TW202132774A

TW202132774A - ２５－羥維生素ｄ測定試劑及２５－羥維生素ｄ測定方法

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Publication number: TW202132774A
Application number: TW109140709A
Authority: TW
Inventors: 山本光章; 大田美恵子; 西尾朋久
Original assignee: 日商積水醫療股份有限公司
Priority date: 2019-11-22
Filing date: 2020-11-20
Publication date: 2021-09-01
Also published as: US20230003746A1; CN114729931A; EP4063860A1; JPWO2021100841A1; WO2021100841A1

Abstract

本發明之課題在於提供一種基於競爭免疫分析來測定25-羥維生素D之方法及測定試劑。本發明提供一種25-羥維生素D測定用試劑，其係基於競爭免疫分析者，且至少包含以下之構成。（1）化學式（I）及/或（II）所示之維生素D衍生物（2）抗25-羥維生素D抗體又，本發明提供一種維生素D測定用試劑，其基於尤其是維生素D衍生物或抗25-羥維生素抗體固定於乳膠之競爭乳膠免疫比濁法（競爭LTIA）。

Description

25-羥維生素D測定試劑及25-羥維生素D測定方法

本發明係關於一種25-羥維生素D測定試劑及25-羥維生素D測定方法。本發明尤其關於一種基於競爭免疫分析之25-羥維生素D測定試劑及25-羥維生素D測定方法。

維生素D係於人類或動物身體之生物學過程中具有較多意義之重要物質。已知具有生理活性之維生素D尤其調整自腸道之鈣吸收及骨鈣化。又，其亦具有使血清之鈣濃度上升之作用。已知維生素D缺乏症或過多症會帶來各種結果，已知尤其是維生素D缺乏症會引起骨質疏鬆症或佝僂病等重大疾病。因此，體內之維生素D之定量對於瞭解潛在缺乏症或過多症而言較重要。

維生素D於生物體中，以2種形態存在，即圖1所示之維生素D2（麥角鈣化固醇）及維生素D3（膽鈣化醇）。維生素D2係自食物獲得之外源性維生素D，維生素D3係藉由日光之紫外線給皮膚帶來之作用所生成之內源性維生素D。該等維生素D與維生素D結合蛋白質結合，藉由該蛋白質而被運送至肝臟，於肝臟中25位碳被氫氧化，從而成為25-羥維生素D（25(OH)VD）。進而，一部分於腎臟中1位碳被氫氧化，從而生成活性型1,25(OH)₂ VD。

基於圖1說明上述維生素D於生物體內進行之2階段之代謝。於最初之階段，維生素D2或維生素D3代謝成25-羥維生素D2或25-羥維生素D3（以下，有時分別記為25(OH)VD2、25(OH)VD3。將該等統稱為25-羥維生素D（以下，有時記為25(OH)VD））。其後，25(OH)VD2或25(OH)VD3代謝成1,25-二羥維生素D2或1,25-二羥維生素D3（以下，有時分別簡稱為1,25(OH)₂ D2、1,25(OH)₂ D3，統稱為1,25(OH)₂ VD）。該等代謝產物中較穩定之25(OH)VD良好地反映血中之維生素D之充足狀態，故而成為有用之指標。

此處，作為25(OH)VD之測定方法，已知有以下例舉之方法。「Lumipulse（註冊商標）25-羥維生素D」係作為藉由化學發光酵素免疫測定法（CLEIA法）測定血清或血漿中之25(OH)VD之方法的試劑而廣為人知。本方法經由第1反應及第2反應，利用酵素反應來測定發光量，藉此測定樣品中之25(OH)VD濃度，上述第1反應形成抗25(OH)VD單株抗體結合鐵氧體粒子與樣品中之25(OH)VD之免疫複合體，上述第2反應形成上述複合體與酵素標記抗25(OH)VD免疫複合體單株抗體之免疫複合體。本方法需要於第1反應之後及第2反應之後分別進行洗淨步驟，從而步驟較複雜。

又，於專利文獻1中揭示一種使用拋棄式錐體之25(OH)VD之免疫分析。本方法將經預處理之試樣與酵素標記抗維生素D抗體於孔中進行混合、培養，其後，轉移至固定有維生素D之錐體中，進而進行培養。於此期間，試樣中之作為抗原之25(OH)VD及固定於錐體之維生素D與酵素標記抗維生素D抗體之抗體部位發生競爭，藉由洗淨來去除非固定化物，藉此可檢測固定於錐體之維生素D與酵素標記抗維生素D抗體之複合體。由於該複合體之濃度與試樣中之抗原濃度成反比例，故而可算出試樣中之25(OH)VD。但是，本方法亦需要洗淨步驟，與上述方法同樣地步驟較複雜。先前技術文獻專利文獻

專利文獻1：日本特表2016-531306號公報

[發明所欲解決之課題]

