が大きく、高感度な検出が可能であることがわかった。
　本発明によれば、サンプル中の２５（ＯＨ）ＶＤ濃度が低い場合であっても感度が良好な競合イムノアッセイにもとづく測定方法及び測定試薬を提供できるようになった。また、本発明を競合ＬＴＩＡに応用した場合には汎用機器である自動分析装置に適用することにより、短時間に大量サンプルの２５（ＯＨ）ＶＤ測定が可能となる。 

Claims (19)

  1. 競合イムノアッセイにもとづく２５ヒドロキシビタミンＤ測定用試薬であって、少なくとも以下の構成を含む２５ヒドロキシビタミンＤ測定用試薬。
    （１）以下の化学式（Ｉ）及び／または（II）に示されるビタミンＤ誘導体
    （２）抗２５ヒドロキシビタミンＤ抗体
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ここでＡは高い親和性でキャリアに化学的に結合することが可能であるトレーサー基を表す。
    Ｘは置換されていないか、又はヘテロ原子で置換された、鎖長３～２０の炭化水素基を示す。
  2. 前記Ａは、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ビオチン、ジゴキシゲニン、チロシン、ＦＩＴＣで置換されたチロシン、置換されたアミノ酸、アミノ酸及びペプチド配列、ＦＩＴＣ、タンパク質及びペプチド類、Ａタンパク質、Ｇタンパク質、ビタミンＤ誘導体から選択される請求項１に記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定用試薬。
  3. 前記化学式（Ｉ）または（II）に示されるビタミンＤ誘導体が、Ａを介してキャリアに２つ以上結合し、多価抗原を形成している構成である請求項１又は２に記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定用試薬。
  4. 競合イムノアッセイの測定原理が、ＲＩＡ、ＥＩＡ、ＬＴＩＡ、ＣＬＥＩＡから選択される、競合イムノアッセイである請求項１～３のいずれかに記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定用試薬。
  5. 競合イムノアッセイが、競合ラテックス免疫比濁法（競合ＬＴＩＡ）である、請求項４に記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定用試薬。
  6. ２５ヒドロキシビタミンＤが２５ヒドロキシビタミンＤ２と２５ヒドロキシビタミンＤ３の総和であり、ビタミンＤ誘導体が、ビタミンＤ２誘導体及び／またはビタミンＤ３誘導体であり、抗２５ヒドロキシビタミンＤ抗体が抗２５ヒドロキシビタミンＤ２及び／または抗２５ヒドロキシビタミンＤ３抗体である、請求項１～５のいずれかに記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定用試薬。
  7. ビタミンＤ３誘導体が以下の化学式（III）に示される化合物である請求項１～６のいずれかに記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定用試薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  8. 前記（１）又は（２）のいずれかが不溶性担体に固定化されている請求項１～７のいずれかに記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定用試薬。
  9. 自動分析装置用の試薬である、請求項1～８のいずれかに記載に２５ヒドロキシビタミンＤ測定用試薬。
  10. 競合イムノアッセイにもとづく２５ヒドロキビタミンＤ測定方法であって、少なくとも以下の工程を含む２５ヒドロキビタミンＤ測定方法。
    （１）化学式（Ｉ）及び／又は（II）に示されるビタミンＤ誘導体の存在下、サンプルと抗２５ヒドロキシビタミンＤ抗体とを接触する工程
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     ここでＡは高い親和性でキャリアに化学的に結合することが可能であるトレーサー基を表す。
    Ｘは置換されていないか、又はヘテロ原子で置換された、鎖長３～２０の炭化水素基を示す。
    （２）サンプル中の２５ヒドロキシビタミンＤに応じた前記ビタミンＤ誘導体と前記抗２５ヒドロキシビタミンＤ抗体との抗原抗体反応の阻害度合いを測定する工程
  11. Ａは、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ビオチン、ジゴキシゲニン、チロシン、ＦＩＴＣで置換されたチロシン、置換されたアミノ酸、アミノ酸及びペプチド配列、ＦＩＴＣ、タンパク質及びペプチド類、Ａタンパク質、Ｇタンパク質、ビタミンＤ誘導体から選択される請求項１０に記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定方法。
  12. 前記化学式（Ｉ）または（II）に示されるビタミンＤ誘導体が、Ａを介してキャリアに２つ以上結合し、多価抗原を形成している構成である請求項１０又は１１に記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定方法。
  13. 競合イムノアッセイの測定原理が、ＲＩＡ、ＥＩＡ、ＬＴＩＡ、ＣＬＥＩＡから選択される、競合イムノアッセイである請求項１０～１２のいずれかに記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定方法。
  14. 競合イムノアッセイが、競合ラテックス免疫比濁法（競合ＬＴＩＡ）である、請求項１３に記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定方法。
  15. ２５ヒドロキシビタミンＤが２５ヒドロキシビタミンＤ２と２５ヒドロキシビタミンＤ３の総和であり、ビタミンＤ誘導体が、ビタミンＤ２誘導体及び／またはビタミンＤ３誘導体であり、抗２５ヒドロキシビタミンＤ抗体が抗２５ヒドロキシビタミンＤ２及び／または抗２５ヒドロキシビタミンＤ３抗体である、請求項１０～１４のいずれかに記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定方法。
  16. ビタミンＤ３誘導体が以下の化学式（III）に示される化合物である請求項１０～１５のいずれかに記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
  17. 前記（１）又は（２）のいずれかが不溶性担体に固定化されている請求項１０～１６のいずれかに記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定方法。
  18. 自動分析装置を用いて測定される請求項１０～１７のいずれかに記載の２５ヒドロキシビタミンＤ測定方法。
  19. 競合イムノアッセイにもとづく２５ヒドロキビタミンＤ３測定方法に用いられる多価抗原であって、以下の化学式（III）に示されるビタミンＤ３誘導体がキャリアに固定化された多価抗原。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
       
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