以往之25(OH)VD之測定方法如上所述，步驟較複雜，且不存在基於不需要洗淨步驟之均相測定法即乳膠免疫比濁法的方法。乳膠免疫比濁法（以下，有時稱為LTIA）係使用固定有抗原或抗體之乳膠粒子，測定受檢物質之方法，於臨床檢查之領域中廣泛使用。LTIA可大致區分為如下兩種方法：「使固定有針對受檢物質之抗體之乳膠粒子與作為受檢物質之抗原發生反應，形成夾層型免疫複合體，根據隨著形成免疫複合體而該乳膠粒子凝集之程度來測定受檢物質（抗原）」的方法（以下，有時稱為夾層LTIA）；及「於固定有抗體之乳膠粒子之存在下，使合成抗原與受檢試樣中之抗原（受檢物質）發生競爭，藉此抑制該乳膠粒子與抗原（受檢物質）之免疫複合體之形成，根據伴隨免疫複合體之形成抑制之該乳膠粒子之凝集抑制（aggregation inhibition）之程度來測定受檢物質（抗原）」的方法（以下，有時稱為競爭LTIA等）。本發明之課題在於提供一種藉由競爭LTIA測定25(OH)VD之方法及測定試劑。進而，本發明之課題亦在於提供一種基於不限於競爭LTIA之競爭免疫分析來測定25(OH)VD之方法及測定試劑。 [解決課題之技術手段]

發明人等對於藉由如下競爭LTIA所進行之測定進行研究，即，於競爭LTIA中，製備於蛋白質等載體上結合有2種以上之25(OH)VD之多價抗原，當血液中之25(OH)VD濃度為零時設為產生最大凝集之狀態，隨著血液中之25(OH)VD濃度增加而凝集量減少。即，對使用「第1試劑包含上述多價抗原且第2試劑包含抗25(OH)VD抗體致敏乳膠之二試劑系套組」之測定系進行研究。此處，於使用使作為測定對象之25(OH)VD衍生化所得者作為多價抗原之情形時，檢測感度不夠令人滿意。但是，使用「使不同於測定對象25(OH)VD之化學式（I）所示之維生素D衍生化所得之結構」作為發生競爭之多價抗原，結果意外地發現測定感度上升。又，亦發現，該所發現之作用亦能應用於不限於競爭LTIA之競爭免疫分析，從而完成本發明。即，本發明具有以下之構成。＜1＞一種25-羥維生素D測定用試劑，其係基於競爭免疫分析者，且至少包含以下之構成：（1）以下之化學式（I）及/或（II）所示之維生素D衍生物（2）抗25-羥維生素D抗體；

此處，A表示可以高親和性與載體化學結合之示蹤劑基； X表示未經取代或經雜原子取代之鏈長3～20之烴基。＜2＞如＜1＞所記載之25-羥維生素D測定用試劑，其中，上述A選自胺基、羧基、硫氫基、生物素、長葉毛地黃配質、酪胺酸、經FITC取代之酪胺酸、經取代之胺基酸、胺基酸及肽序列、FITC、蛋白質及肽類、A蛋白質、G蛋白質、維生素D衍生物。＜3＞如＜1＞或＜2＞所記載之25-羥維生素D測定用試劑，其中，上述化學式（I）或（II）所示之維生素D衍生物為如下構成，即，經由A結合2種以上於載體，形成多價抗原。＜4＞如＜1＞至＜3＞中任一項所記載之25-羥維生素D測定用試劑，其中，競爭免疫分析之測定原理為選自RIA、EIA、LTIA、CLEIA之競爭免疫分析。＜5＞如＜4＞所記載之25-羥維生素D測定用試劑，其中，競爭免疫分析為競爭乳膠免疫比濁法（競爭LTIA）。＜6＞如＜1＞至＜5＞中任一項所記載之25-羥維生素D測定用試劑，其中，25-羥維生素D為25-羥維生素D2與25-羥維生素D3之總和，維生素D衍生物為維生素D2衍生物及/或維生素D3衍生物，抗25-羥維生素D抗體為抗25-羥維生素D2及/或抗25-羥維生素D3抗體。＜7＞如＜1＞至＜6＞中任一項所記載之25-羥維生素D測定用試劑，其中，維生素D3衍生物為以下之化學式（III）所示之化合物。

＜8＞如＜1＞至＜7＞中任一項所記載之25-羥維生素D測定用試劑，其中，上述（1）或（2）之任一者固定於不溶性載體。＜9＞如＜1＞至＜8＞中任一項所記載之25-羥維生素D測定用試劑，其為自動分析裝置用試劑。＜10＞一種25-羥維生素D測定方法，其係基於競爭免疫分析者，且至少包括以下步驟：（1）於化學式（I）及/或（II）所示之維生素D衍生物之存在下，使樣品與抗25-羥維生素D抗體接觸；

此處，A表示可以高親和性與載體化學結合之示蹤劑基； X表示未經取代或經雜原子取代之鏈長3～20之烴基；（2）對樣品中之對應於25-羥維生素D之上述維生素D衍生物與上述抗25-羥維生素D抗體之抗原抗體反應的抑制程度進行測定。＜11＞如＜10＞所記載之25-羥維生素D測定方法，其中，A選自胺基、羧基、硫氫基、生物素、長葉毛地黃配質、酪胺酸、經FITC取代之酪胺酸、經取代之胺基酸、胺基酸及肽序列、FITC、蛋白質及肽類、A蛋白質、G蛋白質、維生素D衍生物。＜12＞如＜10＞或＜11＞所記載之25-羥維生素D測定方法，其中，上述化學式（I）或（II）所示之維生素D衍生物為如下構成，即，經由A結合2種以上於載體，形成多價抗原。＜13＞如＜10＞至＜12＞中任一項所記載之25-羥維生素D測定方法，其中，競爭免疫分析之測定原理為選自RIA、EIA、LTIA、CLEIA之競爭免疫分析。＜14＞如＜13＞所記載之25-羥維生素D測定方法，其中，競爭免疫分析為競爭乳膠免疫比濁法（競爭LTIA）。＜15＞如＜10＞至＜14＞中任一項所記載之25-羥維生素D測定方法，其中，25-羥維生素D為25-羥維生素D2與25-羥維生素D3之總和，維生素D衍生物為維生素D2衍生物及/或維生素D3衍生物，抗25-羥維生素D抗體為抗25-羥維生素D2及/或抗25-羥維生素D3抗體。＜16＞如＜10＞至＜15＞中任一項所記載之25-羥維生素D測定方法，其中，維生素D3衍生物為以下之化學式（III）所示之化合物。

＜17＞如＜10＞至＜16＞中任一項所記載之25-羥維生素D測定方法，其中，上述（1）或（2）之任一者固定於不溶性載體。＜18＞如＜10＞至＜17＞中任一項所記載之25-羥維生素D測定方法，其使用自動分析裝置進行測定。＜19＞一種多價抗原，其係用於基於競爭免疫分析之25-羥維生素D3測定方法者，且以下之化學式（III）所示之維生素D3衍生物固定於載體。

[發明之效果]

根據本發明，藉由競爭LTIA，即便樣品中之25(OH)VD之濃度較低，亦可進行測定。又，藉由檢測感度上升，可準確掌握患者樣品中之25(OH)VD濃度之狀態，可有助於掌握病情。又，由於競爭LTIA可藉由作為通用機器之自動分析裝置進行，故而能夠於短時間內測定大量樣品。進而，又，於以往之利用化學發光酵素免疫測定法（CLEIA法）等免疫分析所進行之羥維生素D測定方法中，亦利用本發明之多價抗原，藉此可於更低濃度區域測定樣品中之羥維生素D。又，即便於已能夠測定之低濃度區域中，亦可期待測定再現性提高之效果。

（測定方法/測定試劑）本發明之25(OH)VD之測定方法係基於競爭免疫分析之測定方法，至少包括以下步驟（1）及（2）。（1）於以下之化學式（I）及/或（II）所示之維生素D衍生物之存在下，使樣品與抗25-羥維生素D抗體（以下，有時稱為抗25(OH)VD抗體）接觸；（2）對與樣品中之25(OH)VD濃度相對應之上述維生素D衍生物與上述抗25(OH)VD抗體的抗原抗體反應的抑制程度進行測定

此處，A表示可以高親和性與載體化學結合之示蹤劑基； X表示未經取代或經雜原子取代之鏈長3～20之烴基。

作為競爭免疫分析之測定原理，可例舉：RIA、EIA、LTIA、CLEIA。較理想為上述維生素D衍生物或上述抗25(OH)VD抗體之任一者固定於不溶性載體。再者，作為本發明之維生素D衍生物之例，典型之構成為形成有固定於蛋白質等載體之多價抗原。以下，對於使用形成多價抗原之維生素D衍生物之情形進行說明。

（1）於競爭LTIA中之應用對於藉由使用乳膠粒子作為不溶性載體之競爭乳膠免疫法（競爭LTIA）測定25(OH)VD之方法進行說明。例如，於維生素D衍生物固定於載體之多價抗原之存在下，使樣品與固定有抗25(OH)VD抗體之乳膠粒子接觸之情形時（下述（1-1）），與樣品中之25(OH)VD之濃度相對應地，上述乳膠粒子之凝集度減少，因此可藉由以光學方式或電化學方式觀察乳膠之凝集程度而測定25-羥維生素D。競爭LTIA之試劑構成例如下所示。＜試劑構成例＞（1-1）抗體致敏系固定有抗25(OH)VD抗體之乳膠粒子將維生素D衍生物固定於載體所得之多價抗原（1-2）抗原致敏系游離之抗25(OH)VD抗體（可添加二級抗體）固定有維生素D衍生物之乳膠粒子再者，亦可於包含上述游離之抗25(OH)VD抗體之試液中添加二級抗體。

（2）於ELISA法中之應用對於藉由使用培養盤作為上述不溶性載體之ELISA法測定25-羥維生素D之方法進行說明。例如，於「將維生素D衍生物固定於載體所得之多價抗原固定於培養盤之孔，且將樣品與游離之抗25(OH)VD抗體添加至培養盤之孔」之情形時，樣品中之25(OH)VD與經固定之維生素D衍生物之間發生抗25(OH)VD抗體之競爭，因此可藉由以光學方式或電化學方式觀察與樣品中之25(OH)VD之濃度相對應的免疫反應之抑制程度而測定25(OH)VD。 ELISA之試劑構成例如下所示。＜試劑構成例＞固相化有維生素D衍生物之培養盤游離之抗25(OH)VD抗體再者，亦可於包含上述游離之抗25(OH)VD抗體之試液中添加二級抗體。

（3）於使用磁性粒子之化學發光法中之應用對於藉由使用磁性粒子作為不溶性載體之化學發光法測定25(OH)VD之方法進行說明。例如，於維生素D衍生物固定於載體所得之標記多價抗原之存在下，使樣品與固定有抗25(OH)VD抗體之磁性粒子接觸之情形時（下述（3-1）），與樣品中之25(OH)VD之濃度相對應地，上述磁性粒子之抗體與標記多價抗原之複合體減少，因此可藉由以光學方式觀察所回收之磁性粒子之標記而測定25(OH)VD。於固定有維生素D衍生物之磁性粒子（或亦包含固定有多價抗原之磁性粒子，該多價抗原係將維生素D衍生物固定於載體而得）之存在下，使樣品與標記抗25(OH)VD抗體接觸之情形時（下述（3-2）），與樣品中之25(OH)VD之濃度相對應地，上述磁性粒子與標記抗體之複合體減少，因此可藉由以光學方式觀察所回收之磁性粒子之標記而測定25(OH)VD。使用磁性粒子之免疫法之試劑構成例如下所示。＜試劑構成例＞（3-1）抗體致敏系固定有抗25(OH)VD抗體之磁性粒子將維生素D衍生物固定於載體所得之標記多價抗原（3-2）抗原致敏系經標記之抗25(OH)VD抗體固定有維生素D衍生物之磁性粒子（或亦包含固定有將維生素D衍生物固定於載體所得之多價抗原之磁性粒子）

（樣品）樣品之來源無特別限定，除了源自生物之生物學樣品以外，亦可為環境樣品等。作為生物學樣品所源自之生物，例如可例舉：哺乳動物（例如人類、猴、小鼠、大鼠、兔、牛、豬、馬、山羊、綿羊）、鳥類（例如雞）等動物、昆蟲、微生物、植物、菌類、魚類，較佳為哺乳動物、菌類、魚類，更佳為哺乳動物，進而較佳為人類。生物學樣品亦可為血液本身、或作為源自血液之樣品之全血、血清、血漿等血液相關樣品、唾液、尿、乳汁、組織或細胞萃取液、或該等之混合物，其中較佳為血液相關樣品。作為環境樣品，可例舉源自土壤、海水、淡水之樣品。樣品亦有時適當稀釋，或進行過濾等而使用。

（測定對象）於本說明書中，測定對象係於25位羥基化而成之25-羥維生素D（25(OH)VD）。即，25(OH)VD2、25(OH)VD3、或該等之總和均為測定對象。於本說明書中，於記為25-羥維生素D（25(OH)VD）之情形時，只要無特別說明，則意指包含25(OH)VD2、25(OH)VD3、或該等之總和之全部。於測定總和之情形時，本發明之維生素D衍生物為維生素D2衍生物及/或維生素D3衍生物，抗25-羥維生素D抗體為抗25-羥維生素D2及/或抗25-羥維生素D3抗體。以下對各維生素D衍生物及抗25-羥維生素D抗體進行敍述。

（維生素D衍生物）本發明中之維生素D衍生物係指進行了用於使維生素D結合於載體表面之化學修飾者，適宜為使烴基及示蹤劑與維生素D結合所得者。維生素D3衍生物及維生素D2衍生物可例舉以下之通式（I）、（II）所表示之化合物。

此處，A表示可以高親和性與載體化學結合之示蹤劑基。具體而言，上述A可例舉：胺基、羧基、硫氫基（-SH）、生物素、長葉毛地黃配質、酪胺酸、經FITC取代之酪胺酸、經取代之胺基酸、胺基酸及肽序列、FITC、肽類、A蛋白質、G蛋白質、維生素D衍生物等。又，該等示蹤劑基可經活化。 X表示未經取代或經雜原子取代之鏈長3～20之烴基。再者，作為雜原子，可例舉S、O、N、P之類之原子。作為載體，可例舉蛋白質或不溶性載體。作為不溶性載體，可例舉：金屬性粒子、乳膠粒子、培養盤，作為蛋白質，可例舉：BSA、維生素D結合蛋白質等。

於載體為蛋白質之情形時，關於A，藉由將末端之結構設為胺基、羧基或硫氫基，可將A與載體結合。又，亦可進而使用公知之「蛋白質交聯劑」、「標記試劑」，使胺基、羧基或硫氫基活化，藉此與任意之載體蛋白化學結合。作為該載體蛋白之結合部位與A之結合部位之結構的組合，可例舉如下組合。 [表1]

成為載體之蛋白質之結合部位之結構	A之結合部位之結構
羧基	胺基
胺基	羧基
胺基	硫氫基
硫氫基	硫氫基
硫氫基	胺基

作為上述蛋白質交聯劑或標記試劑，有生物素標記試劑、雙價試劑、蛋白質標記試劑、HPLC用衍生化試劑等，作為代表性活化方法，例如可例舉以下之方法。（i）將羧酸製成碳二醯亞胺（carbodiimide）之方法使用DCC（Dicyclohexylcarbodiimide）（二環己基碳二醯亞胺）或EDC（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺）等試劑使之活化。（ii）將羧酸製成N-羥基丁二醯亞胺活性酯之方法（下述實施例）繼EDC之後使NHS（N-羥基琥珀醯亞胺）發揮作用之方法。（iii）將羧酸製成醯亞胺型之方法使用DMP（Dimethyl pimelimidate，庚二醯亞胺酸二甲酯）之方法。（iv）使硫氫基與順丁烯二醯亞胺基結合之方法

又，於載體為不溶性載體或金屬性粒子等之情形時，亦可使該載體或粒子之表面活化，形成可與A結合之結構，藉此獲得載體與維生素衍生物之結合體（複合體）。

於化學式（II）所示之維生素D3衍生物中，將A經活化之羧基之情形表示為以下之化學式（III）。

認為競爭免疫分析之測定感度取決於抗體與測定對象（樣品中之游離之25(OH)VD）之親和性和抗體與多價抗原之親和性的平衡，因此，認為於本發明中，藉由刻意降低抗25(OH)VD抗體與多價抗原之親和性，而相對地抗體與游離抗原25(OH)VD之親和性變高，即便為低濃度之游離抗原25(OH)VD，亦能進行檢測。通常，業者考慮使用與游離抗原25(OH)VD相比至少表位部分之結構相同之多價抗原作為發生競爭之多價抗原，因此令人意外的是，當敢於嘗試使用非羥基體而不是羥基體之衍生物時，結果檢測感度上升。並且，藉由刻意降低此種抗25(OH)VD抗體與多價抗原之親和性，相對地使抗體與游離抗原25(OH)VD之親和性變高，而能檢測低濃度區域之游離抗原25(OH)VD，該作用不僅能應用於競爭免疫分析，還能應用於全部競爭免疫分析，因此於競爭免疫分析中之應用亦包含於本發明之範圍內。

（多價抗原）本發明所使用之多價抗原係指使2種以上之本發明之維生素D衍生物結合於載體之表面所得者。作為本發明之多價抗原之維生素D衍生物根據用於測定之抗25-羥維生素D抗體之親和性，可例舉：式（I）所示之VD3衍生物、式（II）所示之VD2衍生物、該等之組合。多價抗原所使用之載體並無特別限定，較佳為高分子，具體而言，可例舉：牛血清白蛋白（BSA）、匙孔螺血氰蛋白（KLH）、藍色載體蛋白（BCP）、卵白蛋白（OVA）等蛋白質。於本發明中，尤佳為BSA。

（預處理）已知25(OH)VD於血中與結合蛋白質（DBP）牢固結合。因此，為了利用抗原抗體反應準確測定25(OH)VD，需要維生素D與DBP之解離操作（預處理）。作為此種預處理，較理想為藉由酸、蛋白質改質劑、界面活性劑、水解酵素等改質劑或有機溶劑等周知之方法進行預處理。又，除該等預處理以外，亦會視需要進行離心分離、萃取、過濾、沈澱、加熱、冷凍、冷藏、攪拌等操作。

（針對25-羥維生素D之抗體）於本發明中，作為抗25(OH)VD抗體，除針對作為測定對象之25(OH)VD或25(OH)VD衍生物之多株抗體或單株抗體以外，可例舉其等之功能性片段。即，若測定對象為25(OH)VD2，則除針對25(OH)VD2或25(OH)VD2衍生物之多株抗體或單株抗體以外，可例舉其等之功能性片段。又，若測定對象為25(OH)VD3，則除針對25(OH)VD3或25(OH)VD3衍生物之多株抗體或單株抗體以外，可例舉其等之功能性片段。又，若測定對象為25(OH)VD2與25(OH)VD3之總和，則除了對25(OH)VD2或25(OH)VD2衍生物之任一者、及25(OH)VD3或25(OH)VD3衍生物之任一者這兩者發揮作用之多株抗體或單株抗體以外，可例舉其等之功能性片段。多株抗體可藉由如下方式獲得，即，以「使作為受檢對象之25(OH)VD或25(OH)VD衍生物與載體蛋白結合所得者」作為免疫原使動物免疫化，獲取該動物之血清，藉此回收已被純化之對象抗體，自上述血清以外之成分分離對象抗體。作為載體蛋白，可利用BSA或KLH（匙孔螺血氰蛋白）等。單株抗體可藉由業者周知之融合瘤技術獲得，又，單株抗體亦可為利用業者周知之技術，藉由基因工程所獲得之重組抗體。作為抗體之功能性片段，可例舉：作為具有抗原抗體反應活性之片段的F(ab')₂ 、Fab'等。該等抗體之功能性片段可藉由利用蛋白質分解酵素（例如胃蛋白酶或木瓜酶等）處理以如上方式獲得之全長抗體而製造。

（不溶性載體）作為本發明所使用之不溶性載體，只要為可載持抗25(OH)VD抗體或多價抗原且可與樣品接觸而測定樣品中之25(OH)VD之不溶性載體即可，可例舉：粒子、培養盤等固相。作為粒子，例如可例舉：乳膠粒子、磁性粒子、金屬粒子等。

（乳膠粒子）作為本發明之競爭LTIA所使用之乳膠粒子，例如可例舉：聚苯乙烯、苯乙烯-苯乙烯磺酸鹽共聚物、甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、聚乙酸乙烯酯-丙烯酸酯等。考慮到受檢物質於受檢試樣中之濃度或測定機器之檢測感度等，適當選擇乳膠粒子之平均粒徑為50 μm～400 μm者。

（固定有抗原或抗體之不溶性載體）於本發明中，將抗原或抗體固定於乳膠粒子等不溶性載體之方法可根據欲固定之抗原或抗體之特性，適當選擇物理吸附（疏水結合）法、化學結合法之任一種。於化學結合法中，可將順丁烯二醯亞胺基等結合性官能基導入至抗體，或者於抗原或抗體具有糖之情形時利用糖與不溶性載體表面之結合性官能基結合而固定。

（競爭LTIA用試劑、試劑套組）本發明之競爭LTIA用試劑之構成概略如上所述，對於更具體之構成進行說明。於使抗體固定於乳膠之情形時，較理想為至少包含以下之（1）及（2），（1）及（2）採用分成第1試劑及第2試劑之構成。再者，例示了以下之（1）及（2）為溶液狀態之情形，但保存時亦可製成乾燥品，於該情形時，只要使用時藉由稀釋液等溶解而成為液狀即可。有時將包含複數試劑構成之情形稱為套組。（1）包含將維生素D衍生物固定於載體所得之多價抗原（維生素D衍生物-載體複合體）之溶液（有時稱為第一試液等）（2）固定有抗25(OH)VD抗體之乳膠粒子溶液（有時稱為乳膠試液、第二試液等）進而，本發明之試劑構成亦有時包含以下之（3）、（4）及（5）。（3）濃度換算用標準物質（有時稱為校準物等）（4）用於將濃度換算用標準物質加以溶解或稀釋之溶液（有時稱為校準物稀釋液等）（5）用於使25(OH)VD自維生素D結合蛋白游離之預處理液

於使抗原固定於乳膠之情形時，至少包含以下之（i）及（ii），除此以外，與上述使抗體固定於乳膠之情形相同。（i）包含抗25(OH)VD抗體之溶液（有時稱為第一試液等）（ii）直接固定有維生素D衍生物之乳膠粒子溶液、或固定有將維生素D衍生物固定於載體所得之多價抗原的乳膠粒子溶液（有時稱為乳膠試液、第二試液等）

（凝集訊號之測定方法）競爭LTIA中之凝集訊號之測定方法通常只要為用於凝集抑制反應測定之方法即可，可例舉如下業者可使用之手段：藉由吸光度比進行之評價、粒子數測定、粒子尺寸測定（若凝集則尺寸變大）、散射光測定或吸收光譜之測定（若凝集則增大或位移）等。進而，亦可於可進行光學檢測之範圍內，以電化學檢測取代。

凝集訊號之測定有如上所述之各種方法，但使用乳膠粒子與通用之生物化學分析裝置之方法較方便。例如，可將包含載持有複數種維生素D衍生物之多價抗原、載持有抗25(OH)VD抗體之乳膠粒子之試劑加入至包含作為測定對象之25(OH)VD之樣品中，於一定溫度加溫一定時間，測定此期間之吸光度，檢測吸光度之變化量，根據以預先已知濃度之標準液作為試樣所得之曲線算出受檢試樣中之25(OH)VD之濃度。於乳膠免疫比濁法中，通常使用波長500～900 nm之吸光度，一般將反應時之吸光度之變化量用於定量。關於利用本發明之測定範圍，可考慮測定對象之種類、結合配偶體（binding partner）之結合性（avidity）、結合配偶體與多價抗原之量比等，適當設定成所需之測定範圍。

本發明之樣品中之25(OH)VD之測定可藉由手工作業來進行，或者亦可使用測定裝置等裝置進行。測定裝置可為通用自動分析裝置，亦可為專用測定裝置（專用機）。尤其是競爭LTIA可藉由通用自動分析裝置實施，亦可利用兩步法（二試劑法）等藉由複數個操作步驟進行之方法實施。以下，例舉實施例更詳細地說明本發明，但本發明並不限定於該等。實施例

1.試驗材料以下示出以下之實施例所使用之主要材料及製造商。 BSA（Sigma-Aldrich公司）匙孔螺血氰蛋白（Thermo Scientific公司）卵白蛋白（Thermo Scientific公司）維生素D2（別名Ergocalciferol）（Sigma-Aldrich公司）維生素D3（別名Cholecalciferol）（Sigma-Aldrich公司） 25-羥維生素D2（Sigma-Aldrich公司） 25-羥維生素D3（別名Calcifediol）（富士膠片和光純藥股份有限公司） ProClin300（Sigma-Aldrich公司）二甲基亞碸（別名DMSO）（富士膠片和光純藥股份有限公司）

[試驗例1]25(OH)VD3衍生物之獲取委託外部業者合成而獲得以下之化學式（IV）所示之25(OH)VD3衍生物，並用於以下之試驗例。

[試驗例2]維生素D3衍生物之獲取委託外部業者合成而獲得以下之化學式（III）所示之維生素D3衍生物，並用於以下之試驗例。

[實施例1]維生素D3衍生物-BSA複合體之製備（1）使牛血清白蛋白（BSA）以成為1.0 mg/mL之方式溶解於0.1 M之Bicine緩衝液中，藉由該緩衝液進行透析。（2）使維生素D3衍生物以成為10 mg/mL之方式溶解於二甲基亞碸（DMSO）中。將其以30分之1量（v/v）添加於（1）之BSA溶液中，藉由漩渦攪拌器進行攪拌。（3）於室溫於遮光下培養2小時。（4）將1 M之Tris-HCl（pH8.0）以總量之10分之1量（v/v）添加，藉由漩渦攪拌器進行攪拌，終止反應，從而獲得維生素D3衍生物-BSA複合體。

[比較例1]25(OH)VD3衍生物-BSA複合體之製備於實施例1（2）中，使用25(OH)VD3衍生物代替維生素D3衍生物，除此以外，以相同之方式進行，從而製備25(OH)VD3衍生物-BSA複合體。

[試驗例3]抗25(OH)VD3抗體之獲取 1.抗體之獲取使25(OH)VD3衍生物與匙孔螺血氰蛋白、卵白蛋白等結合，將其作為免疫原，藉由常規方法對小鼠進行免疫。最終免疫係於細胞融合3～4天前進行，回收脾臟細胞及淋巴結細胞，藉由電融合法或PEG法與骨髓瘤細胞（SP2/O）融合。融合細胞藉由96孔板進行培養，於細胞融合後7～8天後回收培養上清液，進行如下所示之篩選。藉由篩選所選擇之株經選殖化而用於抗體純化。

2.篩選 2-1.一次篩選使用以下所示之抗原固相化ELISA，選擇與固相化之25(OH)VD3衍生物反應之株。（1）將作為固相化抗原之藉由PBS稀釋成1.0 μg/mL之25(OH)VD3衍生物-BSA複合體以50 μL/well分注於96孔ELISA用微量盤中，於室溫靜置2小時。（2）藉由0.05%Tween20-PBS（PBST）（400 μL/well）洗淨3次後，分注作為阻斷液（blocking solution）之1%BSA-PBST（100 μL/well），於室溫靜置1小時。（3）去除阻斷液後，以50 μL/well分注培養上清液，於室溫靜置1小時。（4）藉由PBST洗淨3次後，以50 μL/well分注藉由1%BSA-PBST溶液稀釋10000倍所得之HRP標記山羊抗小鼠多株抗體，於室溫靜置1小時。（5）藉由PBST洗淨3次後，以50 μL/well分注鄰苯二胺顯色液，於室溫靜置10分鐘。（6）以50 μL/well分注反應終止液，測定波長492 nm之吸光度，選定吸光度較高之株。

2-2.二次篩選對於一次篩選所選定之株，進而實施以下所示之競爭ELISA，選擇與游離之25(OH)VD2及25(OH)VD3反應且不與游離之維生素D2及維生素D3反應之株。（1）將作為固相化抗原之藉由PBS稀釋成1.0 μg/mL之25(OH)VD3衍生物-BSA複合體以50 μL/well分注於96孔ELISA用微量盤中，於室溫靜置2小時。（2）藉由PBST洗淨3次後，分注作為阻斷液之1%BSA-PBST（100 μL/well），於室溫靜置1小時。（3）去除阻斷液後，使作為抑制抗原之維生素D2、維生素D3、25(OH)VD2或25(OH)VD3以成為0、0.1、1及10 μg/mL之方式溶解於DMSO中，以25 μL/well添加所獲得之溶液。進而，以25 μL/well添加培養上清液，於室溫靜置1小時。（4）藉由PBST洗淨3次後，以50 μL/well分注藉由1%BSA-PBST溶液稀釋10000倍所得之HRP標記山羊抗小鼠多株抗體，於室溫靜置1小時。（5）藉由PBST洗淨3次後，以50 μL/well分注鄰苯二胺顯色液，於室溫靜置10分鐘。（6）以50 μL/well分注反應終止液，測定波長492 nm之吸光度。選定如下株，即，於使用游離之維生素D2及維生素D3作為抑制抗原之情形時吸光度較高，於使用游離之25(OH)VD2及25(OH)VD3作為抑制抗原之情形時吸光度較低。

2-3.結果獲取共計6株融合瘤。

[實施例2]免疫學測定使用乳膠競爭抑制法測定25(OH)VD3。 I.測定方法及順序 1.試劑之製備（1）第一試劑之製備製備以下組成之第一試劑，上述第一試劑包含0.1 μg/mL之實施例1所製備之維生素D3衍生物-BSA複合體。 [第一試劑之組成] 100 mM Bis-Tris pH7.0 300 mM NaCl 0.05% ProClin300 0.5% BSA 0.1 μg/mL 維生素D3衍生物-BSA複合體

（2）第二試劑之製備將平均粒徑約350 nm之1%乳膠（本公司製造）懸浮液1.0 mL添加於包含0.36 mg之試驗例3所獲取之抗25(OH)VD3抗體之緩衝液1.0 mL中，於4℃攪拌2小時。繼而，添加包含0.1%BSA之緩衝液1.0 mL，於4℃攪拌1小時。將所獲得之抗體致敏乳膠液藉由孔徑0.8 μm之過濾器進行過濾後，以波長600 nm時之吸光度成為3.0 OD之方式進行稀釋，製備以下組成之第二試劑。 [第二試劑之組成] 5 mM MOPS-NaOH pH7.0 3.0 OD（600 nm）抗25(OH)VD3抗體致敏乳膠 0.05% ProClin300

（3）25(OH)VD3稀釋系列之製備將25(OH)VD3溶解於DMSO中，製備750 nM溶液。進而，藉由DMSO稀釋本品，製備375、188、94、47、23 nM溶液。將該等稱為25(OH)VD3稀釋系列，於以下之測定中用作樣品。

2.測定方法測定中使用日立7170型自動分析裝置。將樣品3.0 μL及第一試劑100 μL添加至反應池中，於37℃反應5分鐘。進而，將第二試劑100 μL添加至反應池中，於37℃反應5分鐘，藉由兩點終點法（測光點19-34），於主波長570 nm測定吸光度變化量。

II.測定結果測定作為樣品之25(OH)VD3稀釋系列及作為陰性對照（25(OH)VD3濃度為零）之DMSO。將25(OH)VD3之各稀釋系列中之測定感度（mAbs.）示於表2。又，將相對於濃度零之各稀釋系列之相對感度（%）示於圖2。

[比較例2] 於實施例2之I之1.「試劑之製備」中，將添加至第一試劑中之維生素D3衍生物-BSA複合體設為25(OH)VD3衍生物-BSA複合體，除此以外，以相同之方式製備試劑，以與2.之「測定方法」相同之方式進行測定。將測定結果與實施例2之結果一同示於表2及圖2。

[表2] 25(OH)VD3稀釋系列之測定結果（感度mAbs.）

	測定感度（mAbs.）
實施例2	比較例2
維生素D3	25-羥維生素D3
25-羥維生素D3稀釋系列之濃度（nM）	0	241	231
23	248	228
47	224	223
94	184	218
188	142	202
375	89	159
750	14	54

[考察] 根據圖2，關於測定感度降低10%所需之25(OH)VD3濃度，與25(OH)VD3為0 nM之情形相比，於實施例2中自圖2讀取為約55 nM，於比較例2中為約150 nM，測定感度為約3倍。因此，可知作為競爭抑制法之25(OH)VD測定試劑之多價抗原，使用維生素D3衍生物-BSA複合體之情形時，與使用25(OH)VD3衍生物-BSA複合體之情形相比，競爭反應程度更大，可進行高感度之檢測。 [產業上之可利用性]

根據本發明，可提供一種基於即便於樣品中之25(OH)VD濃度較低之情形時感度亦良好之競爭免疫分析的測定方法及測定試劑。又，於將本發明應用於競爭LTIA之情形時，藉由應用於作為通用機器之自動分析裝置，可於短時間內測定大量樣品之25(OH)VD。

無

[圖1]係表示維生素D於生物體內之代謝之概念示意圖。 [圖2]係於競爭LTIA中，將25(OH)VD3衍生物-BSA複合體（比較例2）或VD3衍生物-BSA複合體（實施例2）添加於測定試劑中，將此時之各稀釋系列中之測定感度（mAbs.）以相對於25(OH)VD3濃度零之相對感度（%）表示之圖。

Claims

一種25-羥維生素D測定用試劑，其係基於競爭免疫分析者，且至少包含以下之構成：（1）以下之化學式（I）及/或（II）所示之維生素D衍生物，（2）抗25-羥維生素D抗體；

此處，A表示可以高親和性與載體化學結合之示蹤劑基； X表示未經取代或經雜原子取代之鏈長3～20之烴基。
如請求項1之25-羥維生素D測定用試劑，其中，上述A選自胺基、羧基、硫氫基、生物素、長葉毛地黃配質、酪胺酸、經FITC取代之酪胺酸、經取代之胺基酸、胺基酸及肽序列、FITC、蛋白質及肽類、A蛋白質、G蛋白質、維生素D衍生物。
如請求項1或2之25-羥維生素D測定用試劑，其中，上述化學式（I）或（II）所示之維生素D衍生物為如下構成，即，經由A結合2種以上於載體，形成多價抗原。
如請求項1至3中任一項之25-羥維生素D測定用試劑，其中，競爭免疫分析之測定原理為選自RIA、EIA、LTIA、CLEIA之競爭免疫分析。
如請求項4之25-羥維生素D測定用試劑，其中，競爭免疫分析為競爭乳膠免疫比濁法（競爭LTIA）。
如請求項1至5中任一項之25-羥維生素D測定用試劑，其中，25-羥維生素D為25-羥維生素D2與25-羥維生素D3之總和，維生素D衍生物為維生素D2衍生物及/或維生素D3衍生物，抗25-羥維生素D抗體為抗25-羥維生素D2及/或抗25-羥維生素D3抗體。
如請求項1至6中任一項之25-羥維生素D測定用試劑，其中，維生素D3衍生物為以下之化學式（III）所示之化合物：
。
如請求項1至7中任一項之25-羥維生素D測定用試劑，其中，上述（1）或（2）之任一者固定於不溶性載體。
如請求項1至8中任一項之25-羥維生素D測定用試劑，其為自動分析裝置用試劑。
一種25-羥維生素D測定方法，其係基於競爭免疫分析者，且至少包括以下步驟：（1）於化學式（I）及/或（II）所示之維生素D衍生物之存在下，使樣品與抗25-羥維生素D抗體接觸；

此處，A表示可以高親和性與載體化學結合之示蹤劑基； X表示未經取代或經雜原子取代之鏈長3～20之烴基；（2）對樣品中之對應於25-羥維生素D之上述維生素D衍生物與上述抗25-羥維生素D抗體之抗原抗體反應的抑制程度進行測定。
如請求項10之25-羥維生素D測定方法，其中，A選自胺基、羧基、硫氫基、生物素、長葉毛地黃配質、酪胺酸、經FITC取代之酪胺酸、經取代之胺基酸、胺基酸及肽序列、FITC、蛋白質及肽類、A蛋白質、G蛋白質、維生素D衍生物。
如請求項10或11之25-羥維生素D測定方法，其中，上述化學式（I）或（II）所示之維生素D衍生物為如下構成，即，經由A結合2種以上於載體，形成多價抗原。
如請求項10至12中任一項之25-羥維生素D測定方法，其中，競爭免疫分析之測定原理為選自RIA、EIA、LTIA、CLEIA之競爭免疫分析。
如請求項13之25-羥維生素D測定方法，其中，競爭免疫分析為競爭乳膠免疫比濁法（競爭LTIA）。
如請求項10至14中任一項之25-羥維生素D測定方法，其中，25-羥維生素D為25-羥維生素D2與25-羥維生素D3之總和，維生素D衍生物為維生素D2衍生物及/或維生素D3衍生物，抗25-羥維生素D抗體為抗25-羥維生素D2及/或抗25-羥維生素D3抗體。
如請求項10至15中任一項之25-羥維生素D測定方法，其中，維生素D3衍生物為以下之化學式（III）所示之化合物：
。
如請求項10至16中任一項之25-羥維生素D測定方法，其中，上述（1）或（2）之任一者固定於不溶性載體。
如請求項10至17中任一項之25-羥維生素D測定方法，其使用自動分析裝置進行測定。
一種多價抗原，其係用於基於競爭免疫分析之25-羥維生素D3測定方法者，且以下之化學式（III）所示之維生素D3衍生物固定於載體：
。